CN107074912B - 流行性感冒病毒疫苗及其用途 - Google Patents

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Abstract

此处提供了多种多聚体流行性感冒血球凝集素主干域多肽，用于提供多种血球凝集素主干域多肽的方法，包括这些多肽的组合物，包括这些多肽的疫苗及其使用方法，特别是在流行性感冒的检测、预防和/或治疗中的使用。

Description

流行性感冒病毒疫苗及其用途
引言
本发明涉及医学领域。此处提供了多种流行性感冒血球凝集素主干域多肽，提供多种血球凝集素主干域多肽的方法，包括这些多肽的组合物，包括这些多肽的疫苗及其使用方法，特别是在流行性感冒的检测、预防和/或治疗中的使用。
背景
流行性感冒病毒是主要的人病原体，引起呼吸系统疾病(通常称为“流行性感冒”或“流感”)，其严重性范围为从亚临床感染至可导致命的亡的原发性病毒性肺炎。感染的临床影响随着流行性感冒株的毒力和宿主的暴露、病史、年龄、以及免疫状态而变化。全世界每年估计大约10亿的人经受流行性感冒病毒感染，导致3-5百万例严重疾病以及估计300,000至500,000例流行性感冒相关死亡。这些感染大多数可能归因于携带H1或H3血球凝集素亚型的甲型流行性感冒病毒，较少程度由乙型流行性感冒病毒促成，并且因此所有三种的代表包括在季节性疫苗中。当前免疫实践依赖于流行的流行性感冒病毒的早期鉴别以允许及时生产有效的季节性流行性感冒疫苗。除了在预测将在下一季中占主导的毒株方面的固有困难之外，抗病毒耐受性以及免疫逃逸也在当前疫苗在防止发病率和死亡率上的失败中发挥作用。除此外，由起源于动物贮器的高毒力病毒株引起大流行并且重配而增加人与人传播的可能性构成了对全球健康的显著且现实的威胁。
甲型流行性感冒病毒广泛分布于自然中并且可感染多种鸟类以及哺乳动物。流行性感冒病毒是属于正粘病毒科的包膜RNA病毒。其基因组由八个单链RNA区段组成，这些区段编码11种不同的蛋白、一种核蛋白(NP)、三种聚合酶蛋白(PA、PB1、以及PB2)、两种基质蛋白(M1以及M2)、三种非结构性蛋白(NS1、NS2、以及PB1-F2)、以及两种外膜糖蛋白：血球凝集素(HA)以及神经氨酸酶(NA)。这些病毒是基于HA以及NA蛋白的抗原结构的区别而分类的，其不同组合表示独特的病毒亚型，这些亚型进一步被分类为特异的流行性感冒病毒株。尽管所有已知的亚型都可以在鸟类中发现，当前流行的人甲型流行性感冒亚型是H1N1以及H3N2。系统发育分析已证实血球凝集素细分为两个主要的组：尤其在系统发育组1中的H1、H2、H5以及H9亚型，以及尤其系统发育组2中的H3、H4以及H7亚型。
乙型流行性感冒病毒株是严格地针对人的。乙型流行性感冒病毒株内的HA中的抗原变化小于甲型株内观察到的那些。乙型流行性感冒病毒的两个遗传上和抗原性上不同的谱系在人中流行，如由B/山形/16/88(也称为B/山形)以及B/维多利亚/2/87(B/维多利亚)谱系(弗格森(Ferguson)等人，2003)代表的。尽管由乙型流行性感冒病毒引起的疾病的光谱通常比由甲型流行性感冒病毒引起的更加温和，仍频繁观察到需要住院治疗的严重疾病具有乙型流行性感冒感染。
已知中和该流行性感冒病毒的抗体主要针对血球凝集素(HA)。血球凝集素或HA是一种三聚体糖蛋白，其被锚定到病毒衣并且具有双功能：它负责结合到细胞表面受体唾液酸并且摄取之后它介导病毒和内涵体膜的融合，导致在该细胞的胞液中释放病毒RNA。HA包括大的头部域以及较小的主干域。附接至该病毒膜是通过连接至该主干域的C-末端锚定序列介导的。该蛋白在指定的环中被翻译后切割以产生两种多肽，即HA1和HA2(全长序列被称为HA0)。膜远端头部区主要来源于HA1，并且膜近端主干区主要来自HA2(图1)。
季节性流行性感冒疫苗必须每年更新的原因是该病毒的大的可变性。在血球凝集素分子中，此变化具体地显现在头部域，其中抗原漂移和移位导致大量的不同变体。由于这也是免疫显性的区域，大部分中和抗体是针对此域并且通过干扰受体结合起作用。该头部域的免疫显性和大的变化的组合也解释了用具体株进行感染为什么不会导致对其他株的免疫：通过第一次感染引发的抗体仅识别有限数目的与原发性感染的病毒紧密相关的毒株。
近来，已描述了缺少所有或基本上所有流行性感冒血球凝集素球状头部域的流行性感冒血球凝集素主干域多肽，并且将其用于产生对该主干域多肽的一个或多个保守表位的免疫应答。认为该主干域多肽的表位比球状头部域的高免疫原性区域具有较小免疫原性，因此在该主干域多肽中缺少球状头部域可能允许发展针对该主干域多肽的一个或多个表位的免疫应答(斯蒂尔(Steel)等人，2010)。斯蒂尔(Steel)等人因此通过使A/波多黎各/8/1934(H1N1)以及A/香港/1968(H3N2)株的来自HA一级序列的HA1的氨基酸残基53至276缺失并且将其用短的柔性连接序列GGGG替代而建立了新的分子。用H3HK68构建体对小鼠进行疫苗接种不会引发与组1 HA具有交叉反应性的抗血清。此外，如示于PCT/EP 2012/073706，这些主干域多肽是高度不稳定的并且不会采取如通过缺少抗体结合(显示结合到该主干区中的保守表位)证明的正确构象。
此外，博姆玛坎蒂(Bommakanti)等人(2010)描述了基于HA2的多肽，其包括HA2的氨基酸残基1-172、7-氨基酸接头(GSAGSAG)、HA1的氨基酸残基7-46、6-氨基酸接头GSAGSA，随后为HA1的残基290-321，在HA1中具有突变V297T、I300E、Y302T以及C305T。该设计是基于H3HA的序列(A/香港/1968)。该多肽仅提供针对H3亚型(A/Phil/2/82)内的另一个流行性感冒病毒株的交叉保护，而不提供针对H1亚型(A/PR/8/34)的交叉保护。在博姆玛坎蒂(Bommakanti)等人(2012)的一篇更近的论文中，描述了来自H1N1 A/波多黎各/8/1934(H1HA0HA6)的基于HA的主干域序列。在此多肽中，残基55至302的等价物已经缺失，并且已经进行了突变I311T、V314T、I316N、C319S、F406D、F409T、以及L416D。基于H3的多肽和基于HA的多肽两者都表达于大肠杆菌，并且因此缺少作为天然存在的HA蛋白的一部分的聚醣。当表达于大肠杆菌中时，该多肽主要作为高分子量聚集体和小单体部分回收。以两个表观解离常数即9和0.2μM，该多肽结合CR6261。作者们显示用佐以100μg的CpG7909的20μg的蛋白免疫(两次，4周间隔)之后，小鼠可幸存于用同源H1N1 A/波多黎各/8/1934病毒的1LD90进行的激发。作者们也描述了循环置换的多肽可比得上以上针对A/香港/1/1968衍生的多肽所述的那些。这些多肽是来源于来自H1N1 A/波多黎各/8/1934、H1N1 A/北卡罗来纳州/20/99或H1N1 A/加利福尼亚/07/2009的HA，并且在H1N1 A/波多黎各/8/1934(即相同亚型内)的小鼠的温和激发(1LD90)模型中可提供部分保护。当在中和测定中测试时，来自用这些多肽免疫的豚鼠的血清未展现可检测水平的中和。
最近，陆(Lu)等人(2013)也描述了来源于H1N1 A/加利福尼亚/05/2009的HA的可溶主干域(stem domain)多肽。在最终设计中，残基54-303的等价物(根据SEQ ID NO:1编号)已经被缺失(前导序列，残基1-17也是不存在的)，并且已经在该蛋白质的B环中引入了两个突变，即F407D和L413D。此外，该多肽包含C-末端三聚域(折叠子)。此外，还引入了两个内部单体二硫桥，一个在三聚折叠子域的区域内，并且一个在位置430和431处。该多肽在基于大肠杆菌的无细胞系统中产生(因此缺乏作为天然存在的HA蛋白的一部分的聚糖)，并且以变性形式回收，它需要在使用前重折叠。没有显示对流行性感冒激发数据的免疫学或保护，因此该多肽的免疫原性和功效是未知的。
在最近的一篇论文中，马拉乔斯宇拉(Mallajosyula)等人(2014)也报道了主干域多肽。在此设计中，基于来自H1N1 A/波多黎各/8/1934的HA，不仅HA1序列的很大一部分被缺失(残基42至289，根据SEQ ID NO:1编号)，还有HA2的N-末端和C-末端序列的很大一部分(分别为残基344至383和457至565)也被缺失。值得注意的是，在H3HA蛋白中，缺失部分包含广泛中和表位，例如，CR8020和CR8043的那些。该多肽在C-末端再次包含折叠子三聚域，并也在大肠杆菌中产生，所以在病毒的HA上缺乏天然存在的聚糖。该多肽结合广泛中和性抗体，并且是CR6261、F10和FI6v3。该多肽也在流行性感冒激发模型(H1N1 A/波多黎各/8/1934的1LD90)中进行测试，并能保护小鼠免于死亡。来源于H1N1 A/新喀里多尼亚/20/1999和H1N1 A/加利福尼亚/04/2009的HA的等价多肽也可以部分地保护。来源于H5N1 A/越南/1203/2004的等价多肽在这种激发模式中只给出有限的保护。此外，仅使用一种流行性感冒株以相对低剂量给予(1-2LD90)来激发动物，因此尚未建立通用疫苗的先决条件的针对多种流行性感冒株的保护。
因此仍存在对安全且有效的通用疫苗的需要，该疫苗刺激产生稳固的广泛中和抗体应答，并且提供针对当前和未来流行性感冒病毒株(季节性和大流行两者)的广泛集合的保护，具体而言提供针对系统发育组1和/或组2内一个或多个甲型流行性感冒病毒亚型的保护，以有效预防和治疗流行性感冒。
概述
此处提供了多种流行性感冒血球凝集素主干域多肽，提供多种主干域多肽的方法，包括这些多肽的组合物，包括这些多肽的疫苗及其使用方法。
在第一方面，本发明提供了新的免疫原性多聚体多肽，这些多肽包括流行性感冒血球凝集素主干域并且缺少球状头部，称为流行性感冒血球凝集素(HA)主干域多肽。当给予至受试者(具体而言人类受试者)时，这些多聚体多肽能够诱导免疫应答。在不存在优势表位(存在于膜远端头部域中)的情况下，本发明的多肽将膜近端主干域HA分子的保守表位呈递给免疫系统。为此，构成该头部域的HA0蛋白的一级序列的部分被去除，并且剩下的氨基酸序列直接地或在一些实施例中通过引入短的柔性连接序列(‘接头’)再连接以恢复氨基酸链的连续性。所得到的序列通过引入特定突变被进一步修饰，这些特定突变稳定了该HA0分子的剩下部分的天然3-维结构。这些多肽不包括流行性感冒病毒的全长HA1和/或HA2。
本发明提供新的多聚体流行性感冒血球凝集素主干域多肽，其中所述多聚体多肽包括至少一个第一和一个第二流行性感冒血球凝集素主干域单体，所述第一和第二单体各自包括：(a)流行性感冒血球凝集素HA1域，它包括HA1 N-末端主干区段，该HA1 N-末端主干区段通过具有0-50个氨基酸残基的连接序列与HA1 C-末端主干区段共价连接，其中所述HA1 C-末端区段连接到(b)流行性感冒血球凝集素HA2域，其中所述HA1 N-末端区段包括HA1的氨基酸1-x，优选地是HA1的氨基酸p-x，并且其中该HA1 C-末端主干区段包括HA1的氨基酸y-C-末端氨基酸，和
(c)其中该多肽不包括在HA1和HA2之间的接合处的蛋白酶切割位点；并且
(d)其中该第一单体通过该第一单体的位置411上的氨基酸与该第二单体的位置419上的氨基酸之间的二硫桥连接到所述第二单体上。
根据本发明，该二硫桥因此形成多聚体中个体单体之间的共价交联。
在某些实施例中，该多聚体多肽是三聚体，即包括三个单体。根据本发明，每个单体通过一个单体的位置411上的氨基酸与另一个单体的位置419上的氨基酸之间的二硫桥连接到另一个单体上。应注意，所使用的编号与SEQ ID NO:1有关。本领域的普通技术人员将能够确定在其他HA序列中的等价位置。
在某些实施例中，该HA1和HA2域来源于从系统发育组1衍生的甲型流行性感冒病毒亚型。
在某些实施例中，该HA1和HA2域来源于包含H1亚型的HA的甲型流行性感冒病毒亚型。
在某些实施例中，x＝SEQ ID NO:1的位置52(或在另一个血球凝集素的等价位置)上的氨基酸，p＝SEQ ID NO:1的位置18(或在另一个血球凝集素的等价位置)上的氨基酸，并且y＝SEQ ID NO:1的位置321(或在另一个血球凝集素的等价位置)上的氨基酸。在某些实施例中，该HA1 N-末端主干区段包括HA1的氨基酸1-52，并且该HA1 C-末端主干区段包括HA1的氨基酸321-端(即HA1的C-末端氨基酸)。因此，在某些实施例中，该HA1区段中的缺失包括从在位置53处的氨基酸直至在位置320处的氨基酸并且包括在位置320处的氨基酸的氨基酸序列。在某些实施例中，这些多肽不包括信号序列。在某些实施例中，该HA1 N-末端区段因此包括HA1的氨基酸18-52，其中p是该成熟HA分子的第一氨基酸(例如在SEQ ID NO:1的情况下p＝18)。
在某些实施例中，该HA1和HA2域来源于从系统发育组2衍生的甲型流行性感冒病毒亚型。
在某些实施例中，该HA1和HA2域来源于包含H3亚型的HA的甲型流行性感冒病毒亚型。
因此，本发明的多聚体多肽包括至少两个单体，每个单体包含HA1域和HA2域，所述HA1域包含HA1 N-末端区段，该HA1 N-末端区段直接抑或通过连接序列与HA1 C末端区段连接。在某些实施例中，该HA2域的N-末端氨基酸直接连接至该HA1 C-末端区段的C-末端氨基酸。
在某些实施例中，这些多肽包含完整的HA2域，即该HA2域包括跨膜域和细胞内序列。在某些实施例中，这些单体的HA2域已被截短。因此,在某些实施例中，本发明的多肽不包含HA的细胞内序列以及跨膜域。在某些实施例中，从该HA2域的位置514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、526、528、529、或530(或等价物)至该HA2域的C末端的氨基酸序列已被去除。
根据本发明，该HA1 C-末端主干区段的C-末端氨基酸连接至HA2域的N-末端氨基酸，从而形成了HA1域和HA2域之间的接合处。本发明的这些多肽不包含在HA1和HA2域之间的接合处的蛋白酶切割位点。在某些实施例中，该HA1 C-末端主干区段的C-末端氨基酸残基(SEQ ID NO:1中的氨基酸343)是除了精氨酸(R)或赖氨酸(K)，优选地是谷氨酰胺(Q)的任何氨基酸。
在本发明的这些免疫原性多肽中的流行性感冒血球凝集素主干域单体实质上比HA0小，优选地缺少所有或基本上所有的HA的球状头部。优选地，这些免疫原性单体长度上不超过360，优选地不超过350、340、330、320、310、305、300、295、290、285、280、275、或270个氨基酸。在某些实施例中，这些免疫原性多肽是从约250至约350，优选地从约260至约340，优选地从约270至约330。
本发明的多肽不包括全长HA1。
在某些实施例中，这些多肽是糖基化的。
根据本发明，相比于野生型HA,具体地是该HA1和HA2域所基于的HA的氨基酸序列，这些多肽进一步在该HA1和/或HA2域中包括一个或多个另外的突变。
在某些实施例中，本发明的多肽包括组1交叉中和抗体CR6261(如披露于WO 2008/028946)和/或抗体CR9114(如描述于WO 2013/007770)的保守主干域表位，该抗体CR9114是能够结合到并且中和组1和组2甲型流行性感冒病毒两者、连同乙型流行性感冒病毒的一种抗体。因此本发明的另一个方面是提供多种HA主干域多肽，其中所述多肽稳定地呈递抗体CR6261和/或CR9114的表位，如通过所述一个抗体或多个抗体结合至所述多肽表明的。
在某些实施例中，这些多肽不结合到CR8020以及CR8057(描述于WO 2010/130636)，它们是仅结合到H3流行性感冒病毒的单克隆抗体。此处提供的流行性感冒血球凝集素主干域多肽适合用于能够针对多个甲型和/或乙型流行性感冒病毒株，发生免疫应答的免疫原性组合物(例如疫苗)中。
在某些实施例中，本发明的多肽包括组2交叉中和抗体CR8020的保守主干域表位(描述于WO 2010/130636中)。
在某些实施例中，这些流行性感冒血球凝集素主干域多肽能够针对系统发育组1和/或组2的甲型流行性感冒病毒株发生免疫应答，特别是针对系统发育组1和组2两者的流行性感冒病毒株。在一个实施例中，这些多肽能够针对同源流行性感冒病毒株发生免疫应答。在一个实施例中，这些多肽能够针对相同和/或不同亚型的异源流行性感冒病毒株发生免疫应答。在另一个实施例中，这些多肽能够对系统发育组1和组2两者的流行性感冒病毒株以及乙型流行性感冒病毒株发生免疫应答。
根据本发明的多肽可用于例如孤立型治疗和/或预防和/或诊断由流行性感冒病毒、特别是系统发育组1或2甲型流行性感冒病毒和/或乙型流行性感冒病毒引起的一种疾病或病况，或与其他预防和/或治疗性处理例如(现存的或未来的)疫苗、抗病毒剂和/或单克隆抗体组合。
在另一个方面，本发明提供编码这些流行性感冒HA主干域多肽的核酸分子。在又另一个方面，本发明提供包括编码这些免疫原性多肽的核酸的载体。
在另一个方面，本发明提供在受试者中诱导免疫应答的方法，该方法包括向该受试者给予根据本发明的多肽和/或核酸分子。
在另一个方面，本发明提供包括根据本发明的多肽和/或核酸分子的免疫原性组合物。此处提供的这些免疫原性组合物可以处于任何允许将这些组合物给予至受试者例如小鼠、白鼬或人的形式。在特定实施例中，这些免疫原性组合物适合于人给药。这些多肽、核酸分子以及组合物可用于预防和/或治疗流行性感冒病毒疾病的方法中和/或用于诊断目的。这些组合物可进一步包括药学上可接受的载体或赋形剂。在某些实施例中，此处描述的组合物包括佐剂或与佐剂组合给予。
在另一个方面，本发明提供用作疫苗的多肽、核酸和/或免疫原性组合物。本发明具体而言涉及用于在预防和/或治疗由系统发育组1和/或2的甲型流行性感冒病毒亚型和/或乙型流行性感冒病毒引起的疾病或病况中用作疫苗的免疫原性多肽、核酸和/或免疫原性组合物。
根据本发明的多肽的不同实施例以及用途将从以下本发明的详细描述中变得清晰。
附图简要说明
图1显示了如以天然三聚体存在的处于融合前状态的HA单体的模型。HA1是以浅灰色显示，HA2是以深灰色显示。指明了螺旋A(CR6261的表位的重要部分)以及螺旋CD(三聚体接口的部分)，还指明了连接这些二级结构元素的环。也指明了HA1的C-末端以及HA2的N-末端。融合肽位于HA2的N-末端。
图2.针对以下的CR9114夹心ELISA结果：
(A)来自H1N1 A/布里斯班/59/2007的处于三聚体和单体形式的纯化的可溶性HA
(B)从表达s127H1(SEQ ID NO:66)、s127H1-t2(SEQ ID NO:91)的培养物获得的培养基；出于比较的原因，也显示了FL HA三聚体和单体的数据
(C)55G7-t2的双半胱氨酸突变体变体(SEQ ID NO:166至176)
(D)127H1-t2的双半胱氨酸变体(SEQ ID NO:177至187)
图3.在还原(A，C)和在非还原条件(B，D)下，表达55G7(A、B)和127H1-t2(C、D)的双半胱氨酸变体的培养物的培养基的蛋白质印迹。每个泳道上方的这些数字指的是如表10中所列的半胱氨酸突变簇。
图4.本发明的多肽的结构模型，指示了在127H1-t2-c18中突变为半胱氨酸的残基411和419的位置。通过从H1N1 A/加利福尼亚/04/2009(PDB3LZG)的全长HA的结构中缺失残基53至320来建立该模型。
图5.(A).在具有另外的C-末端his-标签的s127H1-t2-cl18长(SEQ ID NO:181)的纯化期间，来自制备型尺寸排阻柱(Superdex 200)的洗脱图。级分如下图所示。
(B)在非还原(左)和还原条件(右)下，从尺寸排阻柱收集的级分的SDS-PAGE分析。泳道上的数字对应于图5A，M表示分子量标记物。
(C)级分1-4的非变性PAGE。泳道上的数字对应于图5A，M表示分子量标记物。
(D)级分1-4的蛋白质印迹，使用多克隆抗his-标签抗体用于检测。泳道上的数字对应于图5A，M表示分子量标记物。
图6.广泛中和抗体CR6261和CR9114与级分1至4中的多肽结合的Elisa结果，如图5所示。还包括与多克隆抗H1 Ha血清和组2特异性单克隆抗体CR8020的结合。出于比较的原因，还显示了来自处于单体和三聚体形式的H1N1 A/布里斯班/59/2007的可溶性HA的结果。
图7.级分1至4的CR9114夹心ELISA结果，如图5所示。出于比较的原因，还显示了来自处于单体和三聚体形式的H1N1 A/布里斯班/59/2007的可溶性HA的结果。
图8.在不存在和存在CR8020(顶图)、CR6261或CR9114(两个底图)的Fab片段的情况下，级分3的多肽的SEC-MALS结果。与CR9114和CR6261的Fab片段的复合物形成导致分子量的增加和峰的移动。
图9.如通过双层干涉技术确定的广泛中和抗体CR6261和CR9114与s127H1-t2-cl18long的结合。A和C显示暴露于变化浓度的s127H1-t2-cl18长的固定化单克隆抗体的个体结合曲线；B和D显示用以估计Kd的稳态分析。
图10.阴性对照(PBS，按3周间隔3次免疫)和阳性对照(15mg/kg CR6261，激发前1天)组的存活率(A)、相对体重减轻(B)和临床得分(C)。在最后一次免疫后四周，用致命的剂量(25xLD50)的H1N1 A/波多黎各/8/34激发小鼠并监测21天。误差条表示95％置信区间(B)或四分位数间距(C)。
图11.在10μg基质-M存在下，用30μg s127H1-t2-cl18长进行免疫1次(A)、2次(B)、或3次(C)的组的存活率。在最后一次免疫后四周，用致命的剂量(25xLD50)的H1N1 A/波多黎各/8/34激发小鼠并监测21天。出于比较的原因，还显示了阴性对照组(PBS)。
图12.在10μg基质-M存在下，用30μg s127H1-t2-cl18长进行免疫1次(A)、2次(B)、或3次的组的相对体重变化。在最后一次免疫后四周，用致命的剂量(25xLD50)的H1N1 A/波多黎各/8/34激发小鼠并监测21天。出于比较的原因，还显示了阴性对照组(PBS)。误差条表示95％置信区间。
图13.在10μg基质-M存在下，用30μg s127H1-t2-cl18长进行免疫1次(A)、2次(B)、或3次的组的临床得分。在最后一次免疫后四周，用致命的剂量(25xLD50)的H1N1 A/波多黎各/8/34激发小鼠并监测21天。出于比较的原因，还显示了阴性对照组(PBS)。误差条表示四分位数间距。
图14.使用s127H1-t2-cl18长(A)或全长HA(B)的可溶形式作为抗原，阴性对照组和的实验组的激发前血清(最后一次免疫后4周)的ELISA结果。条表示中值。
图15.用本发明的佐有基质-M的多肽s127H1-t2-cl18长免疫后,在最终免疫后4周(激发前时间点)诱导的抗体能够在竞争ELISA(顶图)中与CR9114针对结合来自H1N1 A/布里斯班/59/07的全长HA进行竞争。出于比较的原因，在独立的底图中指明了未标记的CR9114(即自我竞争)和非结合单克隆抗体CR8020(两者都从5μg/ml起始浓度连续稀释)的竞争水平。条表示中值。
图16.阴性对照(PBS，按3周间隔3次免疫)和阳性对照(15mg/kg CR6261，激发前1天)组的(A)存活率。在最后一次免疫后四周，用致命的剂量(12.5xLD50)的H5N1 A/香港/156/97激发小鼠。在10μg基质-M存在下，用30μg s127H1-t2-cl18长免疫3次的组的(B)存活率、(C)相对体重变化和(D)中值临床得分。误差条表示95％置信区间(C)或四分位数间距(D)。在最后一次免疫后四周，用致命的剂量(12.5xLD50)的H5N1 A/香港/156/97激发小鼠并监测21天。出于比较的原因，阴性对照组(PBS)还示于B、C、D中。
图17.使用来自多个组1(H1、H5和H9)和组II(H3和H7)流行性感冒株的全长HA作为抗原，如实例7中所述的用本发明的多肽s127H1-t2-cl18长免疫3次的小鼠的血清的Elisa结果。
图18.阴性对照(PBS，按3周间隔3次免疫)和阳性对照(15mg/kg CR6261，激发前1天)组的(A)存活率。在最后一次免疫后四周，用致命的剂量(12.5xLD50)的H1N1 A/布里斯班/59/2007激发小鼠。在10μg基质-M存在下，用30μg s127H1-t2-cl18长免疫3次的组的(B)存活率、(C)相对体重变化和(D)中值临床得分。误差条表示95％置信区间(C)或四分位数间距(D)。在最后一次免疫后四周，用致命的剂量(12.5xLD50)的H1N1 A/布里斯班/59/2007激发小鼠并监测21天。出于比较的原因，阴性对照组(PBS)还示于B、C、D中。
图19.使用来自用本发明的多肽s127H1-t2-cl18长或PBS免疫的小鼠的血清的拟颗粒中和测定。在来自用本发明的多肽免疫的动物的血清的高血清浓度下观察到中和。
图20.抗体依赖性细胞毒性(ADCC)替代测定。使用来自H5N1 A/香港/156/97(A)或与H1N1 A/布里斯班/59/07(B)的FL HA转染的靶细胞作为抗原的来源，来自用本发明的多肽s127H1-t2-cl18长免疫的小鼠的血清展示在最高血清浓度下的FcγRIV信号转导活性的30-40倍诱导。
图21.A：CR9114夹心ELISA，用于检测本发明的多聚体形式的多肽(由它们的SEQID NO指示)。将培养基以3倍步骤稀释并且分析。B：CR9114通过ELISA结合本发明的多肽(由它们的SEQ ID NO指示)。将培养基以3倍步骤稀释并且分析。C：CR6261通过ELISA结合本发明的多肽(由它们的SEQ ID NO指示)。将培养基以3倍步骤稀释并且分析。D：CR8020通过ELISA结合本发明的多肽(由它们的SEQ ID NO指示)。将培养基以3倍步骤稀释并且分析。对于纯化的蛋白质(SEQ ID NO:186以及处于三聚体和单体形式的全长HA)，使用5μg/ml的起始浓度。所有多肽包含C-末端因子X可裂解his标签序列。
图22.表达本发明的多肽(由它们的SEQ ID NO指示)的培养物上清液的蛋白质印迹，在还原条件下单体间二硫桥被还原，并且本发明的多肽在凝胶上是单体的(左图)。在氧化条件下，单体间二硫桥保持完整，并且本发明的多肽在凝胶上表现为三聚体。对于SEQ IDNO:186，在本实验中使用纯化的三聚体。
图23.如实例16所述的NHP免疫后获得的血清IgG ELISA效价(抗原全长HA)。图A-F中的HA来源于组1流行性感冒株(在图中鉴定)，图G-J中的HA来源于组2流行性感冒株。使用基于斜率的加权平均方法分析数据。开放符号表示LOD处的测量。条表示中值。
图24.如实例16中所述NHP免疫后获得的血清IgG CR9114竞争结合。使用如图A-C中所鉴定的来自3种不同毒株的FL HA。显示的数据是组中值，误差条表示四分位数间距。
图25.使用如实例16所述免疫接种NHP后获得的血清中的ADCC生物测定效应细胞确定的替代ADCC活性。使用用表达来自3种不同毒株的FL HA的DNA转染的细胞(在图A-C中鉴定)。数据表示为诱导倍数，它是在不存在血清下与背景信号相比的每次测量的信号。线表示个体动物，符号表示一式两份每个血清浓度的平均值。
图26.使用如实例16中所述的NHP免疫后获得的血清的微量中和测定。读数是在连续稀释的血清存在下用每孔100TCID50H5N1 A/HK/156/97孵育16小时后的固定细胞中的基于ELISA的NP的定量。线表示个体动物，符号表示一式两份每个血清浓度的平均值。
图27.实例16所述的实验中包括的非人灵长类动物的温度升高曲线下的面积。每只动物，在开始免疫之前使用21天的窗口重建参考的24小时体温周期。通过从激发后随访期间测量的体温减去加有95％CI的上限的参考体温来计算在21天激发后随访期的期间的体温的净增加。随后以0-3天、0-8天和0-21天的间隔计算净温度升高的AUC。使用具有用于多重比较的杜克-克莱默(Tukey-Kramer)调节的成对t检验来进行治疗之间的统计分析。条表示中值。由于数据记录器故障，没有数据动物J10014(SEQ ID NO:186+基质-M组)。动物Ji0403061(Inflexal组)在第8天结束时死亡，并从0-21天的间隔计算中排除。
图28.血清转移和用如实例17中所述的H5N1 A/香港/156/97激发后的小鼠的存活率(A)和％体重变化(B)。
图29.第70天的供体小鼠(D)和血清转移(-4天)或激发(第0天)之前的受体小鼠(R)的全长HA(H1N1 A/布里斯班/59/2007)ELISA效价。使用基于斜率的加权平均方法分析数据。开放符号表示LOD处的测量。条表示中值。
图30.用如实例18中所述的H1N1 A/布里斯班/59/2007免疫和激发后的小鼠的存活率(A)和％体重变化(B)。
图31.A：如实例18中所述进行免疫的小鼠的全长HA(H1N1 A/布里斯班/59/2007)ELISA效价。使用基于斜率的加权平均方法分析数据。开放符号表示LOD处的测量。条表示中值。B：如实例18中所述小鼠免疫后获得的血清IgG CR9114竞争结合。将来自H1N1 A/布里斯班/59/2007的FL HA用作抗原。显示的数据是组中值，误差条表示四分位数间距。
图32.用如实例19中所述的H1N1 A/荷兰/602/09免疫和激发后的小鼠的存活率(A)和％体重变化(B)。
图33.A：如实例19中所述进行免疫的小鼠的全长HA(H1N1 A/布里斯班/59/2007)ELISA效价。使用基于斜率的加权平均方法分析数据。开放符号表示LOD处的测量。条表示中值。B：如实例19中所述小鼠免疫后获得的血清IgG CR9114竞争结合。将来自H1N1 A/布里斯班/59/2007的FL HA用作抗原。显示的数据是组中值，误差条表示四分位数间距。
图34.用如实例20中所述的H5N1 A/香港/156/97免疫和激发后的小鼠的存活率(A)和％体重变化(B)。
图35.A：如实例20中所述进行免疫的小鼠的全长HA(H1N1 A/布里斯班/59/2007)ELISA效价。使用基于斜率的加权平均方法分析数据。开放符号表示LOD处的测量。条表示中值。B：如实例20中所述小鼠免疫后获得的血清IgG CR9114竞争结合。将来自H1N1 A/布里斯班/59/2007的FL HA用作抗原。显示的数据是组中值，误差条表示四分位数间距。
图36.用如实例21中所述的H1N1 A/波多黎各/8/34免疫和激发后的小鼠的存活率(A)和％体重变化(B)。
图37.A：如实例21中所述进行免疫的小鼠的全长HA(H1N1 A/布里斯班/59/2007)ELISA效价。使用基于斜率的加权平均方法分析数据。开放符号表示LOD处的测量。条表示中值。B：如实例21中所述小鼠免疫后获得的血清IgG CR9114竞争结合。将来自H1N1 A/布里斯班/59/2007的FL HA用作抗原。显示的数据是组中值，误差条表示四分位数间距。
图38：用本发明的多肽瞬时转染后的Hek293F细胞培养物上清液的蛋白质印迹(多克隆抗H1)。
定义
以下给出如本发明中所用的术语的定义。
根据本发明的氨基酸可以是二十种天然存在(或‘标准’氨基酸)的任一种或其变体，比如例如D-脯氨酸(脯氨酸的D-对映体)或在蛋白质中未天然发现的任何变体，比如例如正亮氨酸。这些标准氨基酸可以基于其性质分成若干群组。重要因素是电荷、亲水性或疏水性、尺寸以及官能团。这些性质对于蛋白质结构和蛋白质-蛋白质相互作用来说是重要的。一些氨基酸具有特殊的性质，例如可以与其他半胱氨酸残基形成共价二硫键(或二硫桥)的半胱氨酸，形成到多肽主链的环的脯氨酸，以及比其他氨基酸更灵活的甘氨酸。表1展示这些标准氨基酸的缩写和性质。
术语“氨基酸序列一致性”是指一对对齐的氨基酸序列之间的一致性或相似性程度，通常表示为百分比。百分比同一性是以下候选序列中的氨基酸残基百分比，该候选序列与在比对序列并且引入缺口(如果必要的话，以实现最大序列同源性百分比)之后该肽中的对应氨基酸残基是相同的(即，比对中在给出位置处的氨基酸残基是相同的残基)或相似的(即，比对中在给出位置处的氨基酸取代是保守性取代，如以下讨论的)。序列同源性包括序列一致性以及相似性的百分比是使用本领域中熟知的序列比对技术确定的，例如通过目测以及数学计算，或更优选地，该比较是通过使用计算机程序比较序列信息进行的。一个示例性的、优选的计算机程序是遗传学计算机组(GCG；麦迪逊，威斯康星州)威斯康星程序包版本10.0的程序，‘GAP’(德弗罗(Devereux)等人(1984))。
“保守性取代”是指一类的氨基酸被相同类的另一个氨基酸替代。在具体的实施例中，保守性取代不改变多肽的结构或功能，或两者。用于保守性取代目的的氨基酸类别包括疏水的(例如Met，Ala，Val，Leu)、中性亲水(例如Cys，Ser，Thr)、酸性(例如Asp，Glu)、碱性(例如Asn，Gln，His，Lys，Arg)、构象打断者(例如Gly，Pro)以及芳香族的(例如Trp，Tyr，Phe)。
如此处使用的，术语“疾病”以及“障碍”可互换地使用，以指代受试者中的病况。在一些实施例中，该病况是病毒感染，特别是流行性感冒病毒感染。在特定实施例中，术语“疾病”是指由于病毒在细胞或受试者中的存在、或通过该病毒对细胞或受试者的侵染导致的病理状态。在某些实施例中，该病况是受试者中的疾病，其严重性通过给予免疫原性组合物来诱导该受试者中的免疫应答而被降低。
如此处使用的，在向受试者给予治疗的背景下术语“有效量”是指具有一个或多个预防和/或治疗效果的治疗的量。在某些实施例中，在向受试者给予治疗的背景下术语“有效量”是指足够实现如下的治疗量：流行性感冒病毒感染、与其相关的疾病或症状的严重性的减少或改进，例如但不限于流行性感冒病毒感染、与其相关的疾病或症状的持续时间减少，对流行性感冒病毒感染、与其相关的疾病或症状的进展的预防，对流行性感冒病毒感染、与其相关的疾病或症状的发展或发作或复发的预防，流行性感冒病毒从一个受试者传播至另一个受试者的情况的预防或减少，受试者住院和/或住院时间长短的减少，患有流行性感冒病毒感染或与其相关的疾病的受试者的存活率的增加，流行性感冒病毒感染或与其相关的疾病的消除，流行性感冒病毒复制的抑制或减少，流行性感冒病毒滴度的减少；和/或另一种治疗的一个或多个预防或治疗作用的增强和/或改进。在某些实施例中，该有效量不导致免受流行性感冒病毒疾病的完全保护，但比较于未治疗的受试者导致更低的滴度或减少数目的流行性感冒病毒。流行性感冒病毒的滴度、数目或总负担上的减少的益处包括但不限于该感染的严重症状更少，该感染的症状更少，并且与该感染关联的疾病的时间长短上减少。
如在此所用，术语“宿主”意欲指已经引入了载体(例如克隆载体或表达载体)的生物体或细胞。生物体或细胞可以是原核或真核的。优选地，宿主包括被分离的宿主细胞，例如培养物中的宿主细胞。术语“宿主细胞”仅意味着这些细胞被修饰以(过度)-表达本发明的多肽。应理解，术语宿主意欲不仅指具体主题生物体或细胞，而且还指此类生物体或细胞的子代。因为某些修饰可以由于或者突变或者环境影响而在后代中发生，所以此类子代可以实际上与亲本生物体或细胞不相同，但仍包括在如在此所用的术语“宿主”的范围内。
如在此所用，术语“包括(included)”或“包括着(including)”被视为后面有措辞“无限制”。
如此处使用的，术语“感染”意指通过病毒在细胞或受试者中的扩增和/或存在进行的侵染。在一个实施例中，感染是“活性”感染，即其中病毒在细胞或受试者中复制的一种感染。这样的感染是通过该病毒从最初被该病毒感染的细胞、组织、和/或器官传播至其他细胞、组织、和/或器官来表征。感染也可以是潜伏感染，即其中该病毒未复制的一种感染。在某些实施例中，感染是指由于病毒在细胞或受试者中的存在、或通过该病毒对细胞或受试者的侵染导致的病理状态。
流行性感冒病毒被分类为流行性感冒病毒类型：甲型、乙型和丙型。如此处使用的术语“流行性感冒病毒亚型”是指甲型流行性感冒病毒变体，其通过血球凝集素(H)以及神经氨酸酶(N)病毒表面蛋白的组合来表征。根据本发明，流行性感冒病毒亚型可以通过其H数目被称为例如，如“包括H3亚型的HA的流行性感冒病毒”、“H3亚型的流行性感冒病毒”或“H3流行性感冒”，或通过H数目以及N数目的组合被称为例如，如“流行性感冒病毒亚型H3N2”或“H3N2”。术语“亚型”确切地包括每个亚型内的所有个体“株”，其通常从突变产生并且显示不同病原谱，包括天然分离体连同人工突变体或重配体等。此类株也可称为病毒亚型的不同“分离体”。因此，如在此所用，术语“株”和“分离体”能可互换地使用。人流行性感冒病毒株或分离体的当前命名法包括病毒的类型(属)，即甲型、乙型或丙型，第一次分离的地理定位，株编号以及分离年份，通常在括号中给出HA以及NA的抗原说明，例如A/莫斯科/10/00(H3N2)。在该命名法中非人株也包括起源宿主。甲型流行性感冒病毒亚型可通过参照其系统发育组进一步分类。系统发育分析已证实血球凝集素细分为两个主要的组：尤其在系统发育组1(“组1”流行性感冒病毒)中的H1、H2、H5以及H9亚型，以及尤其系统发育组2(“组2”流行性感冒病毒)中的H3、H4、H7以及H10亚型。
如此处使用的，术语“流行性感冒病毒疾病”是指由于流行性感冒病毒(例如甲型或乙型流行性感冒病毒)在细胞或受试者中的存在或流行性感冒病毒对细胞或受试者的侵染导致的病理状态。在特定的实施例中，该术语是指由流行性感冒病毒引起的呼吸系统疾病。
如此处使用的，术语“核酸”旨在包括DNA分子(例如，cDNA或基因组DNA)以及RNA分子(例如，mRNA)以及使用核苷酸相似物产生的DNA或RNA的相似物。该核酸可以是单链或双链。核酸分子可以被化学或生物化学修饰，或可以包含非天然或衍生化的核苷酸碱基，如本领域的普通技术人员将容易了解。此类修饰包括例如标记；甲基化；用一种相似物取代天然存在的核苷酸中的一者或多者；核苷酸间修饰，例如不带电的键(例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)，带电的键(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)；侧位部分(例如多肽)；嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)；螯合剂；烷基化剂；以及被修饰的键(例如α异头核酸等)。除非另外规定，否则对核酸序列的提及涵盖其互补序列。因此，对具有具体序列的核酸分子的提及应理解为涵盖其互补链与其互补序列。互补链还可用于例如反义疗法、杂交探针以及PCR引物。
如此处使用的，在某些实施例中，HA中氨基酸的编号是基于野生型流行性感冒病毒的HA0中氨基酸的编号，例如H1N1流行性感冒株A/布里斯班/59/2007(SEQ ID NO:1)的氨基酸的编号。如在本发明中所使用，措辞“在HA中位置“x”处的氨基酸”因此意指与具体野生型流行性感冒病毒(例如A/布里斯班/59/2007)(SEQ ID NO:1，其中HA2域的氨基酸已经以斜体指示)的HA0中位置x处的氨基酸相对应的氨基酸。技术人员会理解，其他流行性感冒病毒株和/或亚型中的等价氨基酸可以通过多重序列比对确定。注意，在本申请中所使用的编号系统中，1是指未成熟HA0蛋白质的N-末端氨基酸(SEQ ID NO:1)。该成熟序列起始于例如SEQ ID NO:1的位置18。1.本领域的普通技术人员会理解，在生产过程中指导蛋白(对应于SEQ ID NO:1的氨基酸1-17)的转运的前导序列(或信号序列)不会存在于分泌的最终多肽中。在某些实施例中，根据本发明的多肽因此包括不具有前导序列的氨基酸序列，即该氨基酸序列是基于HA0的不具有信号序列的氨基酸序列。
如本领域的普通技术人员已知的，“多肽”是指通过酰胺键连接的氨基酸的多聚体。如此处使用的，该术语可以是指通过共价酰胺键连接的单个多肽链。术语也可以是指通过非共价相互作用例如离子接触、氢键、范德瓦尔斯接触以及疏水接触相关联的多个多肽链。本领域的普通技术人员会意识到，该术语包括已被修饰的多肽，例如通过翻译后加工例如信号肽切割、二硫键形成、糖基化(例如，N-连接的以及O-连接的糖基化)、蛋白酶切割以及脂质修饰(例如S-棕榈酰化)来修饰。
“主干域多肽”是指包括组成天然存在的(或野生型)血球凝集素(HA)的主干域的一个或多个多肽链的多肽。典型地，主干域多肽是单个多肽链(即对应于血球凝集素HA0多肽的主干域)或两个多肽链(即对应于与血球凝集素HA2多肽相关的血球凝集素HA1多肽的主干域)。根据本发明，与野生型HA分子比较，主干域多肽包括一个或多个突变，具体而言野生型HA的一个或多个氨基酸残基可能已被其他在具体野生型HA中对应位置上非天然存在的氨基酸取代。根据本发明的主干域多肽可另外包括一个或多个连接序列，如下所述。
术语“载体”表示可以插入第二核酸分子以便引入到宿主中的核酸分子，在该宿主中它将被复制并且在一些情况下被表达。换句话说，载体能够输送它所已经连接的核酸分子。如在此所用，术语“载体”涵盖克隆以及表达载体。载体包括但不限于质粒、粘粒、细菌人工染色体(BAC)和酵母人工染色体(YAC)以及来源于细菌噬菌体或植物或动物(包括人类)病毒的载体。载体包含由所提议的宿主识别的复制起点，并且在表达载体情况下是启动子；和由宿主识别的其他调节区。某些载体能够在它们被引入到其中的宿主中自主复制(例如具有细菌复制起点的载体可以在细菌中复制)。其他载体可以在被引入到宿主中后被整合到宿主的基因组中，并且从而与宿主基因组一起复制。
如此处使用的，在病毒的背景下术语“野生型”是指流行的、天然流行的并且产生典型的疾病爆发的流行性感冒病毒。
详细说明
流行性感冒病毒对全球公共健康具有显著影响，每年引起数百万例严重疾病、数千例死亡、以及相当大的经济损失。当前三价流行性感冒疫苗引发对疫苗株以及紧密相关的分离体的强力中和抗体应答，但很少扩大到一个亚型内更发散的株或扩大到其他亚型。此外，选择适合的疫苗株呈现许多挑战并且经常导致次佳保护。另外，目前不可以预测下一个大流行病毒的亚型，包括它将会出现的时间和地点。
血球凝集素(HA)是来自甲型流行性感冒病毒的主要包膜糖蛋白，其是中和抗体的主要靶标。血球凝集素在进入过程中具有两个主要功能。第一，血球凝集素通过与唾液酸受体的相互作用介导病毒附接至靶细胞的表面。第二，病毒的内吞作用之后，血球凝集素随后触发病毒和内涵体膜的融合以将其基因组释放至靶细胞的细胞质中。HA包括约500个氨基酸的大的胞外域，其被宿主衍生的酶切割以产生通过二硫键保持连接的2个多肽。N-末端片段(HA1，320-330个氨基酸)的大多数形成膜远端球状域，该膜远端球状域包含受体-结合位点以及由病毒-中和抗体识别的大部分决定簇。较小的C-末端部分(HA2，约180个氨基酸)形成茎状结构，该茎状结构将该球状域锚定至细胞膜或病毒膜。在HA1多肽(亚型之间34％-59％同源性)中亚型之间的序列同源性的程度小于在HA2多肽中的(51％-80％同源性)。大部分保守区是切割位点附近的序列，具体地HA2N-末端23个氨基酸，其在所有甲型流行性感冒病毒亚型中是保守的(洛瑞尤(Lorieau)等人，2010)。此区域的部分在HA前体分子(HA0)中作为表面环暴露，但当HA0被切割为HA1和HA2时变得不可及。
大部分中和抗体结合到围绕该受体结合位点的环，并干扰受体结合以及附接。由于这些环是高度可变的，靶向这些区域的大部分抗体是株-特异性的，解释了为什么当前疫苗引发这种受限的、株-特异性的免疫。然而，近来，产生了针对流行性感冒病毒血球凝集素的具有广泛的交叉中和效力的完全人类单克隆抗体。功能性以及结构性分析已经揭示，这些抗体干扰膜融合过程，并且是针对流行性感冒HA蛋白的主干域中的高度保守的表位(斯罗索比(Throsby)等人，2008；艾基尔特(Ekiert)等人2009，WO 2008/028946，WO 2010/130636，WO 2013/007770)。
稳定呈递这些抗体的表位的主干域多肽描述于共同未决专利申请PCT/EP 2012/073706中。至少一些此处描述的主干域多肽稳定地呈递CR6261和/或CR9114的表位，并且在小鼠中是免疫原性的。在共同未决的专利申请PCT/EP 2014/060997中已经描述了稳定地呈递CR6261和/或CR9114的表位的另外的免疫原性主干域多肽。
根据本发明，已经设计了呈递这些表位的新的多聚体HA主干域多肽。这些多肽可用于建立通用的基于表位的疫苗，该疫苗诱导针对广范围的流行性感冒株的保护。像在之前所述的主干域多肽中一样，该高度可变的和免疫显性的部分(即头部域)被首先从该全长HA分子去除以建立主干域多肽，也称为迷你-HA，从而将免疫应答向着广泛中和抗体的表位所处的主干域重定向。以上提到的广泛中和抗体用于证实中和表位的存在。
在某些实施例中，本发明的新HA主干多肽在溶液中形成稳定的三聚体，同时暴露中和抗体CR6261和/或CR9114和/或CR8020的表位。个体单体之间的另外相互作用进一步稳定化了该蛋白质和这些表位，当这些多肽用于疫苗时导致这些表位的更好呈递。
在不存在优势表位(存在于膜远端头部域中)的情况下，本发明的主干域多肽能够将膜近端主干域HA分子的保守表位呈递给免疫系统。为此，构成该头部域的HA0蛋白的一级序列的部分被去除，并且直接地或在一些实施例中通过引入短的柔性连接序列(‘接头’)再连接以恢复多肽链的连续性。所得到的多肽序列通过引入特定突变被进一步修饰，这些特定突变稳定了该HA0分子的剩下部分的天然3-维结构。
本发明提供新的多聚体流行性感冒血球凝集素主干域多肽，其中所述多聚体多肽包括至少一个第一和一个第二流行性感冒血球凝集素主干域单体，所述第一和第二单体各自包括：(a)流行性感冒血球凝集素HA1域，它包括HA1 N-末端主干区段，该HA1 N-末端主干区段通过具有0-50个氨基酸残基的连接序列与HA1 C-末端主干区段共价连接，其中所述HA1 C-末端区段连接到(b)流行性感冒血球凝集素HA2域，其中所述HA1 N-末端区段包括HA1的氨基酸1-x，优选地是HA1的氨基酸p-x，并且其中该HA1 C-末端主干区段包括HA1的氨基酸y-C-末端氨基酸，和
(c)其中该多肽不包括在HA1和HA2域之间的接合处的蛋白酶切割位点；并且
(d)其中该第一单体通过该第一单体的位置411上的氨基酸与该第二单体的位置419上的氨基酸之间的二硫桥连接到所述第二单体上。
根据本发明，该二硫桥因此形成多聚体中个体单体之间的共价交联。
在某些实施例中，该多聚体多肽是三聚体，即包括三个流行性感冒主干域单体。根据本发明，每个单体通过一个单体的位置411上的氨基酸与另一个单体的位置419上的氨基酸之间的二硫桥连接到另一个单体上。
根据本发明，已经出人意料地发现，在至少两个不同单体的氨基酸位置411和419(根据SEQ ID NO:1或其他流行性感冒病毒的血球凝集素中的等价残基来编号)之间引入新的二硫桥产生了二聚体多肽，或优选三聚体多肽。与其他公开的三聚体HA-主干结构相反，此单体间二硫键连接的三聚体表达良好并自发折叠。因此，它不需要重折叠程序来达到其如已经描述的三维结构(陆(Lu)等人，2013)。
在某些实施例中，该HA1和HA2域来源于从系统发育组1衍生的甲型流行性感冒病毒亚型。
在某些实施例中，该HA1和HA2域来源于包含H1亚型的HA的甲型流行性感冒病毒亚型。本发明的多肽不包括全长HA1。
在某些实施例中，该HA1和HA2域来源于从系统发育组2衍生的甲型流行性感冒病毒亚型。
在某些实施例中，该HA1和HA2域来源于包含H3亚型的HA的甲型流行性感冒病毒亚型。
在某些实施例中，这些流行性感冒血球凝集素主干域单体实质上比HA0小，优选地缺少所有或基本上所有的HA的球状头部。优选地，这些免疫原性多肽长度上不超过360，优选地不超过350、340、330、320、310、305、300、295、290、285、280、275、或270个氨基酸。在某些实施例中，这些免疫原性多肽长度上是从约250至约350，优选地从约260至约340，优选地从约270至约330个氨基酸。
根据本发明，该“HA1 N-末端区段”是指对应于流行性感冒血球凝集素(HA)分子的HA1域的氨基-末端部分的多肽区段。在某些实施例中，该HA1 N-末端多肽区段包括从该HA1域的位置1至位置x的氨基酸，其中位置x上的氨基酸是HA1内的氨基酸残基。术语“HA1 C-末端区段”是指对应于流行性感冒血球凝集素HA1域的羧基-末端部分的多肽区段。在某些实施例中，该HA1 C-末端多肽区段包括从该HA1域的位置y的氨基酸至C-末端氨基酸并且包括C-末端氨基酸，其中位置y上的氨基酸是HA1内的氨基酸残基。根据本发明，y是大于x，因此该HA1 N-末端区段和该HA1 C-末端区段之间，即HA1的位置x上的氨基酸和位置y上的氨基酸之间的HA1域的区段已经缺失，并且在一些实施例中，由连接序列替代。
在某些实施例中，该HA1 N-末端主干区段包括HA1的氨基酸1-x，并且该HA1 C-末端主干区段包括HA1的氨基酸y-端。因此，在某些实施例中，该HA1区段中的缺失包括从在位置x+1处的氨基酸直至在位置y-1处的氨基酸并且包括在位置y-1处的氨基酸的氨基酸序列。
在某些实施例中，这些多肽不包括信号序列。因此在某些实施例中，该HA1 N-末端区段包括HA1的氨基酸p-x，其中p是该成熟HA分子的第一氨基酸(例如在SEQ ID NO:1的情况下p＝18)。技术人员将能够制备此处所述的不具有信号肽(例如SEQ ID NO:1的氨基酸1-17)的多肽。
再次注意，本文所使用的氨基酸位置的编号参考SEQ ID NO:1。技术人员将能够确定其他血球凝集素序列中的等价位置。
在某些实施例中，这些多肽包含完整的HA2域，因此包括跨膜序列和胞细内序列。在其他实施例中，本发明的多肽不包括HA的细胞内序列以及跨膜域。因此，在某些实施例中，这些多肽包含截短的HA2域。在某些实施例中，这些细胞内序列以及跨膜序列，例如从该HA2域的位置514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、526、528、529、或530(或等价物)至该HA2域的C-末端的氨基酸序列已被去除以在细胞中表达之后产生可溶的多肽。
根据本发明，血球凝集素主干域多肽对HA1和HA2域之间的连接处的蛋白酶切割具有抗性，即在HA1和HA2之间的该连接处不包含蛋白酶切割位点。本领域的普通技术人员已知，跨越HA1和HA2的Arg(R)-Gly(G)序列是胰蛋白酶和胰蛋白酶样蛋白酶的识别位点，并且典型地被切割用于血球凝集素激活。由于此处描述的这些HA主干域多肽不应该被激活，本发明的流行性感冒血球凝集素主干域多肽对蛋白酶切割具有抗性。因此根据本发明，该蛋白酶切割位点被去除或跨越HA1和HA2的蛋白酶位点突变为对蛋白酶切割具有抗性的序列。根据本发明，HA1和HA2之间的切割位点的去除可以通过使在P1位置的R(在少数情况下为K)突变为Q来实现(参见例如孙(Sun)等人，2010，切割位点(SEQ ID NO:1中位置343)的命名法解释)。在某些实施例中，该HA1 C-末端主干区段的C-末端氨基酸残基是除了精氨酸(R)或赖氨酸(K)的任何氨基酸。在某些实施例中，该HA1 C-末端氨基酸是谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、天冬酰胺(N)、天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)。在某些实施例中，该HA1 C-末端主干区段的C-末端氨基酸残基是谷氨酰胺(Q)。
在某些实施例中，这些多肽是糖基化的。
在某些实施例中，这些流行性感冒血球凝集素主干域多肽是基于H1亚型的流行性感冒病毒的HA。用“基于”意指，该HA1域和/或该HA2域的N-末端区段和/或C-末端区段与本领域的普通技术人员已知的或后来发现的H1亚型的任何天然存在的流行性感冒血球凝集素的HA1和/或HA2域的对应N-末端和/或C-末端区段具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％的氨基酸序列一致性。
在某些实施例中，这些多肽基于H1 HA，即HA包括来自H1亚型流行性感冒病毒，特别是来自流行性感冒病毒A/布里斯班/59/2007(H1N1)(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列)，如下所述。技术人员会理解，根据本发明也可使用其他包括H1亚型的HA的甲型流行性感冒病毒。在某些实施例中，这些多肽包括基于选自表2的甲型流行性感冒H1病毒的HA的血球凝集素主干域。
在某些实施例中，这些多肽包括HA1 N-末端多肽区段，该区段包括从H1 HA1域的位置1至位置x的氨基酸，其中x是位置46上氨基酸和位置60上氨基酸之间的任何氨基酸，例位置47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、或59上的氨基酸，优选地其中x是52、53、55或59。优选地，这些多肽包括不具有信号序列的HA1 N-末端区段，即包括以下氨基酸的HA1N-末端区段：从该HA1域的位置18(例如对于H1 HA，例如SEQ ID NO:1)、或其他流行性感冒病毒株(参见例如表2)中的等价位置至该HA1域的位置x的氨基酸。在某些实施例中，该HA1N-末端区段因此包括从该HA1域的位置p(其中对于在SEQ ID NO:1中的H1 HA，p＝18，或其他H1 HA上的等价位置)至该HA1域的位置x的氨基酸。
在某些实施例中，该HA1 C-末端多肽区段包括从H1 HA1域的位置y的氨基酸至H1HA1域的C-末端氨基酸并且包括H1 HA1域的C-末端氨基酸，其中y是H1 HA1的位置290上的氨基酸和H1 HA1的位置325上的氨基酸之间的任何氨基酸，优选地其中y是291、303、318、或321。
在某些实施例中，x＝SEQ ID NO:1的位置52(或在另一个血球凝集素中的等价位置)上的氨基酸，p＝SEQ ID NO:1的位置18(或在另一个血球凝集素中的等价位置)上的氨基酸并且y＝SEQ ID NO:1的位置321(或在另一个血球凝集素中的等价位置)上的氨基酸。在某些实施例中，该HA1 N-末端主干区段包括HA1的氨基酸1-52，并且该HA1 C-末端主干区段包括HA1的氨基酸321-端(即HA1的C-末端氨基酸)。因此，在某些实施例中，该HA1区段中的缺失包括从在位置53处的氨基酸直至在位置320处的氨基酸并且包括在位置320处的氨基酸的氨基酸序列。在某些实施例中，这些多肽不包括信号序列。在某些实施例中，该HA1N-末端区段因此包括HA1的氨基酸18-52，其中p是该成熟HA分子的第一氨基酸(例如在SEQID NO:1的情况下p＝18)。
在某些实施例中，该HA1 N-末端主干区段因此包括HA1的氨基酸残基1-52、优选地HA1的氨基酸残基18-52，并且该HA1 C-末端主干区段包括HA1的氨基酸残基321-343。在某些实施例中，该HA1 N-末端主干区段由HA1的氨基酸残基1-52、优选地HA1的氨基酸残基18-52组成，并且该HA1 C-末端主干区段由HA1的氨基酸残基321-343组成。
根据本发明，相比于对应的野生型流行性感冒病毒HA1和/或HA2域(即这些主干多肽基于的流行性感冒病毒)的氨基酸序列，这些主干多肽在个体单体的该HA1域和/或该HA2域中包括一个或多个突变，即氨基酸取代。
在某些实施例中，该HA2域包括将螺旋A的C-末端残基连接至螺旋CD的N-末端残基的HA2氨基酸序列中的一个或多个突变(图1)。连接螺旋A的C-末端残基和螺旋CD的N-末端残基的H1 HA2氨基酸序列包括如下氨基酸序列，其包括流行性感冒HA(根据SEQ ID NO:1编号)的残基402-418，包括氨基酸序列MNTQFTAVGKEFN(H/K)LE(K/R)(SEQ ID NO:7)。
在某些实施例中，将螺旋A的C-末端残基连接到螺旋CD的N-末端残基的氨基酸序列，即包括血清型H1的流行性感冒HA的氨基酸残基402-418(根据SEQ ID NO:1编号)的区域，包括以下氨基酸序列
X1NTQX2TAX3GKEX4N(H/K)X5E(K/R)(SEQ ID NO:8)。
在某些实施例中，位置402、406、409、413以及416(编号参考SEQ ID NO:1)上的一个或多个氨基酸，即氨基酸X1、X2、X3、X4以及X5中一个或多个已经突变，即包括在该主干多肽基于的野生型流行性感冒病毒中的那些位置处不存在的氨基酸。
在某些实施例中，位置402上的突变氨基酸，即X1，是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：M、E、K、V、R以及T。
在某些实施例中，位置406上的突变氨基酸，即X2，是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：F、I、N、T、H、L以及Y，优选I、L或Y。
在某些实施例中，位置409上的突变氨基酸，即X3，是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：V、A、G、I、R、F以及S，优选A、I或F。
在某些实施例中，位置413上的突变氨基酸，即X4，是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：F、I、N、S、T、Y、E、K、M、以及V，优选I、Y、M或V。
在某些实施例中，位置416上的突变氨基酸，即X5，是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：L、H、I、N、R，优选I。
这些突变中的一个或多个的组合也是可能的。
在某些实施例中，X1是M，X2是Y，X3是I，X4是Y并且X5是S。
根据本发明，相比于对应的野生型流行性感冒病毒HA1和/或HA2域(即这些主干多肽基于的流行性感冒病毒)的氨基酸序列，这些主干多肽在该HA1域和/或该HA2域中包括一个或多个另外的突变，即氨基酸取代。
在某些实施例中，接近于HA0切割位点(SEQ ID NO:1中残基343)的一个或多个氨基酸残基已经突变。在某些实施例中，SEQ ID NO:1的位置337、340、352、或353上、或其他流行性感冒病毒中的等价位置上的一个或多个氨基酸残基已经突变，即被在该主干多肽基于的野生型流行性感冒病毒的HA的氨基酸序列中的对应位置处不存在的氨基酸取代。表6显示天然存在的氨基酸变化。
在某些实施例中，本发明的多肽包括SEQ ID NO:1的位置352上、或其他流行性感冒病毒的等价位置上的至少一个突变。
在某些实施例中，本发明的多肽包括SEQ ID NO:1的位置353上、或其他流行性感冒病毒的等价位置上的至少一个突变。
在某些实施例中，本发明的多肽包括SEQ ID NO:1的位置337上、或其他流行性感冒病毒的等价位置上的至少一个突变。
在某些实施例中，本发明的多肽包括SEQ ID NO:1的位置340上、或其他流行性感冒病毒的等价位置上的至少一个突变。
在某些实施例中，位置337上的突变氨基酸残基(HA1域)是选自下组，该组由以下各项组成：I、E、K、V、A、以及T。
在某些实施例中，位置340上的突变氨基酸残基(HA1域)是选自下组，该组由以下各项组成：I、K、R、T、F、N、S以及Y。
在某些实施例中，位置352上的突变氨基酸残基(HA2域)是选自下组，该组由以下各项组成：D、V、Y、A、I、N、S、以及T。
在某些实施例中，位置353上的突变氨基酸残基(HA2域)是选自下组，该组由以下各项组成：K、R、T、E、G、以及V。
在某些实施例中，该突变的氨基酸在该序列中引入共有N-糖基化，例如N-X-T/S(此处X是任何天然存在的氨基酸，除了P)，如同例如对于I340N在SEQ ID NO:6中的情况。
在某些实施例中，该突变的氨基酸是相同亚型的序列中不会天然存在的氨基酸。
在某些实施例中，在位置337(HA1域)上突变的氨基酸残基是K。
在某些实施例中，在位置340(HA1域)上突变的氨基酸残基是K。
在某些实施例中，在位置352(HA2域)上突变的氨基酸残基是F。
在某些实施例中，在位置353(HA2域)上突变的氨基酸残基是T。
再次指出，贯穿本申请，氨基酸的编号是基于H1 HA0中氨基酸的编号，具体而言H1N1甲型流行性感冒株/布里斯班/59/2007(SEQ ID NO:1)的氨基酸的编号。普通技术人员将能够确定其他流行性感冒病毒的HA中的等价氨基酸，并且因此将能够确定等价突变，参见例如表2的不同H1流行性感冒病毒的序列比对。
根据本发明，这些多肽进一步可以包括位置324上的氨基酸和位置436上的氨基酸之间的另外的二硫桥。因此，根据本发明，至少一个另外的二硫桥已被引入这些主干域多肽中，优选地在H1A/布里斯班/59/2007(SEQ ID NO:1)中位置324和436(或等价物)的氨基酸之间。在某些实施例中，这些多肽因此进一步包括该HA1域中的突变R324C以及该HA2域中的T436C。本领域的普通技术人员可以使用适合的算法例如Clustal、Muscle等，通过比对序列容易地确定等价位置。工程化的二硫桥是通过使至少一个(如果另一个已经是半胱氨酸)、但通常是空间上接近的两个残基突变为半胱氨酸来建立的，该突变将自发地或通过活性氧化在这些残基的硫原子之间形成共价键。
在某些实施例中，这些流行性感冒血球凝集素主干域多肽是基于H3亚型的流行性感冒病毒的HA。用“基于”意指，该HA1域和/或该HA2域的N-末端区段和/或C-末端区段与本领域的普通技术人员已知的或后来发现的H3亚型的任何天然存在的流行性感冒血球凝集素的HA1和/或HA2域的对应N-末端和/或C-末端区段具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％的氨基酸序列一致性。
在某些实施例中，这些多肽基于H3HA，即HA包括来自H3N2病毒A/香港/1/1968(SEQID NO:237)流行性感冒病毒的氨基酸序列，如下所述。技术人员会理解，根据本发明也可使用其他包括H3亚型的HA的甲型流行性感冒病毒。
在某些实施例中，已经在SEQ ID NO:1的位置419-433(或不同HA中的等价位置)处引入氨基酸序列CMKQIEDKIEEIESK(SEQ ID NO:193)或已经在SEQ ID NO:1的位置417-433(或在不同的HA中的等价位置)处引入氨基酸序列RMCQIEDKIEEIESKQK(SEQ ID NO:194)。
在某些实施例中，相比于衍生该HA1和HA2域的HA的氨基酸序列，这些多肽进一步在该HA1和/或HA2域中包括一个或多个另外的突变。因此，这些主干多肽的稳定性进一步增加。
在某些实施例中，这些多肽选择性地结合到抗体CR6261和/或CR9114。在一个实施例中，这些多肽并不结合到抗体CR8020和/或CR8057。在一个实施例中，CR6261包括包含SEQID NO:9的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的轻链可变区；CR9114包括包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的轻链可变区。在一个实施例中，CR8057包括包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链可变区。CR8020包括包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的轻链可变区。
在某些实施例中，这些多肽确实选择性地结合到抗体CR8020。
根据本发明，在某些实施例中，因此提供了以下多聚体多肽，这些多肽模拟CR6261、CR9114、和/或CR8020的特异表位，并且可被用作免疫原性多肽，例如当独自或与其他预防和/或治疗处理组合来体内给予时引发交叉中和抗体。对于“交叉中和抗体”，意指该抗体能够中和系统发育组1的甲型流行性感冒病毒的至少两个、优选至少三个、四个、或五个不同亚型，和/或系统发育组2的甲型流行性感冒病毒的至少两个、优选至少三个、四个、或五个不同亚型，和/或乙型流行性感冒病毒的至少两个不同亚型，特别是至少所有被CR6261和CR9114中和的病毒株。
如上所述的，这些多肽包括至少两个单体，其中所述单体各自包括流行性感冒血球凝集素HA1域，其包括通过具有0-50个氨基酸残基的连接序列共价连接至HA1 C-末端主干区段的HA1 N-末端主干区段。该连接序列不存在于天然存在的或野生型HA中。在某些实施例中，该接头是肽，该肽包括一个氨基酸残基、两个或更少的氨基酸残基、三个或更少的氨基酸残基、四个或更少的氨基酸残基、五个或更少的氨基酸残基、十个或更少的氨基酸残基、15个或更少的氨基酸残基、或20个或更少的氨基酸残基，或30个或更少的氨基酸残基，或40个或更少的氨基酸残基，或50个或更少的氨基酸残基。在一个特定实施例中，该连接序列是选自下组的序列，该组由以下各项组成：G、GS、GGG、GSG、GSA、GSGS、GSAG、GGGG、GSAGS、GSGSG、GSAGSA、GSAGSAG、以及GSGSGSG。
在某些实施例中，该HA1 N-末端区段直接连接至HA1 C-末端区段，即这些多肽不包括连接序列。
处于其天然形式的流行性感冒HA在细胞或病毒膜上作为三聚体存在。在某些实施例中，该细胞内和跨膜序列被去除以使得在细胞中表达后产生分泌的(可溶的)多肽。已经描述表达以及纯化HA的分泌胞外域的方法(参见例如多普海德(Dopheide)等人2009；艾基尔特(Ekiert)等人2009，2011；史蒂文斯(Stevens)等人2004，2006；威尔逊(Wilson)等人1981)。本领域的普通技术人员会理解，这些方法也可直接应用到本发明的主干域多肽以实现分泌(可溶的)多肽的表达。因此这些多肽也包括在本发明中。
在某些实施例中，本发明的多肽包含HA的细胞内序列以及跨膜域。在其他实施例中，这些细胞内序列以及跨膜序列，例如从该HA2域的位置514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、526、528、529、或530(或等价物)至该HA2域的C-末端的氨基酸序列(根据SEQ ID NO:1编号)已被去除以在细胞中表达之后产生可溶的多肽。
在某些实施例中，从位置519到C末端氨基酸的HA2域的C-末端部分已被缺失。在另外的实施例中，从位置530到C末端氨基酸的HA2域的C-末端部分已被缺失。
任选地，可以将his-标签序列(HHHHHH(SEQ ID NO:15)或HHHHHHH(SEQ ID NO:16))连接至(任选地截短的)HA2域用于纯化目的，任选地通过接头连接。任选地该接头可包含蛋白分解切割位点以在纯化之后酶促地去除该his-标签。
在某些实施例中，通过在HA2的C-末端处引入已知会形成三聚体结构的序列，即GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL(SEQ ID NO:3)，任选地通过接头连接，这些多肽进一步稳定化。因此，在某些实施例中，HA2域的C-末端部分已被氨基酸序列GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL(SEQ ID NO:3)替代，任选通过接头连接。该接头可任选地包含切割位点用于之后根据本领域的普通技术人员熟知的方案进行加工。为了促进该可溶形式的纯化，可添加标签序列，例如his标签(HHHHHHH(SEQ ID NO:15)或HHHHHH(SEQ IDNO:16))或FLAG标签(DYKDDDDK)(SEQ ID NO:22)或这些的组合，任选地通过短接头连接。该接头可任选地包含(部分的)蛋白分解切割位点，例如IEGR(SEQ ID NO:24)(因子X)或LVPRGS(SEQ ID NO:23)(凝血酶)，用于之后根据本领域的普通技术人员熟知的方案进行加工。加工的蛋白也包括在本发明中。
在某些实施例中，该HA2域的C-末端部分从位置519-565已经缺失(根据SEQ IDNO:1编号)并且被以下替代：SGRDYKDDDDKLVPRGSPGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGHHHHHH(SEQ ID NO:4)。
在某些实施例中，该HA2域的C-末端部分从位置530-565已经缺失(根据SEQ IDNO:1编号)并且被以下替代：SGRDYKDDDDKLVPRGSPGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGHHHHHH(SEQ ID NO:4)。
该天然HA在细胞表面上作为三聚体存在。将三聚体保持在一起的个体单体之间的相互作用的大部分处于头部域，而在主干域中，三聚体化是通过三聚体叠螺旋基序的形成介导的。去除该头部之后，该三级结构去稳定并且因此需要修饰以增加蛋白稳定性。通过加强该螺旋CD的螺旋倾向，可以建立更稳定的蛋白。
在共同未决的申请PCT/EP 2014/060997中所描述的多肽中，序列MKQIEDKIEEIESKQ(SEQ ID NO:5)，来源于酵母转录激活因子蛋白GCN4并且已知会在位置419-433处(的等价物)的CD螺旋中引入三聚。该序列具有形成螺旋二级结构的高倾向，并且可以按这种方式增强本发明的多肽的整体稳定性。
进一步显示，该多肽的稳定性和多聚化状态取决于本发明的多肽的一级序列中的GCN4衍生序列的确切位置和顺序。
在优选的实施例中，氨基酸序列CMKQIEDKIEEIESK(SEQ ID NO:193)已经引入位置419-433处，或其中序列RMCQIEDKIEEIESKQK(SEQ ID NO:194)已经引入位置417-433处。
在产生本发明的研究中，使用本领域的普通技术人员熟知的分子生物学技术，对多肽s74H9(SEQ ID NO:65)、s127H1(SEQ ID NO:66)、s71H2(SEQ ID NO:71)、s86B4(SEQ IDNO:67)、s115A1(SEQ ID NO:70)、s2201C9(SEQ ID NO:77)、s55G7(SEQ ID NO:68)、s113E7(SEQ ID NO:78)、s6E12(SEQ ID NO:69)、s181H9(SEQ ID NO:76)进行修饰，以建立在位置419-433处包含序列RMKQIEDKIEEIESK(SEQID NO:20)的序列s74H9-t2(SEQ ID NO:93)、s127H1-t2(SEQ ID NO:91)、s71H2-t2(SEQ ID NO:97)、s86B4-t2(SEQ ID NO:92)、s115A1-t2(SEQ ID NO:96)、s220C9-t2(SEQ ID NO:99)、s55G7-t2(SEQ ID NO:95)、s113E7-t2(SEQID NO:100)、s6E12-t2(SEQ ID NO:94)、s181H9-t2(SEQ ID NO:98)。
以相似的方式，建立在位置417-433处包含序列RMKQIEDKIEEIESKQK(SEQ ID NO:21)的多肽s74H9-t3(SEQ ID NO:123)、s127H1-t3(SEQ ID NO:121)、s71H2-t3(SEQ ID NO:127)、s86B4-t3(SEQ ID NO:122)、s115A1-t3(SEQ ID NO:126)、s2201C9-t3(SEQ ID NO:129)、s55G7-t3(SEQ ID NO:125)、s113E7-t3(SEQ ID NO:130)、s6E12-t3(SEQID NO:124)、s181H9-t3(SEQ ID NO:128)。
根据本发明，通过将位置411和419上的氨基酸突变为半胱氨酸，已经引入在第一单体的位置411上的氨基酸和第二单体的位置419上的氨基酸之间的二硫桥。因此,在某些实施例中,氨基酸序列CMKQIEDKIEEIESK(SEQ ID NO:193)已经引入位置419-433处，或氨基酸序列RMCQIEDKIEEIESKQK(SEQ ID NO:194)已经引入位置417-433处。
如上所述的，申请人之前已经鉴定了从来自接种疫苗的个体的初级人B-细胞分离的广泛中和抗体，它们中的一些对于组1是特异性的(例如CR6261，如WO 2008/028946中所述)，并且它们中的一些对于组2流行性感冒病毒是特异性的(例如CR8020，如WO 2010/130636中所述)。这些单克隆抗体的表位的详细分析已经揭示了这些特异抗体缺少交叉反应性的原因。在两种情况下，组1或组2HA分子中不同位置上聚醣的存在至少部分地解释了以下事实：这些抗体是组特异性的。在鉴别与许多组1和2HA分子交叉反应的Cr9114样抗体的情况下，如下所述的，变得明了的是人免疫系统可能针对流行性感冒病毒引发非常广泛的中和抗体。然而，在考虑对于年度疫苗接种方案的需要时，在亚型H1和/或H3的(季节性)流行性感冒病毒的感染或疫苗接种之后，这些抗体显然不会或仅非常低程度地被引发。
根据本发明，提供了以下多聚体多肽，这些多聚体多肽模拟CR6261和/或CR9114，和/或CR8020的特异表位，并且可被用作免疫原性多肽，例如当独自或与其他预防和/或治疗处理组合来体内给予时引发交叉中和抗体。对于“交叉中和抗体”，意指该抗体能够中和系统发育组1的甲型流行性感冒病毒的至少两个、优选至少三个、四个、或五个不同亚型，和/或系统发育组2的甲型流行性感冒病毒的至少两个、优选至少三个、四个、或五个不同亚型，和/或乙型流行性感冒病毒的至少两个不同亚型，特别是至少所有被CR6261和/或CR9114，和/或CR8020中和的病毒株。
在某些实施例中，这些多肽选择性地结合到抗体CR6261和/或CR9114。在某些实施例中，该多肽并不结合到抗体CR8057。CR6261包括包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的轻链可变区；CR9114包括包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的轻链可变区；CR8020包括包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的轻链可变区。CR8057包括包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链可变区。
在某些实施例中，本发明的这些多肽是三聚体。
在某些实施例中，这些多肽单体包括以下氨基酸序列：
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNX1PSX2QSQGLFGAIAGX3X4EGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKX5NTQX6TAX7GCEX8NKX9ERCMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVSGRDYKDDDDKLVPRGSPGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGHHHHHH(SEQ ID NO:145)，
其中X1是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：E、I、K、V、A、以及T；
X2是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：I、K、R、T、F、N、S以及Y；
X3是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：D、F、V、Y、A、I、N、S、以及T；
X4是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：I、K、R、T、E、G以及V；
X5是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：M、E、K、V、R、T；
X6是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：F、I、N、S、T、Y、H、以及L；
X7是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：A、G、I、R、T、V、F、以及S；
X8是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：F、I、N、S、T、Y、G、E、K、M、以及V；并且
X9是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：H、I、L、N、R、以及S。
在某些实施例中，这些多肽单体包括以下氨基酸序列：
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNX1PSX2QSQGLFGAIAGX3X4EGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKX5NTQX6TAX7GCEX8NKX9ERCMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDG(SEQ ID NO:146)，
其中X1是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：E、I、K、V、A、以及T；
X2是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：I、K、R、T、F、N、S以及Y；
X3是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：D、F、V、Y、A、I、N、S、以及T；
X4是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：I、K、R、T、E、G以及V；
X5是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：M、E、K、V、R、T；
X6是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：F、I、N、S、T、Y、H、以及L；
X7是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：A、G、I、R、T、V、F、以及S；
X8是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：F、I、N、S、T、Y、G、E、K、M、以及V；并且
X9是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：H、I、L、N、R、以及S。
在某些实施例中，这些多肽单体包括以下氨基酸序列：
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNX1PSX2QSQGLFGAIAGX3X4EGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKX5NTQX6TAX7GCEX8NKX9ERCMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQIEG(SEQ ID NO:147)，
其中X1是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：E、I、K、V、A、以及T；
X2是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：I、K、R、T、F、N、S以及Y；
X3是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：D、F、V、Y、A、I、N、S、以及T；
X4是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：I、K、R、T、E、G以及V；
X5是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：M、E、K、V、R、T；
X6是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：F、I、N、S、T、Y、H、以及L；
X7是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：A、G、I、R、T、V、F、以及S；
X8是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：F、I、N、S、T、Y、G、E、K、M以及V；并且
X9是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：H、I、L、N、R、以及S。
在某些实施例中，这些多肽单体包括以下氨基酸序列：
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNX1PSX2QSQGLFGAIAGX3X4EGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKX5NTQX6TAX7GCEX8NKX9ERCMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI(SEQ IDNO:148)，
其中X1是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：E、I、K、V、A、以及T；
X2是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：I、K、R、T、F、N、S以及Y；
X3是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：D、F、V、Y、A、I、N、S、以及T；
X4是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：I、K、R、T、E、G以及V；
X5是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：M、E、K、V、R、T；
X6是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：F、I、N、S、T、Y、H、以及L；
X7是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：A、G、I、R、T、V、F、以及S；
X8是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：F、I、N、S、T、Y、G、E、K、M以及V；并且
X9是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：H、I、L、N、R、以及S。
在某些实施例中，X1是K，X2是K，X3是F，X4是T，X5是M.，X6是Y，X7是I；
X8是Y并且X9是S。
这些流行性感冒血球凝集素主干域多肽可以根据任何被认为适合技术人员的技术来制备，包括以下所述的技术。
因此，本发明的免疫原性多肽可通过本领域中已知的标准方法，使用适合的限制性内切酶以及本领域已知的方法被合成为DNA序列，并且被克隆并随后体外或体内表达。本发明因此也涉及编码上述多肽的核酸分子。本发明进一步涉及包括编码本发明的多肽的核酸的载体。在某些实施例中，根据本发明的核酸分子为载体(例如质粒)的一部分。这些载体可以通过本领域的普通技术人员众所周知的方法容易地操纵，并且可以例如被设计成能够在原核和/或真核细胞中复制。另外，许多载体可以直接或以从其分离的希望片段的形式用于真核细胞的转化并且将完全或部分地整合到这些细胞的基因组中，产生在其基因组中包含所需核酸的稳定的宿主细胞。所用的载体可以是适于克隆DNA并且可以用于感兴趣核酸的转录的任何载体。当使用宿主细胞时，优选的是该载体是整合型载体。可替代地，该载体可以是游离型复制载体。
本领域的普通技术人员能够选择适合的表达载体，并且以一种功能性方式插入本发明的核酸序列。为了获得编码多肽的核酸序列的表达，本领域的普通技术人员熟知能够驱动表达的序列可以功能性地连接至编码该多肽的核酸序列，得到可表达形式的编码蛋白或多肽的重组核酸分子。总的来说，该启动子序列被放置在应该表达的序列的上游。许多表达载体在本领域中可获得，例如英杰公司的pcDNA和pEF载体系列、碧迪科学公司(BDSciences)的pMSCV和pTK-Hyg、来自斯曲杰公司(Stratagene)的pCMV-Script等，它们可以用于获得适合的启动子和/或转录终止子序列、polyA序列等等。参照控制编码多肽的转录和翻译的序列，在适当插入编码感兴趣多肽的序列的情况下，得到的表达盒可用于产生感兴趣多肽，称为表达。驱动表达的序列可包括启动子、增强子等，以及其组合。这些应能够在宿主细胞中起作用，从而驱动与它们功能性连接的核酸序列的表达。本领域的普通技术人员知道不同的启动子可以用于获得宿主细胞中一种基因的表达。启动子可以是组成型的或调节型的，并且可以从不同的来源中，包括病毒、原核或真核来源获得，或是人工设计的。感兴趣的核酸的表达可来自天然启动子或其衍生物或来自完全异源的启动子(考夫曼(Kaufman)，2000)。一些熟知的并且多用于在真核细胞中表达的启动子包括来源于于病毒(例如腺病毒)的启动子(例如E1A启动子)、来源于巨细胞病毒(CMV)的启动子(例如CMV即刻早期(IE)启动子(此处称为CMV启动子)(例如可从pcDNA，英杰公司(Invitrogen)获得))、来源于猴病毒40(SV40)的启动子(达斯(Das)等人，1985)等。适合的启动子也可来源于真核细胞，例如金属硫蛋白(MT)启动子、延长因子1α(EF-1α)启动子(吉尔(Gill)等人，2001)、泛素C或UB6启动子(吉尔(Gill)等人，2001)、肌动蛋白启动子、免疫球蛋白启动子、热休克启动子等。对启动子功能和启动子强度进行测试是本领域的普通技术人员的例行途径，并且总的来说可例如包括克隆该启动子序列后的测试基因(例如lacZ、荧光素酶、GFP等)，并且对该测试基因的表达进行测试。当然，启动子可通过其中的序列的缺失、添加、突变而被改变，并且针对功能性进行测试以找到新的、减毒的、或改进的启动子序列。根据本发明，在所选择的真核细胞中给出高转录水平的强启动子是优选的。
使用本领域的普通技术人员熟知的方法，这些构建体可被转染到真核细胞(例如植物、真菌、酵母或动物细胞)或适合的原核生物表达系统像大肠杆菌中。在一些情况下，可将适合的‘标签’序列(例如，如但不限于his-、myc-、strep-、或flag-标签)或完全蛋白(例如，如但不限于麦芽糖结合蛋白或谷胱甘肽S转移酶)添加到本发明的序列中以允许从这些细胞或上清液纯化和/或鉴定这些多肽。任选地，可以包括包含特异蛋白分解位点的序列以在之后通过蛋白分解消化去除该标签。
纯化多肽可以通过本领域中已知的光谱法(例如圆二色谱法、傅里叶变换红外光谱法以及NMR光谱法或X射线晶体分析法)进行分析以调查所希望的结构像螺旋以及β片层的存在。ELISA、Octet以及FACS等可用于调查本发明的多肽与之前所述的广泛中和抗体(CR6261、CR9114、CR8057)的结合。因此，可以选择根据本发明的具有正确构象的多肽。
本发明进一步涉及组合物，其包括治疗有效量的本发明的多肽和/或核酸中的至少一个。该组合物优选地是免疫原性组合物。这些组合物优选地进一步包括一种药学上可接受的载体。在本发明的上下文中，术语“药学上可接受的”意思指载体在所用剂量和浓度下不会在给予它们的受试者中造成不希望有的或有害的影响。这些医药学上可接受的载剂和赋形剂是本领域中熟知的(参见雷明登氏制药科学(Remington’s PharmaceuticalSciences)，第18版，A.R.热纳罗(Gennaro)编，马克出版社(Mack Publishing Company)[1990]；肽和蛋白质的医药配制品发展(Pharmaceutical Formulation Development ofPeptides and Proteins)，S.弗罗加尔(Frokjaer)和L.霍夫高(Hovgaard)编，泰勒弗朗西斯集团(Taylor&Francis)[2000]；以及医药赋形剂手册(Handbook of PharmaceuticalExcipients)，第3版，A.凯博(Kibbe)编，医药出版社(Pharmaceutical Press)[2000])。术语“载体”是指与组合物一起给予的稀释剂、佐剂、赋形剂或运载体。盐水溶液以及葡萄糖和甘油水溶液可以例如用作液体载体，特别是对于可注射溶液而言。精确的配制品可适应给予模型。这些多肽和/或核酸分子优选地呈无菌溶液形式被配制和给予。无菌溶液是通过无菌过滤或通过本领域中自身已知的其他方法制备。这些溶液可接着被冻干或填充到药物剂量容器中。溶液的pH通常在pH 3.0到9.5、例如pH 5.0到7.5范围内。
本发明也涉及如上所述的流行性感冒HA主干域多肽、核酸分子和/或载体以用于诱导针对流行性感冒HA蛋白的免疫应答。本发明也涉及在受试者中诱导免疫应答的方法，该方法包括向受试者给予如上所述的多肽、核酸分子和/或免疫原性组合物。根据本发明的受试者优选地是能够被引起传染病的药剂(具体而言流行性感冒病毒)感染的哺乳动物，或另外可以从免疫应答的诱导受益，此类受试者例如是啮齿动物，例如小鼠、白鼬、或家畜或农畜，或非人的灵长类，或人。优选地，该受试者为一个人类受试者。本发明因此提供了利用此处描述的多肽、核酸和/或免疫原性组合物，用于在受试者中诱导对具体地组1和/或组2甲型流行性感冒病毒(例如包括H1、H2、H3、H4、H5、H7和/或H10亚型的HA的流行性感冒病毒)和/或乙型流行性感冒病毒的流行性感冒病毒血球凝集素(HA)的免疫应答的方法。在一些实施例中，本发明提供了用于在受试者中利用本文所述的多肽、核酸和/或免疫原性组合物来诱导对包含H1亚型的HA的流行性感冒病毒的免疫应答的方法。
在一些实施例中，诱导的免疫应答有效于预防和/或治疗由组1和/或组2甲型流行性感冒病毒亚型和/或乙型流行性感冒病毒引起的流行性感冒病毒感染。在一些实施例中，由此处描述的多肽、核酸和/或免疫原性组合物诱导的免疫应答有效于预防和/或治疗由甲型和/或乙型流行性感冒病毒的两个、三个、四个、五个或六个亚型引起的甲型和/或乙型流行性感冒病毒感染。在一些实施例中，诱导的免疫应答是有效地预防和/或治疗由包含H1亚型的HA的流行性感冒病毒引起的流行性感冒病毒感染。
由于熟知的是小蛋白和/或核酸分子不会总是有效地诱导强力的免疫应答，可能必要的是通过添加佐剂增加这些多肽和/或核酸分子的免疫原性。在某些实施例中，此处描述的免疫原性组合物包括佐剂或与佐剂组合给予。用于与此处描述的组合物组合给予的佐剂可在给予所述组合物之前、伴随、或之后给予。适合的佐剂的实例包括铝盐，例如氢氧化铝和/或磷酸铝；油-乳剂组合物(或水包油组合物)，包括鲨烯-水乳液，例如MF59(参见例如WO 90/14837)；皂苷配制品，例如像QS21和免疫刺激复合物(ISCOMS)(参见例如US 5,057,540；WO 90/03184、WO 96/11711、WO 2004/004762、WO 2005/002620)；细菌或微生物衍生物，它们的实例是脂质A(MPL)、3-O-脱酰的MPL(3dMPL)、包含寡核苷酸的CpG-基序、ADP-核糖基化细菌毒素或其突变体，例如大肠杆菌不耐热肠毒素LT、霍乱毒素CT、百日咳毒素PT、或破伤风类毒素TT，基质M(伊斯康诺瓦(Isconova))。此外，可以使用已知的免疫增强技术，例如将本发明的多肽融合至本领域中已知的蛋白以增强免疫应答(例如破伤风类毒素、CRM197、rCTB、细菌鞭毛蛋白或其他的)或包括病毒体中的多肽，或其组合。可使用的其他非限制实例是例如科夫曼(Coffman)等人(2010)披露的。
在一个实施例中，本发明的流行性感冒血球凝集素主干域多肽结合至病毒样颗粒(VLP)载体。VLP通常包括典型地来源于病毒的一种或多种结构蛋白质的一种或多种病毒多肽。优选地，这些VLP不能够复制。在某些实施例中，这些VLP可缺少病毒的完全基因组或包括病毒的基因组的部分。在一些实施例中，这些VLP不能够感染细胞。在一些实施例中，这些VLP表达其表面上的本领域的普通技术人员已知的一个或多个病毒(例如，病毒表面糖蛋白)或非病毒(例如，抗体或蛋白)靶向部分。
在一个特定实施例中，本发明的多肽结合至病毒体中。可使用本领域的普通技术人员已知的技术产生包含根据本发明的多肽的病毒体。例如，可通过如下产生病毒体：破坏纯化病毒、提取基因组、并且用病毒蛋白(例如，流行性感冒血球凝集素主干域多肽)以及脂质重新装配颗粒以形成包含病毒蛋白的脂质颗粒。
本发明也涉及用于在受试者中诱导针对流行性感冒HA的免疫应答，具体而言用于用作疫苗的上述的多肽、核酸、载体和/或免疫原性组合物。此处描述的流行性感冒血球凝集素主干域多肽、编码此类多肽的核酸、或包括此类核酸或多肽的载体因此可被用于引发针对流行性感冒病毒，例如针对流行性感冒病毒血球凝集素的主干区的中和抗体。本发明具体而言涉及如上所述的用于在预防和/或治疗由系统发育组1和/或系统发育组2的甲型流行性感冒病毒和/或乙型流行性感冒病毒引起的疾病或病况中用作疫苗的多肽、核酸和/或免疫原性组合物。在一个实施例中，该疫苗可被用于预防和/或治疗由系统发育组1和/或2的两个、三个、四个、五个、六个或更多个不同亚型和/或乙型流行性感冒病毒引起的疾病。在一个实施例中，该疫苗可以用于预防和/或治疗由包含H1亚型的HA的流行性感冒病毒引起的流行性感冒感染。
本发明的多肽可在合成之后在体外或在适合的细胞表达系统(包括细菌和真核细胞)中使用，或可替代地，可在需要其的受试者中体内表达，通过表达编码免疫原性多肽的核酸。此类核酸疫苗可采取任何形式，包括裸DNA、质粒、或病毒载体(包括腺病毒载体)。
根据本发明的多肽、核酸分子、载体和/或免疫原性组合物的给予可以使用标准给予途径执行。非限制性实例包括肠胃外给予，例如静脉内、皮内、经皮、肌肉内、皮下等或粘膜给予，例如鼻内、经口等等。本领域的普通技术人员能够确定给予根据本发明的多肽、核酸分子、和/或免疫原性组合物以诱导免疫应答的不同可能性。在某些实施例中，超过一次给予该多肽、核酸分子、和/或免疫原性组合物(或疫苗)，即所谓的同源初免-加强免疫接种方案。在某些实施例中，其中超过一次给予多肽、核酸分子、和/或免疫原性组合物，给予第二剂量可以在例如给予第一剂量之后一周或更长时间、给予第一剂量之后两周或更长时间、给予第一剂量之后三周或更长时间、给予第一剂量之后一个月或更长时间、给予第一剂量之后六周或更长时间、给予第一剂量之后两个月或更长时间、给予第一剂量之后3个月或更长时间、给予第一剂量之后4个月或更长时间等等直至给予第一剂量的多肽、核酸分子、和/或免疫原性组合物之后若干年的时间间隔之后进行。也可能超过两次，例如三次、四次等给予该疫苗，以使得第一次初免给药随后为超过一次的加强给药。在其他实施例中，仅一次给予根据本发明的多肽、核酸分子、载体和/或组合物。
多肽、核酸分子、载体和/或组合物还可以在一种异源初免-加强方案中作为初免或者作为加强来给予。
本发明进一步提供了在受试者中利用此处描述的多肽、核酸和/或组合物预防和/或治疗流行性感冒病毒疾病的方法。在一个特定实施例中，用于在受试者中预防和/或治疗流行性感冒病毒疾病的方法包括向有需要的受试者给予有效量的如上所述的多肽、核酸分子、载体和/或组合物。治疗有效量是指如此处定义的多肽、核酸或组合物有效用于预防、缓解和/或治疗由被组1或2甲型流行性感冒病毒和/或乙型流行性感冒病毒感染所引起的疾病或病况，优选地由包含H1亚型的HA的甲型流行性感冒病毒和/或包含H3亚型的HA的甲型流行性感冒病毒感染引起的疾病的量。预防涵盖抑制或减少流行性感冒病毒的传播或抑制或减少与被流行性感冒病毒感染有关的一种或多种症状的发作、发展或进展。如在此使用的缓解可以指减少可见或可察觉的疾病症状、病毒血症或任何其他可测量的流行性感冒感染表现。
需要治疗的那些包括已经患上由组1或组2甲型流行性感冒病毒或乙型流行性感冒病毒感染引起的病况的那些以及其中流行性感冒病毒感染有待预防的那些。本发明的多肽、核酸分子、载体和/或组合物因此可被给予至一个初试受试者，即不具有由流行性感冒病毒感染引起的疾病或尚未被感染以及当前未被流行性感冒病毒感染的受试者，或给予至已经被流行性感冒病毒感染的和/或已经感染过流行性感冒病毒的受试者。
在一个实施例中，预防和/或治疗可以靶向易受流行性感冒病毒感染的患者群组。这些患者群组包括但不限于例如老年人(例如≥50岁、≥60岁以及优选地≥65岁)、幼童(例如≤5岁、≤1岁)、就医患者以及已经用一种抗病毒化合物治疗但已经展示一种不足的抗病毒反应的患者。
在另一个实施例中，这些多肽、核酸分子和/或载体可与一种或多种其他活性剂例如现存的或未来的流行性感冒疫苗、单克隆抗体和/或抗病毒剂、和/或抗细菌剂和/或免疫调节剂组合给予至受试者。这一种或多种其他活性剂可有益于治疗和/或预防流行性感冒病毒疾病或可缓解与流行性感冒病毒疾病关联的症状或病况。在一些实施例中，这一种或多种其他活性剂是止痛药、退烧药物治疗、或缓解或协助呼吸的疗法。
可以调节本发明的多肽和/或核酸分子的剂量方案以提供最优的所希望的反应(例如治疗反应)。一种适合的剂量范围可以是例如0.1-100mg/kg体重，优选1-50mg/kg体重，优选0.5-15mg/kg体重。采用的多肽和/或核酸分子的精确剂量将例如取决于给药途径和该感染及由其引起的疾病的严重性，并且应当根据执业医师的判断和每一受试者的情况来决定。例如，有效剂量依赖靶位点、该患者的生理学状态(包括年龄、体重、健康)、以及治疗是预防性的还是治疗性的而变化。通常，该患者是人，但也可治疗非人哺乳动物(包括转基因的哺乳动物)。治疗剂量最佳地用滴定法测量以优化安全性和有效性。
本发明的多肽也可用于证实鉴定为潜在的治疗候选者的单克隆抗体的结合。另外，本发明的多肽可以用作诊断工具，例如以通过确定一名个体的血清中是否存在能够结合于本发明多肽的抗体来测试该个体的免疫状态。本发明因此还涉及了一种用于检测患者中流行性感冒感染的存在的体外诊断方法，所述方法包括以下步骤：a)使从所述患者中获得的生物样品与根据本发明的多肽接触；并且b)检测抗体-抗原复合物的存在。
本发明的多肽也可用于鉴定新的结合分子或改进现存的结合分子，例如单克隆抗体以及抗病毒剂。
在以下实例和图式中进一步展示本发明。这些实例并不意在以任何方式限制本发明的范围。
实例
实例1：在PCT/EP 2014/060997中披露的基于主干的多肽
PCT/EP 2012/073706披露了流行性感冒血球凝集素主干域多肽、组合物和疫苗以及在预防和/或治疗流行性感冒的领域中使用它们的方法。PCT/EP 2014/060997披露了来源于H1N1 A/布里斯班/59/2007的全长HA的主干域多肽的另外的序列(SEQ ID NO:1)，它是通过H1-mini2-簇1+5+6-GCN4(SEQ ID NO:2)的定向突变获得的，并且它稳定地呈递CR6261(斯罗索比(Throsby)等人，2009；艾基尔特(Ekiert)等人，2010)和/或CR9114的广泛中和表位。
H1-mini2-簇1+5+6-GCN4(SEQ ID NO:2)是来源于H1N1 A/布里斯班/59/2007(SEQID NO:1)的全长HA，通过采取以下步骤：
1.去除HA0中的切割位点。在此位点对野生型HA的切割得到HA1和HA2。该去除可以通过使在P1位置(SEQ ID NO:1中位置343)的R突变为Q来实现(参见例如孙(Sun)等人，2010，切割位点的命名法解释)。
2.通过使氨基酸53至320从SEQ ID NO:1缺失而去除头部域。通过四残基柔性接头GGGG连接该序列剩下的N-以及C-末端部分。
3.增加由H1A/布里斯班/59/2007(SEQ ID NO:1)中的残基402至418(或等价物)形成的环(A-螺旋以及CD螺旋之间)的溶解度以增加融合前构象的稳定性并且使修饰的HA的融合后构象两者去稳定化。在H1-mini2-簇1+5+6-GCN4(SEQ ID NO:2)中引入突变F406S、V409T、F413G和L416S(编号参照SEQ ID NO:1)
4.在H1A/布里斯班/59/2007中的位置324和436处的氨基酸之间引入二硫桥；这是通过引入突变R324C和Y436C实现的。(编号参照SEQ ID NO:1)
5.在位置419-433处(编号参照SEQ ID NO:1)引入已知会三聚体化的GCN4衍生的序列MKQIEDKIEEIESKQ(SEQ ID NO:5)。
在某些实施例中，将跨膜和胞内域的序列从HA2的位置514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、526、527、528、529、或530(或其等价位置，如从序列比对测定的)至HA2的C-末端(根据SEQ ID NO:1编号)缺失，以使得在细胞中表达之后产生分泌的(可溶的)多肽。该可溶的多肽通过引入已知形成三聚体结构的序列，即折叠子序列GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL(SEQ ID NO:3)而进一步稳定化，任选地通过短接头连接，如上所述。该接头可任选地包含切割位点用于之后根据本领域的普通技术人员熟知的方案进行加工。为了促进该可溶形式的纯化和检测，可以任选地添加标签序列，例如组氨酸标签(HHHHHHH(SEQ ID NO:20)或HHHHHH(SEQ ID NO:21)或FLAG标签(DYKDDDDK；SEQ ID NO:22)或这些的组合，任选地通过短接头连接。该接头可任选地包含(部分的)蛋白分解切割位点，例如LVPRGS(SEQ ID NO:23)(凝血酶)或IEGR(SEQ ID NO:24)(因子X)，用于之后根据本领域的普通技术人员熟知的方案进行加工。加工的蛋白也包括在本发明中。
这样的组合了FLAG-标签、凝血酶切割位点、折叠子、以及His序列的C-末端序列的实例是SEQ ID NO:4FLAG-凝血酶-折叠子-His。将此序列与可溶形式的H1-mini2-簇1+5+6-GCN4(SEQ ID NO:2)序列组合以建立亲本序列(SEQ ID NO:6)，该序列被用于通过诱变建立本发明的新颖多肽。此序列不包含对应于SEQ ID NO:1和2的氨基酸1-17的前导序列。
因此，主干域多肽是通过以下方式来建立的：使编码该分子头部域的该血球凝集素序列的部分缺失，并且通过如描述于PCT/2012/073706以及上述的接头在该缺失的任一侧上重连接该序列的N-和C-末端部分。去除该头部域留下了之前从暴露的水性溶剂屏蔽的分子的部分，潜在地去稳定化本发明的多肽的结构。出于此原因，使用亲本序列SEQ ID NO:6作为起始点，B-环(具体而言氨基酸残基406(SEQ ID NO:1和2中分别是F和S)、409(V和T)413(F和G)以及416(L和S))中的残基以不同组合突变。SEQ ID NO:6是通过去除前导序列并且用Flag-凝血酶-折叠子--his序列(SEQ ID NO:4)替代残基520-565而从H1-mini2-簇1+5+6-GCN4(SEQ ID NO:2)建立。
相似地，在该融合肽周围的区域中，数个疏水残基被暴露于该溶剂，这是由以下事实引起的，不像天然全长HA，这些多肽不能被切割，并且经受相关的构象变化，该构象变化将该疏水融合肽隐藏在该蛋白的内部。为了解决此问题，SEQ ID NO:2中残基I337、I340、F352以及I353中的一些或所有也突变。
通过这种方式，建立HA主干多肽的可溶形式74H9(SEQ ID NO:57)、127H1(SEQ IDNO:55)、71H2(SEQ ID NO:61)、86B4(SEQ ID NO:56)、115A1(SEQID NO:60)、2201C9(SEQ IDNO:63)、55G7(SEQ ID NO:59)、113E7(SEQ ID NO:64)、6E12(SEQ ID NO:58)、181H9(SEQ IDNO:62)，作为库的一部分。
使用本领域的普通技术人员熟知的方案，编码以上所述的多肽的DNA序列被转化到巴斯德毕赤酵母中或被转染到HEK293F细胞中。用于在哺乳动物细胞中表达的构建体包含HA前导序列(SEQ ID NO:1和2中的残基1-17)，而在用于在毕赤酵母中表达的构建体中，该HA前导序列被酵母α因子前导序列(SEQ ID NO:7)替代。以此方式，表达的蛋白向着该细胞培养基定向，从而允许待测定的本发明的多肽的结合和表达而不用进一步纯化。所有序列包含FLAG-折叠子-HIS C-末端序列(SEQ ID NO:4)。
结合本发明的多肽的单克隆抗体(CR6261、CR9114、CR8020)是通过ELISA确定的。为此，将ELISA板用2μg/ml单克隆抗体溶液(20μl/孔)在4℃处理过夜。在去除该抗体溶液之后，在室温下将剩下的表面用脱脂奶粉于PBS中的4％溶液封闭最少1h。在洗涤这些板之后，将20μl的细胞培养基(未搀水的或稀释的)添加到每个孔并且在室温下孵育至少1h。然后洗涤ELISA板并且添加20μl的抗-FLAG-HRP抗体溶液(西格玛A8952，在PBS-Tween中4％脱脂奶粉稀释2000倍)。孵育(在室温下1h)之后，将各板进行再一次洗涤，并且添加20μl发光底物(赛默飞世尔科技公司(Thermoscientific)C#34078)以使该信号显影。可替代地，可使用比色检测方法以使该信号显影。
从均相时间分辨荧光测定来测定本发明的多肽的表达(关于概述，参见例如德歌斯(Degorce)等人，当前化学基因组学(Curr.Chem.Genomics)2009 3:22-32)。为此，通过将210.5μl抗-FLAG-TB(储备液26μg/ml)以及1.68ml的抗-HIS-488(储备液50μg/ml)添加至培养基和50mM HEPES+0.1％BSA的80ml的1比1混合物中制备铽(Tb)标记的抗-FLAG单克隆抗体(供体)和Alexa488标记的抗-His单克隆抗体(受体)(HTRF溶液)的混合物。将19μl的HTRF溶液添加到ELISA板的每个孔中，并且添加1μl的培养基。在激发时并且在允许起源于其他化合物(蛋白，培养基组分等)的干扰性短期背景信号衰退的一个延迟之后，测定在520和665nm的荧光发射的比率。这是对样品中总蛋白含量的测量，并且用于归一化不同实验之间的mAb结合信号。
遵循本领域的普通技术人员熟知的方案，将在表3和4中列出的这些多肽表达于毕赤酵母。收集培养基并且使其结合到CR6261，如上所述测定这些主干域多肽的结合和表达。由于结合测定标度随着表达蛋白浓度进行响应，通过比较结合信号与针对每个表达序列的HTRF测定中的信号的比率，将ELISA结合信号针对蛋白表达进行归一化。相比于SEQ ID NO:6的亲本序列，所有表达的蛋白展现了CR626结合HTRF信号的更高比率。
此外，计算CR6261结合HTRF信号的比率，并且与针对亲本序列SEQ ID NO:6计算的比率进行比较。结果列于表3和4中的第5列；所有表达的蛋白展现更高比率，表明以上所述的主干多肽显示增加的CR6261结合。
实例2：另外的多肽的设计以及表征
上述多肽在CD螺旋中包含来源于酵母转录激活蛋白GCN4的序列RMKQIEDKIEEIESKQ。该序列具有高倾向形成螺旋二级结构，并且可以以这种方式增强本发明的多肽的整体稳定性。已出人意料地发现，血球凝集素主干多肽的稳定性和聚集状态取决于多肽的一级序列中的GCN4衍生序列的确切位置和顺序。
在此实例中，我们描述了一新组多肽，其中将序列RMKQIEDKIEEIESK(SEQ ID NO:20)已经引入位置419-433处(根据SEQ ID NO:1编号；例如SEQ ID NO:81至110)，或将序列RMKQIEDKIEEIESKQK(SEQ ID NO:21)已经引入位置417-433处(例如SEQ ID NO:111至140)。
为此，使用本领域的普通技术人员熟知的分子生物学技术，对实例1中所描述的多肽，即74H9(SEQ ID NO:57)、127H1(SEQ ID NO:55)、71H2(SEQ ID NO:61)、86B4(SEQ IDNO:56)、115A1(SEQ ID NO:60)、2201C9(SEQ ID NO:63)、55G7(SEQ ID NO:59)、113E7(SEQID NO:64)、6E12(SEQ ID NO:58)、181H9(SEQ ID NO:62)进行修饰，以建立在位置419-433处包含序列RMKQIEDKIEEIESK(SEQID NO:20)的序列74H9-t2(SEQ ID NO:83)、127H1-t2(SEQ ID NO:81)、71H2-t2(SEQ ID NO:87)、86B4-t2(SEQ ID NO:82)、115A1-t2(SEQ IDNO:86)、220C9-t2(SEQ ID NO:89)、55G7-t2(SEQ ID NO:85)、113E7-t2(SEQ ID NO:90)、6E12-t2(SEQ ID NO:84)、181H9-t2(SEQ ID NO:88)。
以相似的方式，建立在位置417-433处包含序列RMKQIEDKIEEIESKQK(SEQ ID NO:21)的序列74H9-t3(SEQ ID NO:113)、127H1-t3(SEQ ID NO:111)、71H2-t3(SEQ ID NO:117)、86B4-t3(SEQ ID NO:112)、115A1-t3(SEQ ID NO:116)、2201C9-t3(SEQ ID NO:119)、55G7-t3(SEQ ID NO:115)、113E7-t3(SEQ ID NO:120)、6E12-t3(SEQID NO:114)、181H9-t3(SEQ ID NO:118)。
还可以在来自不同病毒株的HA分子的序列的基础上建立多肽。SEQ ID NO:195-201例如描述了基于H1N1 A/加利福尼亚/07/09株的HA序列的多肽。
如前所述，可以通过去除基于例如从HA2域的残基514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、526、528、529、或530至HA2域的C-末端的序列(根据SEQ ID NO:1编号)的HA的C-末端部分来建立可溶多肽。
可以通过引入已知形成三聚体结构的序列，即GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL(SEQID NO:3)，任选地通过接头连接，这些多肽进一步稳定化。该接头可任选地包含切割位点用于之后根据本领域的普通技术人员熟知的方案进行加工。为了促进该可溶形式的纯化，可添加标签序列，例如his标签(HHHHHHH(SEQ ID NO:15)或HHHHHH(SEQ ID NO:16))或FLAG标签(DYKDDDDK)(SEQ ID NO:22)或这些的组合，任选地通过短接头连接。该接头可任选地包含(部分的)蛋白分解切割位点，例如IEGR(SEQ ID NO:24)(因子X)或LVPRGS(SEQ IDNO:23)(凝血酶)，用于之后根据本领域的普通技术人员熟知的方案进行加工。
通过用序列RSLVPRGSPGHHHHHH(包含修饰的凝血酶切割位点和一种6组氨酸标签(SEQ ID NO:21))替代残基519-565(编号参考SEQ ID NO:1)的等价物来建立SEQ ID NO55-64和81-90的多肽的可溶形式，并且遵循本领域的普通技术人员熟知的方案在HEK293F细胞中表达。
出于比较的原因，描述于PCT/EP 2012/073706中的H1-mini2-簇1+5+6-GCN4t2(SEQ ID NO:52)和H1-mini2-簇1+5+6-GCN4t3(SEQ ID NO:53)的可溶形式也包括在实验中。出于检测目的，收集培养基，并且通过夹心ELISA，使用被用来直接从培养基捕获多肽的包被的mAb CR6261或CR9114，以及针对C-末端his-标签的辣根过氧化物酶(HRP)轭合抗体，检测与CR6261、CR9114的结合。可替代地，将与HRP轭合的链霉亲和素组合的生物素化的CR9114用于在夹心ELISA中，检测CR9114捕获的多肽。这种形式允许检测多肽的多聚体形式的存在。测试的所有多肽均能够如通过ELISA确定来结合CR9114和CR6261。针对s55G7-t2(SEQ ID NO:95)、s86B4-t2(SEQ ID NO:92)、s115A1-t2(SEQ ID NO:96)、s127H1-t2(SEQID NO:91)、s113E7-t2(SEQ ID NO:100)、s220C9-t2(SEQ ID NO:99)、s71H2-t2(SEQ IDNO:127)、s127H1-t2(SEQ ID NO:121)、s74H9-t2(SEQ ID NO:123)观察到如通过CR9114捕获-生物素化的CR9114检测夹心ELISA来检测的多聚化的增加的水平。
为了获得多肽的高纯度的制剂用于进一步表征，将HEK293F细胞用包含编码可溶形式的127H1-t2(SEQ ID NO:81)、86B4-t2(SEQ ID NO:82)和55G7-t2(SEQ ID NO:85)的基因的表达载体pcDNA2004转染。本领域的普通技术人员会理解，在生产过程中指导蛋白(对应于SEQ ID NO:1的氨基酸1-17)的转运的前导序列(或信号序列)不会存在于分泌的最终多肽中。
为了产生多肽，通过在300g向下自旋HEK293F细胞(英杰公司(Invitrogen))5min并且重悬于300mL预加温的FreestyleTM培养基/SF1000烧瓶中来种植1.0*106vc/mL。将此培养物在多极(multitron)孵育器中在37℃，10％CO2，110rpm下孵育1小时。1小时之后，将质粒DNA吸移在9.9mL Optimem培养基中达到在300mL培养体积1.0μg/mL的浓度。平行地将440μL
Figure BDA0001205305560000401
吸移在9.9mL Optimem培养基中并且在室温下孵育5分钟。5分钟之后，将质粒DNA/Optimem混合物添加到
Figure BDA0001205305560000404
混合物中，并且在室温下孵育20分钟。孵育之后，将质粒
Figure BDA0001205305560000403
混合物逐滴添加至该细胞悬液中。将转染的培养物在多极(multitron)孵育器中在37℃，10％CO2，和110rpm下孵育。在第7天，通过离心(在3000g30分钟)从该培养基分离细胞，而将包含可溶多肽的上清液经0.2μm瓶顶过滤器过滤以用于进一步加工。
出于纯化目的，将1500ml(s127H1_t2)、1800ml(s86B4_t2)、和2400ml(s55G7_t2)的培养上清液施加至一个24ml镍琼脂糖凝胶HP柱上，在洗涤缓冲液(20mM TRIS、500mMNaCl，pH 7.8)中预平衡。用在洗涤缓冲液中的10mM咪唑进行的洗涤步骤之后，将结合多肽以在洗涤缓冲液中300mM咪唑的分步梯度进行洗脱。将各洗脱峰进行收集，浓缩，并且施加至尺寸排阻柱以进一步纯化(Superdex 200F，或收集并且合并55G7-t2和127H1-t2级分，并且通过SDS-PAGE分析)，ELISA和分析性尺寸排阻色谱与多角度光散射结合以估计分子量(SEC-MALS)。ELISA结果证实了多肽与CR6261和CR9114结合，但不与CR8020结合。SEC-MALS结果概述于表9中。
表8表明，相比于55G7-t2和86B4-t2，多肽s127H1-t2具有高产量(约30mg蛋白质/l培养上清液)。大多数蛋白展现62kDa的分子量，这是在对于单体或二聚体所预期的分子量之间。为了证实该蛋白质的聚集状态，在来源于CR6261、CR9114和CR8020的Fab片段的存在下，重复SEC-MALS实验。结果概述于表8中。
结果显示，在来自CR6261和CR9114、但无CR8020的Fab片段的存在下，可溶形式的多肽s127H1-t2形成复合物(如SEC色谱图中峰的位移所证明)。这与这些Fab片段的结合反应的特异性一致，由于CR6261和CR9114结合到来源于组1的HA，而CR8020不会。该复合物的大小在多个表中列出，并且表示多肽s127H1-t2结合一到两个Fab片段，这表明纯化的多肽s127H1-t2的群体的至少一部分是处于二聚形式。
为了进一步分析多肽127H1-t2和mAb’s CR6261以及CR9114之间的结合反应，连同为了证实CR6261和CR9114的构象表位的存在，通过生物膜层干涉技术(Octet Red384，福特生物公司(Forte Bio))研究这些抗体与该纯化蛋白的复合。为此，将生物素化的CR6261、CR9114和CR8020固定于链霉亲和素涂覆的传感器上，随后将其首先暴露于纯化多肽的溶液以测量缔合率并且然后暴露于洗涤溶液以测量解离率。
固定的CR6261和CR9114两者识别，如通过在暴露于可溶形式的127H1-t2之后的明显反应证明的。总之，多肽s127H1-t2以高批量生产并且能够以高亲和性结合广泛中和单克隆抗体CR6261和CR9114，这证实了相应的中和表位在该主干域多肽中的存在。该多肽具有形成二聚结构的倾向。
实例3：本发明的二硫键稳定的三聚体
改进疫苗中免疫原上的中和表位的呈递的一种方式是工程化单体免疫原之间的另外相互作用，以建立与单体相比具有增加的稳定性的多聚体种类。该方法的缺点是通过将这些单体免疫原结合在一起，重要的表位可以潜在地被下一个原体覆盖。因此，应注意避免这种情况。此处所述的本发明的多肽源自流行性感冒的血球凝集素分子。该分子是病毒膜上的处于其天然状态的三聚体。这里我们描述了本发明的修饰的多肽，它在溶液中形成稳定的三聚体，同时暴露中和的mAb CR6261和CR9114的表位。
为了产生本发明的三聚体多肽，设计了促进基于HA-主干的多肽的单体种类的三聚化的稳定化相互作用，特别集中于在三聚体中的单个单体之间建立共价二硫桥。为此，分析了来自处于其未切割状态的H1N1 A/南卡罗来纳/1./18(PDB 1RD8)和H1N1 A/加利福尼亚/04/2009(PDB:3LZG)的FL HA的三维结构，以鉴定其中另一单体的接近性和该蛋白质的构象特征可以潜在地允许形成单体间二硫桥的区域。鉴定了残基间距离小于
Figure BDA0001205305560000424
的11对残基(表9)。注意确保每对残基位于三聚体结构中不同的原体(单体)上。将多肽127H1-t2(SEQ ID NO:160至170)和55G7-t2(SEQ ID NO:149-159)中的这些残基的等价物(如通过序列比对确定的)突变为半胱氨酸，目的是形成通过二硫桥的形成共价连接的三聚体多肽。考虑到三聚体HA分子的3重对称性，成功的设计导致了三个前体间二硫桥的形成，这些二硫桥将三聚体中的每个单体共价连接到两个其它单体上。
为了测试所设计的二硫桥以及CR9114和CR6261的中和表位的存在，将可溶形式的所设计的多肽在HEK293F细胞中表达。通过从SEQ ID NO:149至170缺失残基530-565(编号参考SEQ ID NO:1)的等价物以建立多肽SEQ ID NO:171至192从而建立可溶形式。在C末端添加另外的序列EGRHHHHHHH(SEQ ID NO:19)，实际上在因子X蛋白水解切割位点之前引入7组氨酸纯化标签以帮助纯化和/或检测。
为了产生多肽，通过在300g向下自旋HEK293F细胞(英杰公司(Invitrogen))5min并且重悬于30mL预加温的FreestyleTM培养基/SF250烧瓶中来种植1.0*106vc/mL。将此培养物在多极(multitron)孵育器中在37℃，10％CO2，110rpm下孵育1小时。1小时之后，将质粒DNA吸移在1mL Optimem培养基中达到在30mL培养体积1.0μg/mL的浓度。平行地将44μL
Figure BDA0001205305560000421
吸移在1mL Optimem培养基中并且在室温下孵育5分钟。5分钟之后，将质粒DNA/Optimem混合物添加到
Figure BDA0001205305560000422
混合物中，并且在室温下孵育20分钟。孵育之后，将质粒
Figure BDA0001205305560000423
混合物逐滴添加至该细胞悬液中。将转染的培养物在多极(multitron)孵育器中在37℃，10％CO2，和110rpm下孵育。在第7天，通过离心(在3000g 30分钟)从该培养基分离细胞，而将包含本发明的可溶多肽的上清液经0.2μm瓶顶过滤器过滤以用于进一步加工。
收集培养基并在夹心ELISA中分析多聚体形式的多肽的存在，这些多聚体形式的多肽呈递广泛中和抗体CR9114的两个或多个表位。首先，将CR9114包被的板用于直接从培养基中捕获表达的多肽。第二，将与HRP轭合的链霉亲和素组合的生物素化的CR9114用于检测CR9114捕获的本发明的多肽。作为来自H1N1 A/布里斯班/59/2007的处于三聚体和单体形式的对照可溶性纯化全长HA包括在该测定中(图2A)。结果示于图2中。
该三聚体全长HA在低稀释度下显示清晰的信号，但是在约0.0001g/ml以及更低的浓度下，此信号不再是可检测的(图2A)。对于单体全长HA，在低稀释度下也观察到信号，但是强度低得多，并且在约0.02g/ml以及更低时该信号不再是可检测的。最可能的是，该信号由一些残余三聚体引起，这些残余三聚体在纯化期间不能与单体分离或已经随时间从单体形成。可溶形式的H1 mini2-簇1+5+6-GCN4(SEQ ID NO:52)(图2A)和127H1(SEQ ID NO:55)图2B仅显示低强度信号，这表明低浓度或不存在在溶液中展示CR9114的表位的多聚体多肽。可溶形式的127H1-t2(SEQ ID NO:81)图2B在此测定中显示出清晰的反应，这表明一些多聚体种类的存在，但与全长HA三聚体相比，观察到的信号的强度是低的。
基于具有另外引入的半胱氨酸的55G7-t2的可溶性多肽的结果示于图2C中。对于大多数肽，没有观察到或仅观察到非常低的信号，表明在培养基中不存在呈递CR9114的表位的多聚体种类。值得注意的例外是多肽s55G7-t2-c18长(SEQ ID NO:175；在位置411和419处引入另外的半胱氨酸；编号参考SEQ ID NO:1)。显示可检测的反应的唯一的其他多肽是s55G7-t2-cl14长(SEQ ID NO:171；在位置423和424处引入另外的半胱氨酸)，但是信号更低并且在更低稀释度下消失。
基于127H1-t2的多肽的结果示于图2D中。在这种情况下，针对多肽s127H1-t2-cl14长(SEQ ID NO:182；在位置423和424处的另外的半胱氨酸)、s127H1-t2-cl15长(SEQID NO:183；在位置430和431处的另外的半胱氨酸)、s127H1-t2-cl17长(SEQ ID NO:185；在位置405和429处的另外的半胱氨酸)、和s127H1-t2-cl24长(SEQ ID NO:191；在位置344和467处的另外的半胱氨酸)观察到清晰的反应，并且针对s127H1-t2-cl19长(SEQ ID NO:187；在位置38和390处的另外的半胱氨酸)和s127H1-t2-cl23长(SEQ ID NO:190；在位置342和460处的另外外的半胱氨酸)观察到更小程度的反应。针对s127H1-t2-cl16长(SEQ IDNO:184；在位置404和433处的另外的半胱氨酸)观察到低但可检测的反应。然而，如在55G7-t2的情况下，针对具有在位置411和419(SEQ ID NO:186)处引入的另外的半胱氨酸的变体s127H1-t2-cl18长获得最佳结果。
为了进一步表征具有另外的半胱氨酸的本发明的多肽，使用本领域中明确的方案通过蛋白质印迹来分析培养物上清液。出于检测目的，使用针对H1N1(A/加利福尼亚/04/2009)的HA-蛋白的多克隆抗体。对于在非还原条件下的三聚体，即当二硫桥完整时，预期蛋白质带在约90kDa或以上(取决于糖基化程度)，而在还原条件下，预期带接近35kD(对应于本发明的糖基化的单体多肽)。这些结果示于图3A和B中。对于55G7-t2的包含另外的半胱氨酸的变体，在还原条件下，对于s55G7-t2-cl18长和s55G7-t2-cl22长观察到强信号，并且对于s55G7-cl14长观察到更小程度的信号。在非还原条件下，对于s55G7-t2-cl18长和s55G7-t2-cl22长观察到不同大小的超过100kDa的蛋白质的涂片，表明共价交联的主干域多肽存在于这些样品中。还观察到对于s55G7-cl14长的涂片，但是强度低于对于s55G7-cl18和s55G7-cl22所观察到的。
在还原条件下，来源于127H1-t2的包含另外的半胱氨酸的多肽的蛋白质印迹的结果(图3C)表明对于s127H1-t2-cl14长、s127H1-t2-cl15长、s127H1-t2-cl16长、s127H1-t2-cl17长以及s127H1-t2-cl18长的强信号。对于s127H1-t2-cl17长和s127H1-t2-cl18长，在非还原条件下观察到接近100kDa的确定的蛋白带(图3D)，表明存在共价交联的干域域多肽。多肽s127H1-t2-cl14长和s127H1-t2-cl15长也在蛋白质印迹上显示100kDa附近的一些强度，但是信号没有s127H1-t2-cl17长强，并且特别是没有s127H1-t2-cl18长强。该构建体中的二硫桥(cl18)将一个单体的B环连接到另一个单体的CD-螺旋的顶部，如图4所示，并在55G7-t2和127H1-t2两者的背景下给出最强的结果。
陆(Lu)等人(PNAS 2013)描述了包含多个单体间二硫桥的HA主干域多肽。它们的构建体在基于大肠杆菌的无细胞系统中产生，并且与此处所述的蛋白质相反是未折叠的蛋白质，并且需要重折叠。陆等人的基于主干的多肽在C-末端包含折叠子三聚域，并且单体通过多个二硫键共价连接。所述的二硫键位于折叠子三聚域中抑或HA-主干多肽的HA衍生部分中。描述了多肽的HA衍生部分中的四个潜在的二硫键，包括在位置423和424(簇14)以及位置430和431(簇15)处的半胱氨酸。在所述的主干域多肽中，在位置430和431(簇15)处的半胱氨酸获得了最好的结果，尽管也可以在位置423和424(簇14)处观察到半胱氨酸的三聚化。在这两种情况下，另外的二硫桥存在于C-末端折叠子域中。出人意料的是，本文的结果显示在不存在连接C-末端三聚域的二硫键的情况下，通过位置411和419处的半胱氨酸共价连接两种不同单体的工程化二硫化物导致更高量的三聚体主干域多肽。总之，我们已经显示，引入策略性放置的二硫键对可以导致基于HA主干的多肽的多聚化。具体地，在位置411和419(簇18)处同时引入半胱氨酸导致在溶液中形成多聚体种类，如从蛋白质印迹和夹心ELISA结果所证明的。
实例4：本发明的三聚体多肽的纯化以及表征
为了进一步表征本发明的多肽127H1-t2-cl18，纯化该蛋白质。为了促进纯化，可以如上所述去除蛋白质C-末端的跨膜域和胞质域，以建立可溶版本的该蛋白质。本领域的普通技术人员会理解，在生产过程中指导蛋白(对应于SEQ ID NO:1的氨基酸1-17)的转运的前导序列(或信号序列)不会存在于分泌的最终多肽中。本发明的可溶性多肽的非限制性实例是s127H-t2-cl18长(SEQ ID NO:186)。
为了获得本发明多肽的高纯度制剂，用表达载体pcDNA2004转染HEK293F细胞并按照本领域中明确的方案培养7天，该表达载体pcDNA2004包含编码本发明的多肽s127H1-t2-c18长(SEQ ID NO:186)的基因，该多肽s127H1-t2-c18长包含另外的C-末端his标签序列(EGRHHHHHHH)。出于纯化目的，将300ml的培养上清液施加至一个5ml His Trap柱上，在洗涤缓冲液(20mM TRIS、500mM NaCl，pH 7.8)中预平衡。用在洗涤缓冲液中的10mM咪唑进行的洗涤步骤之后，将本发明的结合多肽以在洗涤缓冲液中300mM咪唑的分步梯度进行洗脱。将各洗脱峰进行收集，交换缓冲液,浓缩，并且施加至尺寸排阻柱以进一步纯化(Superdex200)。洗脱曲线示于图5A中，如该图所示收集级分1-4，并通过SDS-PAGE(图5B)、非变性PAGE(图5C)和蛋白质印迹(图5D)进行分析。
在非还原条件下，SDS PAGE显示级分2和3的清晰带在100和150kD之间，如对于本发明的共价连接的三聚多肽所预期的，而级分4显示以约37kD为中心的扩散带，接近于对于本发明的单体多肽所预期的大小。大小的变化是多肽的糖基化程度的变化的结果，并且已经观察到来源于HA的其他主干域多肽。在二硫桥还原时，级分3中的主带移动至约37kD，非常相似于对级分4所观察到的带，表明还原导致单体化。对于级分2，不能清晰地识别偏移。级分1显示一系列大小的蛋白质没有明显的主带。
非变性PAGE(非还原条件)显示级分3和4中的蛋白质之间的明显的大小差异，其中主带分别在146-240kD之间和低于66kD。对于级分2，观察到146和240kD之间的弱信号，而对于级分1没有蛋白质可以检测到，可能是由于大聚集体的形成。
使用多克隆抗His用于检测的蛋白质印迹数据(非还原条件)证实了级分3中的主带是组氨酸标记的材料，因为在100和150kD之间观察到清晰的带。对于级分2，观察到三聚体的预期大小附近的弱信号，但是也检测到更高级的寡聚体，而对于级分4，在37kD附近观察到弱的和扩散的信号。这些数据证实级分2、3和4中的这些主带来源于H1 HA。在级分1中没有观察到蛋白质的信号。
通过ELISA，使用抗His标签的单克隆抗体的包被来捕获本发明的his标记的多肽，来确定CR6261、CR9114和CR8020的中和表位的存在。结合研究中的mAb后，使用与辣根过氧化物酶轭合的第二抗体进行检测。作为对照，包括单体和三聚体全长H1 HA(抗原)连同针对H1 HA的多克隆血清(用于检测)。结果示于图6中。对于级分2、3和4，以及对于单体和三聚体FL HA，清晰地观察到与mAb CR6261和CR9114的结合。对于级分1，仅检测到对于CR9114结合的弱信号，并且几乎没有结合CR6261的信号。没有观察到结合CR8020的级分(来自组2的HA的特异性mAb)。该单体FL HA被多克隆抗H1 HA识别，但是对三聚体FL Ha的反应少得多，可能是由于三聚体与单体中的一些表位的阻断。在级分3(SDS-PAGE上的三聚体)和级分4(在SDS-PAGE上的单体)的结果之间观察到相似的模式，这与在级分3中存在的本发明的多肽在溶液中的良好折叠的三聚体形式一致。
还在CR9114夹心ELISA中测试级分1-4，以检测如上所述的本发明的多聚体多肽(参见图7)。出于比较的原因，单体和三聚体FL HA再次包括在该实验中。级分3表现出非常相似于三聚体FL HA的反应，与本发明多肽的三聚体形式一致，而级分2和4的反应介于单体FL HA和三聚体FL HA之间。
通过分析性尺寸排阻色谱结合多角度光散射(SEC-MALS)来研究CR6261、CR9114和CR8020以及s127H1-t2-cl18长的Fab片段之间的复合物形成，以估计级分3中的蛋白质的分子量(图8)。结果显示，级分3中存在的多肽具有分子量为约110kD，与三聚体的形成一致(基于氨基酸序列计算的单体分子量，不包括糖基化为29.2kD)。在来自CR6261和CR9114、但无CR8020的Fab片段的存在下，本发明的多肽s127H1-t2-cl18长形成复合物(如SEC色谱图中峰的位移所证明)。这与这些Fab片段的结合反应的特异性一致，由于CR6261和CR9114结合到来源于组1的HA，而CR8020不会。与CR6261和CR9114的Fab片段形成的复合物的大小分别为约215和248kD，并且表明多肽127H1-t2-cl18可以结合3个Fab片段(与3个Fab片段复合的三聚体的预期分子量为约250kD；如来源于SEC-MALS实验的分子量总结于表10中)
实例5：本发明的多肽的表征
为了进一步分析本发明的多肽127H1-t2-cl18和mAb’s CR6261以及CR9114之间的结合反应，连同为了再次证实CR6261和CR9114的构象表位的存在，通过生物膜层干涉技术(Octet Red384，福特生物公司(Forte Bio))研究这些抗体与该纯化蛋白的复合。为此，将生物素化的CR6261、CR9114和CR8020固定于链霉亲和素涂覆的传感器上，随后将其首先暴露于本发明的纯化多肽127H1-t2-cl18的溶液以测量缔合率并且然后暴露于洗涤溶液以测量解离率。结果示于图9中。
固定的CR6261和CR9114两者识别本发明的多肽，如通过在暴露于可溶形式的127H1-t2-cl18之后的明显反应证明的(图9A和B)。为了估计结合相互作用的解离常数，使用2倍稀释系列进行滴定。将包含固定的CR6261或CR9114的传感器暴露于浓度分别为10、5、2.5、1.3和0.63、0.31以及0.16nM的可溶s127H1-t2-cl18长溶液中，并且记录6600秒后的最终反应。该反应被绘制为该主干域多肽浓度的函数，并且进行至稳态结合模型的拟合，得到对于CR6261/主干域多肽复合物的解离常数Kd为0.7nM和对于CR9114复合物的解离常数Kd为0.5nM(图9C和D)。
总之，本发明的多肽127H1-t2-cl18形成共价三聚体，该共价三聚体能够以高亲合力结合广泛中和性单克隆抗体CR6261和CR9114，证实了相应的中和表位在该主干域多肽中的存在。在溶液中该结合反应的化学计量为1:3，表明中和表位存在于该三聚体的每个单独的单体中。
实例6：在致命的流行性感冒激发模型中对本发明的多肽的保护效力的评价
为了进一步评价本发明的多肽s127H1-t2-cl18长(SEQ ID NO:186)在致命的流行性感冒激发模型中的保护效力，将具有8-14只雌性BALB/c小鼠(6-8周龄)的组以3周间隔用30μg的佐有10μg基质-M的纯化s127H1-t2-cl18长免疫1次、2次和3次。作为该激发模型的阳性对照，在激发之前1天静脉内给予广泛中和抗体单克隆抗体CR6261(15mg/kg)，而用PBS进行免疫则充当阴性对照。在最后一次免疫后四周，将小鼠用25x LD50异源激发病毒(H1N1A/波多黎各/8/34)激发并且每天监测(存活率、重量、临床得分)持续3周。在ELISA测定中针对结合到用于免疫的本发明的多肽s127H1-t2-cl18长(以证实正确的免疫)、结合到可溶的H1N1 A/布里斯班/59/07全长HA(以证实全长HA的识别)、并且与广泛中和抗体单克隆抗体CR9114竞争结合到全长HA(以确定诱导的抗体是否极为贴近地结合广泛中和CR9114表位)，测试最后一次免疫后4周获得的激发前血清。结果示于图10-15中。
结果显示，该实验是有效的，由于PBS对照组中的所有小鼠在激发后第7天屈从于感染，而阳性对照组(15mg/kg CR6261，激发前1天)被全面保护(图10A)。用s127H1-t2-cl18长(SEQ ID NO:186)免疫一次的10只小鼠中的九只存活于该致命的激发，并且所有小鼠在两次或三次免疫后存活(图11)。此外，对于免疫两次或三次的动物，体重减轻是可忽略的(图12)，并且没有观察到(2或3次)临床征象或观察到最小(1次)临床征象(图13)。相比于PBS对照组，针对用本发明的多肽s127H1-t2-cl18长免疫的所有组观察到统计学显著增加的存活比例、增加的存活时间、体重减轻的降低和减少的临床得分。
来自使用s127H1-t2-cl18长(图14A)或可溶全长HA(图14B)作为抗原的最终免疫后4周的激发前时间点的ELISA数据表明，本发明的多肽s127H1-t2-cl18长是免疫原性的并诱导能够识别全长HA的抗体，甚至在一次免疫后，虽然在两次和三次免疫后水平实质上更高。
为了进一步理解对免疫的免疫学应答，进行竞争结合ELISA。为此，将板结合的全长HA用连续稀释的血清样品孵育，之后在预定的滴定浓度添加CR9114-生物素。进一步孵育之后，遵循本领域中熟知的方案，使用链霉亲和素-轭合的辣根过氧化物酶对结合的CR9114-生物素的量进行定量。使用OD对log稀释度的稳固的线性回归来分析数据，表示为‘斜率OD’(ΔOD/10倍稀释)。该数据显示，通过用本发明的佐剂化多肽进行免疫来诱导多个水平的能够与广泛中和抗体CR9114竞争结合的抗体。两次免疫后，这些水平明显高于背景，并且它们继续在第三次免疫后上升(图15，顶图)。作为比较，在独立的图中指明了通过未标记的CR9114(即自我竞争)和非结合单克隆抗体CR8020(两者都从5μg/ml起始浓度连续稀释)诱导的水平(图15，底图)。
总之，我们显示了用本发明的多肽s127H1-t2l18长(SEQ ID NO:186)进行的免疫可保护小鼠对抗流行性感冒的致命的感染，甚至是在单个免疫轮次之后。该多肽是免疫原性的并且诱导可以结合全长HA的抗体。至少部分诱导的抗体在单克隆抗体CR9114的广泛中和表位的表位处结合或接近该表位处结合。
实例7：在致命的异源亚型H5N1流行性感冒激发模型中对本发明的多肽的保护效力的评价
为了进一步评价本发明的多肽s127H1-t2-cl18长(SEQ ID NO:186)在致命的H5N1流行性感冒激发模型中的保护效力，将具有8-12只雌性BALB/c小鼠(6-8周龄)的组以3周间隔用30μg的佐有10μg基质-M的纯化s127H1-t2-cl18长免疫3次。作为该激发模型的阳性对照，在激发之前1天静脉内给予广泛中和抗体单克隆抗体CR6261(15mg/kg)，而用PBS进行免疫则充当阴性对照。在最后一次免疫后四周，将小鼠用12.5xLD50异源亚型激发病毒(H5N1A/香港/156/97)激发并且每天监测(存活率、重量、临床得分)持续3周。结果示于图16中。
结果显示，该实验是有效的，由于PBS对照组中的所有小鼠在激发后8-10天之间屈从于感染，而阳性对照组(15mg/kg CR6261，激发前1天)被全面保护(图16A)。用s127H1-t2-cl18长(SEQ ID NO:186)免疫的10/10只小鼠幸存于该致命的激发(图16B)。此外，对于这些动物，体重减轻是可忽略的(图16C)，并且在随访期间没有观察到临床症状(图16D)。相比于PBS对照组，针对用本发明的多肽s127H1-t2-cl18长免疫的组观察到统计学显著增加的存活比例、增加的存活时间、体重减轻的降低和减少的临床得分。
总之，我们显示了用本发明的多肽s127H1-t2l18长(SEQ ID NO:186)进行的免疫可保护小鼠对抗异源亚型H5N1流行性感冒株的致命的感染。
实例8：对通过用本发明的多肽免疫诱导的血清的结合宽度的评价
实例6中所述的结果表明本发明的多肽s127H1-t2-cl18长(SEQ ID NO:186)是免疫原性的，并且可以引发能够识别来自用作本发明的多肽的设计基础的毒株的FL HA的抗体。通过ELISA遵循本领域熟知的方法，还对来自如实例7所述免疫3次的小鼠的血清来测试针对来自多个其他组1(H1、H5和H9)和组II(H3和H7)流行性感冒株的全长HA的结合(图17)。结果证实，用本发明的多肽s127H1-t2-cl18长(SEQ ID NO:186)诱导的抗体有效地识别存在于FL HA的天然序列中的表位，并且抗体结合的这些表位在不同的组1(具体是H1、H5和H9HA)以及甚至是一些组2流行性感冒株(例如H7)中是保守的。
实例9：在致命的H1N1 A/布里斯班/59/2007流行性感冒激发模型中对本发明的多肽的保护效力的评价
为了进一步评价本发明的多肽s127H1-t2-cl18长(SEQ ID NO:186)在致命的H1N1流行性感冒激发模型中的保护效力，将具有8-18只雌性BALB/c小鼠(6-8周龄)的组以3周间隔用30μg的佐有10μg基质-M的纯化s127H1-t2-cl18长免疫3次。作为该激发模型的阳性对照，在激发之前1天静脉内给予广泛中和抗体单克隆抗体CR6261(15mg/kg)，而用PBS进行免疫则充当阴性对照。在最后一次免疫后四周，将小鼠用12.5xLD50激发病毒(H1N1 A/布里斯班/59/2007)激发并且每天监测(存活率、重量、临床得分)持续3周。
结果显示，该实验是有效的，由于PBS对照组中的所有小鼠在激发后7-10天之间屈从于感染，而阳性对照组(15mg/kg CR6261，激发前1天)被全面保护(图18A)。用s127H1-t2-cl18长(SEQ ID NO:186)免疫的10/10只小鼠幸存于该致命的激发(图18B)。此外，感染后平均4天体重减轻约10％(图18C)，但在10天内动物完全恢复。临床症状在感染后4天也达到峰值，但在感染后第9天起不存在(图18D)。相比于PBS对照组，针对用本发明的多肽s127H1-t2-cl18长免疫的组观察到统计学显著增加的存活比例、增加的存活时间、体重减轻的降低和减少的临床得分。
总之，我们显示了用本发明的多肽s127H1-t2l18长(SEQ ID NO:186)进行的免疫可保护小鼠对抗H1N1 A/布里斯班/59/2007的致命的感染。
实施例10：对用本发明的多肽免疫的小鼠的血清中流行性感冒中和抗体的存在的评价
为了进一步研究在针对流行性感冒的保护中起作用的抗体介导的效应机制，如下所述，使用来源于H5N1 A/越南/1194/04的拟颗粒,在拟颗粒中和测定(阿尔贝里尼(Alberini)等人，2009)中测试激发前血清。
拟颗粒中和测定
如前所述，生成表达FL HA的拟颗粒(谭波顿(Temperton)等人，2007)。如先前(阿尔贝里尼等人，2009)所述，具有一些修改，使用单轮转导的HEK293细胞与编码荧光素酶报告基因的H5A/越南/1194/04拟颗粒来确定中和抗体。简言之，将热灭活(56℃下30分钟)的激发前血清样品3倍连续稀释于96孔平底培养板中的一式三份的生长培养基(MEM Eagle与EBSS(龙沙公司(Lonza)，巴塞尔，瑞士))中，该生长培养基补充有2mM L-谷氨酰胺(龙沙)、1％非必需氨基酸溶液(龙沙公司)、100U/ml的Pen/Strep(龙沙公司)和10％FBS(欧克隆(Euroclone)，佩罗，意大利))，并且添加滴定数的H5A/越南/1194/04拟颗粒(感染后产生106个相对发光单位(RLU))。在37℃、5％CO2下孵育1h后，每孔添加104个HEK293细胞。在37℃、5％CO2下孵育48h后，添加荧光素酶底物(Britelie Plus，珀金埃尔默公司(PerkinElmer)，沃尔瑟姆(Waltham)，马萨诸塞州)，并根据制造商的说明使用发光计(Mithras LB940，贝特霍尔德技术公司(Berthold Technologies)，德国)测量发光。
如实例6、7和8中所述，从用本发明的多肽s127H1-t2l18长(SEQ ID NO:186)免疫的动物获得的激发前血清显示使用拟颗粒中和测定在高血清浓度下的可检测的中和(图19)。这证明了本发明的多肽用作免疫原时引发广泛中和抗体的能力。除了直接的病毒中和以外，Fc介导的效应机制，例如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)，基本上有助于防止流行性感冒，伴随在这些机制中特别有效的主干定向的bnAb(狄丽罗(DiLillo)等人，2014)。为了测试用本发明的多肽s127H1-t2l18长(SEQ ID NO:186)免疫后引发的的抗体是否能够诱导ADCC，我们使用如以下所述的适于小鼠的ADCC替代测定(帕里克(Parekh)等人，2012；施钮日格(Schneuriger)等人2012；；郑(Cheng)等人，2014)来测试激发前血清。
抗体依赖性细胞毒性(ADCC)替代测定
在37℃、10％CO2下，将人肺癌来源的A549上皮细胞(ATCC CCL-185)维持在补充有10％热灭活的胎牛血清的杜氏改良伊格尔培养基(DMEM)中。实验前两天，使用在Opti-MEM(英杰公司)中的Lipofectamine 2000(英杰公司)，用编码H5A/香港/156/97HA或H1A/布里斯班/59/2007HA的质粒DNA转染A549细胞。在该测定前一天，收获转染的细胞并在用于ADCC的白色96孔板(Costar)中和用于成像的黑色透明底96孔板(BD Falcon)中进行接种。24小时后，将样品稀释于RPMI 1640(Gibco)中的测定缓冲液(4％超低IgG FBS(Gibco))中并且在56℃下加热灭活30分钟，随后在测定缓冲液中连续稀释。对于ADCC生物测定，将A549细胞用新鲜的测定缓冲液和抗体稀释液重新装满，并且将表达小鼠Fcγ受体IV(FcγRIV；普洛麦格公司(Promega))的ADCC生物测定Jurkat效应细胞添加到这些细胞中，并且以1:4.5的靶效应比在37℃下孵育6小时。将细胞平衡至室温15分钟，之后添加Bio-Glo荧光素酶系统底物(普洛麦格公司)。10分钟后在Synergy Neo(Biotek)上读出发光。数据表示为在不存在血清下的信号的诱导倍数。
使用该测定，使用来自H5N1 A/香港/156/97或H1N1 A/布里斯班/59/07的FL HA转染的靶细胞作为抗原的来源，针对FcγRIV信号传导活性测试从用如在实例6、7、和8中所述的本发明的多肽s127H1-t2l18长(SEQ ID NO:186)免疫的动物获得的激发前血清(图20)。在两种情况下，在测试的最高血清浓度下观察到30至40倍诱导，证实了本发明的多肽引发激活FcγRIV信号传导的抗体的能力，指示小鼠中ADCC/ADCP效应子功能。
显示于实例6-9中的这些结果显示，本发明的多肽s127H1-t2l18长(SEQ ID NO:186)能够引发主干靶向、中和与ADCC介导的抗体，并且保护小鼠对抗用同源、异源和异种亚型组I流行性感冒株的致命的激发的能力。
实例11：基于来自H1N1 A/加利福尼亚/07/09的HA的本发明的多肽的设计。
实例1至10描述了基于来自H1N1 A/布里斯班/59/2007的HA的本发明多肽。也可以基于来自其他流行性感冒株例如H1N1 A/加利福尼亚/07/09的其他HA来设计相似的多肽。因此，按照以上列出的程序，建立了SEQ ID NO:202和203中所述的本发明的多肽。
实例12：基于来自H1毒株的HA的本发明的另外的多肽的设计。
实施例1至11描述了基于来自H1N1 A/布里斯班/59/2007(SEQ ID NO:1)和H1N1A/加利福尼亚/07/09(SEQ ID NO:252)的HA的本发明的多肽。也可以基于来自其他H1流行性感冒株的HA来设计相似的多肽，并且这些也包括在本发明中。非限制性实例是H1N1 A/德克萨斯/UR06-0526/07(SEQ ID NO:205)、H1N1 A/纽约/629/95(SEQ ID NO:206)和H1N1 A/AA_马顿(Marton)/43(SEQ ID NO:204)。因此，按照以上概述的程序，建立了在SEQ ID NO:207至216中所述的位置411和419(簇18)处的半胱氨酸之间包含工程化二硫桥的本发明的主干域多肽。SEQ ID NO:202、203、213和214包含在位置415(编号参考SEQ ID NO:1)处引入的另外的赖氨酸突变，以建立根据SEQ ID NO:8的B环序列；这些序列也包括在本发明中。
实例13：本发明的多肽的表达以及表征
为了测试所设计的二硫桥以及CR9114和CR6261的中和表位的存在，将可溶形式的所设计的多肽在HEK293F细胞中表达。通过从SEQ ID NO:202、207、209、213缺失氨基酸残基530-565(编号参考SEQ ID NO:1)的等价物以分别建立本发明的多肽SEQ ID NO:203、208、210和214从而建立可溶形式。应注意，这些序列描述了这些多肽的加工形式，即在去除前导序列之后。在C末端添加另外的序列EGRHHHHHHH(SEQ ID NO:19)或在SEQ ID NO:208EGRHHHHHH的情况下，实际上在因子X蛋白水解切割位点之前引入7或6个组氨酸纯化标签以帮助纯化和/或检测。
为了产生多肽，通过在300g向下自旋HEK293F细胞(英杰公司(Invitrogen))5min并且重悬于30mL预加温的FreestyleTM培养基/SF250烧瓶中来种植1.0*106vc/mL。将此培养物在多极(multitron)孵育器中在37℃，10％CO2，110rpm下孵育1小时。1小时之后，将质粒DNA吸移在1mL Optimem培养基中达到在30mL培养体积1.0μg/mL的浓度。平行地将44μL
Figure BDA0001205305560000511
吸移在1mL Optimem培养基中并且在室温下孵育5分钟。5分钟之后，将质粒DNA/Optimem混合物添加到
Figure BDA0001205305560000512
混合物中，并且在室温下孵育20分钟。孵育之后，将质粒
Figure BDA0001205305560000521
混合物逐滴添加至该细胞悬液中。将转染的培养物在多极(multitron)孵育器中在37℃，10％CO2，和110rpm下孵育。在第7天，通过离心(在3000g 30分钟)从该培养基分离细胞，而将包含本发明的可溶多肽的上清液经0.2μm瓶顶过滤器过滤以用于进一步加工。
收集培养基并在夹心ELISA中分析多聚体形式的多肽的存在，这些多聚体形式的多肽呈递广泛中和抗体CR9114的两个或多个表位。首先，将CR9114包被的板用于直接从培养基中捕获表达的多肽。第二，将与HRP轭合的链霉亲和素组合的生物素化的CR9114用于检测CR9114捕获的本发明的多肽。出于比较的原因，在测定中包括处于三聚体和单体形式的来自H1N1 A/布里斯班/59/2007的可溶纯化的全长HA连同纯化的三聚体s127H1-t2-cl18长(SEQ ID NO:186)(起始浓度为5μg/ml)。结果示于图21A中。
该三聚体全长HA在低稀释度下显示清晰的信号，但是在1:6561或更高的稀释度(即，更低浓度)下，该信号不再是可检测的(图21A)。对于单体全长HA，在低稀释度下也观察到信号，但是强度低得多，并且在1:729的稀释度下该信号不再是可检测的。最可能的是，该信号由一些残余三聚体引起，这些残余三聚体在纯化期间不能与单体分离或已经随时间从单体形成。包含另外的C-末端his标签序列(EGRHHHHHHH)的纯化的三聚体s127H1-t2-cl18长(SEQ ID NO:186)(起始浓度为5μg/ml)也在该测定中产生清晰的信号，该信号在1:19683的浓度下变得不可检测。包含本发明的多肽SEQ ID NO:203、208、210和214的培养基也在该测定中显示清晰的信号，表明本发明的多聚体多肽的存在。对于来源于A/加利福尼亚/07/09(SEQ ID NO:203)的多肽观察到最强的反应。在该测定中针对来源于H1N1 A/AA_马顿/1943(SEQ ID NO:214)的本发明的多肽所观察到的更弱反应是本发明的该具体多肽的更低表达的结果，如从下文所述的培养基的蛋白质印迹的结果所证明的。
为了进一步表征包含另外的半胱氨酸的本发明的多肽，使用本领域中明确的方案通过蛋白质印迹来分析培养物上清液。出于检测目的，使用针对H1N1(A/加利福尼亚/04/2009)的HA-蛋白的多克隆抗体。对于在非还原条件下的二硫键连接的三聚体，即当二硫桥完整时，预期蛋白质带在约90kDa或以上(取决于糖基化程度)，而在还原条件下，预期带接近35kD(对应于本发明的糖基化的单体多肽)。图22显示了来源于以下各项毒株的HA的本发明的多肽的结果：H1N1 A/得克萨斯/(SEQ ID NO:208)、H1N1 A/纽约/629/95(SEQ ID NO:210)、H1N1 A/加利福尼亚/07/09(SEQ ID NO:203)和H1N1 A/AA_马顿/1943(SEQ ID NO:214)。在还原条件下的蛋白质印迹显示，本发明的所有四种多肽尽管表达不同水平，对于H1N1 A/加利福尼亚/07/09衍生的本发明的多肽(SEQ ID NO:203)观察到最高表达，对于H1N1A/AA_马顿/1943衍生的多肽(SEQ ID NO:214)观察到最低表达。在这些条件下，这些多肽作为凝胶中的单体运行，相似于包含另外的C-末端his标签序列(EGRHHHHHHH)的纯化的三聚体s127H1-t2-cl18long(SEQ ID NO:186)。在非还原条件下，对于本发明的所有多肽(包括s127H1-t2-c18长(SEQ ID NO:186))观察到指示本发明的三聚体多肽存在的在100和150kD之间的条带。对于源自H1N1 A/AA_马顿/1943(SEQ ID NO:214)的多肽，单体条带不再可见，并且出现了针对三聚体的预期高度下的条带，尽管由于该多肽的更低表达而处于低强度。此外，还可以观察到在约75kD下运行的二聚体形式。由于本发明的单个多肽的糖基化程度的变化，本发明的这些多肽在大小上有些不均匀。
为了进一步证实CR6261和CR9114的中和表位的存在，通过ELISA分析培养物上清液。首先，将用针对本发明的可溶性多肽上的his-标签的抗体涂覆的平板用于直接从培养基中捕获表达的多肽。第二，加入CR9114或CR6261，并且将HRP轭合的山羊抗人抗体用于检测CR9114或CR6261与本发明的多肽的结合。作为来自H1N1 A/布里斯班/59/2007的处于三聚体和单体形式的阳性对照可溶性纯化全长HA包括在该测定中(图2B、C)。作为阴性对照，也使用来自组2的HA特异性mAb CR8020进行ELISA。结果示于图21D中。本发明的多肽在具有CR9114和CR6261的ELISA中显示出清晰的反应，对于来源于A/加利福尼亚/07/09(SEQ IDNO:203)的多肽观察到最高反应。纯化的可溶性全长HA(单体和三聚体两者)也显示强反应。如所预期的，在具有CR8020的ELISA中没有观察到反应，证实了CR6261和CR9114与本发明的多肽的结合的特异性。
总之，上述结果显示，来源于如上所述的H1 HA序列的本发明的多肽可以形成三聚体种类并且包含CR6261和CR9114的中和表位。
实例14：基于来自流行性感冒组1毒株的HA的本发明的另外的多肽的设计。
实例1至13描述了基于来自H1N1的HA的本发明的多肽。也可以基于来自其他组1流行性感冒株的HA来设计相似的多肽，例如包含H2、H5和H9HA的那些。这些多肽也包括在本发明中。这些毒株的非限制性实例是例如H2N2A/安达(Adachi)/2/1957、H2N2A/新加坡/1/1957、H5N1 A/越南/1203/2004以及H9N2A/香港/69955/2008。因此，按照以上概述的程序，建立了在SEQ ID NO:218至221、SEQ ID NO:223至226、SEQ ID NO:228至231、和SEQ ID NO:233至236中所述的位置411和419(簇18)处的半胱氨酸之间包含工程化二硫桥的本发明的多肽。
应当注意的是，来自H5N1 A/越南/1203/2004的全长HA(SEQ ID NO:227)包含多元切割位点，即在SEQ ID NO:227直接之前的融合肽序列中的位置341-346处的序列RRRKTR。在本发明的多肽228-231中，该多元切割位点已被去除，并被一个单一的谷氨酰胺(Q)残基替代以去除完整的切割位点。这些序列也包括在本发明中。
SEQ ID NO:219、221、224和226在位置407和414-416处包含另外的突变(根据SEQID NO:1编号；请注意，在H2序列中，与SEQ ID NO:1相比，位置9、10和139处的残基是缺失的)，以建立根据SEQ ID NO:8(除了是半胱氨酸的残基418)的B环序列。
SEQ ID NO:230和231在位置407(E407T)和415(N415S)处包含另外的突变(根据SEQ ID NO:1编号)。这些突变建立了根据SEQ ID NO:8(除了是半胱氨酸的残基418)的B环序列。已进一步修饰SEQ ID NO:236和236以包含序列MNTQYTAIGCEYNKSE(即根据SEQ IDNO:8的序列，除了是半胱氨酸的残基418)。
实例15：基于来自流行性感冒组2毒株的HA的本发明的二硫键稳定化的三聚体的设计。
实例1至14描述了基于来自组1毒株的HA的本发明的多肽。也可以基于来自组2(如例如H3和H7)的HA序列来设计二硫键交联的多肽。这些多肽也包括在本发明中。这些毒株的非限制性实例是例如H3N2A/香港/1/1968和H7。
改进疫苗中免疫原上的中和表位的呈递的一种方式是工程化单体免疫原之间的另外相互作用，以建立与单体相比具有增加的稳定性的多聚体种类。该方法的缺点是通过将这些单体免疫原结合在一起，重要的表位可以潜在地被下一个原体覆盖。因此，应注意避免这种情况。
这里我们描述了本发明的修饰的多肽，其在溶液中形成稳定的三聚体，同时暴露中和的mAb CR8020和CR8043的表位。
为了产生本发明的三聚体多肽，设计了促进基于HA-主干的多肽的单体种类的三聚化的稳定化相互作用，特别集中于在三聚体中的单个单体之间建立共价二硫桥。为此，分析了来自H3N2A/香港//1/1968(PDB:3SDY)的FL HA的三维结构，以鉴定其中另一单体的接近性和该蛋白质的构象特征可以潜在地允许形成单体间二硫桥的区域。对六对残基进行鉴定(表11)。注意确保每对残基位于三聚体结构中不同的原体(单体)上。然后将基于组2的主干域多肽中的这些残基(如通过序列比对确定的)的等价物突变为半胱氨酸，以建立本发明的多肽，使得可以形成通过二硫桥的形成而共价连接的多肽。考虑到三聚体HA分子的3重对称性，成功的设计导致了三个前体间二硫桥的形成，这些二硫桥将三聚体中的每个单体共价连接到两个其它单体上。
WO 2013/079473描述了基于来自能够结合广泛中和抗体CR8020、CR8043的组2毒株的HA的主干域多肽。将来自表11的成对二硫键引入来源于H3N2A/香港/1/1968的HA的多肽H3HK mini2a-接头+cl9+10+11+12+GCN4T(本文的SEQ ID NO:238；在WO2013/079473中的SEQ ID NO:130)和H3HK mini2a-接头+cl9+10+11+12+GCN4T-CG7-1(本文的SEQ ID NO:239；在WO 2013/079473中的SEQ ID NO:174)中，以得到本发明的多肽240至251。
SEQ ID NO:240至251的序列包含HA前导序列。本领域的普通技术人员将理解，在成熟蛋白质中该前导序列已被切除并且不再存在。加工的序列也包括在本发明中。
可以通过缺失C-末端跨膜区和胞质域来建立可溶形式的本发明的多肽。该缺失可以例如包括从525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536或537至C-末端的残基。这些多肽也包括在本发明中。在一些情况下，可以添加任选地通过短接头连接、任选地包含蛋白水解切割位点的C-末端三聚序列。三聚域的一个实例是SEQ ID NO:3的折叠子序列。加工的序列也包括在本发明中。
实例16：用于流行性感冒疫苗保护效力评价的NHP pH1N1激发模型的验证以及NHP中的H1 mini-HA#4900的免疫原性和保护效力
为了能够研究替代模型中UFV疫苗候选物的免疫原性和保护效力，使用大流行H1N1毒株(A/墨西哥/InDRE4487/2009)的食蟹猕猴(Cynomolgus macaques)(Macacafasicularis)中的非人灵长类动物(NHP)激发模型先前已经在BPRC(赖斯韦克(Rijswijk)，荷兰)成立。这个模型基于由萨凡尼茨(Safronetz)等人(2011)病毒学杂志(J Virol.)85:1214文献中公开的模型。
然而，需要确定该模型是否可以用于评价流行性感冒疫苗的保护效力。
这项研究的主要目的是
a)评价先前建立的食蟹猕猴中的pH1N1激发模型是否可用于测量疫苗介导的保护效力，使用包含15μg与所用的激发毒株同源的H1N1毒株的FL HA的季节性疫苗(
Figure BDA0001205305560000551
V，季节2013/2014；Inflexal13/14)。
b)评价s127H1-t2-c18长(SEQ ID NO:186)在非人灵长类动物中的免疫原性。
次要目的是评价s127H1-t2-c18长(SEQ ID NO:186)在该pH1N1 NHP激发模型中的保护效力。
在针对α疱疹病毒、STLV、SIV、SRV和流感A NP的血清抗体，针对激发病毒的HAI滴度(允许最大滴度为1/10)的存在下，预先筛选雄性食蟹猴群，连同通过Mantoux和血液测试来测试结核病。一些筛选的动物是先前的CR8020PK研究的一部分。筛选后，使用考虑年龄、体重、HAI滴度以及PK研究中的内含物的随机化区组设计，将适合的动物随机分配到3个组中，每组6只动物。在腹部植入以15分钟间隔测量体温的数据记录器，随后是1个月的恢复期，这之后开始免疫方案。将一组用Inflexal V 13/14(包含15μg H1N1 A/加利福尼亚/07/09的FL HA)的人剂量(0.5mL)接受2次肌肉内(i.m.)免疫，这是针对初试儿童的由医疗机构(CDC、RIVM)提倡的官方指导免疫方案。将第二组用150μgs127H1-t2-cl18long(SEQ ID NO:186；包含另外的His-标签)蛋白(佐有50μg体积为0.5mL的基质-M)蛋白接受3次肌肉内免疫。第三组是阴性对照组，将其肌肉内给予3次0.5mL PBS。所有免疫以4周免疫间隔进行。最终免疫后四周，用4x 106TCID50(其是在模型设置期间建立的剂量)H1N1 A/墨西哥/InDRE4487/2009支气管内激发动物。在21天的随访期间，每天记录临床征象。在测量体重的第1、2、4、6、8、10、14和21天对动物进行麻醉，取气管拭子以通过qPCR确定病毒载量。在该研究结束时，移除数据记录器并分析数据。
为了验证给予的疫苗的免疫原性，在免疫当天连同激发前5天分离血清。对于两种疫苗接种处理，针对结合具有疫苗能力的一组甲型流行性感冒病毒组1和2FL HA的宽度来分析激发前血清应答，以诱导抗体在紧邻CR9114表位处的结合，使用CR9114竞争ELISA，其中反应表示为％竞争、疫苗诱导的抗体的替代ADCC活性(参见下文)和疫苗诱导的抗体的中和活性，使用针对异种亚型H5N1 A/HK/156/97的微量中和测定连同检测由FL HA头部表位介导的病毒中和的HAI测定两者，使用H1N1 A/加利福尼亚/07/09。后者毒株对于该疫苗和激发毒株来说是同源的。
使用ADCC生物测定效应细胞(表达人Fcγ受体IIIA(FcγRIIIA)、人CD3γ和调节萤光素酶报道基因(Promega)的NFAT-应答元件的稳定的Jurkat细胞)以及用编码H1N1和H5N1毒株的FL HA的DNA瞬时转染的A549靶细胞来确定替代ADCC活性。
结果
-在气管病毒载量AUC中，没有看到处理组之间的显着差异(未显示)。
-在本发明的基质-M佐剂的多肽SEQ ID NO:186和PBS组之间在第0-3天(p＝0.010)和第0-8天(p＝0.047)间隔期间的激发后体温增加(发热)中看到显著差异(图27)。
-在第0-3天(p＝0.033)间隔期间，在Inflexal13/14组和PBS组之间的激发后体温增加中看到显著差异(图27)。
-体重和临床征象由于轻度症状而不是信息性的，可能主要通过重复麻醉而确定，并且因此未显示。
-动物Ji0403061(Inflexal13/14组)在激发后第8天死亡。由兽医病理学家进行的尸检确定病毒性肺炎为死亡原因，与直到死亡时高的气管病毒载量一致。
-3x 150μg本发明的多肽SEQ ID NO:186+50μg基质-M的免疫方案是免疫原性的：
·组1 HA结合抗体的诱导(图23)
·对抗3种不同组1 HA蛋白的CR9114竞争抗体的诱导(图24)
·使用微中和测定对中和异种亚型H5N1毒株的抗体的诱导(图26)。
·使用3种不同的组1 HA蛋白作为靶HA对能够产生ADCC效应子功能的抗体的诱导(图25)
结论：在猕猴中的H1N1流行性感冒激发模型中对疫苗介导的疾病干预的证明仅部分是成功的，因为在激发后的前3天只有发热显著减少。用3x150μg H1 mini-HA#4900+50μg基质-M进行的三次免疫在非人灵长类动物中是免疫原性的。诱导的抗体能够结合HA和针对所测试的所有组1全长HA的ADCC效应子功能，并且还中和异种亚型H5毒株。
实例17：通过来自本发明的多肽免疫的小鼠的血清的被动转移来保护免受H5N1A/香港/156/97的致命的激发
为了确定由本发明的多肽诱导的抗体对所观察到的保护的贡献，进行血清转移研究。
本研究的目的是评估来自用s127H1-t2-cl18长(SEQ ID NO:186)免疫三次的小鼠的血清的被动转移(多次给药)是否在基质-M存在下对H5N1流行性感冒A/香港/156/97的致命的激发赋予保护。
将雌性BALB/c供体小鼠(6-8周龄)以3周的间隔用30μg的s127H1-t2-cl18长(SEQID NO:186)(包含佐有10μg基质-M或用PBS免疫的C-末端His-标签)免疫3次。最后一次免疫后4周(d70)分离血清，合并每组并且在受体小鼠(雌性BALB/c，6-8周龄，每组n＝10)中转移。在激发前连续三天(d-3、-2和-1)使每只小鼠腹膜内接受400μl血清。在激发之前1天给予激发模型CR6261(15mg/kg)的阳性对照(n＝8)，而用PBS进行注射则充当阴性对照(n＝8)。在第0天，将小鼠用12.5xLD50H5N1 A/香港/156/97激发并且监测(存活率、重量、临床得分)3周。
为了验证在供体小鼠中H1 mini-HA变体的免疫原性并且评估血清转移至受体小鼠后的HA特异性的抗体水平，在ELISA中针对与来自H1N1 A/布里斯班/59/07的FL HA的结合来测试供体小鼠的肢端流血(d70)的合并的血清样品、血清转移前(d-4)的初始受体小鼠的合并的血清样品连同刚好在激发前(d0)的3次血清转移后的受体小鼠的个体血清样品。
结果
-这些实验组的存活百分比报告于表12中。
-实验是有效的；PBS对照组中的所有小鼠在激发后(中值9.5天)第13天或之前屈从于感染，而阳性对照组(15mg/kg CR6261，激发前1天)被全面保护(p<0.001)。
-相比于PBS血清转移对照组，来自基质-M佐剂的s127H1-t2-cl18长(SEQ ID NO:186)的血清的三次血清转移至初始受体小鼠导致了存活比例显著增加(p＝0.001)(图28A)、存活时间增加(p<0.001)(图28A)、体重减轻降低(p＝0.001)(图28B)和临床得分减少(p<0.001)(未显示)。
-在三次血清转移后，FL HA A/布里斯班/59/07特异性抗体滴度相似于主动免疫后获得的水平。(图29)
结论：通过用基质-M佐剂的H1 mini-HA#4900进行3次免疫而诱导的血清组分(最可能是抗体)足以保护小鼠免受异种亚型H5N1 A/香港/156/97的致命的激发。
实例18：在致命的H1N1 A/布里斯班/59/07小鼠模型中的保护效力的评价
为了提供使用本发明的多肽作为疫苗的用途的另外的证据，评价了三种另外的多肽针对流行性感冒的致命的激发的保护效力。为此，如上所述,将本发明的多肽SEQ ID NO:203和254(都包含C-末端his-标签)在HEK293F细胞中瞬时表达并且纯化。此外，如上所述,按照本领域的普通技术人员熟知的程序，在SF9昆虫细胞中表达本发明的多肽SEQ ID NO:186(也包含另外的C-末端his-标签)(参见，例如，M.考克斯(Cox)，使用杆状病毒-昆虫细胞表达系统对流行性感冒病毒疫苗的开发(Development of an influenza virus vaccineusing the baculovirus-insect cell expression system)，PhD论文，瓦赫宁根(Wageningen)大学，2009年12月)并且纯化。
本研究的目的是确定与PBS对照组相比，在H1N1 A/布里斯班/59/07激发模型中具有基质-M的本发明的多肽的保护效力。
将具有10只雌性BALB/c小鼠(6-8周龄)的组用30μg的佐有10μg基质-M的本发明的多肽以3周间隔免疫3次。作为激发模型的阳性对照，在激发之前1天给予CR6261(15mg/kg)(n＝8)，而用PBS进行注射则充当阴性对照(n＝16)。在最后一次免疫后四周，将小鼠用12.5xLD50激发病毒激发并且监测(存活率、重量、临床得分)3周。
为了验证本发明的多肽的免疫原性，在ELISA测定中针对与来自H1N1 A/布里斯班/59/07的FL HA的结合来测试激发前血清(-1天)。为了确定本发明的多肽诱导的抗体是否在紧邻CR9114表位处结合，进行CR9114竞争ELISA。竞争数据可视化为“％竞争”，定义为(AP)/Ax100)，其中A是当不存在血清时CR9114与FL HA结合的最大OD信号，并且P是在以给定稀释度的血清存在下CR9114与FL Ha结合的OD信号或使用能够量化反应的斜率OD度量来表示。
结果
-这些实验组的存活百分比报告于表12中。
-实验是有效的；PBS对照组(n＝16)中的所有小鼠在激发后(中值8天)第10天或之前屈从于感染，而阳性对照组(n＝8，15mg/kg CR6261，激发前1天)被全面保护(p<0.001)。
-相比于PBS对照组，用佐有基质-M的本发明的多肽SEQ ID NO:186、203和254进行的三次免疫导致了存活比例显著增加(p<0.001)(图30A)、存活时间增加(p<0.001)(图30A)、体重减轻降低(p<0.001)(图30B)和临床得分减少(p<0.001)(未显示)。
-对于所有测试的本发明的多肽，相比于PBS，由本发明的多肽诱导的对H1N1 A/布里斯班/59/07FL HA的激发前IgG抗体滴度显著更高(p<0.001)(图31A)。
-对于所有测试的本发明的多肽，两次免疫后，对H1N1 A/布里斯班/59/07FL HA平台的IgG抗体滴度(未显示)。
-相比于PBS，本发明的基质-M佐剂的多肽SEQ ID NO:186、203和254诱导显著更高的CR9114竞争滴度(p<0.001)(图31B)。
-当H1N1 A/布里斯班/59/07FL HA用作靶抗原时，与测试的本发明的其它多肽相比，本发明的基质-M佐剂的多肽SEQ ID NO:203(背景H1N1 A/加利福尼亚/07/2009)诱导显著更低的CR9114竞争抗体(p≤0.013)(图31B)。
结论：结论：本发明的基质-M佐剂的另外的多肽SEQ ID NO:186、203和254赋予针对H1N1 A/布里斯班/59/07的致命的激发的保护。
实例19：在致命的H1N1 A/NL/602/09小鼠模型中的保护效力的评价
为了提供使用本发明的多肽作为疫苗的用途的另外的证据，评价了三种另外的多肽针对流行性感冒的致命的激发的保护效力。为此，如上所述,将本发明的多肽SEQ ID NO:203和254(都包含C-末端his-标签)在HEK293F细胞中瞬时表达并且纯化。此外，如上所述，按照本领域的普通技术人员熟知的方法(如上所述)，将本发明的多肽SEQ ID NO:186(也包含另外的C-末端his-标签)在SF9昆虫细胞中表达并且纯化。
本研究的目的是确定与PBS对照组相比，在H1N1 A/NL/602/09激发模型中佐有基质-M的另外的三聚体H1 mini-HA变体的保护效力。
将具有10只雌性BALB/c小鼠(6-8周龄)的组用30μg的佐有10μg基质-M的本发明的多肽以3周间隔免疫3次。在激发之前1天给予激发模型CR6261(15mg/kg)的阳性对照(n＝8)，而用PBS进行注射则充当阴性对照(n＝16)。在最后一次免疫后四周，将小鼠用12.5xLD50激发病毒激发并且监测(存活率、重量、临床得分)3周。
为了验证本发明的多肽的免疫原性，在ELISA测定中针对与来自H1N1 A/布里斯班/59/07的FL HA的结合来测试激发前血清(-1天)。为了确定mini-HA诱导的抗体是否在紧邻CR9114表位处结合，进行CR9114竞争ELISA。竞争数据可视化为“％竞争”，定义为(AP)/Ax100)，其中A是当不存在血清时CR9114与FL HA结合的最大OD信号，并且P是在以给定稀释度的血清存在下CR9114与FL Ha结合的OD信号或使用能够量化反应的斜率OD度量来表示；包括针对参考CR9114和CR8020(起始浓度5mg/ml)溶液。
结果
-这些实验组的存活百分比报告于表12中。
-实验是有效的；PBS对照组(n＝16)中的所有小鼠在激发后(中值6天)第8天或之前屈从于感染，而阳性对照组(n＝8，15mg/kg CR6261，激发前1天)被全面保护(p<0.001)。
-相比于PBS对照组，用佐有基质-M的本发明的多肽SEQ ID NO:186、203和254进行的三次免疫导致了存活比例显著增加(p<0.004)(图32A)、存活时间增加(p<0.001)(图32A)和临床得分减少(p<0.001)(未显示)。对于本发明的多肽SEQ ID NO:203，也观察到体重AUC的显著降低(p<0.001)(图32B)。
-相比于PBS，由本发明的多肽SEQ ID NO:186、203和254诱导的对H1N1 A/布里斯班/59/07FL HA的激发前IgG抗体滴度显著更高(p<0.001)(图33A)。
-相比于PBS，本发明的基质-M佐剂的多肽SEQ ID NO:186、203和254诱导显著更高的CR9114竞争滴度(p<0.001)(图33B)。
-当H1N1 A/布里斯班/59/07FL HA用作靶抗原时，与来源于H1N1A/布里斯班/59/2007相比，本发明的基质-M佐剂的三聚体多肽SEQ ID NO:203(背景H1N1 A/加利福尼亚/07/2009)诱导显著更低的CR9114竞争抗体(p≤0.002)(图33B)。
结论：本发明的基质-M佐剂的多肽SEQ ID NO:186、203和254赋予针对H1N1 A/NL/602/09的致命的激发的保护。
实例20：在H5N1 A/香港/156/97小鼠模型中H1 mHA三聚体候选物评价II
为了提供使用本发明的多肽作为疫苗的用途的另外的证据，评价了三种另外的多肽针对流行性感冒的致命的激发的保护效力。为此，如上所述,将本发明的多肽203和254(都包含C-末端his-标签)在HEK293F细胞中瞬时表达并且纯化。此外，如上所述,按照本领域的普通技术人员熟知的方法，将本发明的多肽SEQ ID NO:186(也包含另外的C-末端his-标签)在SF9昆虫细胞中表达并且纯化。
本研究的目的是确定与PBS对照组相比，在H5N1 A/香港/156/97激发模型中佐有基质-M的本发明的多肽SEQ ID NO:186、203和254的保护效力。
将具有10只雌性BALB/c小鼠(6-8周龄)的组用30μg的佐有10μg基质-M的本发明的多肽以3周间隔免疫3次。作为激发模型的阳性对照，在激发之前1天给予CR6261(15mg/kg)(n＝8)，而用PBS进行注射则充当阴性对照(n＝16)。在最后一次免疫后四周，将小鼠用12.5xLD50激发病毒激发并且监测(存活率、重量、临床得分)3周。
为了验证本发明的多肽SEQ ID NO:186、203和254的免疫原性，在ELISA测定中针对与来自H1N1 A/布里斯班/59/07的FL HA的结合来测试激发前血清(-1天)。为了确定mini-HA诱导的抗体是否在紧邻CR9114表位处结合，进行CR9114竞争ELISA。竞争数据可视化为“％竞争”，定义为(AP)/Ax100)，其中A是当不存在血清时CR9114与FL HA结合的最大OD信号，并且P是在以给定稀释度的血清存在下CR9114与FL Ha结合的OD信号或使用能够量化反应的斜率OD度量来表示；包括针对参考CR9114和CR8020(起始浓度5μg/ml)溶液。
结果：
-这些实验组的存活百分比报告于表12中。
-实验是有效的；PBS对照组中的15/16只小鼠在激发后(中值9天)第9天或之前屈从于感染，而阳性对照组(n＝8，15mg/kg CR6261，激发前1天)被全面保护(p<0.001)。
-相比于PBS对照组，用佐有基质-M的本发明的多肽SEQ ID NO:186、203和254进行的三次免疫导致了存活比例显著增加(p<0.001)(图34A)、存活时间增加(p<0.001)(图34A)、体重减轻降低(p<0.001)(图34B)和临床得分减少(p<0.001)(未显示)。
-相比于PBS，由本发明的多肽SEQ ID NO:186、203和254诱导的对H1N1 A/布里斯班/59/07FL HA的激发前IgG抗体滴度显著更高(p<0.001)(图35A)。
-相比于PBS，本发明的基质-M佐剂的多肽SEQ ID NO:186、203和254诱导显著更高的CR9114竞争滴度(p<0.001)(图35B)。
-当H1N1 A/布里斯班/59/07FL HA用作靶抗原时，与本发明的多肽SEQ ID NO:186和254相比(背景H1N1 A/布里斯班/59/2007)，本发明的基质-M佐剂的多肽SEQ ID NO:203(背景H1N1 A/加利福尼亚/07/2009)诱导显著更低的CR9114竞争抗体(p<0.001)(图35B)。
结论：本发明的基质-M佐剂的多肽SEQ ID NO:186、203和254赋予针对异种亚型H5N1 A/香港/156/97的致命的激发的保护。
实例21：在a H1N1 A/波多黎各/8/34小鼠模型中H1 mHA三聚体候选物评价II
为了提供使用本发明的多肽作为疫苗的用途的另外的证据，评价了三种另外的多肽针对流行性感冒的致命的激发的保护效力。为此，如上所述,将本发明的多肽203和254(都包含C-末端his-标签)在HEK293F细胞中瞬时表达并且纯化。此外，如上所述,按照本领域的普通技术人员熟知的方法，将本发明的多肽SEQ ID NO:186(也包含另外的C-末端his-标签)在SF9昆虫细胞中表达并且纯化。
本研究的目的是确定与PBS对照组相比，在H1N1 A/波多黎各/8/1934激发模型中佐有基质-M的本发明的多肽SEQ ID NO:186、203和254的保护效力。
将具有10只雌性BALB/c小鼠(6-8周龄)的组用30μg的佐有10μg基质-M的本发明的多肽EQ ID NO:186、203和254以3周间隔免疫3次。在激发之前1天给予激发模型CR6261(15mg/kg)的阳性对照(n＝8)，而用PBS进行3次免疫则充当阴性对照(n＝16)。在最后一次免疫后四周，将小鼠用25xLD50激发病毒激发并且监测(存活率、重量、临床得分)3周。
为了验证本发明的多肽的免疫原性，在ELISA测定中针对与来自H1N1 A/布里斯班/59/07的FL HA的结合来测试激发前血清(-1天)。为了确定mini-HA诱导的抗体是否在紧邻CR9114表位处结合，进行CR9114竞争ELISA。竞争数据可视化为“％竞争”，定义为(AP)/Ax100)，其中A是当不存在血清时CR9114与FL HA结合的最大OD信号，并且P是在以给定稀释度的血清存在下CR9114与FL Ha结合的OD信号或使用能够量化反应的斜率OD度量来表示；包括针对参考CR9114和CR8020(起始浓度5μg/ml)溶液。
结果
-这些实验组的存活百分比报告于表12中。
-实验是有效的；PBS对照组(n＝16)中的所有小鼠在激发后(中值8天)第9天或之前屈从于感染，而阳性对照组(n＝8，15mg/kg CR6261，激发前1天)被全面保护(p<0.001)。
-相比于PBS对照组，用佐有基质-M的本发明的多肽SEQ ID NO:186、203和254进行的三次免疫导致了存活比例显著增加(p<0.001)(图36A)、存活时间增加(p<0.001)(图36A)、体重减轻降低(p<0.001)(图37B)和临床得分减少(p<0.001)(未显示)。
-对于本发明的多肽SEQ ID NO:186、203和254，与PBS相比，由H1 mini-HA变体诱导的H1N1 A/布里斯班/59/07FL HA的激发前IgG抗体滴度显著更高(p<0.001)(图37A)。
-相比于PBS，本发明的基质-M佐剂的多肽SEQ ID NO:186、203和254诱导显著更高的CR9114竞争滴度(p<0.001)(图37B)。
-当H1N1 A/布里斯班/59/07FL HA用作靶抗原时，与基于H1N1 A/布里斯班/59/2007相比，本发明的基质-M佐剂的三聚体多肽SEQ ID NO:203(背景H1N1 A/加利福尼亚/07/2009)诱导显著更低的CR9114竞争抗体(p≤0.001)(图37B)。
结论：本发明的基质-M佐剂的多肽SEQ ID NO:186、203和254赋予针对H1N1 A/波多黎各/8/34的致命的激发的保护。
实例22：在不同的H1序列背景下本发明的多肽
紧临127H1-t2-cl18long(SEQ ID NO:181)，产生了两个变体Tex_s127H1-t2-cl18长和NY_s127H1-t2-cl18长(SEQ ID NO:208和210)，它们共享相同的设计特征，然而，它们基于源自毒株H1N1 A/德克萨斯/UR06-0526/07(SEQ ID NO:205)和A/纽约/629/95(SEQ IDNO:206)的HA。在此实验中，C-末端因子X切割位点和6个组氨酸标签存在于两种蛋白质中。为了表达和纯化，使用与实例2中所述相似的方案(除了用0.6l培养物上清液开始该程序外)。
在夹心ELISA中(如实例3所述)针对多聚体形式的多肽的存在进一步分析纯化的多肽，这些多聚体形式的多肽呈递广泛中和抗体CR9114的两个或多个表位。简言之，使用包被的mAb CR9114捕获纯化的蛋白，随后将这些纯化的蛋白与生物素化的CR914或CR6261一起孵育，并通过HRP轭合的链霉亲和素评估结合。生产产量和多聚体夹心ELISA结果示于表13中。
表13中显示的结果表明，所有变体产生具有希望的结合特征的多聚体蛋白。与s127H1-t2-cl18长相比，多肽Tex_s127H1-t2-cl18(SEQ ID NO:208)具有相似的产量，而与s127H1-t2-cl18长(SEQ ID NO:181)相比，多肽NY_s127H1-t2-cl18(SEQ ID NO:210)具有约4倍更低产量。测试的所有多肽能够结合CR9114和CR6261，这相似于s127H1-t2-cl18，如通过指示多聚化的存在的ELISA所确定的。总之，这里所示的结果证明了使用不同系统发育起源的H1序列成功产生了基于HA主干的多肽。
实例23：具有另外的C-末端三聚域的本发明的多肽
可以用多种C-末端表达本发明的多肽。除了不同长度(由HA的跨膜域的可替代的截短产生)外，还可以添加用于检测和纯化的标签连同功能域，而不影响抗原结构。下面的构建体证明了将折叠子三聚域(侧接有Flag-和His-标签)添加到短(缺失残基520到C-末端；根据SEQ ID NO:1编号)或长(缺失残基520到C-末端)形式的来源于来自H1A/布里斯班/59/2007(SEQ ID NO:1)或H1A/加利福尼亚/07/2009(SEQ ID NO:252)的FL HA的本发明的多肽的多个版本。
将这些构建体在HEK293F细胞中瞬时表达(如实例2所述)，并研究存在于过滤的培养物上清液中的本发明的多肽。首先通过SDS-PAGE和蛋白质印迹评估表达和三聚化的水平(如实例2所述，参见图38)。在夹心ELISA中(如实例3所述)针对多聚体形式的多肽的存在进一步分析培养基，这些多聚体形式的多肽呈递广泛中和抗体CR9114的两个或多个表位。简言之，使用包被的mAb CR9114捕获纯化的蛋白，随后将这些纯化的蛋白与生物素化的CR914一起孵育，并通过HRP轭合的链霉亲和素评估结合(参见表14)。最后，进行均质结合研究以确认本发明的多肽的表达水平，连同以确定它们与在HA的主干上具有已知表位的良好表征的单克隆抗体(IgG)的结合强度。此处建立了依赖于c-末端Flag-和His-标签连同人单克隆IgG CR9114和CR6261的αLISA装置(珀金埃尔默公司)。所有试剂在包含PBS、0.05％Tween-20、和0.5mg/ml BSA的缓冲液中稀释。
为了使用该αLISA装置确定表达水平，在来自珀金埃尔默公司的抗His供体珠和抗Flag受体珠的存在下，将包含本发明的多肽的过滤的细胞培养物上清液稀释40倍并且在10μg/mL下以终体积为25μL。将该均质混合物在RT孵育1h。如果该激发的供体珠(680nm)和受体珠都结合相应的c-末端标签并且非常接近(约100nm)，则可以测量能量转移(单线态氧)作为该受体珠的发光信号(615nm)。在该均质测定形式中的信号强度直接与溶液中的蛋白质的量成正比。本发明的表达多肽的αLISA信号强度的平均值示于表14中。
在室温下用CR9114或CR6261(分别为1或2nM最终浓度，在25μL中)与两种珠(识别HA的抗His供体珠(10μg/mL)和识别所使用的IgG的抗Fc受体珠(10μg/mL))孵育1小时后，检测本发明的多肽与IgG之间的相互作用。再孵育一小时后，测量该受体珠的αLISA信号。这种均质测定形式中的信号强度直接与两个结合配偶体之间的结合强度(亲和性/亲合力)成正比，并且由此是mini-HA表位的完整性和质量的量度。针对CR9114和CR6261的结合的αLISA信号强度的平均值示于表14中。
这些亲本构建体SEQ ID NO:164(H1A/布里斯班/59/2007背景)和SEQ ID NO:211(H1A/加利福尼亚/07/2009背景)已经包含嵌入C-螺旋中的GCN4三聚域。在这些多肽的可溶形式(也包括在本发明中)的c-末端插入另外的折叠子三聚域是可能的，并且导致相似或更好的表达水平。如通过蛋白质印迹和多聚体ELISA结果所证明的，该另外的三聚域可以进一步关于三聚化水平而改进本发明的多肽。与仅具有一个三聚结的本发明的多肽相比，广泛中和的IgG CR9114和CR6261的结合相等或更好。
表1.标准氨基酸、缩写以及特性
氨基酸 3字母 1字母 侧链极性 侧链电荷(pH 7.4)
丙氨酸 Ala A 非极性 中性
精氨酸 Arg R 极性 正性
天冬酰胺 Asn N 极性 中性
天冬氨酸 Asp D 极性 负性
半胱氨酸 Cys C 非极性 中性
谷氨酸 Glu E 极性 负性
谷氨酰胺 Gln Q 极性 中性
甘氨酸 Gly G 非极性 中性
组氨酸 His H 极性 正性(10％)中性(90％)
异亮氨酸 Ile I 非极性 中性
亮氨酸 Leu L 非极性 中性
赖氨酸 Lys K 极性 正性
甲硫氨酸 Met M 非极性 中性
苯丙氨酸 Phe F 非极性 中性
脯氨酸 Pro P 非极性 中性
丝氨酸 Ser S 极性 中性
苏氨酸 Thr T 极性 中性
色氨酸 Trp W 非极性 中性
酪氨酸 Tyr Y 极性 中性
缬氨酸 Val V 非极性 中性
表2.根据本发明的具体实施例的H1序列的序列比对
Figure BDA0001205305560000651
Figure BDA0001205305560000662
Figure BDA0001205305560000661
Figure BDA0001205305560000671
Figure BDA0001205305560000672
Figure BDA0001205305560000673
Figure BDA0001205305560000681
Figure BDA0001205305560000682
Figure BDA0001205305560000683
Figure BDA0001205305560000691
Figure BDA0001205305560000692
Figure BDA0001205305560000693
Figure BDA0001205305560000701
Figure BDA0001205305560000702
Figure BDA0001205305560000703
Figure BDA0001205305560000711
Figure BDA0001205305560000712
表3.毕赤酵母中表达的多肽。
如所述的测定表达和CR6261结合，并且计算结合和表达信号的比率。
Figure BDA0001205305560000721
Figure BDA0001205305560000731
表4毕赤酵母中表达的多肽。
如所述的测定表达和CR6261结合，并且计算结合和表达信号的比率。
Figure BDA0001205305560000741
Figure BDA0001205305560000751
表5.HEK293F中表达的多肽。
如所述的测定表达和CR6261结合，并且计算结合和表达信号的比率。每个克隆中包括的突变表明于表4以及5中。
Figure BDA0001205305560000761
表6.针对每个亚型以序列总数目的％计的在指示位置天然发生的序列变化
Figure BDA0001205305560000762
Figure BDA0001205305560000771
表7.多肽的mAb结合的纯化以及强度
Figure BDA0001205305560000772
表8.如通过SEC-MALS针对本发明的多肽及其与CR6261和CR9114的Fab片段的复合体确定的分子量。基于本发明的多肽的序列(假设单体)以及来自附接聚醣的大约10kDa的另外贡献来估计理论(theor)值。还通过SEC-MALS确定CR6261、CR9114以及CR8020的Fab片段的分子量，并且分别是48、49以及47kDa。
Figure BDA0001205305560000773
表9.设计和测试的二硫桥
Figure BDA0001205305560000774
Figure BDA0001205305560000781
表10.如从SEC MALS实验所确定的的分子量。括号之间给出了三聚体FL或s127H1-t2-cl18和三聚体FL或s127H1-t2-cl18与Fab片段(每三聚体3个)复合的理论预期值。
Figure BDA0001205305560000782
***从稳态Octet测量计算的Kd app(参见图9)
表11.来源于组2流行性感冒株的HA的主干域多肽的前体间二硫桥的设计
Figure BDA0001205305560000783
表12.在实例17-21中报道的存活比例数据的总结(以％计)
Figure BDA0001205305560000784
Figure BDA0001205305560000791
在激发后第21天(随访结束)报道存活率％，并且都与接受PBS的阴性对照组显著不同。
*在Sf9昆虫细胞中表达；
表13.在夹心ELISA中蛋白产量和纯化的材料的EC50值
Figure BDA0001205305560000792
表14：具有另外的C-末端三聚域的本发明的多肽的表征。。
Figure BDA0001205305560000793
Figure BDA0001205305560000801
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序列
SEQ ID NO 1：H1全长(A/布里斯班/59/2007)
Figure BDA0001205305560000821
SEQ ID NO：2：H1-mini2-簇1+5+6-GCN4
Figure BDA0001205305560000822
SEQ ID NO：3：折叠子
GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
SEQ ID NO：4：FLAG-凝血酶-折叠子-HIS
SGRDYKDDDDKLVPRGSPGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGHHHHHH
SEQ ID NO：5：
MKQIEDKIEEIESKQ
SEQ ID NO：6：H1-mini2-簇1+5+6-GCN4，不具有前导序列并且具有FLAG-凝血酶-折叠子-HIS
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNIPSIQSQGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQSTATGKEGNKSERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVSGRDYKDDDDKLVPRGSPGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGHHHHHH
SEQ ID NO 7：H1共有序列残基402-418(根据SEQ ID NO：1编号)402 MNTQFTAVGKEFN(H/K)LE(K/R)418
＞SC09-114VH蛋白(SEQ ID NO：11)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKSSGGTSNNYAISWVRQAPGQGLDWMGGISPIFGSTAYAQKFQGRVTISADIFSNTAYMELNSLTSEDTAVYFCARHGNYYYYSGMDVWGQGTTVTVSS
＞SC09-114VL蛋白(SEQ ID NO：12)
SYVLTQPPAVSGTPGQRVTISCSGSDSNIGRRSVNWYQQFPGTAPKLLIYSNDQRPSVVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEAEYYCAAWDDSLKGAVFGGGTQLTVL
＞CR6261 VH蛋白(SEQ ID NO：9)
Figure BDA0001205305560000831
＞CR6261 VL蛋白(SEQ ID NO：10)
Figure BDA0001205305560000832
＞SC08-057VH蛋白(SEQ ID NO：13)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTDSVIFMSWVRQAPGKGLECVSIIYIDDSTYYADSVKGRFTISRHNSMGTVFLEMNSLRPDDTAVYYCATESGDFGDQTGPYHYYAMDV
＞SC08-057VL蛋白(SEQ ID NO：14)
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGSSGDIGGYNAVSWYQHHPGKAPKLMIYEVTSRPSGVSDRFSASRSGDTASLTVSGLQAEDEAHYYCCSFADSNILI
＞SC08-020VH蛋白(SEQ ID NO：13)
QVQLQQSGAEVKTPGASVKVSCKASGYTFTRFGVSWIRQAPGQGLEWIGWISAYNGDTYYAQKFQARVTMTTDTSTTTAYMEMRSLRSDDTAVYYCAREPPLFYSSWSLDN
＞SC08-020 VL蛋白(SEQ ID NO：18)
EIVXTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSMNYLAWFQQKPGQAPRLLIYGASRRATGIPDRISGSGSGTDFTLTISRLEPADFAVYYCQQYGTSPRT
SEQ ID NO：2：H1-mini2-簇1+5+6-GCN4
Figure BDA0001205305560000833
SEQ ID NO：52：H1-mini2-簇1+5+6-GCN4t3
Figure BDA0001205305560000841
SEQ ID NO：55：127H1
MKVKLLVLLCTFTATYADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSKQSQGLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQYTAIGKEYNKSERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI
SEQ ID NO：56：86B4
MKVKLLVLLCTFTATYADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSNQSQGLFGAIAGYKEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQFTAIGKEMNKIERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI
SEQ ID NO：57：74H9
MKVKLLVLLCTFTATYADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSNQSQGLFGAIAGFKEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQYTAFGKEMNKSERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI
SEQ ID NO：58：6E12
MKVKLLVLLCTFTATYADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNEPSNQSQGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQLTAFGKEVNKLERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI
SEQ ID NO：59：55G7
MKVKLLVLLCTFTATYADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSNQSQGLFGAIAGYVEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQYTAI GKEMNKLERMKQI E DKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI
SEQ ID NO：60：115A1
MKVKLLVLLCTFTATYADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSKQSQGLFGAIAGYTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQITAVGKEYNKIERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI
SEQ ID NO：61：71H2
MKVKLLVLLCTFTATYADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSNQSQGLFGAIAGFKEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQLTAIGKEVNKSERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI
SEQ ID NO：62：181H9
MKVKLLVLLCTFTATYADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNVPSKQSQGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNKNERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI
SEQ ID NO：63：220C9
MKVKLLVLLCTFTATYADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSTQSQGLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQFTATGKEYNKLERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI
SEQ ID NO：64：113E7
MKVKLLVLLCTFTATYADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSKQSQGLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQYTATGKEINKHERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI
SEQ ID NO：65：s74H9
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSNQSQGLFGAIAGFKEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQYTAFGKEMNKSERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGRSLVPRGSPGHHHHHH
SEQ ID NO：66：s127H1
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSKQSQGLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQYTAIGKEYNKSERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGRSLVPRGSPGHHHHHH
SEQ ID NO：67：s86B4
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSNQSQGLFGAIAGYKEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQFTAIGKEMNKIERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGRSLVPRGSPGHHHHHH
SEQ ID NO：68：s55G7
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSNQSQGLFGAIAGYVEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQYTAIGKEMNKLERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGRSLVPRGSPGHHHHHH
SEQ ID NO：69：s6E12
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNEPSNQSQGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQLTAFGKEVNKLERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGRSLVPRGSPGHHHHHH
SEQ ID NO：70：s115A1
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSKQSQGLFGAIAGYTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQITAVGKEYNKIERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGRSLVPRGSPGHHHHHH
SEQ ID NO：71：s71H2
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSNQSQGLFGAIAGFKEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQLTAIGKEVNKSERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGRSLVPRGSPGHHHHHH
SEQ ID NO：76：s181H9
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNVPSKQSQGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNKNERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGRSLVPRGSPGHHHHHH
SEQ ID NO：77：s220C9
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSTQSQGLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQFTATGKEYNKLERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGRSLVPRGSPGHHHHHH
SEQ ID NO：78：s113E7
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSKQSQGLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQYTATGKEINKHERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGRSLVPRGSPGHHHHHH
SEQ ID NO：72：s74H9-长
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSNQSQGLFGAIAGFKEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQYTAFGKEMNKSERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQIEG
SEQ ID NO：73：s127H1-长
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSKQSQGLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQYTAIGKEYNKSERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQIEG
SEQ ID NO：74：s86B4-长
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSNQSQGLFGAIAGYKEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQFTAIGKEMNKIERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQIEG
SEQ ID NO：75：s55G7-长
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSNQSQGLFGAIAGYVEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQYTAIGKEMNKLERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQIEG
SEQ ID NO：144：s6E12-长
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNEPSNQSQGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQLTAFGKEVNKLERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQIEG
SEQ ID NO：79：s115A长
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSKQSQGLFGAIAGYTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQITAVGKEYNKIERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQIEG
SEQ ID NO：80：s71H2长
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSNQSQGLFGAIAGFKEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQLTAIGKEVNKSERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQIEG
SEQ ID NO：81：127H1-t2
MKVKLLVLLCTFTATYADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSKQSQGLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQYTAIGKEYNKSERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI
SEQ ID NO：82：86B4-t2
MKVKLLVLLCTFTATYADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSNQSQGLFGAIAGYKEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQFTAIGKEMNKIERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI
SEQ ID NO：83：74H9-t2
MKVKLLVLLCTFTATYADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSNQSQGLFGAIAGFKEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQYTAFGKEMNKSERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI
SEQ ID NO：84：6E12-t2
MKVKLLVLLCTFTATYADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNEPSNQSQGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQLTAFGKEVNKLERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI
SEQ ID NO：85：55G7-t2
MKVKLLVLLCTFTATYADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSNQSQGLFGAIAGYVEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQYTAIGKEMNKLERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI
SEQ ID NO：86：115A1-t2
MKVKLLVLLCTFTATYADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSKQSQGLFGAIAGYTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQITAVGKEYNKIERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI
SEQ ID NO：87：71H2-t2
MKVKLLVLLCTFTATYADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSNQSQGLFGAIAGFKEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQLTAIGKEVNKSERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI
SEQ ID NO：88：181H9-t2
MKVKLLVLLCTFTATYADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNVPSKQSQGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNKNERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI
SEQ ID NO：89：220C9-t2
MKVKLLVLLCTFTATYADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSTQSQGLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQFTATGKEYNKLERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI
SEQ ID NO：90：113E7-t2
MKVKLLVLLCTFTATYADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSKQSQGLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQYTATGKEINKHERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI
SEQ ID NO：91：s127H1-t2
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSKQSQGLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQYTAIGKEYNKSERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGRSLVPRGSPGHHHHHH
SEQ ID NO：92：s86B4-t2
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSNQSQGLFGAIAGYKEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQFTAIGKEMNKIERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGRSLVPRGSPGHHHHHH
SEQ ID NO：93：s74H9-t2
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSNQSQGLFGAIAGFKEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQYTAFGKEMNKSERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGRSLVPRGSPGHHHHHH
SEQ ID NO：94：s6E12-t2
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNEPSNQSQGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQLTAFGKEVNKLERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGRSLVPRGSPGHHHHHH
SEQ ID NO：95：s55G7-t2
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSNQSQGLFGAIAGYVEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQYTAIGKEMNKLERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGRSLVPRGSPGHHHHHH
SEQ ID NO：96：s115A1-t2
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSKQSQGLFGAIAGYTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQITAVGKEYNKIERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGRSLVPRGSPGHHHHHH
SEQ ID NO：97：s71H2-t2
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSNQSQGLFGAIAGFKEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQLTAIGKEVNKSERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGRSLVPRGSPGHHHHHH
SEQ ID NO：98：s181H9-t2
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNVPSKQSQGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNKNERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGRSLVPRGSPGHHHHHH
SEQ ID NO：99：s220C9-t2
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SEQ ID NO：100：s113E7-t2
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SEQ ID NO：101：s127H1-t2长
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SEQ ID NO：102：s86B4-t2长
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SEQ ID NO：103：s74H9-t2长
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SEQ ID NO：104：s6E12-t2长
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SEQ ID NO：105：s55G7-t2长
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SEQ ID NO：106：s115A1-t2长
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SEQ ID NO：107：s71H2-t2长
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SEQ ID NO：108：s181H9-t2长
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SEQ ID NO：109：s220C9-t2长
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SEQ ID NO：110：s113E7-t2长
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SEQ ID NO：111：127H1-t3
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SEQ ID NO：112：86B4-t3
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SEQ ID NO：113：74H9-t3
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SEQ ID NO：114：6E12-t3
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SEQ ID NO：115：55G7-t3
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SEQ ID NO：116：115A1-t3
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SEQ ID NO：117：71H2-t3
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SEQ ID NO：118：181H9-t3
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SEQ ID NO：119：220C9-t3
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SEQ ID NO：120：113E7-t3
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SEQ ID NO：121：s127H1-t3
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SEQ ID NO：122：s86B4-t3
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SEQ ID NO：123：s74H9-t3
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SEQ ID NO：124：s6E12-t3
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SEQ ID NO：125：s55G7-t3
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SEQ ID NO：126：s115A1-t3
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SEQ ID NO：127：s71H2-t3
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SEQ ID NO：128：s181H9-t3
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SEQ ID NO：129：s220C9-t3
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SEQ ID NO：130：s113E7-t3
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SEQ ID NO：131：s127H1-t3长
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SEQ ID NO：132：s86B4-t3长
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SEQ ID NO：133：s74H9-t3长
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SEQ ID NO：134：s6E12-t3长
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SEQ ID NO：135：s55G7-t3长
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SEQ ID NO：136：s115A1-t3长
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SEQ ID NO：137：s71H2-t3长
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SEQ ID NO：139：s220C9-t3长
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SEQ ID NO：140：s113E7-t3长
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SEQ ID NO：141：s181H9长
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SEQ ID NO：142：s220C9长
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SEQ ID NO：143：s113E7长
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SEQ ID NO：149：55G7-t2-c114
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SEQ ID NO：150：55G7-t2-cl15
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SEQ ID NO：151：55G7-t2-cl16
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SEQ ID NO：152：55G7-t2-cl17
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SEQ ID NO：153：55G7-t2-c118
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SEQ ID NO：154：55G7-t2-c119
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SEQ ID NO：155：55G7-t2-cl21
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SEQ ID NO：156：55G7-t2-cl22
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SEQ ID NO：157：55G7-t2-cl23
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SEQ ID NO：158：55G7-t2-cl24
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SEQ ID NO：159：55G7-t2-cl25
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SEQ ID NO：160：127H1-t2-c114
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SEQ ID NO：161：127H1-t2-c115
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SEQ ID NO：162：127H1-t2-cl16
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SEQ ID NO：163：127H1-t2-cl17
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SEQ ID NO：164：127H1-t2-cl18
MKVKLLVLLCTFTATYADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSKQSQGLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQYTAIGCEYNKSERCMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI
SEQ ID NO：165：127H1-t2-cl19
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SEQ ID NO：166：127H1-t2-cl21
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SEQ ID NO：167：127H1-t2-cl22
MKVKLLVLLCTFTATYADTICIGYHANNSTDTVDTCLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSKQSQGLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNCVNSVIEKMNTQYTAIGKEYNKSERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI
SEQ ID NO：168：127H1-t2-cl23
MKVKLLVLLCTFTATYADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSKQCQGLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQYTAIGKEYNKSERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKCLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI
SEQ ID NO：169：127H1-t2-cl24
MKVKLLVLLCTFTATYADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSKQSQCLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQYTAIGKEYNKSERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKCQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI
SEQ ID NO：170：127H1-t2-cl25
MKVKLLVLLCTFTATYADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSKQSQCLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQYTAIGKEYNKSERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYECVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI
SEQ ID NO：171：s55G7-t2-cl14长
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVC
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SEQ ID NO：172：s55G7-t2-cl15长
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVC
SAKLRMVTGLRNKPSNQSQGLFGAIAGYVEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQYTAIGKEMNKLERRMKQIEDKIEECCSKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQIEG
SEQ ID NO：173：s55G7-t2-cl16长
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVC
SAKLRMVTGLRNKPSNQSQGLFGAIAGYVEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNCQYTAIGKEMNKLERRMKQIEDKIEEIESCIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQIEG
SEQ ID NO：174：s55G7-t2-cl17长
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVC
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SEQ ID NO：175：s55G7-t2-cl18长
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVC
SAKLRMVTGLRNKPSNQSQGLFGAIAGYVEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQYTAIGCEMNKLERCMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQIEG
SEQ ID NO：176：s55G7-t2-cl19长
DTICIGYHANNSTDTVDTVLCKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVC
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SEQ ID NO：177：s55G7-t2-cl21长
DTICIGYHANNSTDTVDTVLECNVTVTHSVNLLENGGGGKYVC
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SEQ ID NO：178：s55G7-t2-cl22长
DTICIGYHANNSTDTVDTCLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVC
SAKLRMVTGLRNKPSNQSQGLFGAIAGYVEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNCVNSVIEKMNTQYTAIGKEMNKLERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQIEG
SEQ ID NO：179：s55G7-t2-cl23长
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVC
SAKLRMVTGLRNKPSNQCQGLFGAIAGYVEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQYTAIGKEMNKLERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKCLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQIEG
SEQ ID NO：180：s55G7-t2-cl24长
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVC
SAKLRMVTGLRNKPSNQSQCLFGAIAGYVEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQYTAIGKEMNKLERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKCQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQIEG
SEQ ID NO：181：s55G7-t2-cl25长
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVC
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SEQ ID NO：182：s127H1-t2-cl14长
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVC
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SEQ ID NO：183：s127H1-t2-c115长
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVC
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SEQ ID NO：184：s127H1-t2-cl16长
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVC
SAKLRMVTGLRNKPSKQSQGLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNCQYTAIGKEYNKSERRMKQIEDKIEEIESCIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQIEG
SEQ ID NO：185：s127H1-t2-cl17长
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVC
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SEQ ID NO：186：s127H1-t2-cl18长
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVC
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SEQ ID NO：187：s127H1-t2-cl19长
DTICIGYHANNSTDTVDTVLCKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVC
SAKLRMVTGLRNKPSKQSQGLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINCITNKVNSVIEKMNTQYTAIGKEYNKSERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQIEG
SEQ ID NO：188：s127H1-t2-cl21长
DTICIGYHANNSTDTVDTVLECNVTVTHSVNLLENGGGGKYVC
SAKLRMVTGLRNKPSKQSQGLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITCKVNSVIEKMNTQYTAIGKEYNKSERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQIEG
SEQ ID NO：189：s127H1-t2-cl22长
DTICIGYHANNSTDTVDTCLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVC
SAKLRMVTGLRNKPSKQSQGLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNCVNSVIEKMNTQYTAIGKEYNKSERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQIEG
SEQ ID NO：190：s127H1-t2-cl23长
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVC
SAKLRMVTGLRNKPSKQCQGLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQYTAIGKEYNKSERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKCLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQIEG
SEQ ID NO：191：s127H1-t2-cl24长
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVC
SAKLRMVTGLRNKPSKQSQCLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQYTAIGKEYNKSERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKCQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQIEG
SEQ ID NO：192：s127H1-t2-cl24长
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVC
SAKLRMVTGLRNKPSKQSQCLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQYTAIGKEYNKSERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYECVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQIEG
SEQ ID NO：193：CMKQIEDKIEEIESK
SEQ ID NO：194：RMCQIEDKIEEIESKQK
SEQ ID NO：195：smH1 Cali3964-55G7
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SEQ ID NO：196：smH1 Cali3964-86B4
MKAILVVLLYTFATANADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDGGGGKYVCSTKLRLATGLRNKPSNQSQGLFGAIAGYKEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDEITNKVNSVIEKMNTQFTAIGKEMNHIERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDYHDSNVKNLYEKVRSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREEIDGRSLVPRGSPGHHHHHH
SEQ ID NO：197：smH1 Cali3964-127H1
MKAILVVLLYTFATANADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDGGGGKYVCSTKLRLATGLRNKPSKQSQGLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDEITNKVNSVIEKMNTQYTAIGKEYNHSERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDYHDSNVKNLYEKVRSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREEIDGRSLVPRGSPGHHHHHH
SEQ ID NO：198：_smH1 Cali3964-55G7-t2
MKAILVVLLYTFATANADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDGGGGKYVCSTKLRLATGLRNKPSNQSQGLFGAIAGYVEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDEITNKVNSVIEKMNTQYTAIGKEMNHLERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDYHDSNVKNLYEKVRSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREEIDGRSLVPRGSPGHHHHHH
SEQ ID NO：199：_smH1 Cali3964-86B4-t2
MKAILVVLLYTFATANADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDGGGGKYVCSTKLRLATGLRNKPSNQSQGLFGAIAGYKEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDEITNKVNSVIEKMNTQFTAIGKEMNHIERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDYHDSNVKNLYEKVRSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREEIDGRSLVPRGSPGHHHHHH
SEQ ID NO：200：smH1 Cali3964-127H1-t2
MKAILVVLLYTFATANADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDGGGGKYVCSTKLRLATGLRNKPSKQSQGLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDEITNKVNSVIEKMNTQYTAIGKEYNHSERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDYHDSNVKNLYEKVRSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREEIDGRSLVPRGSPGHHHHHH
SEQ ID NO：201：mH1 Cali3964-127H1-t2
MKAILVVLLYTFATANADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDGGGGKYVCSTKLRLATGLRNKPSKQSQGLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDEITNKVNSVIEKMNTQYTAIGKEYNHSERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDYHDSNVKNLYEKVRSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREEIDGVKLESTRIYQILAIYSTVASSLVLVVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI
SEQ ID NO：202：mH1 Cali3964-127H1-t2-cl18
MKAILVVLLYTFATANADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDGGGGKYVCSTKLRLATGLRNKPSKQSQGLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDEITNKVNSVIEKMNTQYTAIGCEYNKSERCMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDYHDSNVKNLYEKVRSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREEIDGVKLESTRIYQILAIYSTVASSLVLVVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI
SEQ ID NO：203：smH1 Cali3964-127H1-t2-cl18长
DTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTMSVNLLEDGGGGKYVCSTKLRLATGLRNKPSKQSQGLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDEITNKVNSVIEKMNTQYTAIGCEYNKSERCMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDYHDSNVKNLYEKVRSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREEIDGVKLESTRIYQIEG
SEQ ID NO：204：FL HA H1N1 A/AA_马顿/43
Figure BDA0001205305560001041
SEQ ID NO：205：FL HA H1N1 A/德克萨斯/URO6-0526/07
Figure BDA0001205305560001042
SEQ ID NO：206：H1N1 A/纽约/629/95
Figure BDA0001205305560001043
SEQ ID NO：207：H1 mini德克萨斯127H1_t2+cl18
MKVKLLVLLCTFTATYADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSKQSQGLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQYTAIGCEYNKSERCMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKNQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLISLGAISFWMCSNGSLQCRICI
SEQ ID NO：208：#5123_sH1 mini德克萨斯127H1_t2+cl18
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSKQSQGLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQYTAIGCEYNKSERCMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKNQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQI
SEQ ID NO：209：H1 mini NY 127H1_t2+cl18
MKAKLLVLLCAFTATYADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDGGGGKYVCSTKLRMVTGLRNKPSKQSQGLFGAIAGFTEGGWTGMIDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAIDGITNKVNSVIEKMNTQYTAIGCEYNKSERCMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKTQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNNECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQI LAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI
SEQ ID NO：210：#5124_sH1 mini NY 127H1_t2+cl18
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDGGGGKYVCSTKLRMVTGLRNKPSKQSQGLFGAIAGFTEGGWTGMIDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAIDGITNKVNSVIEKMNTQYTAIGCEYNKSERCMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKTQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNNECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQI
SEQ ID NO：211：H1 mini Cal 127H1_t2+cl18
MKAILVVLLYTFATANADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDGGGGKYVCSTKLRLATGLRNKPSKQSQGLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDEITNKVNSVIEKMNTQYTAIGCEYNHSERCMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDYHDSNVKNLYEKVRSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREEIDGVKLESTRIYQILAIYSTVASSLVLVVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI
SEQ ID NO：212：sH1 mini Cal 127H1_t2+cl18
DTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDGGGGKYVCSTKLRLATGLRNKPSKQSQGLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDEITNKVNSVIEKMNTQYTAIGCEYNHSERCMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDYHDSNVKNLYEKVRSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREEIDGVKLESTRIYQI
SEQ ID NO：213：H1 mini Mart 127H1_t2+cl18+环
MKARLLVLLCALAATDADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDGGGGKYVCSTKLRMVTGLRNKPSKQSQGLFGAIAGFTEGGWTGMIDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQYTAIGCEYNKSERCMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKNQLRNNAKEIGNGCFEFYHKCNNECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI
SEQ ID NO：214：#5126 sH1 mini Mart 127H1_t2+cl18+环
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDGGGGKYVCSTKLRMVTGLRNKPSKQSQGLFGAIAGFTEGGWTGMIDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQYTAIGCEYNKSERCMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKNQLRNNAKEIGNGCFEFYHKCNNECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQI
SEQ ID NO：215：H1 mini Mart 127H1_t2+cl18
MKARLLVLLCALAATDADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDGGGGKYVCSTKLRMVTGLRNKPSKQSQGLFGAIAGFTEGGWTGMIDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQYTAIGCEYNNSERCMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKNQLRNNAKEIGNGCFEFYHKCNNECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI
SEQ ID NO：216：sH1 mini Mart 127H1_t2+cl18
MKARLLVLLCALAATDADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDGGGGKYVCSTKLRMVTGLRNKPSKQSQGLFGAIAGFTEGGWTGMIDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQYTAIGCEYNNSERCMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKNQLRNNAKEIGNGCFEFYHKCNNECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQ
SEQ ID NO：217：FL HA H2N2 A/安达(Adachi)/2/57
Figure BDA0001205305560001061
SEQ ID NO：218：H2 mini安达(Adachi)127H1_t2+cl18
MAIIYLILLFTAVRGDQICIGYHANNSTEKVDTILERNVTVTHAKDILENGGGGKYVCSEKLVLATGLRNKPQKESQGLFGAIAGFTEGGWQGMVDGWYGYHHSNDQGSGYAADKESTQKAFDGITNKVNSVIEKMNTQYEATGCEYGNLERCMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRMQLRDNVKELGNGCFEFYHKCDDECMNSVKNGTYDYPKYEEESKLNRNEIKGVKLSSMGVYQI LAIYATVAGSLSLAIMMAGISFWMCSNGSLQCRICI
SEQ ID NO：219：H2 mini安达(Adachi)127H1_t2+cl18+环
MAIIYLILLFTAVRGDQICIGYHANNSTEKVDTILERNVTVTHAKDILENGGGGKYVCSEKLVLATGLRNKPQKESQGLFGAIAGFTEGGWQGMVDGWYGYHHSNDQGSGYAADKESTQKAFDGITNKVNSVIEKMNTQYTAYGCEYNKSERCMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRMQLRDNVKELGNGCFEFYHKCDDECMNSVKNGTYDYPKYEEESKLNRNEIKGVKLSSMGVYQILAIYATVAGSLSLAIMMAGISFWMCSNGSLQCRICI
SEQ ID NO：220：#5119 sH2 mini安达(Adachi)127H1_t2+cl18
DQICIGYHANNSTEKVDTILERNVTVTHAKDILENGGGGKYVCSEKLVLATGLRNKPQKESQGLFGAIAGFTEGGWQGMVDGWYGYHHSNDQGSGYAADKESTQKAFDGITNKVNSVIEKMNTQYEATGCEYGNLERCMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRMQLRDNVKELGNGCFEFYHKCDDECMNSVKNGTYDYPKYEEESKLNRNEIKGVKLSSMGVYQI
SEQ ID NO：221：#5120 sH2 mini安达(Adachi)127H1_t2+cl18+环
DQICIGYHANNSTEKVDTILERNVTVTHAKDILENGGGGKYVCSEKLVLATGLRNKPQKESQGLFGAIAGFTEGGWQGMVDGWYGYHHSNDQGSGYAADKESTQKAFDGITNKVNSVIEKMNTQYTAYGCEYNKSERCMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRMQLRDNVKELGNGCFEFYHKCDDECMNSVKNGTYDYPKYEEESKLNRNEIKGVKLSSMGVYQI
SEQ ID NO：222：FL HA H2N2 A/新加坡/1/1957
Figure BDA0001205305560001071
SEQ ID NO：223：H2 mini Sing 127H1_t2+cl18
MAIIYLILLFTAVRGDQICIGYHANNSTEKVDTILERNVTVTHAKDILENGGGGKYVCSEKLVLATGLRNKPQKESQGLFGAIAGFTEGGWQGMVDGWYGYHHSNDQGSGYAADKESTQKAFDGITNKVNSVIEKMNTQYEAIGCEYSNLERCMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRMQLRDNVKELGNGCFEFYHKCDDECMNSVKNGTYDYPKYEEESKLNRNEIKGVKLSSMGVYQI LAIYATVAGSLSLAIMMAGISFWMCSNGSLQCRICI
SEQ ID NO：224：H2 mini Sing 127H1_t2+cl18+环
MAIIYLILLFTAVRGDQICIGYHANNSTEKVDTILERNVTVTHAKDILENGGGGKYVCSEKLVLATGLRNKPQKESQGLFGAIAGFTEGGWQGMVDGWYGYHHSNDQGSGYAADKESTQKAFDGITNKVNSVIEKMNTQYTAIGCEYNKSERCMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRMQLRDNVKELGNGCFEFYHKCDDECMNSVKNGTYDYPKYEEESKLNRNEIKGVKLSSMGVYQILAIYATVAGSLSLAIMMAGISFWMCSNGSLQCRICI
SEQ ID NO：225：#5121 sH2 mini Sing 127H1_t2+cl18
DQICIGYHANNSTEKVDTILERNVTVTHAKDILENGGGGKYVCSEKLVLATGLRNKPQKESQGLFGAIAGFTEGGWQGMVDGWYGYHHSNDQGSGYAADKESTQKAFDGITNKVNSVIEKMNTQYEAIGCEYSNLERCMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRMQLRDNVKELGNGCFEFYHKCDDECMNSVKNGTYDYPKYEEESKLNRNEIKGVKLSSMGVYQI
SEQ ID NO：226：#5122 sH2 mini Sing 127H1_t2+cl18+环
DQICIGYHANNSTEKVDTILERNVTVTHAKDILENGGGGKYVCSEKLVLATGLRNKPQKESQGLFGAIAGFTEGGWQGMVDGWYGYHHSNDQGSGYAADKESTQKAFDGITNKVNSVIEKMNTQYTAIGCEYNKSERCMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRMQLRDNVKELGNGCFEFYHKCDDECMNSVKNGTYDYPKYEEESKLNRNEIKGVKLSSMGVYQI
SEQ ID NO：227：FL HA H5N1 A/越南/1203/2004
MEKIVLLFAIVSLVKSDQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKKHNGKLCDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKANPVNDLCYPGDFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSSHEASLGVSSACPYQGKSSFFRNVVWLIKKNSTYPTIKRSYNNTNQEDLLVLWGIHHPNDAAEQTKLYQNPTTYISVGTSTLNQRLVPRIATRSKVNGQSGRMEFFWTILKPNDAINFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSTIMKSELEYGNCNTKCQTPMGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLATGLRNSPQRERRRKTRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKCDNECMESVRNGTYDYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGIYQILSIYSTVASSLALAIMVAGLSLWMCSNGSLQCRICI
SEQ ID NO：228：H5 mini VN/1203/2004
MEKIVLLFAIVSLVKSDQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKGGGGKYVCSNRLVLATGLRNKPQKESQGLFGAIAGFTEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNSIIDKMNTQYEAIGCEYNNSERCMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKCDNECMESVRNGTYDYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGIYQILSIYSTVASSLALAIMVAGLSLWMCSNGSLQCRICI
SEQ ID NO：229：sH5 mini VN/1203/2004
DQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKGGGGKYVCSNRLVLATGLRNKPQKESQGLFGAIAGFTEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNSIIDKMNTQYEAIGCEYNNSERCMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKCDNECMESVRNGTYDYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGIYQI
SEQ ID NO：230：H5 mini VN/1203/2004+环
MEKIVLLFAIVSLVKSDQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKGGGGKYVCSNRLVLATGLRNKPQKESQGLFGAIAGFTEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNSIIDKMNTQYTAIGCEYNKSERCMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKCDNECMESVRNGTYDYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGIYQILSIYSTVASSLALAIMVAGLSLWMCSNGSLQCRICI
SEQ ID NO：231：sH5 mini VN/1203/2004+环
DQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKGGGGKYVCSNRLVLATGLRNKPQKESQGLFGAIAGFTEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNSIIDKMNTQYTAIGCEYNKSERCMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKCDNECMESVRNGTYDYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGIYQI
SEQ ID NO：232：FL HA H9N2 A/香港/69955/2008
METVSLITMLLVATVINADKICIGYQSTNSTETVDTLTENNVPVTHAKELLHTEHNGMLCATNLGYPLILDTCTIEGLIYGNPSCDLLLGGREWSYIVERPSAVNGLCYPGNVENLEELRSLFSSASSYQRIQIFPDTIWNVSYSGTSKACSDSFYRSMRWLTQKNNAYPIQDAQYTNNREKNILFMWGINHPPTDTAQTNLYTRTDTTTSVATEEINRTFKPLIGPRPLVNGLQGRIDYYWSVLKPGQTLRIRSNGNLIAPWYGHILSGESHGRILKTDLKRGSCTVQCQTEKGGLNTTLPFQNVSKYAFGNCSKYVGVKSLKLAVGLRNVPSRSSRGLFGAIAGFIEGGWSGLVAGWYGFQHSNDQGVGMAADRDSTQKAIDKITSKVNNIVDKMNKQYEIIDHEFSEVETRLNMINNKIDDQIQDIWAYNAELLVLLENQKTLDEHDANVNNLYNKVKRALGSNAVEDGKGCFELYHKCDDQCMETIRNGTYNRRRYQEESKLERQKIEGVKLESEGTYKILTIYSTVASSLVIAMGFAAFLFWAMSNGSCRCNICI
SEQ ID NO：233：H9 mini HK/69955/2009
METVSLITMLLVATVINADKICIGYQSTNSTETVDTLTENNVPVTHAKELLHGGGGKYVCVKSLKLAVGLRNKPSKSSQGLFGAIAGFTEGGWSGLVAGWYGFQHSNDQGVGMAADRDSTQKAIDKITSKVNNIVDKMNKQYEIIDCEYSESERCMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENQKTLDEHDANVNNLYNKVKRALGSNAVEDGKGCFELYHKCDDQCMETIRNGTYNRRRYQEESKLERQKIEGVKLESEGTYKILTIYSTVASSLVIAMGFAAFLFWAMSNGSCRCNICI
SEQ ID NO：234：sH9 mini HK/69955/2009
DKICIGYQSTNSTETVDTLTENNVPVTHAKELLHGGGGKYVCVKSLKLAVGLRNKPSKSSQGLFGAIAGFTEGGWSGLVAGWYGFQHSNDQGVGMAADRDSTQKAIDKITSKVNNIVDKMNKQYEIIDCEYSESERCMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENQKTLDEHDANVNNLYNKVKRALGSNAVEDGKGCFELYHKCDDQCMETIRNGTYNRRRYQEESKLERQKIEGVKLESEGTYKI
SEQ ID NO：235：H9 mini HK/69955/2009+环
METVSLITMLLVATVINADKICIGYQSTNSTETVDTLTENNVPVTHAKELLHGGGGKYVCVKSLKLAVGLRNKPSKSSQGLFGAIAGFTEGGWSGLVAGWYGFQHSNDQGVGMAADRDSTQKAIDKITSKVNNIVDKMNTQYTAIGCEYNKSERCMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENQKTLDEHDANVNNLYNKVKRALGSNAVEDGKGCFELYHKCDDQCMETIRNGTYNRRRYQEESKLERQKIEGVKLESEGTYKILTIYSTVASSLVIAMGFAAFLFWAMSNGSCRCNICI
SEQ ID NO：236：sH9 mini HK/69955/2009+环
DKICIGYQSTNSTETVDTLTENNVPVTHAKELLHGGGGKYVCVKSLKLAVGLRNKPSKSSQGLFGAIAGFTEGGWSGLVAGWYGFQHSNDQGVGMAADRDSTQKAIDKITSKVNNIVDKMNTQYTAIGCEYNKSERCMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENQKTLDEHDANVNNLYNKVKRALGSNAVEDGKGCFELYHKCDDQCMETIRNGTYNRRRYQEESKLERQKIEGVKLESEGTYKI
SEQ ID NO：237：全长HA H3N2 A/香港/1/1968
MKTIIALSYIFCLALGQDLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTLVKTITDDQIEVTNATELVQSSSTGKICNNPHRILDGIDCTLIDALLGDPHCDVFQNETWDLFVERSKAFSNCYPYDVPDYASLRSLVASSGTLEFITEGFTWTGVTQNGGSNACKRGPGSGFFSRLNWLTKSGSTYPVLNVTMPNNDNFDKLYIWGVHHPSTNQEQTSLYVQASGRVTVSTRRSQQTIIPNIGSRPWVRGLSSRISIYWTIVKPGDVLVINSNGNLIAPRGYFKMRTGKSSIMRSDAPIDTCISECITPNGSIPNDKPFQNVNKITYGACPKYVKQNTLKLATGMRNVPEKQTRGLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYGFRHQNSEGTGQAADLKSTQAAIDQINGKLNRVIEKTNEKFHQIEKEFSEVEGRIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFEKTRRQLRENAEDMGNGCFKIYHKCDNACIESIRNGTYDHDVYRDEALNNRFQIKGVELKSGYKDWILWISFAISCFLLCVVLLGFIMWACQRGNIRCNICI
SEQ ID NO：238：#2999 H3 HK68 mini2-cl9+10+11+12-GCN4t
MKTIIALSYIFCLALGQDLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTLVKTITDDQIEVTNATELVQSGGGGKYVCQNTLKLATGMRNVPEKQTQGLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYGFRHQNSEGTGQAADLKSTQAAIDQINGKLNRVREKTNEKSHQTEKESSEGEGRMKQIEDKIEEIESKLWCYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFEKTRRQLRENAEDMGNGCFKIYHKCDNACIESIRNGTYDHDVYRDEALNNRFQIKGVELKSGYKDWILWISFAISCFLLCVVLLGFIMWACQRGNIRCNICI
SEQ ID NO：239：#3801 H3 HK mini2a-接头+cl9+10+11+12+GCN4T-CG7-1
MKTIIALSYIFCLALGQDLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTLVKTITDDQIEVTNATELVQSGGGGKYVCQNTLKLATGMRNVPEKQTQGLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYGFRHQNSEGTGQAADLKSTQAAIDQINGKLNRVREKTNEKSHQTEKESSNATGRMKQIEDKIEEIESKLWCYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFEKTRRQLRENAEDMGNGCFKIYHKCDNACIESIRNGTYDHDVYRDEALNNRFQIKGVELKSGYKDWILWISFAISCFLLCVVLLGFIMWACQRGNIRCNICI
SEQ ID NO：240：#2999-cl14
MKTIIALSYIFCLALGQDLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTLVKTITDDQIEVTNATELVQSGGGGKYVCQNTLKLATGMRNVPEKQTQGLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYGFRHQNSEGTGQAADLKSTQAAIDQINGKLNRVREKTNEKSHQTEKESSEGEGRMKQCCDKIEEIESKLWCYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFEKTRRQLRENAEDMGNGCFKIYHKCDNACIESIRNGTYDHDVYRDEALNNRFQIKGVELKSGYKDWILWISFAISCFLLCVVLLGFIMWACQRGNIRCNICI
SEQ ID NO：241：#2999 cl15
MKTIIALSYIFCLALGQDLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTLVKTITDDQIEVTNATELVQSGGGGKYVCQNTLKLATGMRNVPEKQTQGLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYGFRHQNSEGTGQAADLKSTQAAIDQINGKLNRVREKTNEKSHQTEKESSEGEGRMKQIEDKIEECCSKLWCYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFEKTRRQLRENAEDMGNGCFKIYHKCDNACIESIRNGTYDHDVYRDEALNNRFQIKGVELKSGYKDWILWISFAISCFLLCVVLLGFIMWACQRGNIRCNICI
SEQID NO：242：#2999 cl17
MKTIIALSYIFCLALGQDLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTLVKTITDDQIEVTNATELVQSGGGGKYVCQNTLKLATGMRNVPEKQTQGLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYGFRHQNSEGTGQAADLKSTQAAIDQINGKLNRVREKTNECSHQTEKESSEGEGRMKQIEDKIECIESKLWCYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFEKTRRQLRENAEDMGNGCFKIYHKCDNACIESIRNGTYDHDVYRDEALNNRFQIKGVELKSGYKDWILWISFAISCFLLCVVLLGFIMWACQRGNIRCNICI
SEQ ID NO：243：#2999 cl18
MKTIIALSYIFCLALGQDLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTLVKTITDDQIEVTNATELVQSGGGGKYVCQNTLKLATGMRNVPEKQTQGLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYGFRHQNSEGTGQAADLKSTQAAIDQINGKLNRVREKTNEKSHQTECESSEGEGCMKQIEDKIEEIESKLWCYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFEKTRRQLRENAEDMGNGCFKIYHKCDNACIESIRNGTYDHDVYRDEALNNRFQIKGVELKSGYKDWILWISFAISCFLLCVVLLGFIMWACQRGNIRCNICI
SEQ ID NO：244：#2999cl30
MKTIIALSYIFCLALGQDLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTLVKTITDDQIEVTNATELVQSGGGGKYVCQNTLKLATGMRNVPEKQTQGLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYGFRHQNSEGTGQAADLKSTQAAIDQINGKLNRVREKTNEKSHCTEKESSEGEGRMKQIEDCIEEIESKLWCYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFEKTRRQLRENAEDMGNGCFKIYHKCDNACIESIRNGTYDHDVYRDEALNNRFQIKGVELKSGYKDWILWISFAISCFLLCVVLLGFIMWACQRGNIRCNICI
SEQ ID NO：245：#2999 cl31
MKTIIALSYIFCLALGQDLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTLVKTITDDQIEVTNATELVQSGGGGKYVCQNTLKLATGMRNVPEKQTQGLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYGFRHQNSEGTGQAADLKSTQAAIDQINGKLNRVREKTNEKSHQCEKESSEGEGRMKQIEDCIEEIESKLWCYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFEKTRRQLRENAEDMGNGCFKIYHKCDNACIESIRNGTYDHDVYRDEALNNRFQIKGVELKSGYKDWILWISFAISCFLLCVVLLGFIMWACQRGNIRCNICI
SEQ ID NO：246：#3801-cl14
MKTIIALSYIFCLALGQDLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTLVKTITDDQIEVTNATELVQSGGGGKYVCQNTLKLATGMRNVPEKQTQGLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYGFRHQNSEGTGQAADLKSTQAAIDQINGKLNRVREKTNEKSHQTEKESSNATGRMKQCCDKIEEIESKLWCYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFEKTRRQLRENAEDMGNGCFKIYHKCDNACIESIRNGTYDHDVYRDEALNNRFQIKGVELKSGYKDWILWISFAISCFLLCVVLLGFIMWACQRGNIRCNICI
SEQID NO：247：#3801 cl15
MKTIIALSYIFCLALGQDLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTLVKTITDDQIEVTNATELVQSGGGGKYVCQNTLKLATGMRNVPEKQTQGLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYGFRHQNSEGTGQAADLKSTQAAIDQINGKLNRVREKTNEKSHQTEKESSNATGRMKQIEDKIEECCSKLWCYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFEKTRRQLRENAEDMGNGCFKIYHKCDNACIESIRNGTYDHDVYRDEALNNRFQIKGVELKSGYKDWILWISFAISCFLLCVVLLGFIMWACQRGNIRCNICI
SEQ ID NO：248：#3801 cl17
MKTIIALSYIFCLALGQDLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTLVKTITDDQIEVTNATELVQSGGGGKYVCQNTLKLATGMRNVPEKQTQGLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYGFRHQNSEGTGQAADLKSTQAAIDQINGKLNRVREKTNECSHQTEKESSNATGRMKQIEDKIECIESKLWCYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFEKTRRQLRENAEDMGNGCFKIYHKCDNACIESIRNGTYDHDVYRDEALNNRFQIKGVELKSGYKDWILWISFAISCFLLCVVLLGFIMWACQRGNIRCNICI
SEQ ID NO：249：#3801 cl18
MKTIIALSYIFCLALGQDLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTLVKTITDDQIEVTNATELVQSGGGGKYVCQNTLKLATGMRNVPEKQTQGLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYGFRHQNSEGTGQAADLKSTQAAIDQINGKLNRVREKTNEKSHQTECESSNATGCMKQIEDKIEEIESKLWCYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFEKTRRQLRENAEDMGNGCFKIYHKCDNACIESIRNGTYDHDVYRDEALNNRFQIKGVELKSGYKDWILWISFAISCFLLCVVLLGFIMWACQRGNIRCNICI
SEQ IDNO：250：#3801 cl30
MKTIIALSYIFCLALGQDLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTLVKTITDDQIEVTNATELVQSGGGGKYVCQNTLKLATGMRNVPEKQTQGLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYGFRHQNSEGTGQAADLKSTQAAIDQINGKLNRVREKTNEKSHCTEKESSNATGRMKQIEDCIEEIESKLWCYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFEKTRRQLRENAEDMGNGCFKIYHKCDNACIESIRNGTYDHDVYRDEALNNRFQIKGVELKSGYKDWILWISFAISCFLLCVVLLGFIMWACQRGNIRCNICI
SEQ ID NO：251：#3801cl31
MKTIIALSYIFCLALGQDLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTLVKTITDDQIEVTNATELVQSGGGGKYVCQNTLKLATGMRNVPEKQTQGLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYGFRHQNSEGTGQAADLKSTQAAIDQINGKLNRVREKTNEKSHQCEKESSNATGRMKQIEDCIEEIESKLWCYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFEKTRRQLRENAEDMGNGCFKIYHKCDNACIESIRNGTYDHDVYRDEALNNRFQIKGVELKSGYKDWILWISFAISCFLLCVVLLGFIMWACQRGNIRCNICI
SEQ ID NO：252：FL HA H1N1 A/加利福尼亚/07/2009
MKAILVVLLYTFATANADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDKHNGKLCKLRGVAPLHLGKCNIAGWILGNPECESLSTASSWSYIVETPSSDNGTCYPGDFIDYEELREQLSSVSSFERFEIFPKTSSWPNHDSNKGVTAACPHAGAKSFYKNLIWLVKKGNSYPKLSKSYINDKGKEVLVLWGIHHPSTSADQQSLYQNADAYVFVGSSRYSKKFKPEIAIRPKVRDQEGRMNYYWTLVEPGDKITFEATGNLVVPRYAFAMERNAGSGIIISDTPVHDCNTTCQTPKGAINTSLPFQNIHPITIGKCPKYVKSTKLRLATGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDEITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNHLEKRIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDYHDSNVKNLYEKVRSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREEIDGVKLESTRIYQILAIYSTVASSLVLVVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI
SEQ ID NO：253 H1 mini-HA 127H1-t2 S73L
MKVKLLVLLCTFTATYADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSKQSQGLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQYTAIGCEYNKLERCMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI
SEQ ID NO：254 sH1 mini-HA 127H1-t2longS73L(#5114)
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSKQSQGLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQYTAIGCEYNKLERCMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQI
SEQ ID NO：255：UFV150124
MKVKLLVLLCTFTATYADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSKQSQGLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQYTAIGCEYNKSERCMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVSGRDYKDDDDKPGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGHHHHHH
SEQ ID NO：256：UFV150125
MKVKLLVLLCTFTATYADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSKQSQGLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQYTAIGCEYNKSERCMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQIEGRAAADYKDDDDKPGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGHHHHHH
SEQ ID NO：257：UFV150134
MKAILVVLLYTFATANADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDGGGGKYVCSTKLRLATGLRNKPSKQSQGLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDEITNKVNSVIEKMNTQYTAIGCEYNKSERCMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDYHDSNVKNLYEKVRSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREEIDGVSGRDYKDDDDKPGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGHHHHHH
SEQ ID NO：258：UFV150135
MKAILVVLLYTFATANADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDGGGGKYVCSTKLRLATGLRNKPSKQSQGLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDEITNKVNSVIEKMNTQYTAIGCEYNKSERCMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDYHDSNVKNLYEKVRSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREEIDGVKLESTRIYQIEGRAAADYKDDDDKPGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGHHHHHH

Claims (5)

1.多聚体流行性感冒血球凝集素主干域多肽，其中所述多肽包括至少一个第一和一个第二流行性感冒血球凝集素主干域单体，所述第一和第二单体各自由以下氨基酸序列组成：
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNX1PSX2QSQGLFGAIAGX3X4EGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKX5NTQX6TAX7GCEX8NKX9ERCMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQIEG，
其中X1为K，X2为K，X3为F，X4为T，X5为M，X6为Y，X7为I，X8为Y以及X9为S，
其中所述第一单体通过所述第一单体的位置411上的氨基酸与所述第二单体的位置419上的氨基酸之间的二硫桥连接到所述第二单体上，且其中氨基酸位置的编号是基于SEQID NO:1，
其中所述多肽是三聚体的。
2.核酸分子，该核酸分子编码如权利要求1所述的多肽。
3.载体，该载体包括如权利要求2所述的核酸分子。
4.组合物，该组合物包括如权利要求1所述的多肽，和/或根据权利要求2所述的核酸分子。
5.根据权利要求1所述的多肽、根据权利要求2所述的核酸分子、和/或根据权利要求3所述的载体在制备用于诱导针对流行性感冒病毒的免疫应答的组合物中的用途。
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