JP2022547107A - インフルエンザウイルスワクチン及びその使用 - Google Patents

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Abstract

グループ２インフルエンザヘマグルチニンステムポリペプチド、前記ポリペプチドをコードする核酸、前記核酸を含むベクター、及びそれを含む医薬組成物、並びに、特にインフルエンザウイルス感染の予防及び／又は治療におけるそれらの使用方法が本明細書において提供される。

Description

本発明は医薬の分野に関する。インフルエンザＡヘマグルチニン（ＨＡ）ステムドメインポリペプチド、前記ポリペプチドをコードする核酸、前記ポリペプチドを含む医薬組成物、及びそれらの使用方法が本明細書において提供される。
本発明は、少なくとも一部が、ＨＨＳにより裁定された契約ＨＨＳＯ１００２０１７０００１８Ｃに基づき、米政府の支援の下になされた。米政府は、本発明における所定の権利を有する。
インフルエンザウイルスは、主要なヒト病原体であり、無症状感染から死亡をもたらし得る原発性ウイルス肺炎まで重症度に幅がある呼吸器疾患（一般に「インフルエンザ（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）」又は「インフルエンザ（ｔｈｅ ｆｌｕ）」と称される）を引き起こす。感染の臨床効果は、インフルエンザ株の病原性並びに宿主の曝露、既往歴、年齢、及び免疫状態により変動する。毎年、世界中で約１０億人の人々がインフルエンザウイルスによる感染を受け、３～５百万症例の重病及び推定３００，０００から５００，０００のインフルエンザ関連死をもたらすと推定されている。これらの感染の大部分は、Ｈ１又はＨ３ヘマグルチニン亜型を担持するインフルエンザＡウイルスに起因し得、インフルエンザＢウイルスからの寄与は小さく、したがって、これらの代表物は通常、季節性ワクチンに含まれる。現在の免疫処置の実施は、有効な季節性インフルエンザワクチンの適時の製造を可能にするために、循環インフルエンザウイルスを早期に同定することに依存している。翌シーズンに有力になるであろう株を予測するのが本質的に困難であることの他に、抗ウイルス薬耐性及び免疫回避もまた、現在のワクチンが罹患及び死亡を防ぐのに失敗する一因となっている。これに加え、病原体保有動物から発生し、ヒトからヒトへの拡散を増加させるように再集合した高病原性のウイルス株によって引き起こされるパンデミックの可能性は、地球規模の保健にとって重大で現実的な脅威をもたらす。
インフルエンザウイルスは、オルトミクソウイルス（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）科に属するエンベロープＲＮＡウイルスである。そのゲノムは、１１種の異なるタンパク質、１種の核タンパク質（ＮＰ）、３種のポリメラーゼタンパク質（ＰＡ、ＰＢ１及びＰＢ２）、２種のマトリックスタンパク質（Ｍ１及びＭ２）、３種の非構造タンパク質（ＮＳ１、ＮＳ２及びＰＢ１－Ｆ２）、並びに２種の外部糖タンパク質、すなわちヘマグルチニン（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）をコードする８つの一本鎖ＲＮＡセグメントからなる。
インフルエンザＡウイルスは、自然界に広く分布しており、種々の鳥類及び哺乳動物に感染し得る。このウイルスは、ＨＡタンパク質及びＮＡタンパク質の抗原構造の違いに基づいて分類され、その異なる組合せは特有のウイルス亜型を表し、それが特定のインフルエンザウイルス株にさらに分類される。全ての既知の亜型は鳥類において見出され得るが、現在の循環ヒトインフルエンザＡ亜型は、Ｈ１Ｎ１及びＨ３Ｎ２である。インフルエンザＡウイルスの系統解析により、ヘマグルチニンが２つの主要な、いわゆる系統グループ、とりわけ系統グループ１（グループ１ウイルス）のＨ１、Ｈ２、Ｈ５及びＨ９亜型と、とりわけ系統グループ２（グループ２ウイルス）のＨ３、Ｈ４及びＨ７亜型に細分化されることが示されている。
インフルエンザＢ型ウイルス株は、厳密にはヒトである。インフルエンザＢ型ウイルス株内のＨＡ中の抗原変異は、Ａ型株内で観察されるものよりも小さい。ヒトでは、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８（Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａとも称される）系統及びＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７（Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ）系統で表される、２つの遺伝的に及び抗原的に異なる系統のインフルエンザＢウイルスが循環している。インフルエンザＢウイルスにより引き起こされる疾患の範囲は、一般にインフルエンザＡウイルスにより引き起こされる疾患の範囲より軽度であるが、入院を要する重度の疾病が、依然としてインフルエンザＢ感染に頻繁に見られる。
インフルエンザウイルスを中和する抗体は、主としてヘマグルチニン（ＨＡ）を対象とすることが知られている。ヘマグルチニン又はＨＡは、ウイルス膜に固定され、以下の二重の機能を有する三量体糖タンパクである：細胞表面受容体シアル酸への結合に関与し、取り込まれた後は、ウイルスとエンドソーム膜の融合を媒介し、その結果、ウイルスＲＮＡが標的細胞の細胞質に放出される。ＨＡは、大型のヘッドドメイン及びより小型のステムドメインを含む。ステムドメインはＣ末端膜貫通ドメイン配列によってウイルス膜に固定される。このタンパク質は翻訳後に切断されて、２つのＨＡポリペプチド、ＨＡ１及びＨＡ２（完全な配列はＨＡ０と呼ばれる）を生じる（図１Ａ、１Ｂ）。膜遠位ヘッドドメインは、主としてＨＡ１に由来し、膜近位ステムドメインは、主としてＨＡ２に由来する。ウイルス感染能の活性化にはＨＡ前駆体分子ＨＡ０の切断が必要であり、宿主における活性化プロテアーゼの分布はインフルエンザウイルスの病原性の決定因子の１つである。哺乳動物及び非病原性鳥ウイルスのＨＡは細胞外で切断されるため、宿主内での拡散は適切なプロテアーゼに出会う組織に限定される。一方、病原性ウイルスのＨＡは普遍的に存在するプロテアーゼによって細胞内で切断されるため、様々な細胞型に感染し、全身感染を引き起こす能力を有している。
季節性インフルエンザワクチンを毎年アップデートしなければならない理由は、ウイルスの大きい変異性である。ＨＡタンパク質において、この変異は、抗原ドリフト及びシフトが多数の異なるバリアントをもたらしたヘッドドメイン中で特に顕在化される。これは、免疫優性の区域でもあるため、殆どの中和抗体はこのドメインに対して指向され、受容体結合を妨げることにより作用する。この免疫優性とヘッドドメインの大きな変異の組合せが、特定の株による感染が他の株に対する免疫につながらない理由を説明する。すなわち、初回感染によって誘発される抗体は、一次感染のウイルスと密接に関連した限られた数の株のみを認識する。
最近、完全なインフルエンザヘマグルチニン球状ヘッドドメイン又はその実質的な部分を欠くインフルエンザヘマグルチニンステムポリペプチドが報告され、ステムドメインポリペプチドの１つ以上の保存エピトープに対する免疫応答を生成するために使用されてきている。ステムポリペプチドのエピトープは、球状ヘッドドメインの免疫原性の高い領域よりも免疫原性が低く、したがってステムポリペプチドに球状ヘッドドメインが存在しないことにより、ステムポリペプチドの１つ以上のエピトープに対する免疫応答の発現が可能になると考えられている（Ｓｔｅｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。したがって、Ｓｔｅｅｌらは、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）及びＡ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１９６８（Ｈ３Ｎ２）株のＨＡ１ドメインからアミノ酸残基５３～２７６を欠失させ、その欠失させた配列を短い柔軟な連結配列ＧＧＧＧで置換することによって、インフルエンザＨＡステムポリペプチドを作製した。Ｈ３ ＨＫ６８構築物によるマウスのワクチン接種は、グループ１のＨＡと交差反応性の抗血清を誘発しなかった。さらに、国際公開第２０１３／０７９４７３号パンフレットにおいて説明されているとおり、このステムポリペプチドは不安定であり、完全長の野生型ＨＡステム領域中の保存エピトープに結合すると以前に示された抗体の結合の欠落により証明されるとおり、正確な立体構造をとらなかった。
Ｂｏｍｍａｋａｎｔｉ ｅｔ ａｌ．（２０１０）は、アミノ酸残基３３０～５０１（ＨＡ２）、７アミノ酸リンカー（ＧＳＡＧＳＡＧ）、ＨＡ１のアミノ酸残基１６～５５、６アミノ酸リンカーＧＳＡＧＳＡ、続くＨＡ１の残基２９０～３２１を、ＨＡ１中の変異Ｖ２９７Ｔ、Ｉ３００Ｅ、Ｙ３０２Ｔ及びＣ３０５Ｔと共に含むＨＡ２をベースとしたポリペプチドを報告した。設計は、Ｈ３ ＨＡ（Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１９６８）の配列をベースとした。このポリペプチドは、Ｈ３亜型内の別のインフルエンザウイルス株に対する交差保護を提供したに過ぎなかった（Ａ／Ｐｈｉｌ／２／８２に対して提供したが、Ｈ１亜型（Ａ／ＰＲ／８／３４に対しては提供しなかった）。より最近のＢｏｍｍａｋａｎｔｉら（２０１２）による論文では、Ｈ１Ｎ１ Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４）由来のＨＡに基づくステムポリペプチド（Ｈ１ＨＡ０ＨＡ６）が報告された。このポリペプチドでは、アミノ酸残基４８～２８８の等価物が欠失され、そして変異Ｉ２９７Ｔ、Ｖ３００Ｔ、Ｉ３０２Ｎ、Ｃ３０５Ｓ、Ｆ３９２Ｄ、Ｆ３９５Ｔ及びＬ４０２Ｄが作られた。Ｈ３ベースポリペプチド及びＨ１ベースポリペプチドの両方が、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現され、したがって、天然のＨＡタンパク質の一部であるグリカンを欠く。
Ｃｏｒｂｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（２０１９）は、マウスにおいて防御的ホモサブタイプ抗体を誘発した自己集合フェリチンナノ粒子上に表示されるインフルエンザＡウイルスのＨ３及びＨ７のＨＡステム三量体について報告している。フェリチンに融合したＨＡ抗原はまた、免疫原性ではあるが、繰り返し免疫後のＨＡ指向性免疫応答及びその寿命の低減につながり得る、キャリアナノ粒子に対する望ましくない応答を誘導し得る。さらに、ＨＡ－フェリチン融合タンパク質の発現レベル及び精製の課題は、大量のワクチン投与量の産生を妨げ得る。また、そのようなナノ粒子の表面に近いＨＡエピトープ（ＣＲ８０２０の結合部位など）の接近可能性は、これらの好ましい保存されたＨＡ表面に対する免疫応答を低下させ得る。
従来の卵で育てた全不活化インフルエンザウイルスワクチンの技術が７０年以上前に開発されたにもかかわらず、今日まで、インフルエンザは依然として大きな世界的な健康負担となっている。インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）の一定の抗原ドリフトは、可変ＨＡヘッドドメインに向けられた免疫優性株特異的抗体応答と相まって、従来のワクチン有効性を１０～６０％の範囲でもたらすと共に、認可ワクチンに含まれるウイルス株の季節的更新の必要性をもたらしている。さらに、現在のワクチンのアプローチは、パンデミックインフルエンザウイルス株に対し最小限の防御を提供する。
過去１０年間のＨ３Ｎ２に対するワクチンの有効性は平均してわずか３３％に過ぎず（Ｂｅｌｏｎｇｉａ ｅｔ ａｌ（２０１６））、また最近のＨ３Ｎ２株は病原性の増加を示しており（Ｇａｒｔｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１７））、さらにＨ７ウイルスが非季節性株による最大のパンデミックの脅威の１つとなっていることから、より優れたグループ２ワクチンが特に緊急に必要となっている。
したがって、強固な広域中和抗体応答の産生を刺激し、広範な現在及び将来のインフルエンザウイルス株（季節性及び流行性の両方）に対する保護を提供する安全で有効な「ユニバーサル」ワクチン、特にインフルエンザの有効な予防のために系統グループ２内の１つ以上のインフルエンザＡウイルス亜型に対する保護を提供するワクチンが必要とされている。
本発明は、グループ２のインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）由来の新規単量体及び多量体（特に三量体）ポリペプチドを提供するものであり、このポリペプチドは、インフルエンザＨＡステムドメインを含み、球状ヘッド領域を欠き、本明細書中では、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）ステムポリペプチド又はｍｉｎｉ－ＨＡと呼ばれる。このポリペプチドは、対象、特にヒト対象に投与された場合、少なくともグループ２インフルエンザウイルスに対する細胞性及び／又は体液性免疫応答を誘導する。本発明のポリペプチドは、膜遠位ヘッドドメイン中に存在する優性エピトープの非存在下で、グループ２ＨＡ分子の膜近位ステムの保存エピトープを、免疫系に提示する。
したがって、本発明のＨＡステムポリペプチドにおいては、ＨＡ０タンパク質の一次配列の一部分、すなわちヘッドドメインを構成する部分が欠失しており、残りのアミノ酸配列は、ポリペプチド鎖の連続性を回復させるために、直接、又はいくつかの実施形態では、短い可撓性のある連結配列（「リンカー」）を導入して再連結されている。得られたアミノ酸配列は、ＨＡ分子の残留部分の天然三次元構造を安定化させる特定の変異を導入することによりさらに改変される。
第１の態様において、本発明は、グループ２インフルエンザＡウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）のＨＡ１ドメイン及びＨＡ２ドメインを含む単量体インフルエンザＡ ＨＡステムポリペプチドであって、
（ｉ）ＨＡ１ドメインのヘッド領域の欠失、
（ｉｉ）ＨＡ２ドメインの三量体化領域の改変、
（ｉｉｉ）少なくとも１つの単量体内システイン架橋を形成することができる少なくとも２つのシステイン残基
を含むアミノ酸配列を含み、
このアミノ酸配列の３５５位のアミノ酸はＷであり、
当該ＨＡステムポリペプチドアミノ酸配列におけるアミノ酸位置の番号付けは、Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８１）のＨＡ命名法によるＨ３番号付けであり、これは参考株Ｈ３Ｎ２ Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／６８（配列番号１）の完全長ＨＡ番号付けに対応する
ＨＡステムポリペプチドに関する。
特定の実施形態では、本発明は、ＨＡ１ドメイン及びＨＡ２ドメインを含むグループ２インフルエンザＡヘマグルチニン（ＨＡ）ステムポリペプチドであって、
（ｉ）ＨＡ１ドメインのヘッド領域の欠失であって、５０位のアミノ酸に対応するアミノ酸から３０２位のアミノ酸に対応するアミノ酸までのアミノ酸配列を少なくとも含む欠失；
（ｉｉ）ＨＡ２ドメインの三量体化領域の改変、好ましくはＣヘリックスにおける三量体化領域の改変であって、前記三量体化領域は４０５位のアミノ酸に対応するアミノ酸から４１９位のアミノ酸に対応するアミノ酸までのアミノ酸配列を含む、改変；
（ｉｉｉ）４２２位に対応する位置のシステインと組み合わせて単量体内システイン架橋を形成する（ことができる）３１０位に対応するアミノ酸位置のシステイン、又は４２２位に対応する位置のシステインと組み合わせて単量体内システイン架橋を形成する（ことができる）３１１位に対応するアミノ酸におけるシステイン、又は４１８位に対応する位置のシステインと組み合わせて単量体内システイン架橋を形成する（ことができる）３０８位に対応するアミノ酸位置のシステイン
を含むアミノ酸配列を含み、
このアミノ酸配列の３５５位のアミノ酸はＷであり、
当該ＨＡステムポリペプチドアミノ酸配列におけるアミノ酸位置の番号付けは、Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（前出）のＨＡ命名法によるＨ３番号付けであり、これは参考株Ｈ３Ｎ２ Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／６８（配列番号１）の完全長ＨＡ番号付けに対応する、
ＨＡステムポリペプチドに関する。
本発明によれば、驚くべきことに、本発明の新規なグループ２インフルエンザＨＡステムポリペプチドは高レベルで組換え発現され得、さらなる人工Ｃ末端三量体化ドメインの非存在下に細胞培養上清中で三量体であり、且つ／又はより大きな熱安定性をもたらす高い融解温度を有することが示された。さらに、本発明のグループ２ＨＡステムポリペプチドは、ＣＲ９１１４（国際公開第２０１３／００７７７０号パンフレットに記載）及び／又はＣＲ８０２０（国際公開第２０１０／１３０６３６号パンフレットに記載）などのグループ２ＨＡに結合するＨＡステム結合抗体のエピトープを安定して提示することによって、完全長グループ２ＨＡのステムを模倣する。
第２の態様において、本発明は、本明細書中に記載されるＨＡステムポリペプチドモノマーを少なくとも２つ含む、多量体インフルエンザＡヘマグルチニン（ＨＡ）ステムポリペプチドに関する。
さらなる態様では、本発明は、グループ２インフルエンザＨＡステムポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。
さらに別の態様では、本発明は、インフルエンザＨＡステムポリペプチドをコードする核酸を含むベクター、特に組換えアデノウイルスベクターを提供する。
さらなる態様では、本発明は、グループ２インフルエンザＨＡに対する免疫応答をそれを必要としている対象に誘導する方法であって、対象に、本発明によるインフルエンザＨＡステムポリペプチド、核酸分子、及び／又はベクターを投与することを含む方法を提供する。
別の態様では、本発明は、本発明によるインフルエンザＨＡステムポリペプチド、核酸分子及び／又はベクター、並びに薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
さらなる態様では、本発明は、インフルエンザウイルスに対する免疫応答の誘導に使用するための、特に系統グループ２からのインフルエンザウイルスＡ株によって引き起こされる疾患又は病態の予防のためのワクチンとして使用するための、グループ２インフルエンザＨＡステムポリペプチド、前記インフルエンザＨＡステムポリペプチドをコードする核酸分子、及び／又は前記核酸分子を含むベクターを提供する。
Ａ．本発明のポリペプチドの概略図（下の図）；Ｂ．ＨＡのヘッド領域の除去は本発明のステムポリペプチド（ｍｉｎｉ－ＨＡ）をもたらす；Ｃ．本発明のステムベースのポリペプチド単量体（ｍｉｎｉ－ＨＡ）の三次元表示；Ｄ．本発明のポリペプチド（特に、ポリペプチドＵＦＶ１８００８８）の概略図。 Ａ．ＯＣＴＥＴ（抗Ｃタグ）によって測定されたＥＸＰＩ－ＣＨＯ培養上清のタンパク質発現レベル；Ｂ．構築物１８００８８を発現するＥＸＰＩ－ＣＨＯ細胞の培養上清のＳＥＣ分析（左パネル）及び精製１８００８８のＳＥＣ－ＭＡＬＳ分析；Ｃ．ＥＬＩＳＡによる精製ポリペプチドへのｍＡｂ ＣＲ９１１４の結合（ＥＣ５０値）；Ｄ．示差走査蛍光測定による精製ポリペプチドの温度安定性分析。 図３：本発明のいくつかのステムポリペプチドを発現するＥＸＰＩ－２９３細胞の培養上清のＳＥＣプロファイル及び溶出分析。Ａ．野生型（ＷＴ）残基への復帰変異を有するポリペプチドのＳＥＣプロファイル；点線は安定化ヘッドレスｍｉｎｉ－ＨＡ参照（ＵＦＶ１８０１４１）であり、黒線はＷＴ配列へのｍｉｎｉ－ＨＡ変異である；Ｂ．パネルＡにおけるＳＥＣプロファイルの溶出時間（左）及び三量体ピーク高さ（右）；Ｃ．最小設計ポリペプチドのＳＥＣプロファイル及びＵＦＶ１８００８８からの選択された変異の段階的導入；点線は最小設計ｍｉｎｉ－ＨＡ参照（ＵＦＶ１８０６４７）であり、黒線は変異ｍｉｎｉ－ＨＡである；Ｄ．パネルＣにおけるＳＥＣプロファイルの溶出時間及びピーク高さ。 （上記の通り。） プロトマー間ジスルフィド架橋のある場合とない場合の三量体ステムポリペプチドの安定性。Ａ．回収時のＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞の培養上清（左パネル）、及び４℃で１週間インキュベートした後の精製ポリペプチドを発現するＥＸＰＩ－ＣＨＯ細胞の培養上清のＳＥＣ分析（（この図の上部の構造ｍｉｎｉ－ＨＡモデルに示すような）３９８位及び４０８位におけるシステイン残基の導入なし（ＵＦＶ１８０１９２）及び導入あり（ＵＦＶ１８０１４１））；Ｂ．示差走査蛍光測定により決定された精製ポリペプチドの温度安定性；Ｃ．非還元条件下及び還元条件下でのタンパク質純度のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。示すように、導入されたシステインはプロトマー間ジスルフィド架橋を形成し、温度安定性を増大させる。 図５：Ａ．３５５位及び４８２位で異なるポリペプチドを発現したＥＸＰＩ－２９３の培養上清のＡｌｐｈａＬＩＳＡによって決定されたタンパク質発現レベル及び抗体結合。値は、ＡｌｐｈａＬＩＳＡによって決定され、参照（ＵＦＶ１６１３３３）に対し正規化されている；Ｂ．３８０位及び４３２位が変異したポリペプチドを発現したＥＸＰＩ－２９３の培養上清のＡｌｐｈａＬＩＳＡによって決定されたタンパク質発現、三量体含有量、及び抗体結合。値は参照（ＵＦＶ１７０９９１）に対し正規化されている；Ｃ．Ｉ．４３５位が変異したポリペプチドを発現したＥＸＰＩ－２９３の培養上清のＡｌｐｈａＬＩＳＡによって決定されたタンパク質発現、三量体含有量、及び抗体結合。値は参照（ＵＦＶ１７０６１１）に対して正規化されている、Ｃ．ＩＩ．ＯＣＴＥＴ（左パネル）及びＳＥＣ分析（右パネル）によって決定された、ＥＸＰＩ－ＣＨＯ培養上清中で発現した構築物ＵＦＶ１７１００４（４３５Ｎ）及びＵＦＶ１７１１９７（４３５Ｒ）のタンパク質発現レベル。精製ポリペプチドのインビトロでの特性評価（下のパネル）：ｍＡｂ ＣＲ９１１４及びｍＡｂ ＣＴ１４９の結合（ＥＬＩＳＡ、ＥＣ５０値）及び温度安定性（示差走査蛍光測定、Ｔｍ５０値（℃））；Ｄ．ＥＸＰＩ－ＣＨＯ培養上清のＯＣＴＥＴ及びＳＥＣ分析によって決定された、３８８位が変異したポリペプチドのタンパク質発現レベル。 （上記の通り。） （上記の通り。） 図６：ＨＡヘッドドメイン（ＨＡ１）除去の概略図。ポリペプチドを発現したＥＸＰＩ－２９３細胞の培養上清のＡｌｐｈａＬＩＳＡによって決定された発現レベル、三量体含有量及びｍＡｂ結合。全てのデータは、参照設計ＵＦＶ１６１９０８（Ａ）、ＵＦＶ１６０６５３（Ｂ）、及びＵＦＶ１６０３２１（Ｃ）に対して正規化されている。Ａ．参照設計（ＵＦＶ１６１９０８）では、４６位のアミノ酸から３０６位のアミノ酸までのヘッドドメインの部分が除去され、２つのＨＡ１末端が人工「ＧＰＧＳリンカー」によって連結された。ＨＡヘッドドメイン除去（ＨＡ１ストランドアップ）及びＨＡ１末端の直接連結（すなわち、ヘッド欠失後のＮ末端ＨＡ１セグメントのＣ末端ＨＡ１セグメントへの連結）のための種々の代替切断位置を示す。構築物ＵＦＶ１７０６３７（濃い灰色）では、好ましい構築物ＵＦＶ１８００８８、ＵＦＶ１８００８９、及びＵＦＶ１８００９０と同様、４７位のアミノ酸から３０６位のアミノ酸までのヘッドドメインが除去された；Ｂ．ＨＡヘッドドメイン除去後のＨＡ１上方／下方鎖の直接連結；Ｃ．ヘッドドメイン由来の相同リンカー配列によるＨＡ１のＮ末端及びＣ末端の連結。全ての構築物は、４６位のアミノ酸から３０６位のアミノ酸までのアミノ酸配列の欠失を有する。 （上記の通り。） 図７：Ｂループを安定化させる変異を有する三量体ステムポリペプチドを発現したＥＸＰＩ－２９３の培養上清のＡｌｐｈａＬＩＳＡによって決定された発現レベル及びｍＡｂ結合。全てのデータは、参照設計ＵＦＶ１６１６８６（Ａ）、ＵＦＶ１６１３３３（Ｂ、Ｃ）、及びＵＦＶ１７１１８７（Ｄ）に対して正規化されている；Ａ．４０１位でのＮ結合型グリコシル化のために４０１～４０３位にグリコシル化モチーフを導入することによりＢループを最適化し遮蔽する；点変異によりプロリン残基を導入してＢループを安定化する；Ｃ．第２のグリコシル化モチーフ（３９３位でのＮ結合型グリコシル化のため）を導入してＢループをさらに遮蔽する；Ｄ．Ｎ結合型グリコシル化モチーフの付加（４０１位及び３９２位又は３９３位）とプロリン置換を組み合わせる。ＯＣＴＥＴ（抗Ｈｉｓ２）により決定されたタンパク質発現レベル；Ｅ．ポリペプチドを発現するＥＸＰＩ－２９３細胞の培養上清のＳＥＣプロファイルは、１つのグリカン（ＵＦＶ１８０２０８）又は２つのグリカン及び２つのプロリン（ＵＦＶ１８０２１７）の導入が十分に受け入れられることを示す。三量体ポリペプチドに対応するピークの保持時間及び高さを灰色で示す。 （上記の通り。） ３８位にＮ－結合型グリカンのモチーフのある三量体ステムポリペプチドと同モチーフのない三量体ステムポリペプチドを発現するＥＸＰＩ－ＣＨＯの発現レベル及びｍＡｂ結合。Ａ．ＯＣＴＥＴ（抗Ｃタグ）によって決定された発現レベル、及びＥＬＩＳＡによって決定された抗体結合（ＥＣ５０値）；Ｂ．ＵＦＶ１７０２８２（実線）及びＵＦＶ１７０２７８（破線）のＢＥＬＩＳＡ希釈曲線。 プロトマー内ジスルフィド架橋の導入位置が変化したポリペプチドを発現したＥＸＰＩ－２９３培養上清の分析。参照ＵＦＶ１６０５９５に対して正規化された、ＡｌｐｈａＬＩＳＡによって決定されたタンパク質発現及び抗体結合。Ａ．代替システインは、参照構築物ＵＦＶ１６０５９５に存在する位置の近くに導入された；Ｂ．代替の第２のジスルフィド架橋は第１のジスルフィド架橋の下の領域に導入された。 プロトマー間ジスルフィド架橋の導入位置が変化したポリペプチドを発現したＥＸＰＩ－２９３培養上清の分析。参照設計ＵＦＶ１７００５１に対して正規化された、ＡｌｐｈａＬＩＳＡによって決定されたタンパク質発現及び抗体結合。 代替Ｃ末端トランケーション（ＵＦＶ１７１２７２の５１５位、及びＵＦＶ１７１２８０の４９９位まで段階的）を有する可溶性三量体ポリペプチドバリアントを発現したＥＸＰＩ－２９３培養上清の分析。Ａ．三量体ピークの保持時間及び高さを有するＳＥＣプロファイルを灰色で示す；Ｂ．ＯＣＴＥＴによって決定された、広域中和抗体ＣＲ９１１４及びＣＴ１４９へのポリペプチドの結合；参照ＵＦＶ１７０９９１（黒色）と比較したポリペプチドの相対ＫＯＮ値を示す。 Ｈ３野生型（ＷＴ）からＨ１へのＡヘリックスにおける残基置換を有する本発明のポリペプチドのインビトロでの特性評価。Ａ．発現したポリペプチドを含むＥＸＰＩ－２９３細胞培養上清のＡｌｐｈａＬＩＳＡによって決定されたタンパク質発現レベル及び抗体結合。値は参照（ＵＦＶ１６１４５４）に対して正規化されている；Ｂ．ＯＣＴＥＴ（抗Ｈｉｓ２、左パネル）及びＳＥＣ－ＭＡＬＳ分析（右パネル）によって決定された、３つの独立したＥＸＰＩ－ＣＨＯ培養上清のタンパク質発現レベル。精製ポリペプチドのインビトロでの特性評価（下のパネル）：ｍＡｂ ＣＲ９１１４及びＣＴ１４９の結合（ＥＬＩＳＡ、ＥＣ５０値）及び温度安定性（示差走査蛍光測定、Ｔｍ５０値）。 Ｈ７ ＨＡへのステム表面変異を有する三量体ステムポリペプチドを発現したＥＸＰＩ－２９３細胞の培養上清分析。ＡｌｐｈａＬＩＳＡによって決定された三量体含有量及び抗体結合。全てのデータは、Ｈ１へのＡヘリックス変異３７９及び３８１を含む参照設計ＵＦＶ１７２５６１（Ａ）、又は３７９及び３８１位に野生型Ｈ３ Ａヘリックス残基を含む参照設計ＵＦＶ１７２５６２（Ｂ）に対して正規化されている。ＳＥＣプロファイルにおいて。参照は点線で示されている。 可溶性三量体ステムポリペプチドの生成のための関連する設計要素を含む異なるグループ２Ｈ３株に由来するポリペプチドを発現するＥＸＰＩ－２９３細胞の培養上清のＳＥＣ分析。Ａ．セットＩ設計要素を含み、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１／１９６８、Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／０５、又はＡ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＩＮＦＩＭＨ／１６／００１９／２０１６に基づくｍｉｎｉ－ＨＡポリペプチドのＳＥＣプロファイル（三量体ピークを「Ｔ」で示す）；Ｂループに次のさらなる安定化変異を含むポリペプチドのＳＥＣプロファイル：設計Ｉ（点線）、設計ＩＩ（灰色）及び設計ＩＩＩ（黒色）の要素を含むポリペプチドのＳＥＣプロファイル。 Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８１）のＨ３番号付けによる、野生型Ｈ３Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１／１９６８（ｗｔ Ａ／ＨＫ／１／１９６８）、並びにＨ３由来のｍｉｎｉ－ＨＡ設計ＵＦＶ１８００８８、ＵＦＶ１８００８９及びＵＦＶ１８００９０におけるアミノ酸位置の番号付け。 アデノウイルス（Ａｄ２６．ＦＬＵ．００４）は、ＵＦＶ１８０４８０（天然の膜貫通ドメインを有するＵＦＶ１８０８８）の発現及びフォールディングを駆動した。Ａ）Ａｄ２６．Ｅｍｐｔｙ（１０，０００ＶＰ／細胞、陰性対照）及びＢ）Ａｄ２６．ＦＬＵ．００４（５，０００ＶＰ／細胞）で形質導入されたＭＲＣ－５細胞のＦＡＣＳ分析。形質導入されたＭＲＣ－５細胞をＣＲ９１１４抗体で染色した；Ｃ．Ａｄ２６．ＦＬＵ．００４（５，０００ＶＰ／細胞）又はＡｄ２６．Ｅｍｐｔｙ（５，０００ＶＰ／細胞）で形質導入されたＭＲＣ－５細胞溶解物のウェスタンブロット分析。陽性対照として、ＵＦＶ１８００８８（２００ｎｇ／レーン）をロードした。全ての試料を、非還元（レーン１～３）又は還元（レーン４～６）条件下で実施した。抗体ＣＲ９１１４を用いて、発現したミニＨＡを検出した。 図１７：ポリペプチドＵＦＶ１７０２７８（野生型モチーフ３８－ＮＡＴ－４０をＮ－結合型グリコシル化のために含むポリペプチド）及びＵＦＶ１７０２８２（このグリカンモチーフが点変異Ｔ４０Ｉによってノックアウトされたポリペプチド）のインビボでの特性評価。Ａ．本発明のポリペプチド又はＰＢＳによるマウスの３回目の免疫付与から４週間後のＨ３ Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１／１９６８ ＦＬ ＨＡステム特異的抗体力価。１グループ毎の水平線はグループ中央値を示す。Ｂ．左パネル：示した本発明のポリペプチド又はＰＢＳで免疫したマウスのＨ３Ｎ２ Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１／１９６８チャレンジ後の追跡期間中の生存率；ＵＦＶ１７０２７８上のパネル、ＵＦＶ１７０２８２下のパネル。右パネル：示した本発明のポリペプチド又はＰＢＳで免疫したマウスのＨ３Ｎ２ Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１／１９６８チャレンジ後の追跡期間中の相対体重；ＵＦＶ１７０２７８上のパネル、ＵＦＶ１７０２８２下のパネル。相対体重変化は、０日目に対して表した。追跡期間中の累積体重減少は、曲線下面積（ＡＵＣ）を算出することにより決定した。エラーバーは、９５％信頼区間を示す。 （上記の通り。） 図１８：ナイーブマウスモデルにおける本発明のポリペプチドＵＦＶ１８００８８、ＵＦＶ１８００８９及びＵＦＶ１８００９０の免疫原性のインビボでの特性評価。Ａ．本発明のポリペプチド又はＰＢＳによるマウスの１回（１×）、２回（２×）、又は３回（３×）の免疫化後のＨ３ Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１／１９６８ ＦＬ ＨＡステム特異的抗体力価。１グループ毎の水平線はグループ中央値を示す。Ｂ．本発明のポリペプチド又はＰＢＳによるマウスの１回（１×）、２回（２×）、又は３回（３×）の免疫化後のＦＬ ＨＡ Ｈ３ Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１／１９６８、Ｈ３ Ａ／Ｔｅｘａｓ／５０／２０１２及びＨ７ Ａ／Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ／２１９／２００３抗体力価。１グループ毎の水平線はグループ中央値を示す。破線はＬＬＯＱを示し、白抜きの記号はＬＬＯＱにおける値を示す。 （上記の通り。） 図１９：Ｈ３Ｎ２致死性ナイーブマウスモデルにおける本発明のポリペプチドＵＦＶ１８００８８、ＵＦＶ１８００８９及びＵＦＶ１８００９０のインビボでの特性評価。左パネル：示した本発明のポリペプチド又はＰＢＳで免疫したマウスのＨ３Ｎ２ Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１／１９６８チャレンジ後の追跡期間中の生存率；ＵＦＶ１８００８８上のパネル、ＵＦＶ１８００８９真ん中のパネル及びＵＦＶ１８００９０下のパネル。右パネル：示した本発明のポリペプチド又はＰＢＳで免疫したマウスのＨ３Ｎ２ Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１／１９６８チャレンジ後の追跡期間中の相対体重。相対体重変化は、０日目に対して表した。追跡期間中の累積体重減少は、曲線下面積（ＡＵＣ）を算出することにより決定した。エラーバーは、９５％信頼区間を示す。Ｈ７Ｎ９致死性ナイーブマウスモデル。
定義
本発明で使用する用語の定義を以下に示す。
本発明によるアミノ酸は、２０の天然の（又は「標準」の）アミノ酸又はそのバリアント、例えばＤ－プロリン（プロリンのＤ－エナンチオマー）など、或いは天然ではタンパク質中に見出されない任意のバリアント、例えばノルロイシンなどのいずれかであり得る。標準アミノ酸は、その性質に基づいて、いくつかのグループに分類することができる。重要な因子は、電荷、親水性又は疎水性、サイズ、及び官能基である。これらの性質は、タンパク質の構造及びタンパク質間相互作用にとって重要である。一部のアミノ酸は、特別な性質を有し、例えばシステインは、他のシステイン残基と共有ジスルフィド結合（又はジスルフィド架橋）を形成することができ、プロリンは、ポリペプチド骨格と環を形成し、グリシンは、他のアミノ酸より可撓性がある。表７は、標準アミノ酸の略号及び性質を示す。
「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」又は「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、本明細書で使用される場合、その後に「限定されるものではないが」という語が続くとみなされる。
本明細書で使用される場合、用語「感染」は、細胞又は対象におけるウイルスの侵入、増殖及び／又は存在を意味する。一実施形態では、感染は、「活性」感染、すなわち、ウイルスが細胞又は対象において複製しているものである。このような感染は、ウイルスが最初に感染した細胞、組織及び／又は器官から、他の細胞、組織及び／又は器官へウイルスが拡散することを特徴とする。感染はまた、潜伏感染、すなわち、ウイルスが複製していない感染であり得る。特定の実施形態では、感染は、細胞若しくは対象中のウイルスの存在から生じる、又はウイルスの細胞若しくは対象への侵入による、病理学的状態を指す。
インフルエンザウイルスは、一般的に次のインフルエンザウイルス型：Ａ属、Ｂ属及びＣ属に分類される。用語「インフルエンザウイルス亜型」は、本明細書で使用される場合、ヘマグルチニン（Ｈ）及びノイラミニダーゼ（Ｎ）のウイルス表面タンパク質の組合せによって特徴付けられるインフルエンザＡウイルスバリアントを指す。本発明によれば、インフルエンザウイルス亜型は、それらのＨ番号によって、例えば、「Ｈ３亜型のＨＡを含むインフルエンザウイルス」、「Ｈ３亜型のインフルエンザウイルス」若しくは「Ｈ３インフルエンザ」など、又はＨ番号とＮ番号との組合せによって、例えば、「インフルエンザウイルス亜型Ｈ３Ｎ２」若しくは「Ｈ３Ｎ２」などと称することができる。用語「亜型」には、具体的には、通常、変異から生じ、異なる病原プロファイルを示すそれぞれの亜型内の全ての個々の「株」、例えば、天然分離株、及び人工変異体又はリアソータントなどが含まれる。そのような株はまた、ウイルス亜型の様々な「分離株」と称されることもある。したがって、本明細書で使用される場合、「株」及び「分離株」という用語は互換的に使用され得る。ヒトインフルエンザウイルス株又は分離株についての現在の命名法には、ウイルスの型（属）、すなわち、Ａ、Ｂ又はＣ、最初に分離された地理的場所、株番号及び分離年に加えて、通常、括弧内に示されるＨＡ及びＮＡの抗原の記載が含まれ、例えば、Ａ／Ｍｏｓｃｏｗ／１０／００（Ｈ３Ｎ２）となる。非ヒト株にはまた、命名法において起源の宿主も含まれる。
インフルエンザＡウイルスの亜型は、その系統グループを参照することによりさらに分類することができる。系統解析により、ヘマグルチニンが２つの主要なグループ：とりわけ系統グループ１（グループ１インフルエンザウイルス）のＨ１、Ｈ２、Ｈ５及びＨ９亜型と、とりわけ系統グループ２（グループ２インフルエンザウイルス）のＨ３、Ｈ４、Ｈ７及びＨ１０亜型に細分化されることが示されている。
本明細書で使用される場合、用語「インフルエンザウイルス疾患」又は「インフルエンザ」は、対象におけるインフルエンザウイルス（例えば、インフルエンザＡ又はＢウイルス）の存在から生じる病理学的状態を指す。本明細書で使用される場合、用語「疾患」及び「障害」は、互換的に使用される。特定の実施形態では、この用語は、インフルエンザウイルスによる対象の感染によって引き起こされる呼吸器の疾病を指す。
本明細書で使用される場合、用語「核酸」又は「核酸分子」には、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）及びＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）並びにヌクレオチドアナログを使用して生成されたＤＮＡ又はＲＮＡのアナログが含まれるものとする。核酸は、一本鎖又は二本鎖であり得る。当業者には容易に理解されるであろうが、核酸分子は、化学的に又は生化学的に修飾されていてもよく、又は非天然の若しくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含有していてもよい。そのような修飾には、例えば、標識、メチル化、天然のヌクレオチドの１つ又は複数の、アナログでの置換、ヌクレオチド間修飾、例えば、非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）、荷電結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）、ペンダント部分（例えば、ポリペプチド）、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレンなど）、キレート剤、アルキル化剤、及び修飾結合（例えば、アルファアノマー核酸など）が含まれる。核酸配列についての言及は、別段の記載がない限り、その相補体を包含する。したがって、特定の配列を有する核酸分子についての言及は、その相補的配列を有する相補鎖を包含すると理解されたい。相補鎖はまた、例えばアンチセンス療法、ハイブリダイゼーションプローブ及びＰＣＲプライマーに有用である。
本明細書で使用される場合、ＨＡ中のアミノ酸の番号付けは、Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８１）に記載されるように、Ｈ３番号付けに基づいている。したがって、アミノ酸残基又はアミノ酸位置の番号付けは、Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８１）の図２に記載され及び示されるように、完全長Ｈ３ ＨＡにおける番号付け（特に、Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／６８におけるアミノ酸位置の番号付け）を指す。したがって、番号付けは、参考株Ｈ３Ｎ２ Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／６８の完全長ＨＡ番号付け（配列番号１）に基づいている。番号付けは、特に、配列番号１におけるアミノ酸位置の番号付けを指す。例えば、「３９２位のアミノ酸」又は「３９２位のアミノ酸に対応するアミノ酸」（これらは、本願を通して互換的に使用される）という表現は、Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８１）のＨ３番号付けによる３９２の位置にあるアミノ酸残基を指す。本発明のポリペプチドでは、ＨＡ１ドメイン（ヘッドドメイン）の一部は欠失されているので、本明細書で使用される番号付けは必ずしも本発明のＨＡステムポリペプチド中のアミノ酸の実際の位置を指すわけではなく、完全長ＨＡ分子（すなわち、ヘッドの欠失なし）中の前記アミノ酸の位置を指すことに留意されたい。当業者であれば理解するであろうが、他のインフルエンザウイルス株及び／又は亜型、並びに本発明のステムポリペプチドにおける等価のアミノ酸（すなわち、配列番号１の特定の位置のアミノ酸に対応するアミノ酸）は、配列アラインメントにより決定することができる。
「ポリペプチド」は、当業者に知られているように、アミド結合により結合しているアミノ酸の重合体を指す。本明細書で使用される場合、この用語は、共有アミド結合により結合している単一ポリペプチド鎖を指すことができる。この用語はまた、非共有相互作用、例えば、イオン接触、水素結合、ファン・デル・ワールス接触及び疎水性接触により会合している複数のポリペプチド鎖も指すことができる。この用語に、例えば、シグナルペプチド切断、ジスルフィド結合形成、グリコシル化（例えば、Ｎ結合型及びＯ結合型グリコシル化）、プロテアーゼ切断及び脂質修飾（例えば、Ｓ－パルミトイル化）などの翻訳後プロセシングにより修飾されたポリペプチドが含まれることは、当業者であれば理解するであろう。
「ＨＡステムポリペプチド」は、天然（又は野生型）ヘマグルチニン（ＨＡ）のヘッドドメインを含まないＨＡ由来のポリペプチドを指す。
本明細書で使用される場合、用語「野生型」は、天然に循環しているインフルエンザウイルス由来のＨＡを指す。
インフルエンザウイルスは、世界規模の公衆衛生に対して顕著な影響を及ぼし、毎年数百万例の重度の疾病、数千人の死亡、及びかなりの経済的損失を引き起こしている。現在の３価又は４価のインフルエンザワクチンは、ワクチン株及び密接に関連する分離株に対し、強力な中和抗体応答を誘発するが、ある亜型内のより分岐した株又は他の亜型に及ぶことは殆どない。加えて、適切なワクチン株の選択には多くの困難があり、最適以下の保護となることが多い。さらに、次の流行性ウイルスの亜型を予測することは、それがいつどこで生じるかを含め、現在は未だ不可能である。
ヘマグルチニン（ＨＡ）は、中和抗体の主要な標的であるインフルエンザウイルスの主要なエンベロープ糖タンパク質である。ヘマグルチニンは、侵入プロセスの間の２つの主要な機能を有する。第１に、ヘマグルチニンは、シアル酸受容体との相互作用によって標的細胞の表面へのウイルスの付着を媒介する。第２に、ウイルスのエンドサイトーシス後、ヘマグルチニンは、続いてウイルス及びエンドソーム膜の融合を生んでそのゲノムを標的細胞の細胞質中に放出させる。ＨＡは、宿主由来の酵素により開裂されてジスルフィド結合により結合状態が保たれる２つのポリペプチド（ＨＡ１及びＨＡ２）を生成する約５００のアミノ酸からなる大型エクトドメインを含む。Ｎ末端断片（ＨＡ１ドメイン、約３２０～３３０アミノ酸）の大部分は、受容体結合部位及びウイルス中和抗体により認識される殆どの抗原決定基を含有する膜遠位球状「ヘッドドメイン」を形成する。より小型のＣ末端部分（ＨＡ２ドメイン、約１８０アミノ酸）は、球状ドメインを細胞膜又はウイルス膜に固定するステム様構造（ステムドメイン）を形成する。亜型間の配列同一性の程度は、ＨＡ１ポリペプチド（３４％～５９％の亜型間同一性）がＨＡ２ポリペプチド（５１～８０％の同一性）よりも小さい。保存領域の大部分は、プロテアーゼによる切断部位周囲の配列、特にＨＡ２ Ｎ末端の２３のアミノ酸であり、この配列は全てのインフルエンザＡウイルス亜型で保存される（Ｌｏｒｉｅａｕ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。この領域の一部はＨＡ前駆体分子（ＨＡ０）中で表面ループとして曝露されるが、ＨＡ０が切断されてＨＡ１及びＨＡ２になると、隔絶される。
殆どの中和抗体は、受容体結合部位を包囲するループに結合し、それによって受容体結合及び付着を妨げる。これらのループは変異性が高いため、それらの領域を標的化する殆どの抗体は、株特異的であり、なぜ現在のワクチンがそのような限定された株特異的免疫を誘発するかを説明する。例えば、ＣＲ６２６１などの、広域交差中和効力を有する、インフルエンザウイルスヘマグルチニンに対する完全ヒトモノクローナル抗体が生成された（国際公開第２００８／０２８９４６号パンフレット）。機能及び構造分析により、これらの抗体が膜融合プロセスを妨げ、グループ１のインフルエンザＨＡタンパク質のステムドメイン中の保存性の高いエピトープに向けられていることが明らかになった（Ｔｈｒｏｓｂｙ ｅｔ ａｌ．，２００８、Ｅｋｉｅｒｔ ｅｔ ａｌ．２００９、国際公開第２００８／０２８９４６号パンフレット）。グループ１及び２の多くのＨＡ分子と交差反応するＣＲ９１１４様抗体の同定により（国際公開第２０１３／００７７７０号パンフレットに記載されている）、ヒト免疫系がインフルエンザウイルスに対する極めて広域の中和抗体を誘発することが可能であることが明らかになった。しかしながら、毎年のワクチン接種スキームの必要性を考慮すると、それらの抗体は、亜型Ｈ１及び／又はＨ３の（季節性）インフルエンザウイルスによる感染後にもワクチン摂取後にも、明らかに保護レベルまで誘発されるとは限らない。
本発明によれば、抗体ＣＲ９１１４（配列番号７の重鎖可変領域及び配列番号８の軽鎖可変領域を含む）及び／又は抗体ＣＲ８０２０（配列番号５の重鎖可変領域及び配列番号６の軽鎖可変領域を含む）などの特異的エピトープを模倣する新規なＨＡステムポリペプチドが提供される。本発明のポリペプチドは、インビボで、単独で、又は他の予防的及び／又若しくは治療的処置と組み合わせて投与された場合に、インフルエンザウイルス結合及び／又は中和抗体、好ましくは交差結合及び／又は交差中和抗体を誘発するために使用することができる。「交差結合及び／又は交差中和抗体」は、系統グループ２のインフルエンザＡウイルスの少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、４つ若しくは５つの異なる亜型に結合及び／若しくは中和することができる抗体、又は少なくとも１つのグループ１インフルエンザウイルスと少なくとも１つのグループ２インフルエンザウイルスに結合及び／若しくは中和することができる抗体を意味する。
抗体ＣＲ６２６１及び／又はＣＲ９１１４のエピトープを安定に提示するインフルエンザＨＡステムポリペプチドは、以前に国際公開第２０１３／０７９４７３号パンフレットに記載されている。これらのＨＡステムポリペプチドの少なくともいくつかは、ＣＲ６２６１及び／又はＣＲ９１１４のエピトープを安定に提示することができ、マウスにおいて免疫原性であることが示された。ＣＲ６２６１及び／又はＣＲ９１１４のエピトープを安定に提示することができるさらなるＨＡステムドメインポリペプチドは、国際公開第２０１４／１９１４３５号パンフレット、国際公開第２０１６／００５４８０号パンフレット、及び国際公開第２０１６／００５４８２号パンフレットに記載されている。これらのステムポリペプチドはグループ１のインフルエンザＡウイルスのＨＡに基づいており、グループ１のインフルエンザＡウイルスに対してのみ免疫応答を誘導する。
本発明を導いた研究では、グループ１のＨＡステムポリペプチドに導入された修飾は、グループ２のインフルエンザウイルスのＨＡを使用した場合、安定な三量体ステムポリペプチドを導かなかったことが示された。
本発明は、ポリペプチドが哺乳動物細胞において十分に発現され得、三量体であり（例えば、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ及びＳＥＣによる測定）、且つ熱安定性を有する（例えば、動的走査蛍光測定／示差走査熱量測定（ＤＳＦ／ＤＳＣ）による測定）新規修飾を含むグループ２インフルエンザＨＡステムポリペプチドを提供する。さらに、本発明のグループ２ステムポリペプチドがインビボで中和抗体を誘導することが示されている。さらに、本発明のポリペプチドに対する親和性は、試験した全ての広域中和抗体（ｂｎＡｂ）で１ｎＭ未満であり（Ｏｃｔｅｔ及びＥＬＩＳＡによる測定）、これはポリペプチドが天然の完全長ＨＡのステムを模倣することを明らかに示している。さらに、この新規なＨＡステムポリペプチドは、人工のリンカーも、タグも、Ｎ末端三量体化ドメインも、Ｃ末端三量体化ドメインも必要としない。
したがって、第１の態様では、本発明は、グループ２インフルエンザＡウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）のＨＡ１ドメイン及びＨＡ２ドメインを含む単量体インフルエンザＡ ＨＡステムポリペプチドであって、
（ｉ）ＨＡ１ドメインのヘッド領域の欠失、
（ｉｉ）ＨＡ２ドメインの三量体化領域の改変、
（ｉｉｉ）少なくとも１つの単量体内システイン架橋を形成することができる少なくとも２つのシステイン残基
を含むアミノ酸配列を含み、
このアミノ酸配列の３５５位のアミノ酸はＷであり、
当該ＨＡステムポリペプチドアミノ酸配列におけるアミノ酸位置の番号付けは、Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．のＨＡ命名法によるＨ３番号付けであり、これは参考株Ｈ３Ｎ２ Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／６８（配列番号１）の完全長ＨＡ番号付けに対応する、
ＨＡステムポリペプチドに関する。
したがって、本発明は、ＨＡ２ドメイン中の三量体化領域の改変、好ましくはＣ－ヘリックス中の改変、及び単量体内ジスルフィド架橋を形成する少なくとも２つのシステイン残基を含み；アミノ酸配列中の３５５位のアミノ酸はＷであり；当該ＨＡステムポリペプチドアミノ酸配列におけるアミノ酸位置の番号付けは、参考株Ｈ３Ｎ２ Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／６８（配列番号１）の完全長ＨＡ番号付けに基づいた、Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．のＨＡ命名法によるＨ３番号付けである、ＨＡステムポリペプチド（すなわち、ヘッドレスＨＡポリペプチド）を提供する。
特定の態様では、本発明は、グループ２インフルエンザＡウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）のＨＡ１ドメイン及びＨＡ２ドメインを含む単量体インフルエンザＡ ＨＡステムポリペプチドであって、
（ｉ）ＨＡ１ドメインのヘッド領域の欠失、
（ｉｉ）ＨＡ２ドメインの三量体化領域の改変、
（ｉｉｉ）少なくとも１つの単量体内システイン架橋を形成することができる少なくとも２つのシステイン残基
を含むアミノ酸配列を含み、
３５５位のアミノ酸のＷへの変異を含み、
当該ＨＡステムポリペプチドアミノ酸配列におけるアミノ酸位置の番号付けは、Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（前出）のＨＡ命名法によるＨ３番号付けであり、これは参考株Ｈ３Ｎ２ Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／６８（配列番号１）の完全長ＨＡ番号付けに対応する、
ＨＡステムポリペプチドを提供する。
特定の実施形態では、３５５位のアミノ酸はＷであり、及び４３２位のアミノ酸はＩである、又は３５５位のアミノ酸はＷであり、４３２位のアミノ酸はＩであり、及び３８０位のアミノ酸はＩである。特定の実施形態では、ポリペプチドは、３５５位のアミノ酸のＷへの変異、及び４３２位のアミノ酸のＩへの変異、又は３５５位のアミノ酸のＷへの変異、及び４３２位のアミノ酸のＩへの変異、及び３８０位のアミノ酸のＩへの変異を含む。本発明によれば、これらのアミノ酸の存在は本発明のポリペプチドの三量体レベルを増加させることが示されている。
特定の他の実施形態では、３５５位のアミノ酸はＷ（への変異）であり、３７８位のアミノ酸はＴ（への変異）であり、３７９位のアミノ酸はＮ（への変異）であり、及び／又は３８１位のアミノ酸はＶ（への変異）である。これらのアミノ酸の存在が広域中和抗体の発現及び結合を増加させることが示されている。
特定の実施形態では、ポリペプチドは、Ｂループ内の潜在的なネオエピトープを遮蔽するため、４０１位のＮ結合型グリコシル化のために導入されたグリコシル化モチーフ（ＮｘＴ）をさらに含む。したがって、本発明によれば、ポリペプチドは、４０１位のＮ結合型グリコシル化のための４０１～４０３位のグリコシル化モチーフ（ＮｘＴ）を含む。
特定の実施形態では、本発明は、ＨＡ１ドメイン及びＨＡ２ドメインを含むグループ２インフルエンザＡヘマグルチニン（ＨＡ）ステムポリペプチドであって、
（ｉ）ＨＡ１ドメインのヘッド領域の欠失であって、５０位のアミノ酸に対応するアミノ酸から３０２位のアミノ酸に対応するアミノ酸までのアミノ酸配列を少なくとも含む欠失、
（ｉｉ）ＨＡ２ドメインの三量体化領域の改変、好ましくはＣヘリックスにおける三量体化領域の改変であって、前記三量体化領域は４０５位のアミノ酸に対応するアミノ酸から４１９位のアミノ酸に対応するアミノ酸までのアミノ酸配列を含む、改変、
（ｉｉｉ）４２２位に対応する位置のシステインと組み合わせた３１０位に対応するアミノ酸位置のシステイン；又は４２２位に対応する位置のシステインと組み合わせた３１１に対応するアミノ酸におけるシステイン；又は４１８位に対応する位置のシステインと組み合わせた３０８位に対応するアミノ酸のシステインであって、前記システイン残基はモノマー内ジスルフィド架橋を形成する（ことができる）システインを含むアミノ酸配列を含み；このアミノ酸配列の３５５位のアミノ酸はＷであり、当該ＨＡステムポリペプチドアミノ酸配列におけるアミノ酸位置の番号付けは、参考株Ｈ３Ｎ２ Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／６８（配列番号１）の完全長ＨＡ番号付けに基づいた、Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（前出）のＨＡ命名法によるＨ３番号付けである、ＨＡステムポリペプチドを提供する。
本発明によれば、驚くべきことに、３５５位のアミノ酸がＷであるアミノ酸配列を有するグループ２インフルエンザＨＡステムポリペプチドは、以前に生成されたグループ２ＨＡステムポリペプチドと比較して、哺乳動物細胞において高い発現レベルを示し、三量体化する傾向が大きく、及び／又は熱安定性に優れることがわかった。さらに、本発明のＨＡステムポリペプチドは、インビボでグループ２インフルエンザウイルスに対する体液性及び／又は細胞性免疫応答を誘導する。
当業者に知られているように、完全長インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ０）は、通常、ＨＡ１ドメイン及びＨＡ２ドメインを含む。さらに、完全長インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ０）は、通常、ステムドメイン及びヘッドドメインを含む。ステムドメインは、ＨＡ１ドメインの２つのセグメントと、ＨＡ２ドメインの殆ど又は全てによって形成されている。ＨＡ１ドメインの２つのセグメントは、一次配列においては、球状ヘッドドメインによって分離されている。本明細書に記載されるように、本発明のＨＡステムポリペプチドは、野生型の完全長ＨＡポリペプチド（ＨＡ０）のアミノ酸配列、特にグループ２ＨＡのアミノ酸配列と比較して、ＨＡ１ドメイン及び／又はＨＡ２ドメインにいくつかの改変を含むアミノ酸配列を含む。本願を通して使用される場合、ＨＡステムポリペプチドアミノ酸配列におけるアミノ酸位置の番号付けは、Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（前出）のＨＡ命名法によるＨ３番号付けである（すなわち、参考株Ｈ３Ｎ２ Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／６８（配列番号１）の完全長ＨＡ番号付けに対応する）。
本発明によれば、インフルエンザＨＡポリペプチドのＨＡ１ドメインにおける変化が大きい免疫優性のヘッドの少なくとも一部であって、５０位のアミノ酸から３０２位のアミノ酸までのアミノ酸配列を少なくとも含む部分が、完全長ＨＡ（ＨＡ０）タンパク質から欠失されて、「ｍｉｎｉ－ＨＡ」とも呼ばれるステムポリペプチドが作製された。ＨＡ１ドメインの残りの部分（すなわち、ＨＡ１ドメインのＮ末端セグメント及びＨＡ１ドメインのＣ末端セグメント）は直接（すなわち、リンカーなしで）又は１～１０個のアミノ酸からなるリンカーを介して連結される。したがって、例えば、５０位のアミノ酸から３０２位のアミノ酸までのアミノ酸配列が欠失される場合、４９位のアミノ酸（Ｎ末端ＨＡ１セグメントの最後のアミノ酸）は３０３位のアミノ酸（Ｃ末端ＨＡ１セグメントの最初のアミノ酸）に、直接、又は欠失されたヘッド領域の１～１０個のアミノ酸のリンカーによる置換によって連結される。５０位のアミノ酸から３０２位のアミノ酸までのアミノ酸配列の欠失は、ＨＡ１ドメインにおける最小欠失である。本発明によれば、ＨＡ１ドメインのより大きな部分、例えば、図１Ａ、下の構築物に示すように、４７位のアミノ酸から３０６位のアミノ酸までのアミノ酸配列を欠失させることもできる。
好ましい実施形態では、ＨＡ１ドメインの欠失は、４７位のアミノ酸から３０６位のアミノ酸までのアミノ酸配列を少なくとも含む。したがって、この実施形態では、ステムポリペプチドは、４６位のアミノ酸までのＮ末端ＨＡ１セグメント、及び３０７位のアミノ酸から始まるＣ末端ＨＡ１セグメント（図１Ａの濃い灰色の部分）を含む。
好ましい実施形態では、ＨＡ１ドメインの欠失は、４７位のアミノ酸から３０６位のアミノ酸までのアミノ酸配列からなる。
いくつかの実施形態では、ＨＡ１ドメインにおける欠失は、１～１０個のアミノ酸の連結配列によって置換されている。
さらに、本明細書に記載されるように、本発明のＨＡステムポリペプチドは、ヘッド領域の欠失後のＨＡステムポリペプチドの三量体化を改善するために、ＨＡ２ドメイン中の三量体化領域の改変、好ましくはＣヘリックスにおける改変を含む。特定の好ましい実施形態では、ＨＡ２ドメインにおける前記改変は、ＨＡステムポリペプチドの三量体化を増強する改変である。
特定の実施形態では、前記改変は、Ｃヘリックスにおける異種三量体化ドメインの導入を含む。一般に、Ｃヘリックスは４０５位のアミノ酸から４３４位のアミノ酸までのアミノ酸配列（Ｈ３番号付け）を含むと理解されている。好ましい実施形態では、前記異種三量体化ドメインは、４０５位のアミノ酸から４１９位のアミノ酸までのアミノ酸配列に対応する位置に導入されている（図１Ａ）。したがって、特定の実施形態では、４０５位から４１９位までのＨＡ２ドメイン中の元の（ｗｔ）アミノ酸配列は、同じ長さの異種三量体化配列、すなわち同じ数のアミノ酸で置換されている。
特定の実施形態では、異種三量体化ドメインはＧＣＮ４配列である。
特定の好ましい実施形態では、改変三量体化領域（すなわち、異種三量体化ドメインを含む）は、
４０５ＫＲＭ４０５ＫＩＥＥＥＩＥＳＫ４１９（配列番号９）及び４０５ＰＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫ４１９（配列番号１０）
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、異種三量体化配列のアミノ酸の少なくとも１つはＣに変異されており、（以下に記載するように）単量体間システイン架橋の形成を可能にしている。したがって、特定の好ましい実施形態では、異種三量体化配列は、
４０５ＲＭＫＣＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫ４１９（配列番号１１）及び４０５ＰＭＫＣＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫ４１９（配列番号１２）
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態では、三量体化領域は、アミノ酸配列４０５ＰＭＫＣＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫ４１９（配列番号１２）からなる。
特定の実施形態では、改変は、Ｃヘリックス、好ましくは４０５位のアミノ酸から４１９位のアミノ酸までのアミノ酸を含む三量体化領域における７残基反復配列の変更、好ましくは最適化を含む。［ａｂｃｄｅｆｇ］ｎと表される７残基反復は、一般に、ａ及びｄに疎水性残基を有し、ｅ及びｇに極性／荷電残基を有する。これらのモチーフは殆どのコイルドコイル構造の基礎であり、アルファヘリックスがロープの糸のように一緒にらせん状に巻かれているタンパク質の構造モチーフである（二量体及び三量体が最も一般的な型である）（Ｃｉａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。
さらなる改変として、本発明によるＨＡステムポリペプチドは、単量体内（又は単量体間）システイン（又はジスルフィド）架橋を形成する（ことができる）少なくとも２つのシステイン残基を含む。操作システイン架橋は、少なくとも一方（他方が既にシステインである場合）を変異させることによって導入することができるが、通常は、空間的に近い２つの残基をシステインに変異させ、それらが自然に又は活性酸化によりそれらの残基の硫黄原子間に共有結合が形成されることにより導入され得る。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、３１０位のシステイン及び４２２位のシステイン、又は４２２位に対応する位置のシステインと組み合わせた３１１位に対応するアミノ酸におけるシステイン；又は４１８位に対応する位置のシステインと組み合わせた３０８位に対応するアミノ酸位置のシステインを含み、これらは単量体内システイン架橋の形成を可能にする。特定の実施形態では、ポリペプチドは、３１０位及び／若しくは４２２位に対応する位置のアミノ酸のＣへの変異、又は３１１位及び／若しくは４２２位のアミノ酸のＣへの変異、又は３０８位及び／若しくは４１８位に対応するアミノ酸位置のアミノ酸のＣへの変異を含み、前記システイン残基は前記単量体内システイン架橋を形成する。したがって、これらのシステイン残基は、タンパク質を安定化する単量体内（又はプロトマー内）システイン（又はジスルフィド）架橋を形成する。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、３１０位のシステイン（への変異）及び４２２位のシステイン（への然変異）を含み、少なくとも１つの単量体内システイン架橋を形成する。
本発明によるポリペプチドは、一般に、少なくとも４つのＮ結合型グリコシル化のための天然の（すなわち、天然に存在する）グリコシル化（又はグリカン）モチーフ（ＮｘＴ）、例えばグリカンモチーフを、８～１０位（８ＮＳＴ１０）、２２～２４位（２２ＮＧＴ２４）、３８～４０位（３８ＮＡＴ４０）及び４８３～４８５位（４８３ＮＧＴ４８５）に含む。特定の実施形態では、ポリペプチドは、上記のように、４０１位におけるＮ結合型グリコシル化のために４０１～４０３位に導入された少なくとも１つのグリカンモチーフを含む。特定の実施形態では、ポリペプチドは、少なくとも１つの追加で導入されたグリコシル化モチーフを含む。したがって、特定の実施形態では、少なくとも１つの追加のＮ結合型グリコシル化モチーフは、３９２位でのＮ結合型グリコシル化のために３９２～３９４位に、及び／又は３９３位でのＮ結合型グリコシル化のために３９３～３９５位に存在し及び／又は導入される。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、４０１位でのＮ結合型グリコシル化のための４０１～４０３位のグリコシル化モチーフ、及び３９３位のＮ結合型グリコシル化のための３９３～３９５位のグリコシル化モチーフを含む。
さらなる実施形態では、３８８位に対応する位置のアミノ酸はＭである。特定の実施形態では、３８８位に対応する位置のアミノ酸はＭに変異されるが、この位置の他のアミノ酸も可能であり、これには、例えば、Ｔ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｈ、Ｋ及びＲが含まれるが、これらに限定されない。
さらに、特定の実施形態では、ＨＡポリペプチドは、
－ ３１位のアミノ酸がＥであり、３４位のアミノ酸がＶである、
－ ３９２位のアミノ酸がＳ若しくはＰである、
－ ３９５位のアミノ酸がＴ若しくはＰである、
－ ３９９位のアミノ酸がＳ若しくはＰである、
－ ４３５位のアミノ酸がＮ若しくはＲである、及び／又は
－ ４３９位のアミノ酸がＹである、アミノ酸配列を含む。
したがって、特定の実施形態では、３１位のアミノ酸はＥであり、３４位のアミノ酸はＶである。特定の実施形態では、ポリペプチドは、３１位のアミノ酸のＥへの変異及び３４位のアミノ酸のＶへの変異を含むアミノ酸配列を含む。本発明によれば、これらのアミノ酸残基（すなわち、３１Ｅ及び３４Ｖ）の存在が、本発明のポリペプチドの安定性に重要な寄与因子である水素結合ネットワークを最適化することがわかった。ポリペプチドは、３９２位のアミノ酸がＳ若しくはＰ（への変異）である、３９５位のアミノ酸がＴ若しくはＰ（への変異）である、及び／又は３９９位のアミノ酸がＳ若しくはＰ（への変異）であるアミノ酸配列をさらに含み得る。したがって、本発明のポリペプチドは、いわゆるＢループに１つ以上の変異を含み得る。このＢループは３８５位のアミノ酸から４０４位のアミノ酸までを含む（図１Ｃを参照）。Ｂループの変異は、疎水性を低下させることによってポリペプチドの溶解性を増大させる。したがって、特定の好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＡポリペプチドと比較して、Ｂループに、
－ ３９２位のアミノ酸に対応するアミノ酸のＳ又はＰ、好ましくはＳへの変異、
－ ３９５位のアミノ酸に対応するアミノ酸のＴ又はＰ、好ましくはＴへの変異、及び
－ ３９９位のアミノ酸に対応するアミノ酸のＳ又はＰ、好ましくはＰへの変異
からなる群から選択される少なくとも１つの追加の変異を含む。ポリペプチドは、４３５位のアミノ酸に対応するアミノ酸のＮ又はＲ、好ましくはＮへの変異、及び／又は４３９位のアミノ酸に対応するアミノ酸のＹへの変異をさらに含み得る。これらの変異は、溶液中の三量体の安定性に寄与する三量体界面を最適化すると考えられる。
本明細書で使用される場合、アミノ酸位置の番号付けがＷｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８１）によるＨ３番号付けに基づいていることに再度留意されたい。また、本明細書で使用されるアミノ酸位置の番号付けが完全長Ｈ３ ＨＡポリペプチド（ＨＡ０）の位置の番号付けに基づいていることにも再度留意されたい。したがって、本明細書で使用される場合、「４３４位のアミノ酸」は、Ｈ３ ＨＡ０中の４３４位のアミノ酸を指す。したがって、番号付けは、ヘッド領域の欠失による、本発明のＨＡステムポリペプチドにおけるアミノ酸の実際の位置を指さない（図１５を参照）。
本発明によれば、ＨＡステムポリペプチドは、グループ２ＨＡポリペプチドである。したがって、本発明によれば、本明細書に記載の改変は、系統グループ２のインフルエンザウイルス，例えば、Ｈ３、Ｈ７又はＨ１０亜型のＨＡを含むインフルエンザウイルスのＨＡに導入され、本発明のＨＡステムポリペプチドを生じる。特定の実施形態では、ＨＡステムポリペプチドはＨ３ ＨＡポリペプチドである。したがって、特定の実施形態では、ＨＡステムポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列を有するインフルエンザウイルス Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１／６８、又は配列番号１３のアミノ酸配列を有するインフルエンザウイルス Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５、又は配列番号１４のアミノ酸配列を有するインフルエンザウイルス Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＩＮＦＭＨ／１６／００１９／２０１６などのＨ３亜型のＨＡを含むインフルエンザＡウイルスのＨＡに由来する。当業者であれば理解するであろうが、本発明のポリペプチドはまた、以下に限定されないが、Ａ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９（配列番号１５）、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７（配列番号１６）、又はＡ／Ｐａｎａｍａ／２００７／１９９９（配列番号１７）を含む、他のＨ３インフルエンザＡウイルス株のＨＡにも由来し得る。
上記のように、ステムポリペプチドは、欠失したＨＡ１ヘッド配列を置換し、それによって２つの残りのＨＡ１部分を連結する１～１０個のアミノ酸残基からなる連結配列を含んでも含まなくてもよい。特定の実施形態では、連結配列は、１～５個のアミノ酸を含む。特定の実施形態では、連結配列は、２、３又は４個のアミノ酸を含む。連結配列は、異種連結配列、すなわち、以下に限定されないが、ＧＧＧＧ及びＧＰＳＧなどの、天然の又は野生型のＨＡに存在しないアミノ酸配列であり得る。
特定の実施形態では、連結配列は相同連結配列、すなわち、以下に限定されないが、ＮＰＨＲ、ＧＤＰＨ、ＮＧＧＳ、ＧＧＳＮ、ＧＳＮＡ、ＧＰＧＳ、ＧＳＧＦ、ＧＳＧ、ＧＧ、ＧＧＳ、ＳＧＳ、ＨＰＳＴ、ＩＰＮＩ、ＧＬＳＳ、ＫＰＧＤ、ＤＡＰＩ、ＴＰＮ、及びＴＰＮＧなどの欠失した対応するヘッド領域に由来するアミノ酸配列である。
好ましい実施形態では、ポリペプチドは連結配列を含まない。
上記のように、インフルエンザＨＡ０タンパク質（ＨＡ１及びＨＡ２における）の切断はその活性に必要であり、宿主のエンドソーム膜とウイルス膜との融合を引き起こすことにより、ウイルスゲノムの標的細胞への侵入を促進する。
特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、天然のプロテアーゼ切断部位を含む。したがって、ＨＡ１及びＨＡ２に跨るＡｒｇ（Ｒ）－Ｇｌｙ（Ｇ）配列（すなわち、アミノ酸位置３２９及び３３０）は、トリプシン及びトリプシン様プロテアーゼの認識部位であり、ヘマグルチニン活性化のために通常切断されることが知られている（図１Ａ）。
特定の実施形態では、ポリペプチドはプロテアーゼ切断部位を含まない。したがって、特定の好ましい実施形態では、プロテアーゼ切断部位は、３２９位のアミノ酸残基をアルギニン（Ｒ）又はリシン（Ｋ）以外の任意のアミノ酸に変異させることによって除去されている。特定の実施形態では、３２９位のアミノ酸残基はアルギニン（Ｒ）ではない。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、３２９位のアミノ酸のグルタミン（Ｑ）への変異を含む。したがって、特定の好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドは、投与後のインビトロ又はインビボでの産生中の分子の推定切断を防止するため、切断部位ノックアウト変異Ｒ３２９Ｑを含む。
他の実施形態では、ポリペプチドは、多塩基性切断部位、例えばフーリン切断部位を含む。したがって、ポリペプチドは、細胞内でフーリン様プロテアーゼによって切断されて、天然に折り畳まれ、プロセシングされたＨＡに類似した切断ｍｉｎｉ－ＨＡを産生し得る。
特定の実施形態では、ポリペプチドは、シグナル配列を含まない。シグナル配列（シグナルペプチド、標的シグナル、局在化シグナル、局在化配列、輸送ペプチド、リーダー配列又はリーダーペプチドと呼ばれることもある）は、分泌経路に向かうことになっている新たに合成されるタンパク質の大部分のＮ末端に存在する短いペプチド（通常、１６～３０アミノ酸長）である。シグナル配列は、細胞を促し、通常はタンパク質を細胞膜へと移動させるように働く。多くの場合、シグナルペプチドを含むアミノ酸は、その最終目的地に到達すると、タンパク質から切断される。インフルエンザＨＡでは、シグナル配列は、通常、完全長ＨＡ０のアミノ酸配列の最初の１６個のアミノ酸（Ｈ３番号付けによる－６位から１０位までのアミノ酸に対応する、図１５を参照）を含む。
特定の実施形態では、ポリペプチドはシグナル配列（の一部）を含む。ポリペプチドは、野生型シグナル配列（の一部）、又は代替シグナル配列（の一部）、例えば、以下に限定されないが、
ＭＫＴＩＩＡＬＳＹＩＦＣＬＡＬＧ（配列番号１８）、
ＭＫＴＩＩＡＬＳＹＩＬＣＬＶＦＡ（配列番号１９）、
ＭＫＴＩＩＡＬＳＹＩＬＣＬＶＦＴ（配列番号２０）、及び
ＭＫＴＩＶＡＬＳＹＩＬＣＬＶＦＡ（配列番号２１）
からなる群から選択されるシグナル配列を含み得る。
好ましい実施形態において、（可溶性）ポリペプチドは、シグナル配列を含まない。
一実施形態では、本発明のポリペプチドは、
（ｉ）ＨＡ１ドメインのヘッド領域の欠失であって、４７位のアミノ酸から３０６位のアミノ酸までのアミノ酸からなり、４６位のアミノ酸は３０７位のアミノ酸に直接連結されている、欠失、
（ｉｉ）４０５位のアミノ酸から４１９位のアミノ酸までの元のアミノ酸配列を置換するアミノ酸配列４０５ＰＭＫＣＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫ４１９（配列番号１２）を含む異種三量体化ドメインの導入、
（ｉｉｉ）４２２位に対応する位置のシステイン（への変異）と組み合わせた３１０位に対応するアミノ酸位置のシステイン（への変異）、
（ｉｖ）３９３～３９５位に導入されたグリコシル化モチーフ（すなわち３９３ＮＱＴ３９５）及び４０１～４０３位に導入されたグリコシル化モチーフ（すなわち４０１ＮＡＴ４０３）
を含み、
さらにアミノ酸配列において、
（ａ）３５５位のアミノ酸はＷ（への変異）であり、
（ｂ）４３２位のアミノ酸はＩ（への変異）であり、及び３８０位のアミノ酸はＩ（への変異）であり、
（ｃ）３７８位のアミノ酸はＴ（への変異）であり、及び３７９位のアミノ酸はＮ（への変異）であり、及び／又は３８１位のアミノ酸はＶ（への変異）であり、
（ｄ）３８８位のアミノ酸は、Ｍ（への変異）であり、
（ｅ）３１位のアミノ酸はＥ（への変異）であり、及び３４位のアミノ酸はＶ（への変異）であり、
（ｆ）３９２位のアミノ酸は、Ｓ（への変異）であり、
（ｇ）３９５位のアミノ酸は、Ｔ（への変異）であり、
（ｈ）３９８位のアミノ酸は、Ｃ（への変異）であり、
（ｉ）３９９位のアミノ酸は、Ｐ（への変異）であり、
（ｊ）４０８位のアミノ酸は、Ｃ（への変異）であり、
（ｋ）４３５位のアミノ酸は、Ｎ（への変異）であり、
（ｌ）４３９位のアミノ酸は、Ｙ（への変異）であり、並びに
（ｍ）３２９位のアミノ酸は、Ｑ（への変異）であり、
ＨＡステムポリペプチドアミノ酸配列におけるアミノ酸位置の番号付けは、参考株Ｈ３Ｎ２ Ａ Ａｉｃｈｉ／２／６８（配列番号１）の完全長ＨＡ番号付けに対応するＨ３番号付けである。
特定の実施形態では、ＨＡ１及びＨＡ２ドメインは、Ｈ３亜型のＨＡを含むインフルエンザウイルス、好ましくはインフルエンザウイルス Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１／６８由来である。
特定の好ましい実施形態において、ＨＡ１及びＨＡ２ドメインは、Ｈ３亜型のＨＡを含むインフルエンザウイルス、好ましくはインフルエンザウイルスＡ／香港／１／６８由来であり、前記Ｈ３ ＨＡ１及びＨＡ２ドメイン中のアミノ酸の１つ以上は、Ｈ７ ＨＡの対応するアミノ酸に変異されている。
したがって、特定の実施形態では、ＨＡ１及びＨＡ２ドメインは、Ｈ３亜型のＨＡを含むインフルエンザウイルス、好ましくはインフルエンザウイルス Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１／６８～請求項１９由来であって、
（ａ）２５位のアミノ酸は、Ｋ（への変異）であり、
（ｂ）３６７位のアミノ酸は、Ｙ（への変異）であり、
（ｃ）３７８位のアミノ酸は、Ｔ（への変異）であり、
（ｄ）４７５位のアミノ酸は、Ｄ（への変異）であり、
（ｅ）４７６位のアミノ酸は、Ｄ（への変異）であり、及び／又は
（ｆ）４７９位のアミノ酸は、Ａ（への変異）である。
理論に束縛されることは望むものではないが、Ｈ７ ＨＡに対して、発現、フォールディング及び熱安定性などの望ましい特徴を有する安定化Ｈ３由来ステムポリペプチドの表面を変えることによって、挙動が好ましくない（すなわち、製造がより困難であり、発現レベル及び安定性がより低い）Ｈ７由来のステムポリペプチドに完全に切り替えなくとも、より遠いＨ７ウイルスに対してより保護的であり得る抗体応答を誘導することができると考えられる。
特定の実施形態では、ポリペプチドは、膜貫通（ＴＭ）ドメイン及び細胞質（ＣＤ）ドメイン（前記ＴＭドメイン及びＣＤドメインは、５１４位のアミノ酸に対応するアミノ酸から５５０位のアミノ酸に対応するアミノ酸まで（Ｈ３番号付け）のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を含む）を含むＨＡ２ドメインを含む。したがって、膜結合ｍｉｎｉ－ＨＡポリペプチドが提供される。
分泌可溶性ステムポリペプチドを産生するために、特定の実施形態では、ポリペプチドは、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含まない。したがって、特定の実施形態では、ポリペプチドは、トランケートされたＨＡ２ドメイン、特にＣ末端でトランケートされたＨＡ２ドメインを含む。したがって、本発明によるトランケートＨＡ２ドメインは、ＨＡ２ドメインのＣ末端における１つ以上のアミノ酸残基の欠失によって、完全長ＨＡ２配列よりも短い。
特定の実施形態では、５１４位のアミノ酸に対応するアミノ酸で始まるＨＡ２ドメインのＣ末端部分が欠失されており、したがって、完全な膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインが実質的に除去されている。
特定の実施形態では、Ｃ末端ヘリックスの一部も欠失している。本発明によれば、ＨＡ２ドメインのかなり大きな部分が欠失された場合でさえ、安定な可溶性ＨＡステムポリペプチドが提供され得ることがわかった。したがって、特定の実施形態では、５００位、５０１位、５０２位、５０３位、５０４位、５０５位、５０６位、５０７位、５０８位、５０９位、５１０位、５１１位、５１２位、５１３位又は５１４位のアミノ酸で始まるＨＡ２ドメインのＣ末端部分が欠失されて（再び、Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（前出）により記載されるＨ３番号付けによる番号付け）、細胞における発現後に可溶性ポリペプチドを産生する。
好ましい実施形態では、５０６に対応する位置から始まるＨＡ２ドメインのＣ末端部分が欠失されている。
任意選択により、異種アミノ酸配列（すなわち、インフルエンザＨＡにおいて天然には存在しないアミノ酸配列）を、（トランケートされた）ＨＡ２ドメインに連結することができる。
したがって、特定の実施形態では、Ｈｉｓタグ配列、例えば、ＨＨＨＨＨＨ（配列番号２２）若しくはＨＨＨＨＨＨＨ（配列番号２３）、又はＦＬＡＧタグのＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号２４）、又はＣタグのＥＰＥＡ（配列番号２５）、又はこれらの組合せが、検出及び／又は精製の目的のために、（任意選択でトランケートされた）ＨＡ２ドメインのＣ末端アミノ酸に連結されている。特定の実施形態では、Ｈｉｓタグ配列などの異種アミノ酸配列は、リンカーを介して（トランケートされた）ＨＡ２ドメインに連結され得る。特定の実施形態では、リンカーは、精製後にＨｉｓタグ配列を酵素により除去するために、タンパク質分解切断部位（の一部）、例えばアミノ酸配列ＩＥＧＲ（配列番号２６）又はＬＶＰＲＧＳ（配列番号２７）を含み得る。
特定の実施形態では、（トランケートされた）ＨＡ２ドメインのＣ末端アミノ酸に連結される異種アミノ酸配列は、
ＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬ（配列番号２８）、
ＡＡＡＤＹＫＤＤＤＤＫＬＶＰＲＧＳＰＧＳＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬＧＨＨＨＨＨＨ（配列番号２９）、
ＡＡＡＤＹＫＤＤＤＤＫＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＨＨＨＨＨＨ（ＦＬＡＧ－ＧＳリンカー－Ｈｉｓタグ）、（配列番号３０）、
Figure 2022547107000001
（Ｎａｎｏｌｕｃ－Ｓｔｒｅｐタグ、配列番号３１）、
Figure 2022547107000002
（Ｎａｎｏｌｕｃ－Ｃタグ）（配列番号３２）、
ＥＧＲＡＡＡＷＳＨＰＱＦＥＫＧＡＡＷＳＨＰＱＦＥＫＧＡＡＷＳＨＰＱＦＥＫ（Ｓｔｒｅｐタグ、配列番号３３）、
ＥＧＲＡＡＡＬＰＥＴＧＧＧＡＡＥＰＥＡ（ソルターゼ－Ｃタグ）、（配列番号３４）、
ＳＧＲＤＹＫＤＤＤＤＫＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＷＳＨＰＱＦＥＫＧＡＡＷＳＨＰＱＦＥＫＧＡＡＷＳＨＰＱＦＥＫ（ＦＬＡＧ ＧＳリンカー－Ｓｔｒｅｐタグ）、（配列番号３５）、及び
ＥＧＲＡＡＡＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＷＳＨＰＱＦＥＫＧＡＡＷＳＨＰＱＦＥＫＧＡＡＷＳＨＰＱＦＥＫ（Ｍｙｃタグ－ＧＳリンカー－Ｓｔｒｅｐタグ）、（配列番号３６）
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、異種三量体化ドメインは、（任意選択でトランケートされた）ＨＡ２ドメインのＣ末端アミノ酸、例えば、以下に限定されないが、「フォルドン」三量体化ドメイン（Ｌｅｔａｒｏｖ ｅｔ ａｌ．（１９９３）；Ｓ－Ｇｕｔｈｅ ｅｔ ａｌ．（２００４）に記載）に連結されている。
特定の実施形態では、本発明のＨＡステムポリペプチドは、配列番号４０～４４、４６～６４、６６、６７、６９～９７、１５６～１６４、１６９～１８１及び１８９～２１２から選択されるアミノ酸配列を含む。
好ましい実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４０－４２、２０７及び２１０－２１２から選択されるアミノ酸配列、好ましくは２１０－２１２、より好ましくは配列番号２１０から選択されるアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、ポリペプチドは、好適な細胞（例えば、哺乳動物の細胞）中で発現するとき、グリコシル化される。本発明のポリペプチドは、一般に、上述したように、４つの天然グリコシル化モチーフ（ＮｘＴ）を含む。また、上述したように、本発明によれば、特定の実施形態において、ポリペプチドは、４０１位でのＮ結合型グリコシル化のために、４０１～４０３位に導入された少なくとも１つの導入されたグリコシル化モチーフを含む。ポリペプチドは、好ましくは、３９３位でのＮ結合型グリコシル化のために、３９３～３９５位に導入された追加のグリコシル化モチーフを含む。
さらなる態様では、本発明は、多量体、好ましくは三量体のＨＡステムポリペプチドを提供する。安定な三量体ＨＡステムポリペプチドを得るために、本発明のポリペプチドは、単量体間（プロトマー間とも称される）システイン架橋を形成する（ことができる）少なくとも２つのシステイン残基を含むことが好ましい。したがって、特定の実施形態では、ポリペプチドは、４０８位に対応する位置のシステインと組み合わせて３９６位に対応する位置にシステインを、又は４０８位に対応する位置のシステインと組み合わせて３９７位に対応する位置にシステインを、又は４０８位に対応する位置のシステインと組み合わせて３９８位に対応する位置にシステインを、又は４０５位に対応する位置のシステインと組み合わせて３９８位に対応する位置にシステインを含む。
特定の実施形態では、ポリペプチドは、３９６位のアミノ酸のＣへの変異及び４０８位のアミノ酸のＣへの変異、又は３９７位のアミノ酸のＣへの変異及び４０８位のアミノ酸のＣへの変異、又は３９８位のアミノ酸のＣへの変異及び４０８位のアミノ酸のＣへの変異、又は３９８位のアミノ酸のＣへの変異及び４０５位のアミノ酸のＣへの変異を含み、第１の単量体の３９６位のシステインと第２の単量体の４０８位のシステインとの間、又は第１の単量体の３９７位のシステインと第２の単量体の４０８位のシステインとの間、又は第１の単量体の３９８位のシステインと第２の単量体の４０８位のシステインとの間、又は第１の単量体の３９８位のシステインと第２の単量体の４０５位のシステインとの間に単量体間システイン架橋を形成する。いくつかの実施形態では、４０５位又は４０８位のアミノ酸は異種三量体化配列内にあることに留意されたい。
好ましい実施形態では、ポリペプチドは、３９８位のシステインと４０８位のシステインとを含み、第１の単量体の３９８位のシステインと第２の単量体の４０８位のアミノ酸との間に単量体間システイン架橋を形成する。
本発明はさらに、本発明のインフルエンザＨＡステムポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。当業者には理解されるが、遺伝暗号の縮重の結果として、多数の異なる核酸分子が同じポリペプチドをコードし得る。また以下も当然のことながら、当業者は常用技術を使用して、記載されているポリヌクレオチドにコードされているポリペプチド配列に影響を及ぼさないヌクレオチド置換を行って、ポリペプチドを発現させようとする任意の特定の宿主生物のコドン使用を反映させることができる。したがって、別段の記載がない限り、「アミノ酸配列をコードする核酸分子」には、互いの縮重型であり、同じアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列が含まれる。
特定の実施形態では、インフルエンザＨＡステムポリペプチドをコードする核酸分子は、ヒト細胞などの哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化されている。コドン最適化の方法は既知であり、既に説明されている（例えば、国際公開第９６／０９３７８号パンフレット）。
特定の実施形態では、インフルエンザＨＡステムポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号２０８及び配列番号２０９から選択される核酸配列を含む。
インフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチドは、当業者に好適であると考えられる任意の手法、例えば下記の手法により調製することができる。したがって、本発明のポリペプチドは、当該技術分野において知られる標準的方法によりＤＮＡ配列として合成し、当該技術分野において知られる好適な制限酵素及び方法を使用して、インビトロ又はインビボで、クローニングし、続いて発現させることができる。
本発明はさらに、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子を含むベクターに関する。特定の実施形態では、本発明による核酸分子はしたがって、ベクター、例えば、プラスミドの一部である。このようなベクターは、当業者によく知られた方法により容易に操作することができ、例えば、原核細胞及び／又は真核細胞において複製できるように設計することができる。使用されるベクターは、ＤＮＡのクローニングに好適であり、且つ目的の核酸の転写に使用することができるものであればいかなるベクターでもよい。宿主細胞が使用される場合、ベクターは組込みベクターであることが好ましい。或いは、ベクターは、エピソーム複製ベクターであり得る。当業者は、好適な発現ベクターを選択し、本発明の核酸配列を機能的に挿入することができる。ポリペプチドをコードする核酸配列の発現を得るため、発現を駆動し得る配列を、ポリペプチドをコードする核酸配列に機能的に結合させ、タンパク質又はポリペプチドを発現可能なフォーマットでコードする組換え核酸分子をもたらすことができることは当業者によく知られている。発現を駆動する配列には、プロモーター、エンハンサーなど、及びそれらの組合せが含まれ得る。これらは、宿主細胞中で機能し、それによりそれらに機能的に結合している核酸配列の発現を駆動することができなければならない。当業者は、様々なプロモーターが宿主細胞中での遺伝子の発現を得るために使用され得ることを認識している。プロモーターは、構成的又は調節的であり得、様々な供給源（例えば、ウイルス、原核生物、若しくは真核生物の供給源）から入手するか、又は人為的に設計することができる。目的の核酸の発現は、天然プロモーター若しくはその誘導体から、又は完全に異種のプロモーター（Ｋａｕｆｍａｎ，２０００）からのものであり得る。一部のよく知られ、真核細胞中での発現によく使用されるプロモーターは、ウイルス、例えば、アデノウイルスに由来するプロモーター、例えば、Ｅ１Ａプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に由来するプロモーター、例えば、ＣＭＶ前初期（ＩＥ）プロモーター（本発明においては、ＣＭＶプロモーターと称する）（例えば、ｐｃＤＮＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから得られる）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）に由来するプロモーター（Ｄａｓ ｅｔ ａｌ，１９８５）などを含む。好適なプロモーターは、メタロチオネイン（ＭＴ）プロモーター、伸長因子１α（ＥＦ－１α）プロモーター（Ｇｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００１）、ユビキチンＣ又はＵＢ６プロモーター（Ｇｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００１）、アクチンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーターなど、真核細胞にも由来し得る。プロモーター機能及びプロモーターの強度についての試験は、当業者の定型事項であり、一般に、例えば、試験遺伝子、例えば、プロモーター配列後方のｌａｃＺ、ルシフェラーゼ、ＧＦＰなどのクローニング、及び試験遺伝子の発現試験を包含し得る。当然ながら、プロモーターは、その配列の欠失、付加、変異により改変し、機能性について試験して新たな、強度を弱めた、又は改善されたプロモーター配列を見出すことができる。本発明によれば、最適な真核細胞中で高い転写レベルを付与する強力なプロモーターが好ましい。
当業者によく知られた方法を使用して、コンストラクトを真核細胞（例えば、植物、真菌、酵母若しくは動物細胞）又はＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの好適な原核生物発現系にトランスフェクトすることができる。一部の例では、上述したように、好適な「タグ」配列（例えば、以下に限定されるものではないが、ｈｉｓタグ、ｍｙｃタグ、ｓｔｒｅｐタグ、ソルターゼ、ｃタグ若しくはｆｌａｇタグなど）又は完全タンパク質（例えば、以下に限定されるものではないが、マルトース結合タンパク質若しくはグルタチオンＳトランスフェラーゼなど）を本発明の配列に付加して、細胞又は上清からのポリペプチドの精製及び／又は同定を可能とすることができる。任意選択により、特異的タンパク質分解部位を含有する配列を含めて、後でタグをタンパク質分解消化により除去することができる。
好ましい実施形態では、ポリペプチドは、哺乳動物細胞において産生される。
精製ポリペプチドは、当該技術分野において知られる分光法（例えば、円偏光二色分光法、フーリエ変換赤外分光法、及びＮＭＲ分光法又はＸ線結晶分析法）により分析して、へリックス及びベータシートなどの所望の構造の存在を調べることができる。ＥＬＩＳＡ、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ、ラベルフリーバイオレイヤー干渉法（Ｏｃｔｅｔ）及びＦＡＣＳなどを使用して、ＣＲ８０２０及び／又はＣＲ９１１４などの広域中和抗体への本発明のポリペプチドの結合を調べることができる。したがって、正確な立体構造を有する本発明によるポリペプチドを選択することができる。三量体含量は、例えば、非還元条件下でのＳＤＳゲル電気泳動、ＣＲ８０２０及び／又はＣＲ９１１４などの広域中和抗体の抗体Ｆａｂフラグメントの存在下でのサイズ排除クロマトグラフィー、並びに異なる標識抗体を使用するＡｌｐｈａＬＩＳＡを使用して分析することができる。ポリペプチドの安定性は、温度ストレス、凍結融解サイクル、タンパク質濃度の増大、又は撹拌の後に、上記のように評価することができる。さらに、ポリペプチドの融解温度は、示差走査蛍光測定（ＤＳＦ）及び／又は示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって評価することができる。
特定の実施形態では、核酸は、ワクチン成分として使用され得る組換えベクターに挿入される。好ましくは、組換えベクターはヒトアデノウイルス、例えば血清型２６のヒトアデノウイルス（Ａｄ２６）である。したがって、本発明はまた、本発明によるＨＡステムポリペプチドをコードする核酸分子を含む組換えアデノウイルスベクターを提供する。好ましい実施形態では、ステムポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号２０８及び配列番号２０９からなる群から選択される核酸配列を含む。
組換えアデノウイルスベクターの調製は、当該技術分野においてよく知られている。アデノウイルスに対する用語「組換え」は、本明細書で使用される場合、人為的に改変されていることを意味し、例えば、その中に能動的にクローン化された改変末端を有し、及び／又は、異種遺伝子を含み、すなわち、天然に存在する野生型アデノウイルスではない。特定の実施形態では、本発明によるアデノウイルスベクターは、ウイルス複製に必要なアデノウイルスゲノムのＥ１領域、例えば、Ｅ１ａ領域及び／又はＥ１ｂ領域の少なくとも１つの必須遺伝子機能が欠損している。特定の実施形態では、本発明によるアデノウイルスベクターは、非必須Ｅ３領域の少なくとも一部が欠損している。特定の実施形態では、ベクターは、Ｅ１領域の少なくとも１つの必須遺伝子機能と、非必須Ｅ３領域の少なくとも一部とが欠損している。アデノウイルスベクターは、「多重欠損」であり得、これは、アデノウイルスベクターが、アデノウイルスゲノムの２つ以上の領域のそれぞれに１つ又は複数の必須遺伝子機能が欠損していることを意味する。例えば、前述のＥｌ欠損又はＥ１、Ｅ３欠損のアデノウイルスベクターは、Ｅ４領域の少なくとも１つの必須遺伝子及び／又はＥ２領域（例えば、Ｅ２Ａ領域及び／又はＥ２Ｂ領域）の少なくとも１つの必須遺伝子がさらに欠損していることがある。アデノウイルスベクター、その構築方法及びその増殖方法は、当該技術分野でよく知られており、例えば、米国特許第５，５５９，０９９号明細書、同第５，８３７，５１１号明細書、同第５，８４６，７８２号明細書、同第５，８５１，８０６号明細書、同第５，９９４，１０６号明細書、同第５，９９４，１２８号明細書、同第５，９６５，５４１号明細書、同第５，９８１，２２５号明細書、同第６，０４０，１７４号明細書、同第６，０２０，１９１号明細書、及び同第６，１１３，９１３号明細書に記載されている。
特定の実施形態では、アデノウイルスは血清型２６又は３５のヒトアデノウイルスである。
本発明はさらに、本発明によるポリペプチド、核酸、及び／又はベクター、並びに薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。本発明は特に、治療有効量の本発明のポリペプチド、核酸、及び／又はベクターを含む医薬組成物に関する。本医薬組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。本文脈において、用語「薬学的に許容される」は、担体が用いられる投与量及び濃度において、それらが投与される対象中で所望しない効果も有害効果も引き起こさないことを意味する。そのような医薬的に許容される担体又は賦形剤は当該技術分野でよく知られている（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ－２２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｏｙｄ Ｖ．Ｅｄ．Ａｌｌｅｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ［２０１３］；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓ．Ｆｒｏｋｊａｅｒ ａｎｄ Ｌ．Ｈｏｖｇａａｒｄ，Ｅｄｓ，Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ［２０００］；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，Ｌｉｎｄａ Ｆｅｌｔｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ［２０１３］，ａｎｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｋｉｂｂｅ，Ｅｄ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ［２０００］を参照されたい）。「担体」という用語は、希釈剤、賦形剤、又はビヒクルを指し、それらと一緒に、ポリペプチド、核酸、及び／又はベクターが投与される。生理食塩水並びに水性デキストロース溶液及びグリセロール溶液は、例えば、特に注射液用の液体担体として使用することができる。
本発明のポリペプチド又は核酸分子はまた、例えばポリマー、リポソーム、ビロソーム、ウイルス様粒子などのナノ粒子と組み合わせて、又はそれにコンジュゲートさせて投与することができる。ポリペプチド又は核酸分子は、ナノ粒子と組み合わせる、ナノ粒子でカプシド化させる、又はナノ粒子にコンジュゲートさせる（例えば、共有結合又は吸着させる）ことができる。
本発明はさらに、薬剤として使用するための、本明細書に記載のポリペプチド、核酸、及び／又はベクターに関する。
本発明は特に、インフルエンザウイルスに、特にグループ２インフルエンザウイルスに対する免疫応答の誘導に使用するための、本明細書に記載のポリペプチド、核酸、及び／又はベクターに関する。
本発明はまた、それを必要とする対象にインフルエンザＡ型ウイルスに対する免疫応答を誘導する方法であって、本明細書に記載されるポリペプチド、核酸分子及び／又はベクターの治療有効量を前記対象に投与することを含む。本発明による対象は、好ましくは、インフルエンザウイルスに感染し得、又はさもなければ免疫応答の誘導から利益を受け得る哺乳動物であり、そのような対象は、例えば、げっ歯類、例えば、マウス、フェレット、又は家庭若しくは農場動物、又は非ヒト霊長類、又はヒトである。好ましくは、対象は、ヒト対象である。
特定の実施形態では、本発明は、グループ２インフルエンザＡウイルスに対する免疫応答を誘導する方法を提供する。免疫応答には、体液性（すなわち、インフルエンザウイルス中和抗体の誘導）及び／又は細胞性免疫応答が含まれ得る。特定の実施形態では、本発明は、グループ２インフルエンザウイルスの少なくとも１、２、３、４、５又は６つの亜型に対する免疫応答を誘導する方法を提供する。特定の実施形態では、本発明は、Ｈ３亜型のＨＡを含むインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導する方法を提供する。
特定の実施形態では、誘導される免疫応答は、Ｈ３亜型のＨＡを含むインフルエンザＡウイルス、及び／又はＨ７亜型のＨＡを含むインフルエンザＡウイルスなどの、グループ２インフルエンザＡウイルスによって引き起こされるインフルエンザウイルス感染を予防に有効である。特定の実施形態では、誘導される免疫応答は、Ｈ３亜型のＨＡを含むインフルエンザＡウイルスにより引き起こされるインフルエンザウイルス感染の予防に有効である。特定の実施形態では、誘導される免疫応答は、Ｈ３及びＨ７亜型のＨＡを含むインフルエンザＡウイルスにより引き起こされるインフルエンザウイルス感染の予防に有効である。
本発明はさらに、インフルエンザワクチンとしての使用、特にグループ２インフルエンザウイルス株によって引き起こされるインフルエンザに対するワクチンとしての使用のための、本明細書中に記載されるポリペプチド、核酸、及び／又はベクターに関する。
特定の実施形態では、本発明のポリペプチド、核酸分子及び／又はベクターは、アジュバントと組み合わせて投与される。本発明のポリペプチド、核酸分子及び／又はベクターの投与前、投与と同時に、又は投与後に、アジュバントを投与することができる。好適なアジュバントの例としては、アルミニウム塩、例えば、水酸化アルミニウム及び／又はリン酸アルミニウム；油－エマルション組成物（又は水中油型組成物）、例として、スクアレン－水エマルション、例えば、ＭＦ５９（例えば、国際公開第９０／１４８３７号パンフレットを参照）；サポニン配合物、例えば、ＱＳ２１及び免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）など（例えば、米国特許第５，０５７，５４０号明細書、国際公開第９０／０３１８４号パンフレット、国際公開第９６／１１７１１号パンフレット、国際公開第２００４／００４７６２号パンフレット、国際公開第２００５／００２６２０号パンフレットを参照）；細菌又は微生物誘導体（その例は、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、３－Ｏ－脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）（任意選択により、リポソーム中に配合）、ＣｐＧモチーフ含有オリゴヌクレオチド、ＡＤＰリボシル化細菌毒素又はその変異体、例えば、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）熱不安定エンテロトキシンＬＴ、コレラ毒素ＣＴ、百日咳毒素ＰＴ、又は破傷風トキソイドＴＴである）、Ｍａｔｒｉｘ Ｍ、又はこれらの組合せが挙げられる。さらに、既知の免疫増強技術、例えば、免疫応答を増強することが当該技術分野において知られているタンパク質（例えば、破傷風トキソイド、ＣＲＭ１９７、ｒＣＴＢ、又は細菌のフラジェリンなど）への本発明のポリペプチドの融合、若しくはビロソーム中へのポリペプチドの包含、又はこれらの組合せを使用することができる。
本発明によるポリペプチド、核酸分子、及び／又はベクターの投与は、標準的な投与経路を使用して実施することができる。非限定的な例として、非経口投与、例えば、静脈内、皮内、経皮、筋肉内、皮下など、又は粘膜投与、例えば、鼻腔内、経口などが挙げられる。当業者であれば、本発明によるポリペプチド、核酸分子、及び／又はベクターを投与して免疫応答を誘導する種々の可能性を決定することができよう。
特定の実施形態では、ポリペプチド、核酸分子、及び／又はベクターは、２回以上、すなわち、いわゆる同種プライムブーストレジメンで投与される。２回目の投与は、例えば、本発明のポリペプチド、核酸分子、及び／又はベクターの１回目の投与の１週間後、１回目の投与の２週間後、１回目の投与の３週間後、１回目の投与の１か月後、１回目の投与の６週間後、１回目の投与の２か月後、１回目の投与の３か月、又は１回目の投与の４か月若しくはそれ以上など、１回目の投与の数年後まで行うことができる。ポリペプチド、核酸分子、及び／又はベクターを、第１のプライム投与後に２回以上のブースト投与が続くように、３回以上（例えば、３回、４回など）投与することも可能である。
ポリペプチド、核酸分子、及び／又はベクターは、プライム又はブーストとして、異種プライムブーストレジメンで投与することもできる。
本発明は、インフルエンザウイルス疾患の予防を、それを必要とする対象において行う方法であって、前記対象に、本明細書に記載のＨＡポリペプチド、免疫原性断片、核酸分子及び／又はベクターの治療有効量を投与することを含む方法をさらに提供する。治療有効量は、インフルエンザによる感染から生じる疾患又は病態を予防、寛解、及び／又は治療するのに有効なポリペプチド、核酸分子、又はベクターの量を指す。予防には、インフルエンザウイルスの拡散の阻害若しくは低減、又はインフルエンザウイルスによる感染に伴う症状の１つ以上の発症、発現若しくは進行の阻害若しくは低減が包含される。寛解は、本明細書で使用される場合、目に見えるか若しくは知覚できる疾患の症状、ウイルス血症、又はインフルエンザ感染の任意の他の計測可能な徴候の低減を指し得る。
治療を必要とする対象には、インフルエンザウイルスの感染から生じる病態に既に苦しんでいる対象、及びインフルエンザウイルスの感染が予防されるべき対象が含まれる。したがって、本発明のポリペプチド、核酸及び／又はベクターは、未投薬の対象、すなわち、インフルエンザウイルス感染により引き起こされる疾患を有さない、若しくはインフルエンザウイルス感染により感染されたことがなく、現在も感染されていない対象、又はインフルエンザウイルスに既に感染している対象に投与することができる。
一実施形態では、予防は、インフルエンザウイルス感染を受けやすい患者群において標的化することができる。そのような患者群には、以下に限定されないが、例えば、高齢者（例えば≧５０歳、≧６０歳、好ましくは≧６５歳）、低年齢者（例えば≦５歳、≦１歳）、入院患者、免疫不全の対象、及び抗ウイルス性化合物で処置を受けたが、十分な抗ウイルス応答を示していない患者が含まれる。
本発明のポリペプチド、核酸分子、及び／又はベクターは、代替インフルエンザワクチン、モノクローナル抗体、抗ウイルス剤、抗菌剤、及び／又は免疫調節剤などの１種以上の他の活性剤と組み合わせて対象に投与し得る。１つ以上の他の活性剤は、インフルエンザウイルス疾患の治療及び／又は予防に有益であり得、又はインフルエンザウイルス疾患に伴う症状又は病態を改善し得る。一部の実施形態では、１つ又は複数の他の活性剤は、鎮痛剤、抗発熱薬、又は呼吸を緩和若しくは補助する治療物である。
以下の実施例及び図面において本発明をさらに説明する。実施例は、決して本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１：ＨＡステムベースのポリペプチド－本発明の好ましいポリペプチド、ＵＦＶ１８００８８、ＵＦＶ１８００８９及びＵＦＶ１８００９０の構造及び設計要素
Ｈ３インフルエンザウイルス Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１／６８由来の切断されていないインフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ０）のステム（又は茎）を表すポリペプチドＵＦＶ１８００８８を、ＨＡ１由来の頭部ドメイン、特に４７位から３０６位のアミノ酸までのアミノ酸を含む領域（の少なくとも一部）を欠失させることによって作製した（図１Ａ及び１Ｂ）。本発明のアミノ酸位置の番号付けについては、Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（前出）によるＨ３番号付けが使用されることに留意されたい。Ａヘリックス、Ｂループ、並びにＣ、Ｄ及びＥヘリックスを含む本発明のポリペプチド（ｍｉｎｉ－ＨＡ）の主要な構造要素を図１Ｃに示す。
可溶性エクトドメインとして発現される場合、本発明のポリペプチドは、最後のヘリックス（４９９位で終わる）の後にＣ末端でトランケートされる。ＵＦＶ１８００８８は５０６位で切断された。すなわち、５０６位のアミノ酸から始まるＨＡ配列のＣ末端部分が欠失された。
本発明のポリペプチド、ＵＦＶ１８００８８は、この実施例に記載されるように、３２９位の天然の一塩基性切断部位アミノ酸アルギニン（Ｒ）（すなわち、ＨＡ１ドメインのＣ末端アミノ酸、図１を参照と）の、例えばグルタミン（Ｑ）への変異により、プロテアーゼ切断に対し耐性とされた。天然の完全長ＨＡとは対照的に、変異Ｒ３２９Ｑを含む本発明のポリペプチドは、もはや切断することができず、タンパク質の内部に疎水性融合ペプチドを埋め込む関連する構造変化を受けることができない。
頭部ドメインの除去は、曝露される水性溶媒から既に遮蔽された分子の一部を残す。この理由により、Ｂループ中のいくつかのアミノ酸残基、すなわちアミノ酸３８５～４０４を含む領域（図１Ｃ）を、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１／１９６８由来の親野生型完全長ＨＡと比較して変異させて、ステムポリペプチドを安定化させた。特に、３８８位のアミノ酸をＭに変異させ、３９２位のアミノ酸をＳに変異させた。
さらに、Ｂループのヘリックス傾向を減少させるために、プロリンを、特に３９９位のプロリンを導入した。最後に、Ｂループ内の潜在的なネオエピトープを遮蔽するために、１つ又は２つのＮ結合型グリコシル化モチーフ（すなわち、ＮｘＴ）をＢループに、特に、３９３位のＮ結合型グリコシル化のために３９３～３９５位にグリコシル化モチーフを、４０１位のＮ結合型グリコシル化のために４０１～４０３位にグリコシル化モチーフを導入した。
さらに、可溶性ＨＡステム由来ポリペプチドの安定な三量体化を促進するために、ＧＣＮ４由来三量体化ドメイン配列４０５ＰＭＫＣＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫ４１９（配列番号１２）をＨＡ２ドメイン、特にＣヘリックスに導入し、元の（すなわち、野生型の）アミノ酸配列の４０５位のアミノ酸から４１９位のアミノ酸までを置換した。
さらに、システイン（まだ存在していない場合）を３９８位及び４０８位に導入して（なお、４０８位は導入されたＧＣＮ４配列中に位置する）、第１の単量体の３９８位のシステインと隣接する単量体の４０８位のシステインとの間にプロトマー間ジスルフィド架橋を形成し、単量体を三量体ステムポリペプチドに共有結合させた。
ポリペプチドＵＦＶ１８００８８の発現をさらに安定化及び増加させるために、また野生型完全長ＨＡのステムに類似する正確なフォールディングを確実にするために、さらなる変異をポリペプチドに、特に３１位（Ｄ３１Ｅ）、３４位（Ｉ３４Ｖ）、３１０位（Ｋ３１０Ｃ）、３５５位（Ｈ３５５Ｗ）、３７８位（Ｎ３７８Ｔ）、３７９位（３７９Ｎ）、３８０位（Ｋ３８０Ｉ）、３８１位（Ｌ３８１Ｖ）、４２２位（Ｓ４２２Ｃ）、４３２位（Ｅ４３２Ｉ）、４３５位（Ｈ４３５Ｒ）、及び４３９位（Ｌ４３９Ｙ）に導入した（図１Ｄ）。
ポリペプチドＵＦＶ１８００８８のバリアント、すなわちＵＦＶ１８００８９及びＵＦＶ１８００９０を調製した。これらのポリペプチドは、ＵＦＶ１８００８８と比較してさらなる突然変異を含んだ。したがって、ＵＦＶ１８００８９は、追加の変異（ＵＦＶ１８００８８と比較して）Ｌ３６７Ｙ、Ｎ４７５Ｄ、Ａ４７６Ｄ及びＥ４７９Ａを含んだ。ＵＦＶ１８００９０は、追加の（ＵＦＶ １８００８８と比較して）変異Ｌ２５Ｋ、Ｌ３６７Ｙ、Ａ４７６Ｄ及びＥ４７９Ａを含み、変異Ｇ３７９Ｎ及びＬ３８１Ｖは含まなかった。
実施例２：本発明の三量体ポリペプチドの発現、精製及びインビトロでの特性評価
哺乳動物細胞におけるタンパク質の発現
本発明のポリペプチドＵＦＶ１８００８８、ＵＦＶ１８００８９及びＵＦＶ１８００９０（実施例１に記載）をコードするＤＮＡ断片を合成し（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）、ｐｃＤＮＡ２００４発現ベクター（社内で改変した強化ＣＭＶプロモーターを有するｐｃＤＮＡ３プラスミド）にクローニングした。ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭトランスフェクション試薬（Ｇｉｂｃｏ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を製造業者のプロトコールに従って使用し、それぞれの工業グレードＤＮＡを一過性にトランスフェクトすることによって、ポリペプチドをＥｘｐｉＣＨＯ懸濁細胞中で製造し、ＥｘｐｉＣＨＯＴＭ発現培地中で培養した。製造業者のプロトコールに従って、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ＣＨＯエンハンサー及びＥｘｐｉＣＨＯフィード（Ｇｉｂｃｏ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をトランスフェクションの１日後に細胞培養物に加えた。分泌されたポリペプチドを含有する培養上清を、７日目～１１日目の間に回収し、遠心分離によって清澄化し、続いて０．２μｍボトルトップフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ）で濾過した。
タンパク質精製
ポリペプチドを２段階プロトコールによって精製した。最初に、回収し清澄化した培養上清を、アガロースをベースとしたビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に固定化したＣタグ特異的単一ドメイン抗体からなるアフィニティーレジン（Ｃａｐｔｕｒｅ Ｓｅｌｅｃｔ）を充填したＨｉＳｃａｌｅ １６／２０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。このレジンは、Ｃタグ、すなわちポリペプチドのＣ末端に融合した４残基酸ペプチド（Ｅ－Ｐ－Ｅ－Ａ（配列番号２５））に非常に特異的である。回収された培養上清中の適用ポリペプチドの量を、精製前にＯＣＴＥＴによって決定した（培養上清及び精製タンパク質分析の項を参照）。Ｃタグ化タンパク質の溶出を、２Ｍ ＭｇＣｌ２を含有するトリス緩衝液を用いて行った。ＵＶシグナル（Ａ２８０）に基づいて、溶出画分をプールし、Ｍｉｌｌｅｘ－ＧＶ ０．２２μｍフィルター膜（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により濾過した。続いて、収集した溶出ピークを、泳動用緩衝液（２０ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．８）中で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇ ２６／６０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用して、潜在的な多量体及び／又は単量体タンパク質不純物を除去した。三量体画分をプールし、純度を分析ＳＥＣ－ＭＡＬＳによって評価した。
培養上清及び精製タンパク質分析
上記のように、回収した培養上清中の発現ステムポリペプチドのレベルを、ＯＣＴＥＴプラットフォーム（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用するバイオレイヤー干渉法によって精製前に評価した。要するに、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔＴＭビオチン抗Ｃタグ結合体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をストレプトアビジン（ＳＡ）バイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）に固定し、その後、精製相同ポリペプチドの明確な参照バッチの希釈系列の結合シフトを評価することによって標準曲線を確立した。続いて、本発明のポリペプチドを含む、予め希釈した回収培養上清（動力学緩衝液（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）で１０倍及び３０倍希釈）の結合シフトを測定し、確立した標準曲線を使用して、ポリペプチドの濃度を計算した。
培養上清中のポリペプチド及び精製ポリペプチドの三量体含量を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）Ｉｎｆｉｎｉｔｙ １２６０シリーズセットアップ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用するサイズ排除クロマトグラフィー多角光散乱（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）分析によって評価した。精製された各ポリペプチドの４０μｇをＴＳＫゲル Ｇ３０００ＳＷｘｌカラム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）に流し（１ｍＬ／分）、溶出した物質のモル質量を、ｍｉｎｉＤＡＷＮ Ｔｒｅｏｓ多角度光散乱検出器及びＯｐｔｉｌａｂ Ｔ－ｒＥｘ示差屈折率検出器（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）によって、溶出した物質のモル質量を測定した。データをＡｓｔｒａ６ソフトウェアパッケージ（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で解析し、分子量計算は屈折率シグナルから導いた。
本発明の精製ポリペプチドの正しいフォールディングを、ＥＬＩＳＡ（抗体結合のＥＣ５０値）によって評価した。この目的のために、ステムポリペプチドを１０ｎＭの濃度でコーティングし、７０ｎＭを出発濃度として使用して、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＣＲ９１１４（国際公開２０１３／００７７７０号パンフレットに記載）の希釈系列と共にインキュベートした。抗体結合を、二次抗ヒトＦｃ ＨＲＰ抗体（マウス抗ヒトＩｇＧ、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）と共にインキュベートすることによって決定し、ＰＯＤ基質を添加して可視化した。ＥｎＳｉｇｈｔ（商標）マルチモードプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して読み出しを行った。ＥＣ５０値を、Ｓｐｏｔｆｉｒｅスイート（Ｔｉｂｃｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）を用いて計算した。
精製したポリペプチドの熱安定性を、示差走査型蛍光測定（ＤＳＦ）により、６μｇポリペプチド溶液に添加したＳｙｐｒｏ Ｏｒａｎｇｅ Ｄｙｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の蛍光発光をモニターすることによって判定した。温度を２５℃から９５℃まで徐々に（６０℃／時）上昇させると、ポリペプチドがアンフォールドし、露出した疎水性残基に蛍光色素が結合し、発光に特性変化が生じる。ＶｉｉＡ７リアルタイムＰＣＲ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）を使用して融解曲線を測定し、Ｓｐｏｔｆｉｒｅスイート（Ｔｉｂｃｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）によってＴｍ５０値を計算した。Ｔｍ５０値はタンパク質の５０％がアンフォールドされる温度を表し、したがって、ポリペプチドの温度安定性の尺度となる。
結果及び結論
ポリペプチドの発現レベル及び三量体含量を、トランスフェクション後９日目に、２つの独立した７０ｍＬ ＥｘｐｉＣＨＯトランスフェクションにおいて決定した（図２Ａ）。全てのポリペプチドは良好に発現した。Ｈ３Ｎ２ Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１／６８由来のポリペプチドＵＦＶ１８００８８は、約７００ｍｇ／Ｌ培養上清のレベルで発現した。ポリペプチドＵＦＶ１８００８８に設計が類似し、表面アミノ酸におけるさらなる改変（すなわち、Ｈ７ ＨＡにより密接に類似するように表面を変化させる） Ｌ３６７Ｙ、Ｎ４７５Ｄ、Ａ４７６Ｄ及びＥ４７９Ａ、並びに改変Ｌ２５Ｋ、Ｌ３６７Ｙ、Ｎ３７９Ｇ、Ｖ３８１Ｌ、Ａ４７６Ｄ及びＥ４７９Ａを含むポリペプチドＵＦＶ１８００８９及びＵＦＶ１８００９０はそれぞれ約５００ｍｇ／Ｌ及び約３５０ｍｇ／Ｌのレベルで発現した。
分析ＳＥＣによる粗細胞培養上清の分析（図２Ｂ、左パネル）は、明確な可溶性三量体ポリペプチド集団の存在を示した（約８．３分の保持時間）。同様の分析はまた、２段階精製プロトコールにより非常に純粋な三量体ポリペプチドが得られることを示した（図２Ｂ、右パネル）。さらに、三量体ポリペプチドは正しく折り畳まれ、広域中和モノクローナル抗体ＣＲ９１１４のエピトープを示した。これは、１ｎＭ未満のＥＣ５０値を有する強力なＣＲ９１１４結合を示すＥＬＩＳＡ分析によって明らかである（図２Ｃ）。さらに、ポリペプチドの５０％がアンフォールドする温度をＤＳＦによって決定した。全てのポリペプチドは温度安定性であり、ＵＦＶ１８００８８、ＵＦＶ１８００８９及びＵＦＶ１８００９０についてそれぞれ６６．６℃、６４．６℃及び６０．９℃のＴｍ５０値を示した（図２Ｄ）。
結論として、本実施例に記載の本発明のポリペプチドは、十分に発現され、適切に折り畳まれた三量体ポリペプチドとして細胞培養上清から精製された。
実施例３：本発明のポリペプチドにおける単一点変異の特性評価（ＳＥＣプロファイル）
設計
本発明の三量体ポリペプチド（図１に概略的に示す）に導入された変異の寄与を評価するために、アミノ酸を、ポリペプチドＵＦＶ１８０１４１（ＵＦＶ１８００８８の全ての特徴を含む、すなわち、４７位のアミノ酸から３０６位のアミノ酸までのヘッド領域の欠失（すなわち、欠失４７～３０６）、ＨＡ２ドメインの４０５～４１９位における三量体化領域の導入（なお、導入されたＧＣＮ４配列はＵＦＶ１８００８８と比較してわずかに異なる：すなわち４０５ＲＭＫＣＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫ４１９（配列番号１１）、４２２位に対応する位置のシステインと組み合わせて３１０位に対応するアミノ酸位置にシステインを含み（プロトマー内ジスルフィド架橋を形成する）、３２９位にＱを含み（プロテアーゼ切断耐性）、３５５位のアミノ酸はＷであり；３７８位のアミノ酸はＴであり、３７９位のアミノ酸はＮであり、３８１位のアミノ酸はＶであり；４０１～４０３位にグリカンモチーフを含み）、４０８位に対応する位置（ＧＣＮ４配列中）のシステインと組み合わせて３９８位に対応する位置にシステインを含んでプロトマー間ジスルフィド架橋を形成し、３８８位にＭ、３１位にＥ及び３４位にＶを含み、３８０位及び４３２位にＩ、３９２位にＳ、３９５位にＴ、３９９位にＳ、及び４３５位にＮ、及び４３９位にＹを含む）から、骨格株Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１／１９６８（表１、図３Ａ）中の元のアミノ酸へ復帰変異させた。ＵＦＶ１８００８８と同様に、ポリペプチドＵＦＶ１８０１４１は、５０６位のアミノ酸の後がトランケートされた。しかし、ＵＦＶ１８０１４１は、３９３～３９５位に追加のグリコシル化モチーフ、４０５位にＢループ安定化プロリンを含まず、３９９Ｐの代わりに３９９Ｓを有する。さらに、ＵＦＶ１８００８８はＣ末端タグＥＰＥＡ（配列番号２５）を含み、一方、ＵＦＶ１８０１４１は、異なるＣ末端タグを含んだ。
例外はＣ４０８Ｑ変異であり、これは野生型Ｈ３に戻る変異ではなく、導入されたＧＣＮ４三量体化ドメイン配列（４０５～４１９位に導入）へ復帰変異された。特定の変異の欠如の影響を分析ＳＥＣによって評価した。
選択された変異の有益な効果を評価するための別の方法は、以下の特徴を含む、最小設計ポリペプチド、すなわちＵＦＶ１８０６４７へのそれら変異の段階的導入である：４７位のアミノ酸から３０６位のアミノ酸までのヘッド領域の欠失（すなわち、欠失４７～３０６）、ＨＡ２ドメインの三量体化ドメインの導入、すなわち、４０５～４１９位における４０５ＲＭＫＣＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫ４１９（配列番号：１１）の導入；４２２位に対応する位置のシステインと組み合わせて３１０位に対応する位置のシステイン（プロトマー内ジスルフィド架橋を形成する）、３２９位にＱ（プロテアーゼ切断抵抗性）を含み、３５５位のアミノ酸はＷであり；３７８位のアミノ酸はＴであり、３７９位のアミノ酸はＮであり、３８１位のアミノ酸はＶであり；４０１～４０３位にグリカンモチーフを含み、４０８位に対応する位置のシステインと組み合わせて３９８位に対応する位置にシステインを含み（プロトマー間ジスルフィド架橋を形成する）、３８８位にＭを含む。変異を付加した構築物を分析ＳＥＣにより分析し、最小設計ポリペプチドと比較した（表２、図３Ｃ）。
Figure 2022547107000003
Figure 2022547107000004
哺乳動物Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞におけるタンパク質の発現
表１及び表２に列挙したポリペプチドをコードするＤＮＡ断片を、実施例２に記載のように合成した。スクリーニング目的及び精製のためのＣ末端ＦＬＡＧリンカー－Ｈｉｓタグを含むポリペプチドを、真核懸濁細胞株Ｅｘｐｉ２９３Ｆにおいてマイクロスケール（２００μＬ）で産生した。要するに、９６ハーフディープウェルプレート（Ｓｙｓｔｅｍ Ｄｕｅｔｚ）中で、細胞密度２．５Ｅ＋０６ｖｃ／ｍＬにて、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ２９３トランスフェクションキット（Ｇｉｂｃｏ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、細胞に工業グレードＤＮＡを一過性にトランスフェクトし、Ｅｘｐｉ２９３発現培地（Ｇｉｂｃｏ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含有する振盪フラスコ中で、３７℃、２５０ｒｐｍ、８％ＣＯ２及び湿度７５％にてインキュベートした。分泌ポリペプチドを含有する細胞培養上清を３日目に回収し、遠心分離（１０分、４００×ｇ）により清澄化し、次いで濾過した（９６ウェルフィルタープレート、０．２２μｍ ＰＶＤＦ膜、Ｃｏｒｎｉｎｇ）。
培養上清の分析
Ｅｘｐｉ２９３細胞培養回収物中の本発明のポリペプチドの含量を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）Ｉｎｆｉｎｉｔｙ１２６０シリーズセットアップ（Ａｇｉｌｅｎｔ）における分析用ＳＥＣによって評価した。１００μＬの培養上清の注入容量をＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷｘｌカラム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）上に流し（１ｍＬ／分）、ＵＶ検出によって溶出をモニターした（図３Ａ）。或いは、試料を、ＢＥＨ ２００Ａカラム（Ｗａｔｅｒｓ、注入容量４０μＬ、流量０．３５ｍＬ／分）を備えたＶａｎｑｕｉｓｈシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用する超高速液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ）によって分析し、溶出画分を、Ｈｅｌｉｏｓ光散乱検出器（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、図３Ｃ）によってモニターした。ＳＥＣプロファイルを、Ａｓｔｒａ６ソフトウェアパッケージ（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）により分析した。ＳＥＣプロファイルの溶出時間及び三量体ピーク（高さ及び形状）を図３Ｂ及び図３Ｄに可視化する。
結果及び結論
例えば、ＵＦＶ１８０１９３（Ｗ３５５Ｈ復帰変異）、ＵＦＶ１８０１９４（ＧＣＮ４欠失）、ＵＦＶ１８０１９５（分子内ジスルフィド架橋の欠失）及びＵＦＶ１８０１９９（Ｉ４３２ｅ復帰変異）によって示される復帰変異のサブセットはステムポリペプチドの発現に有害のようであったが、他の復帰変異は許容された（図３Ａ及び３Ｂ）。
ＵＦＶ１８００８８に導入された安定化変異を欠くポリペプチド（表２）は、（ＵＦＶ１８００８８設計に向けて）本発明の変異を漸増的に付加すると、最小三量体ステムポリペプチドの発現レベルの有意な改善を示した。例えば、図３Ｃに示すように、ポリペプチドＵＦＶ１８０１０３４の三量体ピークは、変異Ｋ３８０Ｉ、Ｅ４３２Ｉの導入により、溶出時間がシフトし、高さが増加した（図３Ｄ）。Ｂループにおける安定化変異（ＵＦＶ１８１０４２：Ｆ３９２Ｓ、Ｈ３９３Ｎ、Ｉ３９５Ｔ、Ｆ３９９Ｐ、Ｒ４０５Ｐ）の漸増的付加は、三量体ポリペプチドの発現をさらに増加させた。
この実施例は少なくとも以下のアミノ酸位置（例えば、変異）：すなわち、３５５位におけるＷ（への変異）、及び／又は位置３７８におけるＴ（への変異）、３７９位におけるＮ（への変異）３８１位におけるＶ（への変異）、及び／又は４３２位におけるＩ（への変異）、若しくは４３２位及び３８０位におけるＩ（への変異）、並びに４０１位におけるＮ結合型グリコシル化のための４０１～４０３位におけるグリコシル化モチーフは、高レベルの所望の可溶性三量体ポリペプチドを得るために有益であることを示す。Ｂループに安定化変異（例えば、Ｆ３９２Ｓ、Ｈ３９３Ｎ、Ｉ３９５Ｔ、及びＦ３９９Ｐ）を加えると、三量体ポリペプチドの発現がさらに増加する。
実施例４：プロトマー間ジスルフィド架橋；本発明のポリペプチドの安定性
設計
本発明のポリペプチドにおいてプロトマー間ジスルフィド架橋を形成するＢループ及びＣヘリックスにおける導入システイン（図４に概略的に示す）の寄与を評価するために、システインを、それぞれの、骨格株Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１／１９６８（３９８位）に存在する野生型残基（グルタミン酸）と導入ＧＣＮ４三量体化ドメイン配列（４０５～４１９）に存在するグルタミン（残基４０８）に復帰変異させた。システイン及びその後のジスルフィド架橋を省いた影響を、分析ＳＥＣ、ＤＳＦ及びＳＤＳ－ＰＡＧＥによって評価した。
タンパク質の発現、精製及び特性評価
ポリペプチドＵＦＶ１８０１９２及びＵＦＶ１８０１４１をコードするＤＮＡ断片を、実施例３に記載のようにＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞においてマイクロスケールで、及び実施例２に記載のようにＥｘｐｉＣＨＯ細胞において中間スケールで産生した（約６０ｍＬ、８日目に回収）。培養上清を、実施例２におけるように、回収日に（マイクロスケール）、又は回収培養上清を４℃で１週間インキュベーションした後に（中間スケール）、分析ＳＥＣによって分析した。回収した培養上清（中間スケール）から、ｈｉｓタグポリペプチドを、ＡＫＴＡ Ａｖａｎｔ ２５システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて２段階プロトコールで精製した。第１段階で、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーを、プレパックのｃＯｍｐｌｅｔｅ Ｈｉｓタグ精製カラム（Ｒｏｃｈｅ）を使用して実行し、１ｍＭイミダゾールで洗浄し、３００ｍＭイミダゾールで溶離した。第２段階で、ＳＲＴ－１０Ｃ ＳＥＣ－３００カラム（Ｓｅｐａｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてサイズ排除クロマトグラフィーを実施し、三量体ピーク画分を回収した。精製タンパク質の熱安定性を、ＤＳＦによって測定し（実施例２のように）、タンパク質の純度を、Ｂｏｌｔシステムを使用し、製造者の使用説明書（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って、１０％ビス－トリスゲルを流すことによって、非還元条件下及び還元条件下で、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）によって評価した。
結果及び結論
分析ＳＥＣによる細胞培養上清の評価は、Ｂループ（３９８位）及びＣ－ヘリックス（４０８位）に導入システインを有するポリペプチド（ＵＦＶ１８０１４１）と有さないポリペプチド（ＵＦＶ１８０１９２）の両方がいずれも溶液中に三量体ポリペプチドを発現することを示した（図４Ａ；左パネル）。小規模でのトランスフェクションの３日後の回収日では、ポリペプチドＵＦＶ１８０１９２は、ペプチドＵＦＶ１８０１４１と比較してより豊富であった。それにもかかわらず、８日目、ＵＦＶ１８０１９２を含有する上清を４℃で１週間貯蔵した後のより高いスケールでの回収物には、第２の非三量体ピークが現れ（約８．５分の保持時間）、プロトマー間ジスルフィド架橋を欠く構築物の構造の不安定性を示した（図４Ａ；右パネル）。安定性の相異は、精製ポリペプチドのＤＳＦ評価によって確認された。プロトマー間ジスルフィド架橋を欠くポリペプチド（ＵＦＶ１８０１９２）は５０．８℃でアンフォールドし、一方、３９８位及び４０８位に導入システインを有するポリペプチドは、６７．７℃でアンフォールドした（図４Ｂ）。精製されたポリペプチドのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、３９８位及び４０８位にシステインを含まないポリペプチドは、予想通り、非還元条件下及び還元条件下の両方で約４０ｋＤａの単量体高さで泳動することを示した。対照的に、２つの導入システインを有するポリペプチドでは、共有結合三量体で予想されるように非還元条件下で約１２０ｋＤａ、及び還元条件下で約４０ｋＤａの予想される単量体高さで、主バンドが観察される（図４Ｃ）。
この実施例で示されたデータは、３９８位及び４０８位に２つのシステインを導入してプロトマー間ジスルフィド結合を形成することによる単量体の共有結合が、かなりのより安定した可溶性三量体ポリペプチドをもたらすことを実証する。
実施例５：３５５位、３８０位及び３４２位、４３５位並びに３８８位の代替的置換
設計
本発明のポリペプチドの最適化のために、３５５位（図５Ａ）、３８０位及び４３２位（図５Ｂ）、４３５位（図５Ｃ）、並びに３８８位（図５Ｄ）における代替的置換を試験した。ポリペプチドの発現及びフォールディングを、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞培養上清において評価した。
哺乳動物細胞におけるタンパク質の発現
ポリペプチドをコードするＤＮＡ断片を、実施例２に記載されるようにして合成した。スクリーニング目的のためのＣ末端ＦＬＡＧ－リンカー－Ｈｉｓタグを含むポリペプチドを、実施例２に記載のようにＥｘｐｉＣＨＯ真核細胞株において産生した図５ＣＩＩ及び図５Ｄに記載のポリペプチド（それぞれ、５０ｍＬ及び３０ｍＬの中間スケールで）を除いて、実施例３に記載のようにＥｘｐｉ２９３Ｆ真核細胞においてマイクロスケール（２００μＬ）で産生した。
培養上清の分析
本発明のポリペプチドの発現、フォールディング及び三量体含量を、増幅発光近接均質性アッセイ（ＡｌｐｈａＬＩＳＡ、図５Ａ、５Ｂ、５ＣＩ）により、製造者の使用説明書（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）に従って評価した。この溶解結合平衡アッセイは、ドナービーズ及びアクセプタービーズの両方のポリペプチドへの首尾よい結合に基づく。近接している場合、６８０ｎｍでのドナービーズのレーザー照射は一重項酸素の流れを生成し、近くのアクセプタービーズにおける化学的事象を誘発し、６１５ｎｍの化学発光を生じる。発現レベルは、ニッケルドナービーズ（抗Ｈｉｓタグ）及び抗ＦＬＡＧタグアクセプタービーズを細胞培養上清に同時に添加することによって、発現－ＡｌｐｈａＬＩＳＡセットアップにより測定した。この発現－ＡｌｐｈａＬＩＳＡセットアップは、ポリペプチドのフォールディングに関係なく、Ｃ末端Ｆｌａｇ－Ｌｉｎｋｅｒ－Ｈｉｓタグを認識する。ポリペプチドの正しいフォールディングは、ニッケルドナービーズ、ヒトＩｇＧ ＣＲ９１１４（２ｎＭ）又はＣＴ１４９（１ｎＭ）、及び抗ヒトＩｇＧアクセプタービーズを細胞培養上清に同時に添加することによって、結合－ＡｌｐｈａＬＩＳＡにおいて評価した。ポリペプチドが正しく折り畳まれ、インフルエンザウイルスＨＡ特異的ＩｇＧの結合が可能な場合にのみ、シグナルを得ることができる。
三量体－ＡｌｐｈａＬＩＳＡセットアップを使用して、培養上清中に存在する三量体ポリペプチドの含量を決定した。それは、単量体ＨＡに特異的に結合するＣＴ１４９又はＣＲ９１１４などのヒトＩｇＧに依存する。異なる標識がされたＩｇＧ ＣＴ１４９又はＣＲ９１１４の１：１混合物がＨＡに添加される場合、ＡｌｐｈａＬＩＳＡシグナルは、単一の抗体のみの結合を可能にする単量体ではなく、少なくとも２つの抗体の結合を可能にする多量体が存在する場合にのみ検出され得る。三量体－ＡｌｐｈａＬＩＳＡを、ビオチン化及びＤＩＧ標識ＣＴ１４９ ＩｇＧ又はＣＲ９１１４ ＩｇＧ（それぞれ０．５ｎＭ、１：１の比）の存在下で、ストレプトアビジンドナービーズ及び抗ＤＩＧ ＩｇＧアクセプタービーズを培養上清に同時に添加することによって三量体－ＡｌｐｈａＬＩＳＡを行った。
全てのＡｌｐｈａＬＩＳＡセットアップに対し、検出ビーズを１０μｇ／ｍＬの濃度で添加した。培養上清を、製造業者の使用説明書に従って、フック効果を回避するために、異なる希釈で試験した。暗所、室温での２時間のインキュベーション後に、ＥｎＳｉｇｈｔ（商標）マルチモードプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して読み出しを行った。全てのデータを、１００％に設定したそれぞれの参照構築物に対して正規化した。
細胞培養上清中の発現したポリペプチドのレベルを、ＯＣＴＥＴプラットフォームを製造業者の使用説明書（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）に従って用いて、バイオレイヤー干渉法により評価した。要するに、抗ＨＩＳ（ＨＩＳ２）バイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用して、明確な精製した均質なポリペプチドの参照バッチの希釈系列の結合シフトを測定することにより、標準曲線を確立した。続いて、本発明のポリペプチドを含有する、予め希釈した（動態緩衝液中、ＦｏｒｔｅＢｉｏ）細胞培養上清の結合シフトを測定し、確立した標準曲線を使用して、ポリペプチドの濃度を計算した（図５ＣＩＩ、５Ｄ）。培養回収物中の本発明のポリペプチドの含量を、実施例４に記載されるように、ＨＰＬＣ（図５ＣＩＩ）及びＵＨＰＬＣ（図５Ｄ、１０μＬの注入容量）における分析ＳＥＣによって評価した。選択したポリペプチドＵＦＶ１７１００４及びＵＦＶ１７１１９７を精製した後、モノクローナル抗体ＣＲ９１１４及びＣＴ１４９の結合をＥＬＩＳＡによって評価した。最後に、これらの精製ポリペプチドの熱安定性をＤＳＦによって決定した（いずれの方法も実施例２に記載されているように、図５ＣＩＩ）。
結果及び結論
ポリペプチドＵＦＶ１６１７３９中の３５５位にトリプトファン（Ｗ）を導入すると、３５５位に野生型ヒスチジンを有する構築物（ＵＦＶ１６１３３３）と比較して、発現、並びに抗体ＣＲ９１１４及びＣＴ１４９の結合が大きく増加した。３５５Ｗと４８２位のイソロイシン（Ｉ）の同時導入（ＵＦＶ１６１８００）は、単一の変異３５５Ｗのみを有する構築物と比較して、発現及び抗体結合をさらに増加させた。３５５位のフェニルアラニン（Ｆ）と４８２Ｉの同時導入は、十分に許容されたが、３５５位及び４８２位にそれぞれの野生型残基を有する対照構築物と比較して、発現及び抗体結合の増加は小さかった（図５Ａ）。
複数のアミノ酸残基及びそれらの組合せを、３８０位及び４３２位について評価した。全体として、試験したアミノ酸置換は、十分に許容され、発現レベル、三量体含量、及び抗体結合に対する影響は非常に小さかった（図５Ｂ）。ポリペプチド中の３８０位及び４３２位におけるイソロイシンの同時導入（ＵＦＶ１７１００４）は、参照と比較して最も高い三量体収率（２１５％）をもたらした。
４３５位では、４つの異なるアミノ酸置換（Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ）が十分に許容されることが示された。それぞれのポリペプチド及び４３５位に野生型のヒスチジンを含有する参照ポリペプチドＵＦＶ１７０６１１は、発現、三量体含量、並びにモノクローナル抗体ＣＲ９１１４及びＣＴ１４９の結合について同等のＡｌｐｈａＬＩＳＡレベルを示した（図５ＣＩ）。置換４３５Ｎ（ＵＦＶ１７１００４）及び４３５Ｒ（ＵＦＶ１７１１９７）を有するポリペプチドのさらなる特性評価により、これらの発現レベル（ＯＣＴＥＴ）、ＳＥＣプロファイル、並びにｍＡｂ ＣＲ９１１４及びＣＴ１４９（ＥＬＩＳＡ）の結合強度が類似していることが確認された。しかしながら、４３５位にアスパラギン（Ｎ）を有するポリペプチドは、この位置にアルギニン（Ｒ）置換を有するポリペプチドと比較して、約４℃高い熱安定性を示した（図５ＣＩＩ）。
Ａ－ヘリックスの上部に位置する３８８位にアミノ酸置換（Ｍ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｈ、Ｋ及びＲ）を有するポリペプチドを、発現レベル（Ｏｃｔｅｔ）及び三量体含量（分析ＳＥＣによる）について評価した。発現レベルを、４７５ｍｇ／Ｌのメチオニン置換（ＵＦＶ１８００８８）から１９２ｍｇ／Ｌの発現レベルのあまり好ましくないアルギニン置換までランク付けした。ＳＥＣプロファイルは全て三量体ポリペプチドを示し、３８８位の評価された残基が全て許容され、全体の構造に影響しないことを示した（図５Ｄ）。３８８位にアミノ酸置換を有するポリペプチドは全て、参照ポリペプチド（ＵＦＶ１８００８８）と比較して、Ｃ末端タグ（それぞれＦｌａｇ－リンカー－Ｈｉｓタグ及びＣ－タグ）の長さの差異のために、より短い保持時間で溶出した。
まとめると、本発明のポリペプチドの種々の最適化領域において単一の代替アミノ酸置換が可能であって、十分に許容され、発現レベル、三量体含量及びタンパク質フォールディングは、最小限の影響しか受けない。
実施例６：ＨＡ１ヘッド欠失の明確化
設計
本発明のステムポリペプチドは、好ましくは、４７位から３０６位のアミノ酸までの欠失を含む（図１に概略的に示す）。この実施例では、欠失後に生じるＨＡ１末端間のヘッドドメインに由来する代替の欠失及びリンカーを探索した（図６に概略的に示す）。まず、ＨＡ１上方鎖の代替欠失位置を評価した（表３）。参照設計（ＵＦＶ１６１９０８、４７位のアミノ酸から３０６位のアミノ酸までの欠失を有し、ＧＰＧＳリンカーで置換されている）に存在するＨＡ１末端を灰色で示す。
Figure 2022547107000005
第２に、ＨＡ１上方鎖の代替欠失位置とＨＡ１下方鎖の代替欠失位置を組み合わせた（表４）。
Figure 2022547107000006
第３に、ＨＡ１末端を連結するための、除去されたヘッドドメイン由来のアミノ酸配列を含む相同リンカーの使用を調べた（表５）。
Figure 2022547107000007
哺乳動物細胞におけるタンパク質の発現と培養上清の分析
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ断片を、実施例２に記載されているように合成した。スクリーニング目的のためのＣ末端ＦＬＡＧ－リンカー－Ｈｉｓタグを含むポリペプチドを、実施例３に記載されるように、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ真核細胞においてマイクロスケール（２００μＬ）で産生した。ポリペプチドの発現、三量体含量及びフォールディング（ＣＲ９１１４又はＣＴ１４９のｍＡｂ結合）を、実施例５に記載のようにＡｌｐｈａＬＩＳＡによって評価した。全てのデータを、１００％に設定したそれぞれの参照構築物ＵＦＶ１６１９０８（図６Ａ）、ＵＦＶ１６０６５３（図６Ｂ）及びＵＦＶ１６０３２１（図６Ｃ）に対して正規化した。
結果及び結論
ＨＡ１上方鎖におけるヘッドドメイン欠失位置の変化は、発現レベル、三量体収率及びタンパク質フォールディング（すなわち、抗体結合）に対して最小限の影響しかなかった（図６Ａ）。対照的に、ＨＡ１上方鎖及び下方鎖の両方に代替欠失位置を含むポリペプチドの発現は、発現レベルを約５０％まで低下させ、抗体ＣＴ１４９の結合を約７０％まで低下させた（図６Ｂ）。これは、試験された範囲内の位置、特にＨＡ１下方鎖が欠失される位置がポリペプチドの発現とフォールディングの両方に影響を及ぼすことを示す。
ヘッドドメイン除去後の残りのＨＡ１末端（すなわち、Ｎ末端ＨＡ１断片及びＣ末端ＨＡ１断片）を直接連結することに代わる方法は、相同連結配列を介する連結である。表５に示すように、この目的のために、ＨＡ１上方鎖（残基４５）を、対応するＨ３ ＨＡヘッドドメインに由来する短い配列によってＨＡ１下方鎖（残基３０７）に連結した。これにより、参照と比較して発現レベルが３３％～２２３％変化したポリペプチドが得られた（図６Ｃ）。同様に、抗体ＣＴ１４９の結合は大きな広がりを示し、参照と比較して５７％～３５０％の範囲の値が観察された。良好に発現したポリペプチドは、大部分が高い抗体結合も示した。
全体として、ＨＡヘッドドメインを欠失させることによる三量体の正しく折り畳まれたステムポリペプチドの生成は、１つの正確な欠失位置に依存しない。ＨＡ１末端を直接連結し、ＨＡ１の上方鎖及び下方鎖の両方の欠失位置のバリエーションは首尾よく生成された。或いは、ヘッドドメインに由来する相同アミノ酸リンカーを導入することによってＨＡ１末端を連結することも可能であり、異なる配列組成及び長さ（少なくとも２～５アミノ酸）を有する多くのペプチドを選択して、ヘッドドメイン除去後にＨＡ１末端を再連結することができた。
実施例７：本発明のポリペプチドにおけるＢループの最適化
設計
ＨＡ１ヘッドドメインを欠失した後、ＨＡステムポリペプチドのＢループ（図１Ｂ及びＣ、アミノ酸３８５～４０４を含む）が露出される。この領域を免疫系から部分的に遮蔽し、ループをさらに安定化するために、グリコシル化モチーフ及びプロリン残基を導入した（図７）。グリコシル化モチーフ（ＮｘＴ）を、４０１位におけるＮ結合型グリコシル化のために、Ｅ４０１Ｎ及びＥ４０３Ｔの変異によって４０１～４０３位に導入し、Ｓ３９８Ｎの変異（ＮｘＴモチーフを生ずる）による３９８～４００位におけるＮ結合型グリカンモチーフ、又はＳ３９２Ｎ及びＱ３９４Ｔの変異による３９２～３９４位におけるＮ結合型グリカンモチーフ、又はＨ３９３Ｎ及びＩ３９５Ｔの変異による３９３～３９５におけるＮ結合型グリカンモチーフ（両方ともＮｘＴモチーフを生ずる）と組み合わせて試験した。Ｂループ配列のヘリックス傾向を低下させることができるプロリン置換を、３８５～４０６の間の位置のいずれかでの単一点変異と、３９２及び３９６又は３９８での二重点変異とによって導入した。
哺乳動物細胞におけるタンパク質の発現と培養上清の分析
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ断片を、実施例２に記載されているように合成した。スクリーニング目的のためのＣ末端ＦＬＡＧ－リンカー－Ｈｉｓタグを含むポリペプチドを、実施例３に記載されるように、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ真核細胞株においてマイクロスケール（２００μＬ）で産生した。ポリペプチドの発現、三量体含量及びフォールディング（ｍＡｂ ＣＲ９１１４、ＣＴ１４９（Ｗｕ ｅｔ ａｌ． （２０１５）によって記載されている）及びＳＤ１５０１３（配列番号３９のアミノ酸配列を含む）の結合）を、実施例５に記載されるように、ＡｌｐｈａＬＩＳＡによって評価した（ＳＤ１５０１３の結合は、２ｎＭの濃度のＳＤ１５０１３の存在下で、抗Ｈｉｓアクセプタービーズ及びストレプトアビジンドナービーズを使用して評価した）。細胞培養上清を、回収日に、実施例２に記載されるように、分析用ＳＥＣによって分析した。
全てのデータを、１００％に設定したそれぞれの参照構築物ＵＦＶ１６１６８６（図８Ａ）、ＵＦＶ１６１３３３（図７Ｂ及びＣ）及びＵＦＶ１７１１８７（図７Ｄ）に対して正規化した。
結果及び結論
４０１位のＮ結合型グリコシル化のために、４０１、４０２、及び４０３位の残基をそれぞれＮ、Ａ、及びＴに変異させることによって、Ｂループに単一のグリコシル化モチーフを導入すると、ポリペプチドの発現レベルが２倍に増加した。同様に、抗体ＣＲ９１１４及びＣＴ１４９がそれぞれ５倍及び７倍、単一ドメインＳＤ１５０１３（１０倍）と、結合の大幅な増加が観察された（図７Ａ）。
Ｂループへのプロリンの導入は、ポリペプチドの発現レベルに影響を与えず、値は参照構築物に対して９４％～１２８％で変化した（図７Ｂ）。対照的に、３８６位、３８７位、３８８位、及び３８９位におけるプロリン残基の付加は、抗体結合に対して有害であった。ＣＲ９１１４、ＣＴ１４９及びＳＤ１５０１３の最小結合は、プロリンがＢループのＮ末端に導入された場合、ポリペプチドのフォールディングに負の影響を及ぼすことが示された。３９０～４０５位のいずれかに単一のプロリンを導入するか、又は２つのプロリンを３９２位及び３９６位若しくは３９２位及び３９８位に導入すると、ＣＲ９１１４結合が約４０％増加したが、ＣＴ１４９結合は比較的類似しているか、又は減少した（参照と比較して約６５％）。ＳＤ１５０１３は、これらの構築物において最大の広がりを示し、参照と比較して約５０％～約１５０％の範囲の相対結合を有した。２つのプロリンの導入は十分に許容され、ＣＲ９１１４、ＣＴ１４９及びＳＤ１５０１３の結合は概ね、単一のプロリン導入の場合の抗体結合値の平均であることがわかった。ＵＦＶ１６１７０８へのＳＤ１５０１３の結合については例外が観察され、１４７％の結合を示したが、３９２位及び３９６位の単一変異では、結合の減少が観察された（参照に対して６４％及び７５％）。
Ｂループへの第２のグリコシル化モチーフの導入は十分に許容され（図７Ｃ）、３９３位に追加のモチーフを有する両方のポリペプチド（ＵＦＶ１６１７１５）又は３９８位に追加のモチーフを有するポリペプチド（ＵＦＶ１６１７２１）は共に、参照と比較して相対的に類似の発現レベルを示し、ＣＲ９１１４結合は増加し（約１４５％）、ＣＴ１４９結合は影響がなく（約９０％）、ＳＤ１５０１３結合はわずかに減少した（約６０％）。
プロリン残基及び／又は第２のグリコシル化モチーフ（３９２～３９５位）の同時導入は、４０１～４０３位に単一のグリコシル化モチーフを含み、プロリンを含まない参照よりも、発現が約２倍低いポリペプチドを生じた（図７Ｄ）。抗体結合（ＣＲ９１１４及びＣＴ１４９）は殆ど影響を受けなかったが、ＳＤ１５０１３の低下が観察された（参照に対して約４８～８８％）。近接していることに起因するＮ３９８及びＮ４０１の同時グリコシル化の可能性は低いことから、Ｎ３９３又はＮ３９２への追加のグリカンが好ましい。
１つのＮ結合型グリカンモチーフ（ＵＦＶ１８０２０８）又は２つのＮ結合型グリカンモチーフ及び２つのプロリン（ＵＦＶ１８０２１７）を有する本発明のポリペプチドを含むＥＸＰＩ－２９３細胞培養上清のＳＥＣ－ＭＡＬＳ分析は、それぞれの三量体ポリペプチドに対応する明確なピークを示す（図７Ｅ）。
安定化プロリン残基及び追加のＮ結合グリコシル化モチーフの形態のＢループに対する変異は、十分に許容された。発現及び抗体結合における差異が観察されたが（ＳＤ１５０１３結合で最も顕著）、ＢループのＮ末端領域（３９２～３８９位）及び第２のＮ結合型グリコシル化モチーフを除いて、プロリンの導入は、タンパク質のフォールディング及び三量体化に影響を及ぼすことなく可能であった。
実施例８：本発明のポリペプチドの３８位のＮ結合型グリコシル化モチーフ
設計
ＣＲ９１１４エピトープに近い（３８位）保存グリコシル化モチーフの発現及びフォールディングに対する影響を評価するために、野生型モチーフ３８－ＮＡＴ－４０をＮ結合型グリコシル化のために含むポリペプチド（ＵＦＶ１７０２８２）を、モチーフが点変異Ｔ４０Ｉによってノックアウトされたポリペプチド（ＵＦＶ１７０２７８）と比較した。
哺乳類細胞におけるタンパク質の発現、培養上清分析、精製及び特性評価
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ断片を、実施例２に記載されるように合成し、発現させ、精製した。培養上清中の発現されたポリペプチドのレベルを、固定化したｍＡｂ ＣＴ１４９及び本発明のポリペプチドを含有する２５倍希釈細胞培養上清を用い、実施例２に記載されるように、バイオレイヤー干渉法によりＯＣＴＥＴプラットフォームを使用して評価した。精製されたポリペプチドへの抗体の結合強度を、実施例２に記載されるようにＥＬＩＳＡ（ＥＣ５０）により評価した。
結果及び結論
３８位のＮ結合型グリコシル化モチーフを除去すると（ＵＦＶ１７０２７８）、発現レベルは、モチーフを有するポリペプチド（ＵＦＶ１７０２８２）に対して約５０％減少したが、両ポリペプチドともにポリペプチドの十分な発現を維持し、培養上清１リットル当たり２５５ｍｇを超える値を有した。ＥＬＩＳＡによる測定で、抗体の結合強度は、ＣＲ９１１４及びＣＴ１４９のＥＣ５０値が約１ｎＭであることから明らかなように、２つのポリペプチド間で有意な差はなかった（図８Ａ及びＢ）。
結論として、３８位のＮ結合型グリコシル化モチーフの除去は、発現レベルの減少は観察されるものの、十分に許容され、且つポリペプチドのフォールディングへの影響はないようであった。
実施例９：ＨＡ１－ＨＡ２間の分子内ジスルフィド架橋の代替位置
設計
本発明の三量体ステムポリペプチドのプロトマーは、ＨＡ１下方鎖（３１０位）をＨＡ２鎖のＣヘリックス（４２２位）に共有結合するジスルフィド架橋の導入によって安定化されることが好ましい。このプロトマー内ジスルフィド架橋の代替選択肢を、それぞれのシステインの正確な位置をわずかにシフトさせる（３１１位／４２２位及び３０８位／４１８位）ことによって評価した。３１０／４２２ジスルフィド架橋に加えて、システインの第２の対を評価して、ＨＡ１（２６位）をＨＡ２ＣヘリックスのＣ末端部分（４３３位）と連結させた。
哺乳動物細胞におけるタンパク質の発現と培養上清の分析
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ断片を、実施例２に記載されているように合成した。実験の規模を、マイクロスケール（２００μＬ）に代えて、培養物を中間スケール（３０ｍＬ）で増殖させる規模としたことを除いて、実施例２に記載されるように、ポリペプチドをＥｘｐｉ－２９３細胞中で発現させた。本発明のポリペプチドの発現レベル及びフォールディング（ｍＡｂ ＣＲ９１１４及びＣＴ１４９の結合）を、それぞれ２．５ｎＭ及び１．２５ｎＭのＣＲ９１１４及びＣＴ１４９濃度を使用して、実施例５に記載されるように、ＡｌｐｈａＬＩＳＡによって評価した。
結果及び結論
残基３１０から３１１又は３０８へのシステインの再配置（４２２位から４１８位へのシステインの再配置と組み合わせて）は十分に許容され、抗体結合によって明らかなように、ポリペプチドの発現レベル及びフォールディングに最小限の影響を及ぼしただけであった（図９Ａ）。３１０－４２２ジスルフィド架橋の下の領域に第２のジスルフィド架橋を導入することは、発現レベルが影響を受けないことによって示されるように、原理的には可能であったが、ＣＲ９１１４結合及びＣＴ１４９結合の劇的な減少（それぞれ、参照に対して２％及び４８％）は所望の保存されたステムエピトープのフォールディングに対する負の効果を示した（図９Ｂ）。
実施例１０：プロトマー間ジスルフィド架橋の代替位置
設計
ＨＡステムポリペプチドのプロトマーは、三量体ＨＡタンパク質の上部におけるプロトマー間ジスルフィド架橋によって共有結合されていることが好ましい（図４Ａ）。２つのシステイン残基が、１つはＢループ（３９８位）に、１つはＣヘリックス（位置４０８）に導入され、これらは両方とも三量体内の隣接するプロトマー中の立体的に近接したシステインと対合する；すなわち、プロトマー１のシステイン３９８はプロトマー２のシステイン４０８とジスルフィド結合を形成し、プロトマー２のシステイン３９８はプロトマー３のシステイン４０８とジスルフィド結合を形成し、プロトマー３のシステイン３９８はプロトマー１のシステイン４０８とジスルフィド結合を形成する。このプロトマー間ジスルフィド結合の代替選択肢を、システインへの点変異の正確な位置をわずかに上方又は下方シフトさせることによって探索した（図１０）。
哺乳動物細胞におけるタンパク質の発現と培養上清の分析
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ断片を、実施例２に記載されているように合成した。スクリーニング目的のためのＣ末端ＦＬＡＧ－リンカー－Ｈｉｓタグを含むポリペプチドを、実施例３に記載されるように、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ真核細胞株においてマイクロスケール（２００μＬ）で産生した。本発明のポリペプチドの発現、三量体含量及びフォールディング（ｍＡｂ ＣＲ９１１４又はＣＴ１４９の結合）を、実施例５に記載のようにＡｌｐｈａＬＩＳＡによって評価した。
結果及び結論
導入されたプロトマー間ジスルフィドを有するポリペプチドは、これらのシステインを有さないポリペプチドと比較して約１．８倍低い発現を示した。しかしながら、三量体化の違いは劇的である（図１０）。プロトマー間ジスルフィドを有するポリペプチドは、同じレベルで発現し、及び全て、同様の高いレベルの三量体及び抗体ＣＲ９１１４及びＣＴ１４９の結合親和性を示した。これは、保存されたステムエピトープの三量体化及び正しいフォールディングのためのプロトマー間ジスルフィド架橋の決定的な重要性を実証する。さらに、プロトマー間ジスルフィド架橋の位置のわずかな変化は十分に許容された。
実施例１１：Ｃ末端における代替トランケーション
設計
インフルエンザウイルスヘマグルチニンは、ウイルス粒子の表面に位置し、タンパク質のＣ末端部分がウイルス膜に埋め込まれた膜タンパク質である。本発明のポリペプチドの可溶性バージョンでは、エクトドメインが、エクトドメインのＣ末端アルファヘリックスを膜貫通（ＴＭ）ドメイン及び細胞質ドメインと連結する天然リンカー配列（５００～５１３位）内の異なる位置でトランケートされ得る。
代替のＣ末端切断位置を評価した（表６）。
Figure 2022547107000008
細胞培養上清の分析
表６に列挙したポリペプチドをコードするＤＮＡ断片を、実施例３に記載されるように合成し、実施例４に記載されるように懸濁ＥＸＰＩ－２９３細胞培養物中で発現させた。
細胞培養上清を回収し、実施例４Ａに記載されるように、のＨＰＬＣを使用する分析ＳＥＣによって、三量体ポリペプチドレベルを分析した。発現された本発明のポリペプチドの正しいフォールディングを、実施例６に記載されるように、バイオレイヤー干渉法によりＯＣＴＥＴプラットフォームを使用して、細胞培養上清中で評価した。要するに、動態緩衝液（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）で５倍希釈した上清を、ストレプトアビジンバイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）にロードしたビオチン化ヒトモノクローナル抗体ＣＲ９１１４又はＣＴ１４９（１０μｇ／ｍＬ）の結合について評価した。会合工程の最初の１００秒の曲線フィッティングを行って、ＫＯＮ値を計算し、曲線を１：１モデルにフィットさせた。ＭＯＣＫ試料を陰性対照として含めた。
結果及び結論
残基５０１と５１３の間のＣ末端トランケーションは、十分に許容され、三量体及び発現レベル並びに抗体結合に対してわずかな影響しかなかった。トランケートされたポリペプチドは、ＳＥＣ分析において同様の三量体ピークパターンを示し（図１１Ａ）、Ｏｃｔｅｔ分析では、ＣＲ９１１４及びＣＴ１４９結合について良好な又は改善されたＫＯＮを示す（図１１Ｂ）。トランケーション（ＵＦＶ１７１２８０において、４９９位の後）がエクトドメインのＣ末端ヘリックスに達すると、ＳＥＣ及びＯＣＴＥＴ分析によって示されるように、三量体発現及び抗体結合レベルの明らかな低下が生じた。
実施例１２：本発明のポリペプチドのＡヘリックスにおける代替変異
設計
本発明のポリペプチドのＡヘリックスのＣ末端部分の位置決め及びフォールディングは、保存されたステムエピトープの正確な表示のために重要である。最適な構造を見出すために、Ａヘリックスの３つの残基（３７８、３７９及び３８１）を、グループ１ＨＡ（Ｈ１ Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／０７）又はグループ２ＨＡ（Ｈ３ Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１／１９６８）からこの位置に由来する残基に変異させた。さらに、推定Ａヘリックス安定化変異Ｇ３７９Ａを評価した。
哺乳類細胞におけるタンパク質の発現、培養上清分析、精製及び特性評価
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ断片を、実施例２に記載されているように合成した。スクリーニング目的のためのＣ末端ＦＬＡＧ－リンカー－Ｈｉｓタグを含むポリペプチドを、実施例３に記載されるように、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ真核細胞株においてマイクロスケール（２００μＬ）で産生した。ポリペプチドの発現、三量体含量及びフォールディング（２．５ｎＭのｍＡｂ ＣＲ９１１４又はＣＴ１４９の結合によって）を、実施例５に記載のようにＡｌｐｈａＬＩＳＡによって評価した。さらに、ポリペプチドを、実施例４に記載されるように、ＥＸＰＩ－ＣＨＯ細胞において中間スケール（５０ｍＬ）で発現させ、発現レベルを、実施例５に記載されるように、バイオレイヤー干渉法により決定し、粗細胞培養上清を、実施例３に記載されるように、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によってＳＥＣ－ＭＡＬＳにより分析した。ポリペプチドを、実施例４に記載されるように、アフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーによって２段階プロトコールで精製した。精製されたポリペプチドの抗原性をＥＬＩＳＡ（ＣＲ９１１４及びＣＴ１４９抗体結合のＥＣ５０値）によって評価し、ポリペプチドの５０％がアンフォールドする温度を、実施例２に記載されるように、両方ともＤＳＦによって決定した。
結果及び結論
３７８位、３７９位及び３８１位におけるＨ１由来残基の量の徐々の増加は、ポリペプチドの発現レベルに影響を及ぼした。３つ全てのＨ１様残基を含むポリペプチドＵＦＶ１６１４４８は最も低い発現ポリペプチド（８４％）であったが、３７９位及び３８１位にＨ１様残基を含むＵＦＶ１６１４５１は最も高い発現ポリペプチド（１６３％）であった。推定Ａヘリックス安定化突然変異３７９Ａ（ＵＦＶ１６１４５９及びＵＦＶ１６１４５８）を含むポリペプチドは、発現が最も悪かった（それぞれ４２及び７５％）を発現した。ポリペプチドの正しいフォールディングを、ＡｌｐｈａＬＩＳＡで評価した。ＣＲ９１１４及びＣＴ１４９の両結合の相対シグナルは、大きな広がりを示した。ポリペプチドＵＦＶ１６１４５３（３７９Ｎ）は、ＣＲ９１１４及びＣＴ１４９についてそれぞれ６１％及び２４％の最小結合を示した。Ｈ１（３７８Ｔ、３７９Ｎ及び３８１Ｖ）への全ての変異を含むポリペプチドＵＦＶ１６１４４８は、ＣＲ９１１４及びＣＴ１４９についてそれぞれ１７０６％及び８４１％の最も高い結合を示した（図１２Ａ）。
Ａヘリックス変異の効果を、とりわけ、Ｈ３５５Ｗ変異及び代替のプロトマー間ジスルフィド架橋（３９７／４０８における）を含む、より安定化された三量体ステムポリペプチドＵＦＶ１７１００４及び（ＵＦＶ１７１１１６）においてさらに研究した。３つの独立した中間スケールのＥｘｐｉＣＨＯ産生において、ＵＦＶ１７１００４（Ａヘリックスの３７８位、３７９位、及び３８１位にＨ１残基を含む）は、ポリペプチドＵＦＶ１７１１１６（それらの位置にＨ３残基を含む）よりもわずかに高いレベルで発現された。
同様に、培養上清のＳＥＣ－ＭＡＬＳ分析において最小の差異が観察され、両構築物で、三量体画分に対応するピーク（約８分の保持時間）は、形状及び高さにおいて重なり合っていた。正しいタンパク質フォールディングの尺度としての抗体ＣＲ９１１４及びＣＴ１４９の結合をＥＬＩＳＡによって決定し、強い結合（ＥＣ５０＜０．０１ｎＭ）を示した。ＤＳＦによって決定される温度安定性は、両ポリペプチド間で有意な差を示した。ポリペプチドＵＦＶ１７１１１６の５０％が６６．２℃でアンフォールドしたのに対して、ポリペプチドＵＦＶ１７１００４は６８．０℃のＴｍ５０値を示した（図１２Ｂ）。
まとめると、Ｈ３ベースのステムポリペプチドのＡヘリックスにＨ１残基を導入すると、より熱安定性であり、ＣＲ９１１４及びＣＴ１４９結合の増加を示したポリペプチドが得られた。抗体結合の差は、とりわけ、安定化変異Ｈ３５５Ｗを含む構築物ＵＦＶ１７１００４及びＵＦＶ１７１１１６において、あまり劇的ではなかった。
実施例１３：Ｈ７への表面変異の導入
設計
本発明の三量体ステムポリペプチドは、先の実施例に記載されるように、Ｈ３インフルエンザウイルスＡ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１／１９６８由来のＨＡに基づく。グループ２のＨ３及びＨ７ヘマグルチニン血球凝集素のステムでは高度に保存されているにもかかわらず、保存ステムエピトープの領域の少数の表面残基は異なっている。この実施例では、ポリペプチド表面に位置する選択された残基を、（参照のＵＦＶ１７２５６１及びＵＦＶ１７２５６２に存在する）Ｈ３残基から対応するＨ７残基に段階的に変異させた。これらの残基は、β２／β３ループの位置（残基２５及び２７）、Ａヘリックスの残基（残基３６７）、及びポリペプチドの下部の残基（残基４７５、４７６、及び４７９）を含む。
哺乳動物細胞におけるタンパク質の発現と培養上清の分析
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ断片を、実施例２に記載されているように合成した。スクリーニング目的のためのＣ末端ＦＬＡＧ－リンカー－Ｈｉｓタグを含むポリペプチドを、実施例３に記載されるように、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ真核細胞株においてマイクロスケール（２００μＬ）で産生した。本発明のポリペプチドの発現、三量体含量及びフォールディング（ｍＡｂ ＣＲ９１１４又はＣＴ１４９の結合）を、実施例５に記載のようにＡｌｐｈａＬＩＳＡによって評価した。全てのＡｌｐｈａＬＩＳＡデータを、１００％に設定したそれぞれの参照構築物ＵＦＶ１７２５６１及びＵＦＶ１７２５６２に対して正規化した。第１の参照構築物は３７９位及び３８１位のＨ１残基への変異を含み、第２の参照は、３７９位及び３８１位に野生型Ｈ３残基を含む。さらに、培養上清を、回収日に、実施例２に記載されるように、分析ＳＥＣによって分析した。
結果及び結論
β２／β３ループ、Ａヘリックス（３７９位及び３８１位にＨ１様残基を含む）、及びステムの下部にＨ７様残基を導入すると、発現及び三量体収率がわずかに減少し、ＡｌｐｈａＬＩＳＡによって決定される三量体ステムポリペプチドへの抗体結合の変動（±２０％）は比較的小さかった。同様に、粗細胞培養上清のＳＥＣ分析は、Ｈ７への表面変異を含むポリペプチドの発現レベルの減少を示した（図１３Ａ）。
同様の効果が、３７９位及び３８１位にＨ３様残基を含む骨格バリアントに表面変異を導入した際に観察される（図１３Ｂ）。
まとめると、本発明のＨ３ ＨＡ由来のステムポリペプチドの表面を、特にＡ－ヘリックスの上部にＨ１様残基の存在下で、Ｈ７に向けて改変することができる。
実施例１４：グループ２ｍｉｎｉ－ＨＡアプローチへの一般的な適用
設計
本発明の三量体ステムポリペプチドの生成に必要な設計要素は、Ｈ３ ＨＡ骨格（Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１／１９６８）において発現され、２つの代替のＨ３骨格、すなわちＡ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５及びＡ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＩＮＦＩＭＨ／１６／００１９／２０１６にも導入された。設計要素を漸増的に導入し；セットＩポリペプチドは最小セットの変異を含み、セットＩＩはさらに部分的Ｂループ安定化変異を含み、セットＩＩＩは全てのＢループ追加安定化変異を含む。
哺乳動物細胞におけるタンパク質の発現と培養上清の分析
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ断片を、実施例２に記載されているように合成した。スクリーニング目的のためのＣ末端ＦＬＡＧリンカー－Ｈｉｓタグを含むポリペプチドを、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ真核細胞株においてマイクロスケール（２００μＬ）で産生し、粗細胞培養上清を、実施例３に記載されるように、回収日に分析ＳＥＣによって分析した。
結果及び結論
ＳＥＣ－ＭＡＬＳ分析で観察されたように、セットＩ設計要素の導入は、３つの骨格全てで三量体ステムポリペプチドをもたらしたが、三量体ピークはＡ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５由来ポリペプチドで最も明らかであり、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１／１９６８由来ポリペプチドで最小であった（図１４Ａ）。Ｂループにおけるさらなる安定化変異（セットＩＩ及びセットＩＩＩ）は、ポリペプチド発現レベル及び三量体含量の有意な増加をもたらした（図１４Ｂ）。まとめると、これらの結果は、本発明のポリペプチドの改変を他のグループ２骨格に導入することにより、可溶性三量体ｍｉｎｉ－ＨＡが得られることを確証するものである。
実施例１５：ヒト肺線維芽細胞の細胞膜上の正確にフォールディングされた三量体グループ２ｍｉｎｉ－ＨＡのアデノウイルス駆動インビトロ発現。
この実施例では、ヒト肺線維芽細胞（ＭＲＣ－５）の細胞表面におけるアデノウイルス２６（Ａｄ２６．ＦＬＵ．００４）駆動発現及び三量体ＵＦＶ１８０４８０（天然膜貫通ドメインを有するＵＦＶ１８０８８）のフォールディングを評価した。ＭＲＣ－５細胞に培地中で形質導入した（５，０００ＶＰ／細胞）。２日後、細胞を溶解緩衝液中で溶解して、ウェスタンブロット分析によって三量体ＵＦＶ１８０４８０の発現を評価するか、又は細胞をトリプシン処理によって回収して、フローサイトメトリーを用いて正しく折り畳まれたＵＦＶ１８０４８０の細胞表面発現を評価した。いずれの場合も、ＵＦＶ１８０４８０をコードする導入遺伝子を欠くＡｄ２６．Ｅｍｐｔｙを陰性対照として含めた。
Ａｄ２６．ＦＬＵ．００４形質導入細胞からのタンパク質溶解物、並びに陽性対照として働くタンパク質ＵＦＶ１８００８８を、還元条件下（三量体グループ２ｍｉｎｉ－ＨＡタンパク質の完全なアンフォールディングを確実にする）又は非還元条件下（ｍｉｎｉ－ＨＡタンパク質の三量体性質を確実にする）でＳＤＳ－ＰＡＧＥ用に処理し、タンパク質をニトロセルロースブロットに移した。グループ２のｍｉｎｉ－ＨＡ構造特異的ビオチン化抗体ＣＲ９１１４でブロットをプローブすることによって発現を試験し、ＨＲＰ結合ストレプトアビジンを用いて発現を可視化した。
フローサイトメトリーによるＵＦＶ１８０４８０の細胞膜関連発現を試験するために、Ａｄ２６．ＦＬＵ．００４形質導入細胞をトリプシン処理し、フローサイトメトリー緩衝液に再懸濁した。非透過性細胞をＣＲ９１１４でプローブし、広範な洗浄後、ＰＥ結合抗ヒト抗体でプローブして、ＵＦＶ１８０４８０を可視化した。
結果及び結論
フローサイトメトリー（ｆｌｏｗ ｃｙｔｒｏｍｅｔｒｙ）分析を用いて、ＵＦＶ１８０４８０の細胞表面発現を分析した。Ａｄ２６．Ｅｍｐｔｙ形質導入細胞と比較して（図１６Ａ）、Ａｄ２６．ＦＬＵ．００４形質導入ＭＲＣ－５細胞の大部分（約９６．３％）は、細胞表面に高レベルのＵＦＶ１８０４８０を示した（図１６Ｂ）。
ＭＲＣ－５におけるＵＦＶ１８０４８０発現のフローサイトメトリー分析は、単量体ＵＦＶ１８０４８０の発現と三量体ＵＦＶ１８０４８０の発現とを区別しなかった。したがって、ウェスタンブロット分析を行った。分子量及び三量体ＵＦＶ１８００８８との比較に基づいて、Ａｄ２６．ＦＬＵ．００４がＭＲＣ－５細胞において三量体ＵＦＶ１８０４８０の発現を駆動することが示された（図１６Ｃ）。単量体ＵＦＶ１８０４８０のアミノ酸配列に基づいて、分子量は３４．４ｋＤａと推定され、これは約１０３．２ｋＤａの三量体ＵＦＶ１８０４８０のサイズを生じる。Ａｄ２６．Ｅｍｐｔｙ形質導入細胞からではなく、Ａｄ２６．ＦＬＵ．００４形質導入細胞からの溶解物（５，０００ＶＰ／細胞）は、約１０３．２ｋＤａのバンドを示し、三量体ＵＦＶ１８００８８（予想されるＭＷ ８９．１ｋＤａ）と比較してわずかに高い泳動を示した（図１６Ｃ、レーン１～３を比較されたい）。約３４ｋＤａでバンドは観察されず、ＵＦＶ１８０４８０の大部分がその三量体形態であることを示した（図１６Ｃ、レーン１）。還元（すなわち、完全にアンフォールドする）条件下で処理した場合、試料のいずれも特定のバンドを示さなかった（図１６Ｃ、レーン４～６）。
したがって、本発明によれば、Ａｄ２６．ＦＬＵ．００４の形質導入により、ＵＦＶ１８０４８０がインビトロで発現されることが確認された。ヒト細胞の細胞表面の三量体タンパク質の存在も確認された。
実施例１６：本発明のポリペプチドＵＦＶ１７０２７８及びＵＦＶ１７０２８２は免疫原性であり、致死Ｈ３Ｎ２ Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１／１９６８ナイーブマウスチャレンジモデルにおいて保護を誘導する
この実施例では、２％（ｖ／ｖ）Ａｄｊｕｐｌｅｘアジュバント添加ＵＦＶ１７０２７８（３８位にＮ結合型グリカンのための保存モチーフを有する）及びＵＦＶ１７０２８２（３８位にＮ結合型グリカンのための保存モチーフを有さない）の用量範囲のインビボ免疫原性及び保護効果（追跡期間の終わりの生存率に基づく）を、偽免疫（ＰＢＳ）動物と比較して評価した。
１０匹の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス群（６～８週齢）を、２％（ｖ／ｖ）のＡｄｊｕｐｌｅｘをアジュバントとして加えた可溶性三量体ＵＦＶ１７０２７８又はＵＦＶ１７０２８２の用量範囲で、３週間隔で３回、筋肉注射により免疫した。用量範囲は３０ｍｃｇから始めて０．０３μｇまでの４回の１０倍希釈からなった。陰性対照として、１８匹のマウスをＰＢＳで３回免疫した。最後の免疫付与から４週間後に、マウスから採血して免疫応答を分析し、その１日後にマウスに１２．５×ＬＤ５０のマウス馴化Ｈ３Ｎ２ Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１／１９６８チャレンジウイルスでチャレンジし、３週間モニターした（生存、体重、臨床スコア）。追跡調査終了時の生存率を主要アウトカムパラメータとした。
結果
全ての用量のＵＦＶ１７０２７８及びＵＦＶ１７０２８２が、ＰＢＳ群力価と比較して、有意に高いＨ３ Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１／１９６８ ＨＡステム特異的抗体力価（ＣＲ９１１４競合アッセイで測定）を誘導したので、ＵＦＶ１７０２７８及びＵＦＶ１７０２８２は免疫原性であることが示された（Ｐ＜０．００１；ＡＮＯＶＡ、事後ｔ検定、ステップワイズ試験（最高用量から開始）及び構築物について２倍のボンフェローニ補正）（図１７Ａを参照）。
さらに、ＰＢＳ群と比較して、全ての用量で、Ａｄｊｕｐｌｅｘアジュバント添加ＵＦＶ１７０２７８及びＵＦＶ１７０２８２は、有意な保護を提供した（Ｐ＜０．００１；フィッシャーの正確検定、ステップワイズ試験（最高用量から開始）、及び構築物について２倍のボンフェローニ補正）（図１７Ｂを参照）。（曲線下面積によって定義される）体重減少は、ＰＢＳ群と比較して、全ての用量で有意に減少した（Ｐ＜０．００１；ＡＮＯＶＡ、構築物に対する２倍のボンフェローニ補正、及び最高用量から開始するステップワイズ試験）（図１７Ｂを参照）。
結論
したがって、本発明によれば、ＵＦＶ１７０２７８及びＵＦＶ１７０２８２は免疫原性であり、致死Ｈ３Ｎ２ Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１／１９６８マウスチャレンジモデルにおいて保護を提供することが示された。
実施例１７：本発明のポリペプチドＵＦＶ１８００８８、ＵＦＶ１８００８９及びＵＦＶ１８００９０は、ナイーブマウスチャレンジモデルにおいて免疫原性である
この実施例では、２％（ｖ／ｖ） Ａｄｊｕｐｌｅｘアジュバント添加ＵＦＶ１８００８８、ＵＦＶ１８００８９及びＵＦＶ１８００９０の用量範囲のインビボ免疫原性を、偽免疫（ＰＢＳ）動物と比較して評価した。
１０匹の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス群（６～８週齢）を、３ｍｃｇの可溶性三量体ＵＦＶ１８００８８、ＵＦＶ１８００８９又はＵＦＶ１８００９０で、３週間隔で１回、２回又は３回、筋肉注射により免疫した。最終免疫を同じ日に与えた。陰性対照として、１８匹のマウスをＰＢＳで３回免疫した。全ての免疫化は２％（ｖ／ｖ）Ａｄｊｕｐｌｅｘをアジュバントして添加した。最後の免疫付与から４週間後に、マウスから採血して免疫応答を分析した。
結果
全ての構築物が、ＰＢＳ群力価と比較して、２回又は３回の免疫化後に有意に高いＨ３ Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１／１９６８ ＨＡステム特異的抗体力価（ＣＲ９１１４競合アッセイで測定）を誘導したので、ＵＦＶ１８００８８、ＵＦＶ１８００８９及びＵＦＶ１８００９０は免疫原性であることが示された（Ｐ＜０．００１；ウィルコクソン、多重比較及びステップワイズ試験（最高用量から開始）のための３倍ボンフェローニ補正）（図１８Ａを参照）。１回の免疫化後に有意なステム特異的抗体を誘導した構築物はなかった。
全ての構築物は、２回又は３回の免疫化後に、ＰＢＳ群力価と比較して、有意に高いＨ３ Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１／１９６８及びＨ３ Ａ／テキサス／５０／２０１２ ＨＡ特異的抗体力価（ＦＬ ＨＡ結合ＥＬＩＳＡで測定）を誘導した（Ｐ＜０．０１；ウィルコクソン、多重比較及びステップワイズ試験（最高用量から開始）のための３倍ボンフェローニ補正）（図１８Ｂ参照）。さらに、ＵＦＶ１８００８８及びＵＦＶ１８００８９による１回の免疫化は、ＰＢＳ群力価と比較して、有意に高いＨ３ Ａ／Ｔｅｘａｓ／５０／２０１２ ＨＡ特異的抗体力価を誘導した（Ｐ＜０．０１）。
全ての構築物は、３回の免疫化後に、ＰＢＳ群力価と比較して、有意に高いＨ７Ａ／Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ／２１９／２００３ ＨＡ特異的抗体力価（ＦＬ ＨＡ結合アッセイで測定）を誘導した（Ｐ＜０．００１；ウィルコクソン、多重比較及びステップワイズ試験（最高用量から開始）のための３倍ボンフェローニ補正）（図１８Ｂを参照）。ＵＦＶ１８００８９及びＵＦＶ１８００９０による２回の免疫化は、ＰＢＳ群抗体価と比較して有意に高い力価を誘導した（それぞれＰ＜０．００１及びＰ＜０．０１）が、１回の免疫化後に有意に高い力価は検出されなかった。
結論
したがって、本発明によれば、ＵＦＶ１８００８８、ＵＦＶ１８００８９及びＵＦＶ１８００９０がナイーブマウスモデルにおいて免疫原性であることが示された。全ての構築物は、顕著なＨＡステム特異的抗体価を誘導し、複数の系統発生的に異なるＨ３（異なる年で分離された株由来）及びＨ７ ＨＡ蛋白質と結合する抗体を誘導した。
実施例１８：本発明のポリペプチドＵＦＶ１８００８８、ＵＦＶ１８００８９及びＵＦＶ１８００９０は、ナイーブマウスチャレンジモデルにおいて、Ｈ３Ｎ２ Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１／１９６８による致死チャレンジに対する保護を誘導する
この実施例では、２％（ｖ／ｖ）Ａｄｊｕｐｌｅｘアジュバント添加ＵＦＶ１８００８８、ＵＦＶ１８００８９及びＵＦＶ１８００９０の用量範囲のインビボ保護効果（追跡期間終了時の生存率に基づく）を、偽免疫（ＰＢＳ）動物と比較して評価した。
１０匹の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス群（６～８週齢）を、３ｍｃｇの可溶性三量体ＵＦＶ１８００８８、ＵＦＶ１８００８９又はＵＦＶ１８００９０で、３週間隔で１回、２回又は３回、筋肉注射により免疫した。最終免疫を同じ日に与えた。陰性対照として、１８匹のマウスをＰＢＳで３回免疫した。全ての免疫化は２％（ｖ／ｖ）Ａｄｊｕｐｌｅｘをアジュバントして添加した。最後の免疫付与から４週間後に、マウスに２５×ＬＤ５０のマウス馴化Ｈ３Ｎ２ Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１／１９６８チャレンジウイルスでチャレンジし、３週間モニターした（生存、体重、臨床スコア）。追跡調査終了時の生存率を主要アウトカムパラメータとした。
結果
ＵＦＶ１８００８８、ＵＦＶ１８００８９及びＵＦＶ１８００９０は、２回又は３回の免疫化で、ＰＢＳ群と比較して、有意な保護を提供することが示された（Ｐ＜０．００１；フィッシャーの正確検定、構築物に対する２倍のボンフェローニ補正、及び最高用量から開始するステップワイズ試験）（図１９参照）。１回の免疫化後に有意な保護を誘導した構築物はなかった。（曲線下面積によって定義される）体重減少は、ＵＦＶ１８００８９による１回の免疫化後を除いて、ＰＢＳ群と比較して、全ての用量で有意に減少した（Ｐ＜０．０５；ＡＮＯＶＡ、構築物に対する２倍のボンフェローニ補正、及び最高用量から開始するステップワイズ試験）（図１９を参照）。
結論
したがって、本発明によれば、ＵＦＶ１８００８８、ＵＦＶ１８００８９及びＵＦＶ１８００９０は免疫原性であり、致死Ｈ３Ｎ２ Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１／１９６８マウスチャレンジモデルにおいて保護を提供することが示された。
Figure 2022547107000009
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Ｓ－Ｇｕｔｈｅ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３７：９０５－９１５．
Ｓｔｅｅｌ ｅｔ ａｌ．（２０１０），ｍＢｉｏ １（１）：１－９．
Ｔｈｒｏｓｂｙ ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｐｌｏｓ Ｏｎｅ １２（３）：１－１５．
Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９２，７２－７５．
Ｗｕ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ６（７７０８）：１－１１．
配列
配列番号１ ＣＡＡ２４２６９．１ ヘマグルチニン（インフルエンザＡ ウイルス（Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／１９６８（Ｈ３Ｎ２）（シグナル配列を除く）
Figure 2022547107000010
配列番号１：Ｈ３ 完全長（Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１／６８）
Figure 2022547107000011
ＣＲ６２６１ ＶＨ タンパク質（配列番号３）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＰＦＲＳＹＡＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＰＥＷＭＧＧＩＩＰＩＦＧＴＴＫＹＡＰＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＤＦＡＧＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＭＹＹＣＡＫＨＭＧＹＱＶＲＥＴＭＤＶＷＧＫＧＴＴＶＴＶＳＳ
ＣＲ６２６１ ＶＬ タンパク質（配列番号４）
ＱＳＶＬＴＱＰＰＳＶＳＡＡＰＧＱＫＶＴＩＳＣＳＧＳＳＳＮＩＧＮＤＹＶＳＷＹＱＱＬＰＧＴＡＰＫＬＬＩＹＤＮＮＫＲＰＳＧＩＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＡＴＬＧＩＴＧＬＱＴＧＤＥＡＮＹＹＣＡＴＷＤＲＲＰＴＡＹＶＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ
ＣＲ８０２０ ＶＨ タンパク質（配列番号５）
ＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＶＫＴＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＦＧＶＳＷＩＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＷＩＳＡＹＮＧＤＴＹＹＡＱＫＦＱＡＲＶＴＭＴＴＤＴＳＴＴＴＡＹＭＥＭＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＰＰＬＦＹＳＳＷＳＬＤＮＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ＣＲ８０２０ ＶＬ タンパク質（配列番号６）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＭＮＹＬＡＷＦＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＲＲＡＴＧＩＰＤＲＩＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＡＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＧＴＳＰＲＴＦＧＱＧＡＫＶＥＩＫ
ＣＲ９１１４ ＶＨ タンパク質（配列番号７）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＳＳＧＧＴＳＮＮＹＡＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＤＷＭＧＧＩＳＰＩＦＧＳＴＡＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＳＡＤＩＦＳＮＴＡＹＭＥＬＮＳＬＴＳＥＤＴＡＶＹＦＣＡＲＨＧＮＹＹＹＹＳＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
ＣＲ９１１４ ＶＬ タンパク質（配列番号８）
ＳＹＶＬＴＱＰＰＡＶＳＧＴＰＧＱＲＶＴＩＳＣＳＧＳＤＳＮＩＧＲＲＳＶＮＷＹＱＱＦＰＧＴＡＰＫＬＬＩＹＳＮＤＱＲＰＳＶＶＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＡＳＬＡＩＳＧＬＱＳＥＤＥＡＥＹＹＣＡＡＷＤＤＳＬＫＧＡＶＦＧＧＧＴＱＬＴＶＬ
Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５のＦＬ ＨＡ（配列番号１３）
Figure 2022547107000012
Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＩＮＦＭＨ／１６／００１９／２０１６のＦＬ ＨＡ（配列番号１４）
Figure 2022547107000013
Ａ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９のＦＬ ＨＡ（配列番号１５）
Figure 2022547107000014
Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７のＦＬ ＨＡ（配列番号１６）
Figure 2022547107000015
Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／１９９９のＦＬ ＨＡ（配列番号１７）
Figure 2022547107000016
ＣＴ１４９ ＶＨ タンパク質（配列番号３７）
Figure 2022547107000017
ＣＴ１４９ ＶＬ タンパク質（配列番号３８）
ＥＶＶＬＴＱＳＰＧＴＬＡＬＰＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＨＲＶＧＳＴＹＩＡＷＹＱＱＫＳＧＱＡＰＲＲＬＩＹＧＡＳＮＲＡＴＤＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＲＲＬＥＰＥＤＳＡＶＹＹＣＱＱＦＳＶＳＰＷＴＦＧＱＧＴＲＶＥＩＫ
ＳＤ１５０１３（配列番号３９）
Figure 2022547107000018
配列番号４０：ＵＦＶ１８００８８
Figure 2022547107000019
配列番号４１：ＵＦＶ１８００８９
Figure 2022547107000020
配列番号４２：ＵＦＶ１８００９０
Figure 2022547107000021
配列番号４３：ＵＦＶ１８０１４１
Figure 2022547107000022
配列番号４４：ＵＦＶ１８０１９２
Figure 2022547107000023
配列番号４５：ＵＦＶ１８０１９３
Figure 2022547107000024
配列番号４６：ＵＦＶ１８０１９４
Figure 2022547107000025
配列番号４７：ＵＦＶ１８０１９５
Figure 2022547107000026
配列番号４８：ＵＦＶ１８０１９６
Figure 2022547107000027
配列番号４９：ＵＦＶ１８０１９７
Figure 2022547107000028
配列番号５０：ＵＦＶ１８０１９８
Figure 2022547107000029
配列番号５１：ＵＦＶ１８０１９９
Figure 2022547107000030
配列番号５２：ＵＦＶ１８０２００
Figure 2022547107000031
配列番号５３：ＵＦＶ１８０２０１
Figure 2022547107000032
配列番号５４：ＵＦＶ１８０２０２
Figure 2022547107000033
配列番号５５：ＵＦＶ１８０２０３
Figure 2022547107000034
配列番号５６：ＵＦＶ１８０２０４
Figure 2022547107000035
配列番号５７：ＵＦＶ１８０２０５
Figure 2022547107000036
配列番号５８：ＵＦＶ１８０２０６
Figure 2022547107000037
配列番号５９：ＵＦＶ１８０２０７
Figure 2022547107000038
配列番号６０：ＵＦＶ１８１０３４
Figure 2022547107000039
配列番号６１：ＵＦＶ１８１０３６
Figure 2022547107000040
配列番号６２：ＵＦＶ１８１０３８
Figure 2022547107000041
配列番号６３：ＵＦＶ１８１０４０
Figure 2022547107000042
配列番号６４：ＵＦＶ１８１０４２
Figure 2022547107000043
配列番号６５：ＵＦＶ１６１３３３
Figure 2022547107000044
配列番号６６：ＵＦＶ１６１７３９
Figure 2022547107000045
配列番号６７：ＵＦＶ１６１８００
Figure 2022547107000046
配列番号６８：ＵＦＶ１６１８０４
Figure 2022547107000047
配列番号６９：ＵＦＶ１７０９９１
Figure 2022547107000048
配列番号７０：ＵＦＶ１７１００４
Figure 2022547107000049
配列番号７１：ＵＦＶ１７１１９０
Figure 2022547107000050
配列番号７２：ＵＦＶ１７１１９１
Figure 2022547107000051
配列番号７３：ＵＦＶ１７１１９２
Figure 2022547107000052
配列番号７４：ＵＦＶ１７１１９３
Figure 2022547107000053
配列番号７５：ＵＦＶ１７１１９４
Figure 2022547107000054
配列番号７６：ＵＦＶ１７１１９５
Figure 2022547107000055
配列番号７７：ＵＦＶ１７０６１１
Figure 2022547107000056
配列番号７８：ＵＦＶ１７０６１２
Figure 2022547107000057
配列番号７９：ＵＦＶ１７０６１３
Figure 2022547107000058
配列番号８０：ＵＦＶ１７０６１４
Figure 2022547107000059
配列番号８１：ＵＦＶ１６１９０８
Figure 2022547107000060
配列番号８２：ＵＦＶ１７１１９７
Figure 2022547107000061
配列番号８３：ＵＦＶ１８０６６６
Figure 2022547107000062
配列番号８４：ＵＦＶ１８０６６７
Figure 2022547107000063
配列番号８５：ＵＦＶ１８０６６８
Figure 2022547107000064
配列番号８６：ＵＦＶ１８０６６９
Figure 2022547107000065
配列番号８７：ＵＦＶ１８０６７０
Figure 2022547107000066
配列番号８８：ＵＦＶ１８０６７１
Figure 2022547107000067
配列番号８９：ＵＦＶ１８０６７２
Figure 2022547107000068
配列番号９０：ＵＦＶ１８０６７３
Figure 2022547107000069
配列番号９１：ＵＦＶ１８０６７４
Figure 2022547107000070
配列番号９２：ＵＦＶ１８０６７５
Figure 2022547107000071
配列番号９３：ＵＦＶ１７０６３６
Figure 2022547107000072
配列番号９４：ＵＦＶ１７０６３７
Figure 2022547107000073
配列番号９５：ＵＦＶ１７０６３８
Figure 2022547107000074
配列番号９６：ＵＦＶ１７０６３９
Figure 2022547107000075
配列番号９７：ＵＦＶ１７０６４０
Figure 2022547107000076
配列番号９８：ＵＦＶ１６０６５３
Figure 2022547107000077
配列番号９９：ＵＦＶ１６０７６４
Figure 2022547107000078
配列番号１００：ＵＦＶ１６０７６５
Figure 2022547107000079
配列番号１０１：ＵＦＶ１６０７６６
Figure 2022547107000080
配列番号１０２：ＵＦＶ１６０６７４
Figure 2022547107000081
配列番号１０３：ＵＦＶ１６０６７５
Figure 2022547107000082
配列番号１０４：ＵＦＶ１６０７６７
Figure 2022547107000083
配列番号１０５：ＵＦＶ１６０７６８
Figure 2022547107000084
配列番号１０６：ＵＦＶ１６０７６９
Figure 2022547107000085
配列番号１０７：ＵＦＶ１６０７７０
Figure 2022547107000086
配列番号１０８：ＵＦＶ１６０７７１
Figure 2022547107000087
配列番号１０９：ＵＦＶ１６０７７２
Figure 2022547107000088
配列番号１１０：ＵＦＶ１６０３２１
Figure 2022547107000089
配列番号１１１：ＵＦＶ１６０４０３
Figure 2022547107000090
配列番号１１２：ＵＦＶ１６０４０４
Figure 2022547107000091
配列番号１１３：ＵＦＶ１６０４０５
Figure 2022547107000092
配列番号１１４：ＵＦＶ１６０４０６
Figure 2022547107000093
配列番号１１５：ＵＦＶ１６０４０７
Figure 2022547107000094
配列番号１１６：ＵＦＶ１６０４０８
Figure 2022547107000095
配列番号１１７：ＵＦＶ１６０４０９
Figure 2022547107000096
配列番号１１８：ＵＦＶ１６０４１０
Figure 2022547107000097
配列番号１１９：ＵＦＶ１６０４１１
Figure 2022547107000098
配列番号１２０：ＵＦＶ１６０４１２
Figure 2022547107000099
配列番号１２１：ＵＦＶ１６０４１３
Figure 2022547107000100
配列番号１２２：ＵＦＶ１６０４１４
Figure 2022547107000101
配列番号１２３：ＵＦＶ１６０４１５
Figure 2022547107000102
配列番号１２４：ＵＦＶ１６０４１６
Figure 2022547107000103
配列番号１２５：ＵＦＶ１６０４１７
Figure 2022547107000104
配列番号１２６：ＵＦＶ１６０４１８
Figure 2022547107000105
配列番号１２７：ＵＦＶ１６０４１９
Figure 2022547107000106
配列番号１２８：ＵＦＶ１６０４２０
Figure 2022547107000107
配列番号１２９：ＵＦＶ１６１６８６
Figure 2022547107000108
配列番号１３０：ＵＦＶ１６１７２２
Figure 2022547107000109
配列番号１３１：ＵＦＶ１６１７２３
Figure 2022547107000110
配列番号１３２：ＵＦＶ１６１６８８
Figure 2022547107000111
配列番号１３３：ＵＦＶ１６１６８９
Figure 2022547107000112
配列番号１３４：ＵＦＶ１６１６９０
Figure 2022547107000113
配列番号１３５：ＵＦＶ１６１６９１
Figure 2022547107000114
配列番号１３６：ＵＦＶ１６１６９２
Figure 2022547107000115
配列番号１３７：ＵＦＶ１６１６９３
Figure 2022547107000116
配列番号１３８：ＵＦＶ１６１６９４
Figure 2022547107000117
配列番号１３９：ＵＦＶ１６１６９５
Figure 2022547107000118
配列番号１４０：ＵＦＶ１６１６９６
Figure 2022547107000119
配列番号１４１：ＵＦＶ１６１６９７
Figure 2022547107000120
配列番号１４２：ＵＦＶ１６１６９８
Figure 2022547107000121
配列番号１４３：ＵＦＶ１６１６９９
Figure 2022547107000122
配列番号１４４：ＵＦＶ１６１７００
Figure 2022547107000123
配列番号１４５：ＵＦＶ１６１７０１
Figure 2022547107000124
配列番号１４６：ＵＦＶ１６１７０２
Figure 2022547107000125
配列番号１４７：ＵＦＶ１６１７０３
Figure 2022547107000126
配列番号１４８：ＵＦＶ１６１７０４
Figure 2022547107000127
配列番号１４９：ＵＦＶ１６１７０５
Figure 2022547107000128
配列番号１５０：ＵＦＶ１６１７０６
Figure 2022547107000129
配列番号１５１：ＵＦＶ１６１７０７
Figure 2022547107000130
配列番号１５２：ＵＦＶ１６１７０８
Figure 2022547107000131
配列番号１５３：ＵＦＶ１６１７０９
Figure 2022547107000132
配列番号１５４：ＵＦＶ１６１７１５
Figure 2022547107000133
配列番号１５５：ＵＦＶ１６１７２１
Figure 2022547107000134
配列番号１５６：ＵＦＶ１７１１８７
Figure 2022547107000135
配列番号１５７：ＵＦＶ１７１１２０
Figure 2022547107000136
配列番号１５８：ＵＦＶ１７１１２１
Figure 2022547107000137
配列番号１５９：ＵＦＶ１７０９９４
Figure 2022547107000138
配列番号１６０：ＵＦＶ１７０９９５
Figure 2022547107000139
配列番号１６１：ＵＦＶ１８０２０８
Figure 2022547107000140
配列番号１６２：ＵＦＶ１８０２１７
Figure 2022547107000141
配列番号１６３：ＵＦＶ１７０２７８
Figure 2022547107000142
配列番号１６４：ＵＦＶ１７０２８２
Figure 2022547107000143
配列番号１６５：ＵＦＶ１６０５９５
Figure 2022547107000144
配列番号１６６：ＵＦＶ１６１１９６
Figure 2022547107000145
配列番号１６７：ＵＦＶ１６１１９８
Figure 2022547107000146
配列番号１６８：ＵＦＶ１６１１６９
Figure 2022547107000147
配列番号１６９：ＵＦＶ１７００６２
Figure 2022547107000148
配列番号１７０：ＵＦＶ１７００５１
Figure 2022547107000149
配列番号１７１：ＵＦＶ１７０４２８
Figure 2022547107000150
配列番号１７２：ＵＦＶ１７０４４０
Figure 2022547107000151
配列番号１７３：ＵＦＶ１７１２７２
Figure 2022547107000152
配列番号１７４：ＵＦＶ１７１２７３
Figure 2022547107000153
配列番号１７５：ＵＦＶ１７１２７４
Figure 2022547107000154
配列番号１７６：ＵＦＶ１７１２７５
Figure 2022547107000155
配列番号１７７：ＵＦＶ１７１２７６
Figure 2022547107000156
配列番号１７８：ＵＦＶ１７１２７７
Figure 2022547107000157
配列番号１７９：ＵＦＶ１７１２７８
Figure 2022547107000158
配列番号１８０：ＵＦＶ１７１２７９
Figure 2022547107000159
配列番号１８１：ＵＦＶ１７１２８０
Figure 2022547107000160
配列番号１８２：ＵＦＶ１６１４５４
Figure 2022547107000161
配列番号１８３：ＵＦＶ１６１４５３
Figure 2022547107000162
配列番号１８４：ＵＦＶ１６１４５９
Figure 2022547107000163
配列番号１８５：ＵＦＶ１６１４５１
Figure 2022547107000164
配列番号１８６：ＵＦＶ１６１４５８
Figure 2022547107000165
配列番号１８７：ＵＦＶ１６１４５０
Figure 2022547107000166
配列番号１８８：ＵＦＶ１６１４４８
Figure 2022547107000167
配列番号１８９：ＵＦＶ１７１１１６
Figure 2022547107000168
配列番号１９０：ＵＦＶ１７２５６１
Figure 2022547107000169
配列番号１９１：ＵＦＶ１７２５６３
Figure 2022547107000170
配列番号１９２：ＵＦＶ１７２５６４
Figure 2022547107000171
配列番号１９３：ＵＦＶ１７２５７１
Figure 2022547107000172
配列番号１９４：ＵＦＶ１７２５６２
Figure 2022547107000173
配列番号１９５：ＵＦＶ１７２５８８
Figure 2022547107000174
配列番号１９６：ＵＦＶ１７２５８３
Figure 2022547107000175
配列番号１９７：ＵＦＶ１７２５８５
Figure 2022547107000176
配列番号１９８：ＵＦＶ１８０６４２
Figure 2022547107000177
配列番号１９９：ＵＦＶ１８０６４５
Figure 2022547107000178
配列番号２００：ＵＦＶ１８０６４７
Figure 2022547107000179
配列番号２０１：ＵＦＶ１８１１０６
Figure 2022547107000180
配列番号２０２：ＵＦＶ１８１１０７
Figure 2022547107000181
配列番号２０３：ＵＦＶ１８１１０９
Figure 2022547107000182
配列番号２０４：ＵＦＶ１８１１１７
Figure 2022547107000183
配列番号２０５：ＵＦＶ１８１１１８
Figure 2022547107000184
配列番号２０６：ＵＦＶ１８１１２０
Figure 2022547107000185
配列番号２０７：ＵＦＶ１８０４８０（ＵＦＶ１８００８８ ＋ 天然の膜貫通（ＴＭ）ドメイン）
Figure 2022547107000186
配列番号２０８：ＵＦＶ１８００８８をコードするヌクレオチド配列
Figure 2022547107000187
配列番号２０９：ＵＦＶ１８０４８０（ＵＦＶ１８００８８ ＋ ＴＭドメイン）をコードするヌクレオチド配列
Figure 2022547107000188
配列番号２１０（ＵＦＶ１８００８８の最小配列）
Figure 2022547107000189
配列番号２１１（ＵＦＶ１８００８９の最小配列）
Figure 2022547107000190
配列番号２１２（ＵＦＶ１８００９０の最小配列）
Figure 2022547107000191

Claims (41)

  1. グループ２インフルエンザＡウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）のＨＡ１ドメイン及びＨＡ２ドメインを含む単量体インフルエンザＡ ＨＡステムポリペプチドであって、
    － 前記ＨＡ１ドメインのヘッド領域の欠失、
    － 前記ＨＡ２ドメインの三量体化領域の改変、
    － 少なくとも１つの単量体内システイン架橋を形成することができる少なくとも２つのシステイン残基
    を含むアミノ酸配列を含み、
    前記アミノ酸配列の３５５位のアミノ酸はＷであり、
    前記ＨＡステムポリペプチドアミノ酸配列におけるアミノ酸位置の番号付けは、参考株Ｈ３Ｎ２ Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／６８（配列番号１）の完全長ＨＡ番号付けに対応するＨ３番号付けである、ＨＡステムポリペプチド。
  2. ４３２位のアミノ酸はＩであるか、又は４３２位のアミノ酸はＩであり、及び３８０位のアミノ酸はＩである、請求項１に記載のポリペプチド。
  3. ３７８位のアミノ酸はＴであり、３７９位のアミノ酸はＮであり、及び／又は３８１位のアミノ酸はＶである、請求項１又は２に記載のポリペプチド。
  4. ４０１位でのＮ結合型グリコシル化のために４０１～４０３位に導入されたグリコシル化モチーフをさらに含む、請求項１、２又は３に記載のポリペプチド。
  5. 前記ＨＡ１ドメインの前記ヘッド領域の前記欠失は、５０位のアミノ酸に対応するアミノ酸から３０２位のアミノ酸に対応するアミノ酸までのアミノ酸配列を少なくとも含む欠失を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  6. 前記ＨＡ１ドメインの前記ヘッド領域の前記欠失は、４７位のアミノ酸から３０６位のアミノ酸までのアミノ酸配列を少なくとも含む、請求項５に記載のポリペプチド。
  7. 前記ＨＡ２ドメインの前記三量体化領域は、４０５位のアミノ酸に対応するアミノ酸から４１９位のアミノ酸に対応するアミノ酸までのアミノ酸配列を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  8. 前記三量体化ドメインの前記改変は、異種三量体化ドメインの導入を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  9. 前記異種三量体化ドメインはＧＣＮ４配列である、請求項８に記載のポリペプチド。
  10. 前記三量体化ドメインの前記改変は、Ｃヘリックスにおける７残基反復配列の改変を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  11. 前記ＨＡ２ドメインの前記改変三量体化領域は、アミノ酸配列４０５ＲＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫ４１９（配列番号９）又は４０５ＰＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫ４１９（配列番号１０）を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  12. ４２２位に対応する位置のシステインと組み合わせて３１０位に対応するアミノ酸位置のシステイン、又は４２２位に対応する位置のシステインと組み合わせて３１１位に対応するアミノ酸におけるシステイン、又は４１８位に対応する位置のシステインと組み合わせて３０８位に対応するアミノ酸位置のシステインを含み、前記システインは単量体内システイン架橋を形成することができる、請求項１～１１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  13. ４２２位に対応する位置のシステインと組み合わせて３１０位に対応するアミノ酸位置のシステインを含み、前記システインは前記少なくとも１つの単量体内システイン架橋を形成する、請求項１２に記載のポリペプチド。
  14. ３８８位のアミノ酸はＭである、請求項１～１３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  15. 少なくとも１つの追加導入されたグリコシル化モチーフを含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  16. 前記少なくとも１つの追加導入されたグリコシル化モチーフは、３９２位でのＮ結合型グリコシル化のために３９２～３９４位に、及び／又は３９３位でのＮ結合型グリコシル化のために３９３～３９５位に存在する、請求項１５に記載のポリペプチド。
  17. Ｂループ中のアミノ酸の１つ以上はＰに変異されている、請求項１～１６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  18. － ３１位のアミノ酸はＥであり、３４位のアミノ酸はＶである、
    － ３９２位のアミノ酸はＳ若しくはＰである、
    － ３９５位のアミノ酸はＴ若しくはＰである、
    － ３９９位のアミノ酸はＳ若しくはＰである、
    － ４３５位のアミノ酸はＮ若しくはＲである、及び／又は
    － ４３９位のアミノ酸はＹである、
    請求項１～１７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  19. 前記ＨＡステムポリペプチド単量体は、前記ＨＡ１ドメインと前記ＨＡ２ドメインとの間にプロテアーゼ切断部位を含まない、請求項１～１８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  20. ３２９位のアミノ酸はアルギニン（Ｒ）ではなく、好ましくは３２９位のアミノ酸はグルタミン（Ｑ）である、請求項１９に記載のポリペプチド。
  21. 前記ＨＡステムポリペプチド単量体は、天然の切断部位又は多塩基性の切断部位を含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  22. 前記ＨＡ１ドメイン及びＨＡ２ドメインは、Ｈ３亜型のＨＡを含むインフルエンザウイルス由来であり、好ましくはインフルエンザウイルスＡ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１／６８由来である、請求項１～２１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  23. 前記Ｈ３ ＨＡ及びＨＡ２ドメイン中のアミノ酸の１つ以上は、Ｈ７ ＨＡの対応するアミノ酸に変異されている、請求項２２に記載のポリペプチド。
  24. ２５位のアミノ酸はＫである、
    ３６７位のアミノ酸はＹである、
    ３７８位のアミノ酸はＴである、
    ４７５位のアミノ酸はＤである、
    ４７６位のアミノ酸はＤである、及び／又は
    ４７９位のアミノ酸はＡである、
    請求項２３に記載のポリペプチド。
  25. シグナル配列（の一部）を含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  26. トランケートされたＨＡ２ドメインを含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  27. ５１６位のアミノ酸に対応するアミノ酸で開始する前記ＨＡ２ドメインのＣ末端部分が少なくとも欠失している、請求項２６に記載のポリペプチド。
  28. ５０６位のアミノ酸に対応するアミノ酸で開始する前記ＨＡ２ドメインのＣ末端部分が欠失している、請求項２６又は２７に記載のポリペプチド。
  29. 前記ＨＡ１ドメインにおける前記ヘッド領域の前記欠失は、１～１０個のアミノ酸からなる連結配列によって置換されている、請求項１～２８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  30. ４０８位に対応する位置のシステインと組み合わせて３９６位に対応する位置にシステインを、又は４０８位に対応する位置のシステインと組み合わせて３９７位に対応する位置にシステインを、又は４０８位に対応する位置のシステインと組み合わせて３９８位に対応する位置にシステインを、又は４０５位に対応する位置のシステインと組み合わせて３９８位に対応する位置にシステインを含む、請求項１～２９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  31. ４０８位に対応する位置のシステインと組み合わせて３９８位に対応する位置にシステインを含む、請求項３０に記載のポリペプチド。
  32. 請求項１～３１のいずれか一項に記載のＨＡステムポリペプチド単量体を少なくとも２つ含む、多量体インフルエンザＡヘマグルチニン（ＨＡ）ステムポリペプチド。
  33. 請求項３０若しくは３１に記載のＨＡステムポリペプチド単量体を少なくとも２つ含む、多量体インフルエンザＡヘマグルチニン（ＨＡ）ステムポリペプチドであって、第１のＨＡステムポリペプチド単量体は第２の単量体に、前記第１の単量体の３９６位、３９７位若しくは３９８位のシステインと前記第２の単量体の４０８位のシステインとの間の単量体間ジスルフィド架橋によって連結されているか、又は第１のＨＡステムポリペプチド単量体は第２の単量体に、前記第１の単量体の３９８位のシステインと前記第２の単量体の４０５位のシステインとの間の単量体間ジスルフィド架橋によって連結されている、多量体インフルエンザＡヘマグルチニン（ＨＡ）ステムポリペプチド。
  34. 第１のＨＡステムポリペプチド単量体は第２の単量体に、前記第１の単量体の３９８位のシステインと前記第２の単量体の４０８位のシステインとの間の単量体間ジスルフィド架橋によって連結されている、請求項３３に記載の多量体インフルエンザＡヘマグルチニン（ＨＡ）ステムポリペプチド。
  35. 前記ポリペプチドは三量体である、請求項３０～３４のいずれか一項に記載の多量体ポリペプチド。
  36. 請求項１～３１のいずれか一項に記載のＨＡステムポリペプチド単量体をコードする核酸。
  37. 請求項３６に記載の核酸分子を含むベクター。
  38. 組換えアデノウイルスベクターである、請求項３７に記載のベクター。
  39. 請求項１～３１のいずれか一項に記載の単量体ＨＡステムポリペプチド、請求項３２～３５のいずれか一項に記載の多量体インフルエンザＨＡステムポリペプチド、請求項３６に記載の核酸、及び／又は請求項３７若しくは３８に記載のベクター、並びに薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
  40. インフルエンザウイルスに対する免疫応答の誘導に使用するための、請求項１～３１のいずれか一項に記載の単量体ＨＡステムポリペプチド、請求項３２～３５のいずれか一項に記載の多量体インフルエンザＨＡステムポリペプチド、請求項３６に記載の核酸、及び／又は請求項３７若しくは３８に記載のベクター。
  41. ワクチンとして使用するための、請求項１～３１のいずれか一項に記載の単量体ＨＡステムポリペプチド、請求項３２～３５のいずれか一項に記載の多量体インフルエンザＨＡステムポリペプチド、請求項３６に記載の核酸、及び／又は請求項３７若しくは３８に記載のベクター。
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