TW202317600A - 預防多種病毒感染的多價疫苗 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種多價疫苗，用於預防各種流感病毒株之至少一者以及各種冠狀病毒株之至少一者，包括但未侷限於嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2（SARS CoV 2）。在一具體實施例中，本發明之多價疫苗包含一治療上有效量之重組嵌合蛋白，其包含衍生自冠狀病毒之任何變體的受體交互作用結構域及衍生自流感病毒之任何變體之血球凝集素（HA）之保守區的主幹區。

Description

預防多種病毒感染的多價疫苗
本發明一般而言係有關預防多種病毒感染（例如，冠狀病毒、流感）之多價疫苗的組成物及其製備方法。
最近由新型冠狀病毒株SARS-CoV-2引起的COVID-19大流行已造成全球數億人感染及數百萬人死亡。病毒的高傳播性與致病性引起了人們對未來大流行的擔憂。此外，流感是由流感病毒引起的傳染病。由於高突變率與頻繁的基因重組，必須每年設計新的流感疫苗，以靶向預期導致下一次流行病的潛在流感病毒株。血球凝集素（HA）為一種流感表面蛋白，主要為疫苗開發的候選抗原。HA蛋白包含兩個HA1區（球狀頭部結構域）與HA2區（主幹結構域），其中HA1區比HA2區更易變異。當前針對流感病毒的疫苗主要基於僅針對數目有限之病毒株提供預防的HA1區設計。HA2的保守結構由一種以上的HA亞型所共有，這表明存在針對多種流感病毒亞型之通用疫苗的潛力，且無需每年更新。
因此，需要開發一種可預防受試者免受彼等病原體（包括其等之各種病毒株與變體）侵害的疫苗。然而，病毒蛋白的適當結構構形為宿主受體結合及隨後宿主細胞感染的關鍵。病毒蛋白的同元三聚體結構為數種病毒類型（包括冠狀病毒、流感病毒、人類免疫不全病毒（HIV）及呼吸道融合病毒（RSV））之有效感染所需。舉例而言，SARS-CoV與SARS-CoV-2之三聚體S蛋白為其與宿主受體ACE2結合所需，而MERS-CoV之三聚體S蛋白為其與宿主受體二肽基肽酶4（DPP4）結合所需。因此，需要具有適當蛋白構形結構的多價疫苗以確保其功效。
本專利申請案係申請補充於2021年6月23日提申之題為「預防流感與冠狀病毒的多價疫苗」之美國臨時專利申請號63/213,778的內容，在此全部併入本案。
一種包含一重組嵌合蛋白之多價疫苗，其中重組嵌合蛋白包含一衍生自冠狀病毒之任何病毒株或變體的受體交互作用結構域及一衍生自流感病毒之血球凝集素（HA）之保守區之任何病毒株或變體的主幹區。在一具體實施例中，主幹區衍生自HA2區。在一具體實施例中，HA包含亞型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7或H8。在一具體實施例中，冠狀病毒之受體交互作用結構域係衍生自冠狀病毒之受體結合結構域（RBD）。
一種製備本發明之多價疫苗的方法，其包含下列步驟：分離一編碼衍生自冠狀病毒之任何病毒株或變體之受體交互作用結構域的基因片段；分離一編碼衍生自流感病毒之任何病毒株或變體之HA之保守區之主幹區的基因片段；製備一包含三聚化結構域之基因片段；融合步驟1、步驟2及步驟3之基因片段；使用步驟4之融合的基因片段表達如請求項1之重組嵌合蛋白；以及純化從步驟5表達之如請求項1之重組嵌合蛋白。
本發明之組成物可包含、組成自或基本上組成自本文所述之本發明基本元件與限制，以及本文所述之任何額外或任意的成分、組分或限制。
如說明書與申請專利範圍中使用的，除非上下文中另有明確規定，否則單數形式「一」、「一個」及「該」包括複數參考體。舉例而言，術語「一個」細胞包括複數個細胞，包括其混合物。
量值之上下文中的「約」意指基於指示值之最大±20%，較佳為±10%的平均差。舉例而言，關於總脂質/兩親體莫耳濃度，約30莫耳%之陰離子脂質的量意指30莫耳%±6莫耳%且較佳為30莫耳%±3莫耳%之陰離子脂質。
「有效量」或「治療上有效量」為一足以產生有益或所需結果的量。有效量可以一或多次投予、施加或劑量之方式給藥。
「受試者」、「個體」或「患者」在本文中可互換使用，其意指脊椎動物，較佳為哺乳類動物，更佳為人類。哺乳類動物包括但未侷限於，鼠科、猿猴、人類、農場動物、運動動物及寵物。
在衍生自天然存在之基因序列的基因片段的上下文中，術語「衍生自」意指基因片段與天然存在之基因序列具有至少50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%或約100%一致性之基因序列。
本發明提供一種多價疫苗，用於預防各種流感病毒株之至少一者以及各種冠狀病毒株之至少一者，其包括但未侷限於嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2（SARS CoV 2）。在一具體實施例中，本發明之多價疫苗包含一治療上有效量之重組嵌合蛋白，其包含衍生自冠狀病毒之任何變體的受體交互作用結構域及衍生自流感病毒之任何變體之血球凝集素（HA）之保守區的主幹區。在一具體實施例中，主幹區包含流感病毒之任何變體之HA2區的至少一部分。在一具體實施例中，主幹區不含HA蛋白之天然存在的受體結合結構域（RBD）。在一具體實施例中，衍生自冠狀病毒之任何變體的受體交互作用結構域包含冠狀病毒之任何變體的RBD。在一具體實施例中，衍生自SARS-CoV-2之任何變體的受體交互作用結構域包含SARS-CoV-2之任何變體之RBD的至少一部分。在一具體實施例中，衍生自冠狀病毒之受體交互作用結構域係融合至衍生自流感病毒之保守HA區之主幹區的C端。圖1B說明本發明之重組嵌合蛋白HA-C-RBD_棘的具體實施例。
在本發明之嵌合蛋白的任何具體實施例中，主幹區可衍生自任何HA亞型，包括H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8以及其他亞型。在一具體實施例中，本發明之嵌合蛋白包含HA蛋白，其中HA之RBD以冠狀病毒之RBD取代。在一具體實施例中，HA係選自於H1亞型，且主幹區係藉由移除HA1區之位置46-306的胺基酸而形成，如圖3A所示。在另一具體實施例中，流感病毒包含流感病毒之任何病毒株，包括A型、B型、C型及D型。
在本發明之重組嵌合蛋白的任何具體實施例中，衍生自冠狀病毒之受體交互作用結構域不含冠狀病毒之全長棘（S）蛋白。在本發明之重組嵌合蛋白的任何具體實施例中，受體交互作用結構域係衍生自冠狀病毒棘蛋白之S1結構域。在本發明之嵌合蛋白的任何具體實施例中，受體交互作用結構域不含冠狀病毒之S蛋白的全長S1次單元。在本發明之嵌合蛋白的任何具體實施例中，受體交互作用結構域係衍生自冠狀病毒棘蛋白之RBD結構域。在本發明之嵌合蛋白的任何具體實施例中，本發明之受體交互作用結構域可衍生自SARS-CoV-2之任何變體，包括α、β、γ、δ及ο。在一具體實施例中，冠狀病毒之受體交互作用結構域包含與下列SEQ NO. 1具有至少85%、90%、95%、98%或99%一致性之胺基酸序列：
Figure 02_image001
本發明之重組嵌合蛋白的任何具體實施例可進一步包含一或多個三聚化結構域。在一具體實施例中，一或多個三聚化結構域包含GCN4白胺酸拉鍊、噬菌體T4彈力素（fibritin）摺疊子、源自肺界面活性蛋白（lung surfactant protein）之三聚化模體、膠原蛋白或其組合。在一具體實施例中，GCN4白胺酸拉鍊包含與下列SEQ NO. 2具有至少85%、90%、95%、98%或99%一致性之胺基酸序列：
Figure 02_image003
在一具體實施例中，摺疊子包含與下列SEQ NO. 3具有至少85%、90%、95%、98%或99%一致性之胺基酸序列：
Figure 02_image005
在本發明之重組嵌合蛋白的任何具體實施例中，主幹區可經突變以促進重組蛋白之三聚化。在一具體實施例中，HA蛋白包含源自A/布利斯班(Brisbane)/59/2007 (H1N1)之H1，且突變包含HA1區中之點突變R310C、I323K、I326K、R329Q、HA2區中之點突變I10T、F63Y、V66I、K68C、F70Y、L73S，並以SEQ NO. 2取代HA2區中之胺基酸殘基75-90。
在本發明之重組嵌合蛋白的任何具體實施例中，主幹區可經突變以與三聚化結構域整合。在本發明之重組嵌合蛋白的任何具體實施例中，主幹區可經突變以與三聚化結構域整合，其中三聚化結構域不影響天然存在於HA保守區上之保守構形表位。在一具體實施例中，經突變以與三聚化結構域整合之主幹區包含與下列SEQ NO. 4具有至少85%、90%、95%、98%或99%一致性之胺基酸序列（整合的三聚化結構域以黑體字表示）：
Figure 02_image007
在本發明之重組嵌合蛋白的任何具體實施例中，三聚化結構域係融合在受體交互作用結構域與主幹區之間。在本發明之重組嵌合蛋白的任何具體實施例中，摺疊子三聚化結構域係融合在受體交互作用結構域與主幹區之間，且圖1B與圖3A說明其具體實施例。
本發明之重組嵌合蛋白的任何具體實施例進一步包含一或多種連接子，其包含與SEQ NO. 5具有至少85%、90%、95%、98%或99%一致性之胺基酸序列：
Figure 02_image009
本發明之嵌合蛋白的任何具體實施例可具有重組蛋白之至少一胺基酸殘基經醣化。在一具體實施例中，醣化包含N-醣化及/或O-醣化。在一具體實施例中，至少一醣化位點係經完全醣化。完全醣化係定義為由以下方法乙節中描述之製備方法所產生的醣化。在另一具體實施例中，至少一醣化位點係經單醣化，其中單醣化為單一GlcNAc。如與圖6-8相關之實施例中所示，本發明之單醣化重組嵌合蛋白顯示比本發明之完全醣化之重組嵌合蛋白引發更高的抗原性。在一具體實施例中，本發明之重組蛋白包含與下列SEQ ID NO. 6具有至少85%、90%、95%、98%或99%一致性之胺基酸序列，且為實施例中之HA-C-RBD_棘（醣化位點以粗體表示）：
Figure 02_image011
在一具體實施例中，本發明之多價疫苗包含重組蛋白之同元三聚體（其包含受體交互作用結構域），其中三聚體形式之重組蛋白促進其與宿主細胞的交互作用。在一具體實施例中，三聚體形式之重組蛋白促進受體交互作用結構域與個別宿主受體蛋白的結合。在一具體實施例中，重組蛋白包含冠狀病毒（如SARS-CoV或SARS-CoV-2）之任何病毒株或變體之RBD的至少一部分，且個別宿主受體蛋白為血管張力素轉換酶2（ACE2）。在另一具體實施例中，重組蛋白包含MERS-CoV之RBD的至少一部分，且個別宿主受體蛋白為二肽基肽酶4（DPP4）。
在本發明之各種揭示的具體實施例中，重組蛋白包含在C端融合一聚組胺酸標籤（His6），以促成蛋白純化流程。
在本發明之各種揭示的具體實施例中，本發明之多價疫苗包含次單元疫苗，其不含任何類病毒顆粒（VLP）。
在本發明之任何具體實施例中，多價疫苗進一步包含佐劑，其中佐劑可包含鯊烯系乳液佐劑或任何鋁系疫苗佐劑。在一具體實施例中，本發明之鯊烯系乳液佐劑包含鯊烯與山梨糖醇酐三油酸酯。在一具體實施例中，本發明之鯊烯系乳液佐劑包含約20至50 mg/mL，例如約20、約25、約30、約35、約40、約45或約50 mg/mL之鯊烯油，其包括落入彼等數值內之所有範圍與數字。在一具體實施例中，本發明之鯊烯系乳液佐劑包含約3至6 mg/mL，例如約3、約3.5、約4、約4.5、約5、約5.5或約6 mg/mL之山梨糖醇酐三油酸酯，其包括落入彼等數值內之所有範圍與數字。在一具體實施例中，鯊烯系乳液佐劑包含MF59 ®。
本發明亦提供一種製備本發明之多價疫苗的方法。圖13說明本發明多價疫苗之製備方法的具體實施例。如圖13所示，本發明之方法始於步驟10之分離編碼本發明之冠狀病毒之受體交互作用結構域之任何具體實施例的基因片段以及步驟20之分離編碼本發明之主幹區之任何具體實施例的基因片段。在一具體實施例中，基因片段包含質體、RNA或mRNA。
接著，在步驟26中，將步驟10與步驟20之兩個基因片段融合在一起以形成融合的基因片段。隨後，在步驟40中使用融合的基因片段表達本發明之嵌合蛋白的具體實施例。在步驟50中，純化所表達之嵌合蛋白。在步驟60中可添加本發明之佐劑的任何具體實施例。
在本發明方法之一具體實施例中，可任意地進一步包含步驟22之將編碼主幹區之基因片段突變，以促進重組蛋白之三聚化。在一具體實施例中，編碼具有整合的三聚化結構域之突變主幹區的基因片段包含與SEQ NO. 4具有至少85%、90%、95%、98%或99%一致性之胺基酸序列。在本發明方法之一具體實施例中，可任意地進一步包含步驟24之將編碼三聚化結構域之基因片段分離，該基因片段能表達包含與SEQ NO. 2具有至少85%、90%、95%、98%或99%一致性之胺基酸序列的蛋白，其可在步驟26中融合在步驟10之編碼受體交互作用結構域的基因片段與步驟20之編碼主幹區的基因片段之間。本發明之方法可任意地進一步包含步驟28之將編碼聚組胺酸標籤之基因片段分離及步驟29之將聚組胺酸標籤融合至編碼主幹區之基因片段的末端。本發明之方法可任意地進一步包含步驟30之使用連接子將各種基因片段融合。在另一具體實施例中，多價疫苗之製備方法可任意地進一步包含進行步驟34之重組嵌合蛋白的醣化。在一具體實施例中，施加完全醣化。在另一具體實施例中，以Endo H處理完全醣化的重組蛋白，以產生單醣化蛋白，其中單醣化為單一GlcNAc。
在一具體實施例中，本發明方法之融合步驟係使用重組DNA技術進行。在一具體實施例中，表達本發明方法之嵌合蛋白的步驟係使用人類胚腎細胞293或昆蟲細胞sf9進行。
本發明亦包含一種治療方法，用於預防至少一選自於由冠狀病毒與流感病毒所組成群組之病毒。投予方法包含非經口以及經由鼻道噴霧。在一具體實施例中，任何具體實施例揭示之嵌合蛋白包含約15-45 µg/0.5 mL或約30 µg/0.5 mL。本發明之治療方法進一步包含投予二或多次本發明之多價疫苗的任何具體實施例，其中每次投予之間隔為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12週。
本領域技術人員可理解的是，可對上述實例進行改變而不背離其廣泛的發明概念。因此，應當理解，本發明未侷限於所揭示之特定實例，而是旨在涵蓋如所附申請專利範圍定義之本發明精神與範疇內的修改。
應當理解，如所主張，前面一般描述與下面詳細描述皆僅為示例性與解釋性，且未侷限本發明。
根據發明詳述，可對技術進行彼等與其他修改。一般而言，在下列揭示中使用之術語不應理解為將技術侷限於本說明書中揭示之特定具體實施例，除非上面發明詳述明確定義此類術語。據此，本技術之實際範疇涵蓋所揭示之具體實施例及實踐或實施本技術之所有等效方式。 實施例 方法 蛋白表達與純化
藉由使用聚乙亞胺，將編碼HA-C-RBD_棘、RBD-FH6、RBD-Fc及棘-dTM之質體各轉染至人類胚腎細胞株HEK293F或GnTI-HEK293S細胞中，並培養在添加0.5%胎牛血清之Freestyle 293表達培養基（Invitrogen）中。編碼HA-C-RBD_棘之質體可表達包含胺基酸SEQ NO 6之蛋白。編碼RBD-FH6之質體可表達包含下列胺基酸SEQ NO 7之蛋白：
Figure 02_image013
編碼RBD-Fc之質體可表達包含下列胺基酸SEQ NO 8之S蛋白：
Figure 02_image015
編碼棘-dTM之質體可表達包含下列胺基酸SEQ NO 9之S蛋白：
Figure 02_image017
在轉染72小時後收集上清液，並藉由離心而澄清。以鎳螯合層析術純化HA-C-RBD_棘蛋白，以獲得完全醣化的HA-C-RBD_spikefg（完全醣化）與高甘露糖型HA-C-RBD_spikemg。純化的HA-C-RBD_spikemg在4℃下以Endo H處理過夜，以產生在醣化位點處具有單一GlcNAc的HA-C-RBD_棘蛋白，亦即單醣化HA-C-RBD_spikemg。藉由粒徑篩析層析術移除Endo H。分別以鎳螯合層析術與蛋白A層析術純化RBD-FH6與RBD-FC蛋白。 體外 HA-C-RBD_ 棘蛋白之抗原性評估
為了檢查HA-C-RBD_棘之抗原性，以一系列2倍稀釋之HA-C-RBD_棘、SARS-CoV2之棘蛋白、RBD-FH6、流感H1之HA-主幹及流感H1之HA塗覆96孔ELISA培養盤，其始於16 μg/ml。將構形抗HA主幹抗體（FI6）或棘蛋白受體（ACE2-Fc）添加至培養盤中，並在37℃下培養1小時。在以PBST洗滌後，添加HRP標記之抗人類IgG，並在37℃下培養1小時。在洗去未結合之抗體後，添加3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺（TMB）受質，並藉由添加1M H 2SO 4以終止反應。利用Microplate Reader讀取各孔之吸光度（OD 450 nm）。 使用競爭 ELISA 評估免疫接種小鼠血清樣品中之流感病毒中和抗體
藉由人類胚腎293F細胞表達HA主幹特異性抗體（FI6），並藉由蛋白A瓊脂糖純化。免疫接種小鼠之血清首先以2倍系列稀釋添加至HA塗覆之96孔培養盤中，並在37℃下培養1小時。將FI6添加至各孔中，並在37℃下培養1小時。在洗去未結合之抗體後，藉由抗人類IgG-HRP檢測FI6。利用Microplate讀取各孔之吸光度（OD 450 nm）。競爭百分比之計算如下：競爭% = (A-C)/(A-B) x 100%，其中A為僅添加FI6的平均OD值，C為添加血清而後FI6的OD值，且B為不含血清與FI6之各孔的OD值。 小鼠之病毒攻擊實驗
雌性BALB/c小鼠（6-8週大）在第0、14、35及56天以棘蛋白及HA-C-RBD棘次單元疫苗（每劑10 µg）進行肌內免疫接種。在第28、49及70天收集免疫接種小鼠的血清樣本。在第77天，以致死劑量（10 LD50）之H1N1流感病毒（A/重配體/NYMC X-181（California/07/2009 x NYMC X-157））攻擊小鼠。每兩天監控一次受攻擊小鼠的存活與體重減輕，共14天，若其等之體重減輕超過30%，則利用二氧化碳窒息進行安樂死。在實驗結束時，利用吸入CO 2之人道方式將動物犧牲。 使用 ELISA 評估免疫接種小鼠血清樣品中之 SARS-CoV-2 中和抗體
96孔ELISA培養盤在室溫下以含有hACE2-Fc之PBS塗覆過夜。培養盤在37℃下以含有1%BSA之PBS阻斷1小時。將2倍系列稀釋之血清樣品與棘蛋白在37℃下預先培養1小時。將血清與棘預混合物添加至ELISA培養盤中，並在37℃下培養1小時。在洗去未結合之抗體後，藉由兔抗His抗體與抗兔IgG-HRP檢測棘。利用Microplate讀取各孔之吸光度（OD 450 nm）。 使用假病毒中和試驗評估免疫接種小鼠血清樣品中之 SARS-CoV-2 中和抗體
針對假病毒中和試驗，將免疫接種小鼠之血清樣品熱滅活、系列稀釋以及在37℃下以含有1,000個轉導單位（TU）之SARS-CoV-2（WT或變體）假型慢病毒的DMEM（補充1% FBS）培養1小時。隨後，在96孔培養盤中以10,000個穩定表達人類ACE2之HEK293T細胞接種混合物。將培養基更換成新鮮完全DMEM（在感染後16小時補充10% FBS，且細胞另外繼續培養24小時，接著使用Bright-Glo螢光素酶試驗系統進行螢光素酶試驗，以測量相對光單位（RLU）。將抑制百分比計算為在各稀釋樣品存在下之RLU減少與無樣品對照組之RLU值的比率。 結果 實施例 1 確認 HA-C-RBD_ 棘蛋白之 ACE2 結合活性
圖4顯示HA-主幹、HA-C-RBD_棘、HA、SARS-CoV-2棘蛋白及RBD-FH6之ACE2結合活性的結果。如圖4所示，在塗覆濃度範圍從0.0625 µg/mL至16 µg/mL時，相較於使用SARS-CoV2棘蛋白之陽性對照組，HA-C-RBD_棘與RBD-FH6皆顯示出與受體ACE2相似或甚至更好的結合活性。僅使用HA或HA-主幹之陰性對照組未顯示出與ACE2的任何結合活性。彼等結果表明，HA-C-RBD_棘與RBD-FH6呈現出與ACE2結合的適當結構，因此呈現出抗原性以引發針對棘RBD的中和抗體。 實施例 2 以廣泛中和抗體 FI6 （構形）測定 HA-C-RBD_ 棘蛋白之 抗原性
圖5顯示HA-主幹、HA-C-RBD_棘、HA、SARS-CoV-2棘蛋白及RBD-FH6之FI6結合活性的結果。如圖5所示，相較於僅使用HA或HA-主幹之陽性對照組，HA-C-RBD_棘在中和FI6上顯示出相似或甚至更好的活性。相較於僅使用棘蛋白之陰性對照組，RBD-FH6未顯示出任何中和活性並顯示出相似的結果。彼等結果表明，HA-C-RBD_棘呈現出HA2結構域的適當構形結構，因此呈現出抗原性以引發針對HA保守區的中和抗體。 實施例 3 確認醣化 HA-C-RBD_ 棘蛋白之 ACE2 結合活性
圖7B顯示HA-主幹、完全醣化SARS-CoV-2棘蛋白、完全醣化HA-C-RBD_spikefg及單醣化HA-C-RBD_spikemg 2之ACE2結合活性的結果。如圖7B所示，HA-C-RBD_spikefg與HA-C-RBD_spikemg各自顯示出超過80%之抑制棘RBD（圖7A中之HRP-RBD）的ACE2結合活性（圖7B）。此類活性明顯高於（＞400%）完全醣化棘蛋白（spikefg）的抑制活性（圖7B）。完全醣化HA-主幹（4900fg）係用作陰性對照組，且對抑制ACE2與棘RBD之結合不具活性。彼等結果表明，HA-C-RBD_棘之醣化可增強其抗原性以引發針對棘RBD的中和抗體，其中單醣化HA-C-RBD_spikemg提供比完全醣化HA-C-RBD_spikefg甚至更多的抗原性。 實施例 4 以廣泛中和抗體 FI6 （構形）測定醣化 HA-C-RBD_ 棘蛋白之抗原性
圖8B顯示完全醣化SARS-CoV-2棘蛋白、完全醣化HA主幹、單醣化HA主幹、完全醣化HA-C-RBD_spikefg及單醣化HA-C-RBD_spikemg之HA結合活性的結果。如圖8B所示，以HA-C-RBD_spikefg或HA-C-RBD_spikemg免疫接種之小鼠的血清在與廣泛中和抗體FI6競爭結合至HA上顯示出60-90%活性，其中HA-C-RBD_spikemg觀察到更好的活性（約90%）。競爭活性以醣化HA-主幹（4900fg或4900mg）免疫接種小鼠之血清作為陽性對照組，且抑制活性為約70-100%（圖8B）。使用醣化HA-C-RBD_棘之本發明在呈現抗原性以引發針對HA保守區之中和抗體上顯示出與醣化HA-主幹有可比擬的活性，其中單醣化HA-C-RBD_棘顯示出比HA-C-RBD_spikefg有實質上更高的抗原性。 實施例 5 以 HA-C-RBD_ 棘免疫接種之小鼠中引發之抗體與亞型 H1N1 HA 蛋白的結合活性測定
圖9顯示使用HA-C-RBD_spikemg疫苗接種所產生之針對H1N1 HA蛋白之Cal/09、Bri/07、Bri/18、Bri/18FL變體以及H3與H7流感病毒的保護作用。將HA-C-RBD_棘免疫接種小鼠之血清與H1N1 HA蛋白之亞型（亞型Cal/09、Bri/07、Bri/18及Bri/18FL）一起培養。FI6在本研究中用作陽性對照組。HA-C-RBD_棘免疫接種小鼠之血清對個別H1亞型所顯示之抗體結合活性為陽性對照組FI6之抗體結合活性的30-100%。
HA蛋白根據系統發生相似性分成2組，其中第1組包括H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13、H16、H17及H18，其餘的則在第2組中。相較於源自同一組之HA蛋白，第1組與第2組HA蛋白之間的保守區具有較少的相似性。為了研究不同組之HA蛋白結合活性，發明人分析了來自HA-C-RBD_棘免疫接種小鼠之血清與選自於第2組之HA蛋白（例如，H3與H7）的抗體結合活性。如圖9所示，來自HA-C-RBD_棘免疫接種小鼠之血清與H3的結合活性為其與H1之結合活性的30-90%，且相較於FI6與H3之結合活性，此活性高出400%以上。此數據表明，本發明可提供預防廣譜的流感病毒。 實施例 6 以棘蛋白或 HA-C-RBD_ 棘免疫接種之 H1N1- 攻擊小鼠的體重變化與存活分析
圖10A與10B說明以SARS-CoV-2棘蛋白或HA-C-RBD_棘免疫接種之小鼠的體重變化與存活率。如圖10A與10B所示，以棘蛋白或HA-C-RBD_棘免疫接種之小鼠在感染後7天內體重減輕。在感染後8天內，所有以棘蛋白免疫接種之小鼠由於體重減輕超過30%而進行安樂死（圖10A）。以HA-C-RBD_棘免疫接種之小鼠的體重減輕在第7天後恢復，並在感染後14天恢復到初始體重的約95%（感染後1天）（圖10A）。所有以HA-C-RBD_棘免疫接種的小鼠在實驗中皆存活（圖10B）。 實施例 7 以假型病毒評估 SARS-C-V-2 中和抗體效價
圖11A與11B顯示棘蛋白（spikefg）或HA-C-RBD_棘（HFRfg）疫苗接種小鼠之血清樣品針對兩種不同SARS-CoV-2變體的中和活性。如圖11A與11B所示，棘蛋白（spikefg）或HA-C-RBD_棘（HFRfg）疫苗接種小鼠之血清係用於測定假型病毒的中和抗體效價。HFRfg組之血清活性在中和原始SARS-CoV-2武漢D614G病毒株上優於spikefg組，其中PRNT50值降低約8倍。在中和較新之SARS-CoV-2病毒株ο(Omicron)上，兩組的活性皆降低（PRNT50值增加約2至16倍），其中spikefg與HFRfg數據之間的PRNT50無顯著差異。 實施例 8 四價 HA-C-RBD_ 棘疫苗在小鼠中之相容免疫原性
包含從四種不同病毒株（武漢、B.1.1.7（英國）、B.1.617.2（印度）及B.1.617.1（印度））分離之RBD的包含HA-C-RBD_棘的四價疫苗可同時提供預防四種SARS-CoV-2病毒株（武漢、B.1.1.7（英國）、B.1.617.2（印度）及B.1.617.1（印度）），其活性與個別單價疫苗相當。
無
圖1A說明急性呼吸道症候群冠狀病毒2（SARS CoV 2）棘蛋白之蛋白結構，且圖1B說明本發明之重組嵌合蛋白HA-C-RBD_棘的具體實施例。 圖2A說明SDS-PAGE，且圖2B說明棘-dTM、HA-C-RBD-棘、RBD-FH6及RBD-Fc之粒徑篩析層析術。 圖3A說明能表達本發明之重組嵌合蛋白HA-C-RBD_棘的基因片段，且圖3B說明本發明之多價HA-C-RBD_棘嵌合蛋白之各種具體實施例的純化結果，每一者對應於RBD區，其衍生自SARS-CoV-2之武漢、B.1.1.7、B.1.617.2及B.1.617.1變體的RBD區。 圖4說明藉由ACE2受體結合ELISA之棘蛋白、HA、HA主幹、RBD-FH6及HA-C-RBD_棘的受體結合活性。 圖5說明藉由FI6構形mAb之棘蛋白、HA、HA主幹、RBD-FH6及HA-C-RBD_棘的抗原性測定。 圖6說明完全醣化（fg）與單醣化（mg）HA-C-RBD_棘嵌合蛋白之表達與純化結果。 圖7A描繪ACE2受體結合試驗，且圖7B說明本發明之醣化HA-C-RBD_棘嵌合蛋白的受體結合活性。 圖8A描繪FI6結合至HA-主幹，且圖8B說明醣化 HA-C-RBD_棘嵌合蛋白誘發HA主幹結構域-中和抗體的活性。 圖9說明在以HA-C-RBD_棘嵌合蛋白免疫接種之小鼠中針對H1N1亞型HA蛋白、H3及H7的抗體結合活性。 圖10A說明體重變化，且圖10B說明藉由棘蛋白或HA-C-RBD_棘疫苗接種之X-181（H1N1）-攻擊小鼠的存活分析。 圖11A說明藉由假型病毒株武漢D614G疫苗接種之小鼠的SARS-CoV-2中和抗體效價評估，且圖11B說明藉由假型病毒株Omicron疫苗接種之小鼠的SARS-CoV-2中和抗體效價評估。 圖12說明單價與四價HA-C-RBD_棘疫苗在小鼠中的免疫原性。 圖13說明包含本發明重組嵌合蛋白之多價疫苗之製備方法的具體實施例。
無
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Claims (45)

  1. 一種多價疫苗，其包含一治療上有效量之重組嵌合蛋白，其中該重組嵌合蛋白包含一受體交互作用結構域，其包含冠狀病毒之任何病毒株或變體之受體交互作用結構域的至少一部分，以及一主幹區，其包含流感病毒之任何病毒株或變體之血球凝集素（HA）之保守區的至少一部分。
  2. 如請求項1之多價疫苗，其中該多價疫苗不含任何治療上有效之類病毒顆粒（VLP）。
  3. 如請求項1之多價疫苗，其中該主幹區包含流感病毒之血球凝集素（HA）之保守區之HA2區的至少一部分。
  4. 如請求項1之多價疫苗，其中該主幹區不含該HA之天然存在的RBD。
  5. 如請求項1之多價疫苗，其中該HA包含亞型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7或H8。
  6. 如請求項1之多價疫苗，其中該主幹區包含與SEQ NO. 4具有至少85%、90%、95%、98%或99%一致性之胺基酸序列。
  7. 如請求項1之多價疫苗，其中該冠狀病毒之受體交互作用結構域包含該冠狀病毒之受體結合結構域（RBD）的至少一部分。
  8. 如請求項1之多價疫苗，其中該冠狀病毒之受體交互作用結構域包含SARS-CoV-2之任何病毒株或變體之RBD的至少一部分。
  9. 如請求項1之多價疫苗，其中該受體交互作用結構域包含與SEQ NO. 1具有至少85%、90%、95%、98%或99%一致性之胺基酸序列。
  10. 如請求項1之多價疫苗，其中該受體交互作用結構域不含該冠狀病毒之全長棘（S）蛋白。
  11. 如請求項1之多價疫苗，其中該受體交互作用結構域不含該冠狀病毒之S蛋白的全長S1次單元。
  12. 如請求項1之多價疫苗，其中該受體交互作用結構域係經醣化。
  13. 如請求項1之多價疫苗，其中該重組嵌合蛋白包含一或多個三聚化結構域。
  14. 如請求項1之多價疫苗，其中該主幹區係經突變以促進三聚化，其中該突變包含整合的三聚化結構域。
  15. 如請求項14之多價疫苗，其中該突變更包含R310C、I323K、I326K或R329Q或其組合之點突變，其對應於衍生自該主幹區之該HA之HA1區，以及I10T、F63Y、V66I、K68C、F70Y或L73S或其組合之至少一者，其對應於衍生自該主幹區之該HA之HA2區。
  16. 如請求項15之多價疫苗，其中該突變不影響該主幹區之保守構形表位。
  17. 如請求項14之多價疫苗，其中該整合的三聚化結構域包含GCN4三聚化結構域，其包含與SEQ NO. 2具有至少85%、90%、95%、98%或99%一致性之胺基酸序列。
  18. 如請求項15之多價疫苗，其中該突變之主幹區包含與SEQ NO. 4具有至少85%、90%、95%、98%或99%一致性之胺基酸序列。
  19. 如請求項1之多價疫苗，其中該重組嵌合蛋白係經醣化。
  20. 如請求項1之多價疫苗，其中該重組嵌合蛋白係經單醣化。
  21. 如請求項1之多價疫苗，其中該重組嵌合蛋白更包含摺疊子三聚化結構域，其中該摺疊子三聚化結構域係融合至該主幹區之C端且該受體交互作用結構域係融合至該摺疊子三聚化結構域之C端。
  22. 如請求項17之多價疫苗，其中該重組嵌合蛋白包含與SEQ NO. 6具有至少85%、90%、95%、98%或99%一致性之胺基酸序列。
  23. 如請求項1之多價疫苗，其更包含一治療上有效量之鯊烯系乳液佐劑，其包含約20至50 mg/mL之鯊烯油與約3至6 mg/mL之山梨糖醇酐三油酸酯。
  24. 如請求項1之多價疫苗，其提供預防至少二種、至少三種、至少四種、至少五種或至少六種A型流感病毒亞型。
  25. 一種製備如請求項1之多價疫苗的方法，其包含下列步驟： 分離一編碼受體交互作用結構域之基因片段，其包含冠狀病毒之任何病毒株或變體之受體交互作用結構域的至少一部分； 分離一編碼流感病毒之任何病毒株或變體之HA之保守區之至少一部分之主幹區的基因片段； 製備一包含三聚化結構域之基因片段； 融合步驟1、步驟2及步驟3之基因片段； 使用步驟4之融合的基因片段表達如請求項1之重組嵌合蛋白； 純化從步驟5表達之如請求項1之重組嵌合蛋白。
  26. 如請求項25之製備方法，其中該三聚化結構域包含摺疊子三聚化結構域。
  27. 如請求項25之多價疫苗，其中該主幹區包含該流感病毒之HA2區的至少一部分。
  28. 如請求項25之多價疫苗，其中該HA包含亞型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7或H8。
  29. 如請求項25之製備方法，其中該編碼主幹區之基因片段不含該HA之天然存在的RBD。
  30. 如請求項25之製備方法，其更包含在編碼該主幹區之基因片段上進行突變的步驟，其促進該重組嵌合蛋白之三聚化。
  31. 如請求項30之方法，其中該進行突變之步驟包含將GCN4三聚化結構域整合至該編碼主幹區之基因片段中。
  32. 如請求項31之方法，其中該突變更包含R310C、I323K、I326K或R329Q或其組合之點突變，其對應於衍生自該主幹區之HA的HA1區，以及I10T、F63Y、V66I、K68C、F70Y或L73S或其組合之至少一者，其對應於衍生自該主幹區之HA的HA2區。
  33. 如請求項32之方法，其中該主幹區包含與SEQ NO. 4具有至少85%、90%、95%、98%或99%一致性之胺基酸序列。
  34. 如請求項25之製備方法，其更包含進行該重組嵌合蛋白之醣化的步驟。
  35. 如請求項34之製備方法，其中該重組嵌合蛋白係經完全醣化。
  36. 如請求項34之製備方法，其中該重組嵌合蛋白係經單醣化。
  37. 如請求項25之製備方法，其中該編碼受體交互作用結構域之基因片段包含該冠狀病毒之RBD的至少一部分。
  38. 如請求項25之製備方法，其中該編碼受體交互作用結構域之基因片段包含SARS-CoV-2之任何病毒株或變體之RBD的至少一部分。
  39. 如請求項25之製備方法，其中該編碼受體交互作用結構域之基因片段包含與SEQ NO. 1具有至少85%、90%、95%、98%或99%一致性之胺基酸序列。
  40. 如請求項25之製備方法，其中該編碼受體交互作用結構域之基因片段不含該冠狀病毒之全長棘（S）蛋白。
  41. 如請求項25之製備方法，其中該編碼受體交互作用結構域之基因片段不含S蛋白之全長S1次單元。
  42. 如請求項25之製備方法，其中該表達的重組嵌合蛋白包含該摺疊子三聚化結構域融合至該主幹區之C端及該冠狀病毒之受體交互作用結構域融合至該摺疊子三聚化結構域之C端。
  43. 如請求項25之製備方法，其中該重組嵌合蛋白包含與SEQ NO. 6具有至少85%、90%、95%、98%或99%一致性之胺基酸序列。
  44. 一種治療方法，其包含以非經口方式或藉由鼻道噴霧投予患者如請求項1之多價疫苗的步驟，以預防受試者免受流感病毒與冠狀病毒感染。
  45. 如請求項44之治療方法，其更包含在第一次投予後約3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、11週或12週，第二次投予相同受試者如請求項1之多價疫苗。
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