TW202207979A

TW202207979A - 組合疫苗

Info

Publication number: TW202207979A
Application number: TW110125037A
Authority: TW
Inventors: 萊茵哈德格魯克; 卡斯帕班齊格; 伊曼紐爾蒙托莫利; 阿加塔法奇歐; 卡洛斯昆圖
Original assignee: 美商斯派克納有限公司
Priority date: 2020-07-07
Filing date: 2021-07-07
Publication date: 2022-03-01
Also published as: US20230256085A1; IL299735A; MX2023000411A; AR122899A1; GB2596820A; JP2023533772A; BR112023000323A2; WO2022009121A1; CN117957016A; KR20230049084A; CA3184878A1; CO2023001072A2; AU2021303789A1; GB202010425D0; EP4178612A1

Abstract

本發明係關於對抗流感及COVID-19兩者之組合疫苗。特別地，本發明係關於包含一或多種流感病毒抗原及一或多種SARS-CoV-2 (冠狀病毒SARS-CoV-2)抗原，特別是一或多種SARS-CoV-2棘蛋白抗原之組合疫苗，及包含編碼該等抗原之多核苷酸之疫苗，且此等疫苗用於治療或預防COVID-19 (SARS-CoV-2感染)及流感感染。

Description

組合疫苗

本發明係關於對抗流感及COVID-19兩者之組合疫苗。特定言之，本發明係關於包含一或多種流感病毒抗原及一或多種SARS-CoV-2抗原，較佳至少一種SARS-CoV-2 (冠狀病毒2019-nCoV)棘蛋白抗原之組合疫苗，及包含編碼該等抗原之多核苷酸之疫苗，及此等疫苗用於治療或預防COVID-19 (SARS-CoV-2感染)及流感感染。

截至2020年6月29日，全球超過10,000,000人確診為COVID-19陽性(由嚴重急性呼吸系統症候群冠狀病毒2 (SARS-CoV-2或冠狀病毒2019-nCoV)引起之疾病)。截至同一天，全球已記錄超過500,000例由於COVID-19引起之死亡。

大多數感染SARS-CoV-2之病患經歷輕度至中度症狀，包括高溫或發燒、咳嗽、呼吸急促、疲勞及個體之嗅覺或味覺喪失或改變。一些病患進展為嚴重疾病，該疾病可涉及急性呼吸窘迫症候群(ARDS)、細胞激素風暴、多器官衰竭、感染性休克及血栓。另外，針對SARS-CoV-2感染測試呈陽性之一些病患無症狀，或經歷輕微症狀，使得除非進行測試，否則難以診斷。迄今為止的證據指示此等無症狀病患排出SARS-CoV-2病毒顆粒(通常比有症狀感染之病患更久)，且因此仍可有效傳播該SARS-CoV-2病毒。

與SARS-CoV-2感染相關聯之廣泛症狀，及無症狀病患之存在使得確定COVID-19之流行病學特性變得更困難。另外，至少一項研究指示，大多數無症狀及有症狀病患在恢復期僅八週內，對抗SARS-CoV-2之IgG及中和抗體之含量即均降低。一些臨床資料證實，相當大比例之無症狀病患(40%)，及少數有症狀感染之病患(~13%)在早期恢復期對IgG呈血清陰性(Long等人，Nat. Med. 2020 https://doi.org/10.1038/s41591-020-0965-6)。因此，儘管開發SARS-CoV-2之疫苗係全球範圍內廣泛研究之標的，但現有證據表明，由此產生之對SARS-CoV-2感染之任何免疫力均可能係短期的。因此，持續需要開發COVID-19之疫苗，該等COVID-19可用於疫苗中以產生並維持對抗SARS-CoV-2感染及COVID-19疾病之保護性免疫力。此外，需要提供可容易整合至現有公共衛生疫苗接種計劃及時間表內之疫苗(考慮與疫苗組分抑制相關之問題)，及需大規模且廉價地生產此等疫苗。

本發明藉由提供流感-COVID-19組合疫苗解決上文需求中之一或多者。此等組合疫苗包含一或多種流感病毒抗原及一或多種SARS-CoV-2抗原，較佳至少一種SARS-CoV-2 (冠狀病毒2019-nCoV)棘蛋白抗原，一或多種或編碼該等抗原之多核苷酸，容許使用現有針對流感病毒之公共衛生計劃，每年提高對抗SARS-CoV-2之免疫力。

迄今為止，儘管許多SARS-CoV-2之疫苗處於開發及/或臨床試驗中，但尚無經批准之疫苗可用於一般用途。此外，現有證據表明，對抗SARS-CoV-2之免疫力可相對較短暫。

發明人先前已開發編碼SARS-CoV-2棘蛋白之多核苷酸，該等多核苷酸提供該SARS-CoV-2棘蛋白之表現經增加之含量及持續時間，同時保留該天然棘蛋白之構象。

發明人現已證實，包含其SARS-CoV-2棘蛋白之疫苗組合物可與流感病毒疫苗成功組合，而無生產組合疫苗產品中常見之疫苗組分抑制之預期問題。另外，儘管標準流感疫苗不含有佐劑，但可將佐劑Addavax®成功併入根據本發明之SARS-CoV-2/流感疫苗內。在現有針對流感之公共衛生疫苗計劃中，每年對抗SARS-CoV-2感染之疫苗接種具有提高對抗SARS-CoV-2之免疫力且同時達成良好病患依從性之潛勢。

因此，本發明提供一種流感-COVID-19組合疫苗，其包含：(a)流感血球凝集素(HA)或其免疫原性片段；及(b)一或多種來源於SARS-CoV-2之抗原或其免疫原性片段；其中該等抗原能夠激發對抗流感及COVID-19之免疫反應及保護。

該流感-COVID-19組合疫苗可進一步包含流感神經胺糖酸酶(NA)或其免疫原性片段。該流感HA或其免疫原性片段可為：(i)包含於不活化流感病毒體中；(ii)重組HA或其免疫原性片段；(iii)包含HA或其免疫原性片段之融合蛋白；或(iv)由RNA或DNA疫苗編碼。該流感NA或其免疫原性片段可為：(i)包含於不活化流感病毒體中；(ii)重組NA或其免疫原性片段；(iii)包含NA或其免疫原性片段之融合蛋白；或(iv)由RNA或DNA疫苗編碼。一或多種來源於SARS-CoV-2之抗原或其免疫原性片段可為：(i)至少一種重組SARS-CoV-2棘蛋白或其免疫原性片段；(ii)至少一種包含SARS-CoV-2棘蛋白或其免疫原性片段之融合蛋白；(iii)至少一種包含SARS-CoV-2棘蛋白或其免疫原性片段之病毒樣顆粒(VLP)；(iv)至少一種編碼重組SARS-CoV-2棘蛋白或其免疫原性片段之多核苷酸；或(v)由至少一種RNA或DNA疫苗編碼。

在本發明之流感-COVID-19組合疫苗中，(i)流感HA或其免疫原性片段及流感NA或其免疫原性片段可包含於不活化流感病毒體中；及(ii)一或多種來源於SARS-CoV-2之抗原或其免疫原性片段可為：(i)至少一種包含SARS-CoV-2棘蛋白或其免疫原性片段之融合蛋白，或(ii)至少一種包含SARS-CoV-2棘蛋白或其免疫原性片段之病毒樣顆粒(VLP)。

在本發明之流感-COVID-19組合疫苗中：(a)流感HA或其免疫原性片段可包含於減毒活流感病毒體中；(b)流感NA或其免疫原性片段可包含於減毒活流感病毒體中；及/或(c)一或多種來源於SARS-CoV-2之抗原或其免疫原性片段可包含於活病毒載體中。包含該一或多種來源於SARS-CoV-2之抗原或其免疫原性片段之該活病毒載體可為：腺病毒載體；麻疹病毒載體；腮腺炎病毒載體；風疹病毒載體；水痘病毒載體；小兒麻痺病毒載體；或黃熱病病毒載體。

本發明之流感-COVID-19組合疫苗可進一步包含佐劑。該佐劑通常係細胞(Th1)及/或體液(Th2)免疫反應(較佳兩者)之刺激物。該佐劑可包含鯊烯水包油乳液、鋁鹽或單磷醯脂質A (MPL)。

一或多種來源於SARS-CoV-2之抗原可選自：(a)與SEQ ID NO: 1具有至少90%一致性之來自SARS-CoV-2之棘蛋白，或其與該棘蛋白具有共同抗原交叉反應性之片段；(b)包含與SEQ ID NO: 1具有至少90%一致性之來自SARS-CoV-2之棘蛋白，或其與該棘蛋白具有共同抗原交叉反應性之片段之融合蛋白；(c)包含與SEQ ID NO: 1具有至少90%一致性之來自SARS-CoV-2之棘蛋白，或其與該棘蛋白具有共同抗原交叉反應性之片段之VLP；(d)編碼與SEQ ID NO: 1具有至少90%一致性之來自SARS-CoV-2之棘蛋白，或其與該棘蛋白具有共同抗原交叉反應性之片段之多核苷酸；或(e)表現與SEQ ID NO: 1具有至少90%一致性之來自SARS-CoV-2之棘蛋白，或其與該棘蛋白具有共同抗原交叉反應性之片段之病毒載體、RNA疫苗或DNA質體；其中視需要該SARS-CoV-2棘蛋白之片段包含該SARS-CoV-2棘蛋白之受體結合域(RBD)或由其構成，該RBD較佳與SEQ ID NO: 15具有至少90%一致性。

一或多種來源於SARS-CoV-2之抗原可為包含SARS-CoV-2棘蛋白或其免疫原性片段之融合蛋白，且進一步包含：(a) B型肝炎表面抗原，或其與該B型肝炎表面抗原具有共同抗原交叉反應性之片段；(b) HPV 18 L1蛋白，或其與該HPV 18 L1蛋白具有共同抗原交叉反應性之片段；(c) E型肝炎P239蛋白，或其與該E型肝炎P239蛋白具有共同抗原交叉反應性之片段；及/或(e) HPV 16 L1蛋白，或其與該HPV 16 L1蛋白具有共同抗原交叉反應性之片段。該融合蛋白可：(a)由多核苷酸編碼，該多核苷酸包含與SEQ ID NO: 3、5、6或8、26、27、29、30或32中之任一者具有至少90%一致性之核酸序列或由其構成；及/或(b)包含與SEQ ID NO: 9、10、11、12、28、31或33中之任一者具有至少90%一致性之胺基酸序列或由其構成。

一或多種來源於SARS-CoV-2之抗原可為包含SARS-CoV-2棘蛋白或其免疫原性片段之VLP，其中該VLP包含本發明之融合蛋白或由其構成。

流感HA或其免疫原性片段及流感NA或其免疫原性片段可包含於以下中：(a)季節性流感疫苗，特定言之季節性3價流感疫苗或季節性4價流感疫苗；(b)單價大流行流感疫苗；或(c)通用流感疫苗。

本發明亦提供如本文描述之流感-COVID-19組合疫苗，其用於治療及/或預防COVID-19及流感之方法中。

本發明進一步提供流感HA或其免疫原性片段；及來源於SARS-CoV-2之抗原或其免疫原性片段，及視需要流感NA或其免疫原性片段於製造用於治療及/或預防COVID-19及流感之藥劑中之用途，其中該藥劑係如本文定義之流感-COVID-19組合疫苗。

本發明進一步提供一種使個體針對流感及COVID-19兩者免疫之方法，其包括對該個體投與治療有效量之如本文定義之流感-COVID-19組合疫苗。

該流感-COVID-19組合疫苗可以10至14個月之間隔投與，視需要其中該流感-COVID-19組合疫苗係以約12個月之間隔投與。

定義除非另有定義，否則本文所使用之所有技術及科學術語具有與本發明所屬領域之一般技術者通常瞭解之含義相同之含義。Singleton等人，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY，第20版，John Wiley and Sons, New York (1994)，及Hale及Marham，THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY，Harper Perennial, NY (1991)為熟練技術人員提供本發明中所使用之許多術語之通用詞典。術語之含義及範圍應明確；然而，在任何潛在歧義之情況下，本文所提供之定義優先於任何詞典或外部定義。應瞭解，本發明不限於本文描述之特定方法學、方案及試劑等，且因此可變化。

本發明不限於本文揭示之例示性方法及材料，及與彼等本文描述者相似或相等之任何方法及材料可用於本發明之實施例之實務或測試中。本文使用之術語僅用於描述特定實施例之目的，且無意限制僅由隨附申請專利範圍定義之本發明之範圍。

本發明實施例之描述無意為詳盡的或將本發明限制於本文揭示之精確形式。如彼等熟習相關領域者將認知，儘管本文僅出於闡述之目的描述本發明之特定實施例及實例，但各種等效修飾可在本發明之範圍內。例如，儘管以給定順序呈現方法步驟或功能，但替代實施例可以不同順序執行功能，或可大體上同時執行功能。本文所提供之本發明之教示可視需要應用至其他程序或方法。本文描述之各種實施例可組合以提供其他實施例。本發明之態樣可視需要經修飾以採用上文之參考文獻及申請案之組合物、功能及概念，以提供本發明之又其他實施例。此外，由於生物功能等效性考量，可對蛋白質結構作出一些改變而不影響生物或化學作用之種類或量。鑒於詳細描述，可對本發明作出此等及其他改變。所有此等修飾意欲包括在隨附申請專利範圍之範圍內。

數值範圍包括定義該範圍之數字。除非另有指示，否則任何核酸序列均以5'至3'方向從左至右書寫；胺基酸序列分別以胺基至羧基方向從左至右書寫。

本文所提供之標題不限制本發明之各種態樣或實施例。

如本文使用，術語「能夠」當與動詞一起使用時包含或意謂相應動詞之動作。例如，「能夠相互作用」亦意謂相互作用，「能夠裂解」亦意謂裂解，「能夠結合」亦意謂結合及「能夠特異性靶向」亦意謂特異性靶向。

術語之其他定義可出現在整個說明書中。在更詳細描述例示性實施例之前，應瞭解本發明不限於本文描述之特定實施例，且因此可變化。亦應瞭解，本文所使用之術語僅出於描述特定實施例之目的，且無意限制，因為本發明之範圍將僅由隨附申請專利範圍定義。

在提供值範圍之情況下，應瞭解亦明確揭示介於該範圍之上限與下限之間之各中介值(除非內文另有明確規定，否則精確至該下限單位之十分之一)。介於規定範圍中之任何規定值或中介值與該規定範圍中之任何其他規定值或中介值之間的各更小範圍包含於本發明內。此等更小範圍之上限及下限可獨立地包括在該範圍內或排除在該範圍外，且其中一個、零個或兩個限值包括在更小範圍內之各範圍亦包含於本發明內，受限於規定範圍中任何明確排除之限值。在規定範圍包括限值中之一或兩者之情況下，排除彼等包括之限值中之一或兩者之範圍亦包括在本發明中。

如本文使用，冠詞「一」及「一個」可為指該冠詞之語法對象中之一者或多於一者(例如至少一者)。此外，除非內文另有要求，否則單數術語應包括複數及複數術語應包括單數。在本申請案中，除非另有說明，否則使用「或」意謂「及/或」。此外，使用術語「包括(including)」及其他術語(諸如「包括(includes)」及「包括(included)」係非限制性的。

「約」一般可意謂考慮到量測之性質或精度，所量測的量之可接受誤差度。例示性誤差度係於給定值或值範圍之20百分比(%)內，通常，於10%內，且更通常，於5%內。較佳地，術語「約」在本文中應瞭解為正使用數之數值之加或減(±) 5%，較佳± 4%、± 3%、± 2%、± 1%、± 0.5%、± 0.1%。

如本文使用，提及組合物、方法及該方法或組合物必不可少之其各別組分所使用之術語「包含(comprising)」或「包含(comprises)」仍對包括未指定元素(無論是否必需)開放。

術語「由……構成」係指如本文描述之組合物、方法及其各別組分，其等排除本發明之說明書中未列舉之任何元素。

如本文使用，術語「基本上由……構成」係指彼等給定發明所需之元素。該術語允許不實質上影響本發明之基本及新穎或功能特性之元素之存在。

本文描述為「包含」一或多種特徵之實施例亦可視為「由此等特徵構成」及/或「基本上由此等特徵構成」之相應實施例之揭示內容。

如本文使用之術語「醫藥上可接受」意謂經聯邦或州政府之監管機構批准，或列入美國藥典、歐洲藥典或其他公認用於動物，且更特定言之用於人類之藥典中。

濃度、量、體積、百分比及其他數值可以範圍形式呈現於本文中。亦應瞭解，此範圍形式僅出於便利及簡潔使用，且應靈活解釋為不僅包括明確列舉為範圍之限值之數值，但亦包括該範圍內所包含之所有個別數值或子範圍，就如同明確列舉各數值及子範圍一樣。

當結合蛋白質使用時，術語「變體」意謂該蛋白質之肽或肽片段，其含有胺基酸(例如非天然胺基酸)之一或多種類似物，或經取代之鍵聯。

當結合蛋白質使用時，術語「衍生物」意謂包含所述蛋白質及另一肽序列之蛋白質。該另一肽序列應較佳不干擾原始蛋白質之基本折疊及因此構象結構。兩種或更多種肽(或片段，或變體)可連接在一起以形成衍生物。或者，肽(或片段，或變體)可連接至無關分子(例如第二無關肽)。衍生物可化學合成，但通常將藉由重組核酸方法製備。可包括另外組分，諸如脂質，及/或多醣，及/或多肽組分。

如本文使用，術語「蛋白質」及「多肽」在本文中可互換使用以指定一系列由相鄰殘基之α-胺基與羧基基團之間的肽鍵彼此連接之胺基酸殘基。術語「蛋白質」及「多肽」係指胺基酸(包括經修飾之胺基酸(例如，磷酸化、糖化、糖基化等)及胺基酸類似物)之聚合物，與其尺寸或功能無關。「蛋白質」及「多肽」通常提及相對較大之多肽使用，而術語「肽」通常提及小多肽使用，但此等術語在此項技術中之用法重疊。當提及基因產物及其片段時，術語「蛋白質」及「多肽」在本文中可互換使用。因此，例示性多肽或蛋白質包括基因產物、天然生成之蛋白質、同源物、異種同源物、同種同源物、片段及前述之其他等效物、變體、片段及類似物。

本發明之蛋白質可包括其中來自一種物種之胺基酸殘基於保守或非保守位置取代另一物種中之相應殘基之變體。本發明中可產生並使用本文揭示之蛋白質分子之變體。遵循計算化學在將多元資料分析技術應用於結構/性質-活性關係中之引導[參見例如Wold等人，Multivariate data analysis in chemistry. Chemometrics-Mathematics and Statistics in Chemistry (B. Kowalski編)；D. Reidel出版公司，Dordrecht, Holland, 1984 (ISBN 90-277-1846-6]，可使用眾所周知的數學技術(諸如統計回歸、模式識別及分類)推導蛋白質之定量活性-性質關係[參見例如Norman等人，Applied Regression Analysis. Wiley-lnterscience；第3版(April 1998) ISBN: 0471170828；Kandel、Abraham等人，Computer-Assisted Reasoning in Cluster Analysis. Prentice Hall PTR, (May 11, 1995), ISBN: 0133418847；Krzanowski、Wojtek，Principles of Multivariate Analysis: A User's Perspective (Oxford Statistical Science Series, No 22 (Paper)). Oxford University Press；(2000年12月), ISBN: 0198507089；Witten、Ian H.等人，Data Mining: Practical Machine Learning Tools and Techniques with Java Implementations. Morgan Kaufmann；(October 11, 1999), ISBN:1558605525；Denison David G. T. (編)等人，Bayesian Methods for Nonlinear Classification and Regression (Wiley Series in Probability and Statistics). John Wiley & Sons; (July 2002), ISBN: 0471490369；Ghose、Arup K.等人，Combinatorial Library Design and Evaluation Principles, Software, Tools, and Applications in Drug Discovery. ISBN: 0-8247-0487-8]]。蛋白質之性質可自蛋白質序列、功能及三維結構之經驗及理論模型(例如，分析可能接觸殘基或計算之理化性質)推導，且可個別及組合考慮此等性質。

本文使用胺基酸名稱、三字母縮寫或單字母縮寫提及胺基酸。如本文使用，術語「蛋白質」包括蛋白質、多肽及肽。如本文使用，術語「胺基酸序列」係與術語「多肽」及/或術語「蛋白質」同義。在一些情況下，術語「胺基酸序列」係與術語「肽」同義。術語「蛋白質」及「多肽」在本文中可互換使用。在本發明及隨附申請專利範圍中，可使用胺基酸殘基之習知單字母及三字母密碼。遵從IUPACIUB生化命名聯合委員會(JCBN)定義胺基酸之3字母密碼。亦應瞭解，由於遺傳密碼之簡併性，因此多肽可由多於一種核苷酸序列編碼。

非保守位置之胺基酸殘基可經保守或非保守殘基取代。特定言之，審慎考慮保守胺基酸置換。

「保守胺基酸取代」係其中胺基酸殘基經具有相似側鏈之胺基酸殘基置換者。此項技術中已定義具有相似側鏈之胺基酸殘基家族，包括鹼性側鏈(例如，離胺酸、精胺酸或組胺酸)、酸性側鏈(例如，天冬胺酸或麩胺酸)、不帶電之極性側鏈(例如，甘胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸或半胱胺酸)、非極性側鏈(例如，丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸或色胺酸)、β-分支鏈側鏈(例如，蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及芳族側鏈(例如，酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸或組胺酸)。因此，若多肽中之胺基酸經來自相同側鏈家族之另一胺基酸置換，則認為胺基酸取代係保守的。本發明之抗體中包括經保守修飾之變體不排除變體之其他形式，例如多型性變體、種間同源物及對偶基因。

「非保守胺基酸取代」包括彼等其中以下者：(i)由具有正電性側鏈之殘基(例如，Arg、His或Lys)取代負電性殘基(例如，Glu或Asp)，或由負電性殘基取代具有正電性側鏈之殘基，(ii)由親水性殘基(例如，Ser或Thr)取代疏水性殘基(例如，Ala、Leu、Ile、Phe或Val)，或由疏水性殘基取代親水性殘基，(iii)由半胱胺酸或脯胺酸取代任何其他殘基，或由任何其他殘基取代半胱胺酸或脯胺酸，或(iv)由具有巨大疏水性或芳族側鏈之殘基(例如，Val、His、Ile或Trp)取代具有較小側鏈(例如，Ala或Ser)或無側鏈(例如，Gly)之殘基，或由具有較小側鏈或無側鏈之殘基取代具有巨大疏水性或芳族側鏈之殘基。

本說明書中對SARS-CoV-2多核苷酸及/或蛋白質之提及包括其片段及變體。

如本文使用，術語「片段」在SARS-CoV-2棘蛋白之內文中係指蛋白質之一部分，其可包含全長SARS-CoV-2棘蛋白之一或多個域或部分域。根據本發明之SARS-CoV-2棘蛋白片段通常可為如本文描述之免疫原性片段。SARS-CoV-2棘蛋白之片段通常長度大於200個胺基酸。本發明之SARS-CoV-2棘蛋白片段可包含長度為至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、至少1000、至少1100個或更多個胺基酸殘基或由其構成。本發明之片段通常與SARS-CoV-2棘蛋白具有共同抗原交叉反應性(且因此稱為免疫原性片段)。SARS-CoV-2棘蛋白片段可包含以下或由以下構成：(i) SARS-CoV-2棘蛋白之受體結合域(RBD)；(ii) SARS-CoV-2棘蛋白之N末端域(NTD)；(iii) SARS-CoV-2棘蛋白之C末端域(CTD) (諸如CTD1及/或CTD2)，此等CTD亦稱為子域(SD)，其中CTD1亦稱為SD1且CTD2亦稱為SD2；及/或(iv)融合肽(FP)；及/或(v) FPPR域；或其任何組合。特定言之，根據本發明之SARS-CoV-2棘蛋白之片段可包含RBD域或由其構成。以非限制性實例說明之，根據本發明之SARS-CoV-2棘蛋白之片段可由RBD域構成，或可包含RBD域與NTD域之組合。

變體SARS-CoV-2棘蛋白保留天然棘蛋白之一或多個構象抗原決定基及激發中和抗體及/或免疫保護反應之產生之能力。本發明之變體SARS-CoV-2棘蛋白多核苷酸編碼此等棘蛋白。以實例說明之，變體與參考序列(例如本發明之SARS-CoV-2多核苷酸及/或蛋白質，特別定義SARS-CoV-2多核苷酸及/或蛋白質之本說明書中呈現之任何SEQ ID NO)可具有至少80%，較佳至少90%，更佳至少95%，且最佳至少97%或至少99%胺基酸序列同源性。因此，變體可包括多核苷酸之一或多種類似物(例如非天然核酸)，或經取代之鍵聯。同樣，以實例說明之，術語片段在關於SARS-CoV-2多核苷酸及/或蛋白質使用時意謂具有參考SARS-CoV-2多核苷酸及/或蛋白質之至少十個，較佳至少十五個，更佳至少二十個核酸殘基之多核苷酸。術語片段亦係關於上文提及之變體。因此，以實例說明之，本發明之SARS-CoV-2多核苷酸及/或蛋白質之片段可包含具有至少10、20或30個核酸之核酸序列，其中該多核苷酸序列與參考SARS-CoV-2多核苷酸及/或蛋白質序列之相應核酸序列(連續)核酸具有至少80%序列同源性。片段及變體之此等定義亦適用於本發明之其他多核苷酸。在肽序列之內文中，術語片段意謂具有參考蛋白之至少十個，較佳至少十五個，更佳至少二十個胺基酸殘基之肽。術語片段亦係關於上文提及之變體。因此，以實例說明之，片段可包含具有至少10、20或30個胺基酸之胺基酸序列，其中該胺基酸序列與參考序列之相應胺基酸序列(連續)胺基酸具有至少80%序列同源性。

較佳地，變體係保守取代變體。如本文提及之「變體」係與天然或參考多肽大體上同源，但具有因為一或複數個缺失、插入或取代而不同於天然或參考多肽之胺基酸序列之多肽。編碼多肽之DNA序列包括當相較於天然或參考DNA序列時，包含核苷酸之一或多個添加、缺失或取代之序列，但該等序列編碼相對於參考蛋白保留相關生物活性(例如，野生型參考蛋白之至少50%)之變體蛋白或其片段。如對於胺基酸序列，熟練技術人員將認知，改變編碼序列中單一胺基酸或小百分比(即5%或更少，例如4%或更少、或3%或更少、或1%或更少)胺基酸之對核酸、肽、多肽或蛋白質序列之個別取代、缺失或添加係「經保守修飾之變體」，其中該改變導致以化學相似之胺基酸取代胺基酸。經審慎考慮，一些變化可潛在改善相關活性，使得變體(保守或不保守)具有超過100%之野生型活性，例如110%、125%、150%、175%、200%、500%、1000%或更大。

如本文描述之多肽可包含至少一個肽鍵置換。單個肽鍵或多個肽鍵，例如2個鍵、3個鍵、4個鍵、5個鍵或6個或更多個鍵，或所有肽鍵均可經置換。如本文描述之經分離之肽可包含一種類型之肽鍵置換或多種類型之肽鍵置換，例如2種類型、3種類型、4種類型、5種類型或更多種類型之肽鍵置換。肽鍵置換之非限制性實例包括脲、硫脲、胺甲酸酯、磺醯脲、三氟乙胺或鄰-(胺基烷基)-苯乙酸、對-(胺基烷基)-苯乙酸、間-(胺基烷基)-苯乙酸、硫醯胺、四唑、硼酸酯、烯烴基，及其衍生物。

如本文描述之多肽可包含由活生物體產生之多肽及/或蛋白質中通常發現之天然生成之胺基酸，例如Ala (A)、Val (V)、Leu (L)、Ile (I)、Pro (P)、Phe (F)、Trp (W)、Met (M)、Gly (G)、Ser (S)、Thr (T)、Cys (C)、Tyr (Y)、Asn (N)、Gln (Q)、Asp (D)、Glu (E)、Lys (K)、Arg (R)及His (H)。如本文描述之多肽可包含替代胺基酸。替代胺基酸之非限制性實例包括D胺基酸、β-胺基酸、同型半胱胺酸、磷酸絲胺酸、磷酸蘇胺酸、磷酸酪胺酸、羥基脯胺酸、γ-羧基麩胺酸鹽；馬尿酸、八氫吲哚-2-羧酸、抑胃酶胺酸、1,2,3,4,-四氫異喹啉-3-羧酸、青黴胺(3-巰基-D-纈胺酸)、鳥胺酸、瓜胺酸、α-甲基-丙胺酸、對苯甲醯基苯丙胺酸、對胺基苯丙胺酸、對氟苯丙胺酸、苯基甘胺酸、炔丙基甘胺酸、肌胺酸及第三丁基甘胺酸)、二胺基丁酸、7-羥基-四氫異喹啉羧酸、萘基丙胺酸、聯苯丙胺酸、環己基丙胺酸、胺基-異丁酸、正纈胺酸、正白胺酸、第三白胺酸、四氫異喹啉羧酸、哌啶酸、苯基甘胺酸、高苯丙胺酸、環己基甘胺酸、脫氫白胺酸、2,2-二乙基甘胺酸、l-胺基-1-環戊烷羧酸、l-胺基-1-環己烷羧酸、胺基-苯甲酸、胺基-萘甲酸、γ-胺基丁酸、二氟苯丙胺酸、六氫菸鹼酸、α胺基丁酸、噻吩基-丙胺酸、第三丁基甘胺酸、三氟纈胺酸；六氟白胺酸；氟化類似物；經疊氮化物修飾之胺基酸；經炔烴修飾之胺基酸；經氰基修飾之胺基酸；及其衍生物。

多肽可(例如)藉由將一部分添加至組成肽之胺基酸中之一或多者而修飾。如本文描述之多肽可包含一或多個部分分子，例如每個肽對應1或多個部分分子、每個肽對應2個或更多個部分分子、每個肽對應5個或更多個部分分子、每個肽對應10個或更多個部分分子或每個肽對應更多個部分分子。如本文描述之多肽可包含一或多種類型之修飾及/或部分，例如1種類型之修飾、2類型之修飾、3類型之修飾或更多種類型之修飾。修飾及/或部分之非限制性實例包括聚乙二醇化；糖基化；羥乙基澱粉化(HESylation)；ELP化(ELPylation)；脂化；乙醯化；醯胺化；封端修飾；氰基；磷酸化；白蛋白及環化。

原始胺基酸序列之改變可藉由熟習此項技術者已知的許多技術中之任一者進行。胺基酸取代可藉由合成在編碼欲改變之胺基酸之核苷酸序列中含有密碼子改變之寡核苷酸而引入(例如)於特定位置，欲改變之胺基酸之側翼係由允許連接至原始序列之片段之限制性位點。連接後，所得重構序列編碼具有所需胺基酸插入、取代或缺失之類似物。或者，可使用寡核苷酸定向之定點誘變程序以提供具有根據所需取代、缺失或插入改變之特定密碼子之經改變之核苷酸序列。用於製造此等改變之技術包括彼等由Walder等人，(Gene 42:133, 1986)；Bauer等人，(Gene 37:73, 1985)；Craik (BioTechniques, January 1985, 12-19)；Smith等人，(Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981)；及美國專利第4,518,584及4,737,462號揭示之技術，該等案件係以全文引用之方式併入本文中。如本文描述之多肽可經化學合成且突變可作為化學合成方法之部分併入。

如本文使用，術語「多核苷酸」、「核酸」及「核酸序列」係指併入核糖核酸、脫氧核糖核酸或其類似物之單元之任何分子，較佳聚合分子。該核酸可為單股或雙股的。單股核酸可為變性雙股DNA之一個核酸股，或者，該核酸可為非來源於任何雙股DNA之單股核酸。在一項態樣中，該核酸可為DNA。在另一態樣中，該核酸可為RNA。合適之核酸分子係DNA，包括基因體DNA或cDNA。其他合適之核酸分子係RNA，包括mRNA。

典型抗體包含至少兩個「輕鏈」(LC)及兩個「重鏈」(HC)。此等抗體之輕鏈及重鏈係由數個域構成之多肽。各重鏈包含重鏈可變區(本文中縮寫為「VH」)及重鏈恆定區(本文中縮寫為「CH」)。該重鏈恆定區包含重鏈恆定域CH1、CH2及CH3 (抗體類別IgA、IgD及IgG)及視需要重鏈恆定域CH4 (抗體類別IgE及IgM)。各輕鏈包含輕鏈可變域(本文中縮寫為「VL」)及輕鏈恆定域(本文中縮寫為「CL」)。可變區VH及VL可進一步細分為高變區，稱為互補決定區(CDR)，其間散佈更保守之區域，稱為框架區(FR)。各VH及VL由三個CDR及四個FR構成，自胺基末端至羧基末端以下列順序排佈：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈及輕鏈之「恆定域」不直接參與將抗體結合至標靶，但顯示各種效應功能。抗體與其標靶抗原或抗原決定基之間的結合係由互補決定區(CDR)介導。該等CDR係高序列可變性區域，位於抗體重鏈及輕鏈之可變區內，其中其等形成抗原結合位點。該等CDR係抗原特異性之主要決定因子。通常，該抗體重鏈及輕鏈各包含非連續排佈之三個CDR。該等抗體重鏈及輕鏈CDR3區在根據本發明之抗體之結合特異性/親和力中發揮重要作用且因此提供本發明之另一態樣。因此，如本文使用之術語「抗原結合片段」包括抗原結合多肽之任何天然生成或人造構築之構型，該抗原結合多肽包含一、二或三個輕鏈CDR，及/或一、二或三個重鏈CDR，其中該多肽能夠結合至抗原。

CDR之序列可藉由參考此項技術中已知的任何編號系統鑑別，例如，Kabat系統(Kabat, E. A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)；Chothia系統(Chothia &, Lesk,「Canonical Structures for the Hypervariable Regions of Immunoglobulins」，J. Mol. Biol. 196, 901–917 (1987))或IMGT系統(Lefranc等人，「IMGT Unique Numbering for Immunoglobulin and Cell Receptor Variable Domains and Ig superfamily V-like domains」，Dev. Comp. Immunol. 27, 55–77 (2003))。

對於本發明中討論之重鏈恆定區胺基酸位置，根據Edelman, G.M.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63 (1969) 78-85)中首次描述之EU索引編號。Kabat等人，(1991) (同上)中亦闡述Edelman之EU編號。因此，術語「如Kabat中闡述之EU索引」、「EU索引」、「Kabat之EU索引」或「EU編號」在重鏈之內文中係指基於如Kabat等人，(1991)中闡述之Edelman等人之人類lgG1 EU抗體之殘基編號系統。Kabat等人，(同上)中同樣闡述用於輕鏈恆定區胺基酸序列之編號系統。因此，如本文使用，「根據Kabat編號」係指Kabat等人，(同上)中闡述之Kabat編號系統。

術語「降低」、「減少(reduced)」、「減少(reduction)」或「抑制」在本文中均用於意謂降低統計顯著量。術語「減少(reduce)」、「減少(reduction)」或「降低」或「抑制」通常意謂如相較於參考水準降低至少10% (例如在缺乏給定治療之情況下)，且可包括(例如)降低至少約10%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或更多。如本文使用，「減少」或「抑制」不包含如相較於參考水準完全抑制或減少。「完全抑制」係如相較於參考水準100%抑制。對於未患給定疾患之個體，降低可較佳下降至如正常範圍內可接受之水準。

術語「增加(increased)」、「增加(increase)」、「增強」或「活化」在本文中均用於意謂增加統計顯著量。術語「增加(increased)」、「增加(increase)」、「增強」或「活化」可意謂如相較於參考水準增加至少10%，例如如相較於參考水準增加至少約20%、或至少約30%、或至少約40%、或至少約50%、或至少約60%、或至少約70%、或至少約80%、或至少約90%或高達且包括100%增加或介於10至100%之間的任何增加，或如相較於參考水準至少約2倍、或至少約3倍、或至少約4倍、或至少約5倍或至少約10倍增加、或介於2倍至10倍之間的任何增加或更大。在標誌物或症狀之內文中，「增加」係此水準之統計顯著之增加。

如本文使用，「個體」意謂人類或動物。通常，該動物係脊椎動物，諸如靈長類動物、囓齒類動物、家畜或狩獵動物。靈長類動物包括黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猴及獼猴(例如，恆河猴(Rhesus))。囓齒類動物包括小鼠、大鼠、土撥鼠、雪貂、兔及倉鼠。家畜及狩獵動物包括奶牛、馬、豬、鹿、北美野牛、水牛、貓科物種(例如，家貓)、犬科物種(例如，狗)、狐狸、狼、鳥類物種(例如，雞)、鴯鶓、鴕鳥及魚(例如，鱒魚、鯰魚及鮭魚)。較佳地，該個體係哺乳動物，例如，靈長類動物(例如，人類)。術語「個體(individual)」、「病患」及「個體(subject)」」在本文中可互換使用。

較佳地，個體係哺乳動物。該哺乳動物可為人類、非人類靈長類動物、小鼠、大鼠、狗、貓、馬或奶牛，但不限於此等實例。較佳地，個體係人類。個體可為男性或女性，成人或青少年。

個體可為先前已經診斷患有或鑑別為罹患或患有需治療之病症或與此病症相關之一或多種併發症，且視需要已經受如本文定義之病症或與該病症相關之一或多種併發症之治療之個體。或者，個體亦可為先前未診斷為患有如本文定義之病症或與該病症相關之一或多種併發症之個體。例如，個體可為顯示病症或與該病症相關之一或多種併發症之一或多種風險因子之個體或不顯示風險因子之個體。

「需治療特定病症之個體」可為患有該病症、診斷為患有該病症或處於發展該病症之風險下之個體。

本文提及之特定分子含量包含分子之實際量，諸如該分子之質量、莫耳量、濃度或莫耳濃度。例如，在本發明之內文中，對特定分子含量之提及可為指該分子之濃度。

分子含量可在任何適當之生理隔室中測定。較佳之生理隔室包括血漿、血液及/或血清。分子含量可從來自病患之任何適當樣本(例如血漿樣本、血液樣本、血清樣本、組織樣本、支氣管肺泡灌洗(BAL)樣本及/或CSF樣本)測定。可測試之樣本之其他非限制性實例係組織或流體樣本(尿液)及活檢樣本。因此，以非限制性實例說明之，本發明可提及分子在病患之血漿及/或BAL中之含量(例如濃度)。使用本發明之結合成員預處理分子/生物標誌物之含量可互換稱為「基線」。

用本發明之疫苗治療後之分子含量可與用該疫苗預治療之病患中之分子含量比較。分子之水準可直接或間接量測，且可使用任何適當之技術測定。合適之標準技術為此項技術中已知，例如西方墨點法(western blotting)及酶聯免疫吸附檢定(ELISA)。

如本文使用，術語SARS-CoV-2及2019-nCoV可互換使用以係指導致疾病COVID-19之病毒病原體。對SARS-CoV-2感染之提及係指疾病COVID-19。術語COVID-19疫苗(或對抗COVID-19之疫苗)亦與術語SARS-CoV-2疫苗(或對SARS-CoV-2之疫苗)同義。

如本文使用，術語「疫苗」用於係指誘導免疫反應之組合物。例如，該組合物可在投與該組合物之病患中誘導免疫反應。

減毒活疫苗包含能夠感染宿主細胞並在其中複製，但已以某種方式修飾使得其等不引起疾病之完整病毒顆粒或病毒體。

活載體疫苗包含活病毒載體(其通常係非致病性病毒)，其已經修飾以表現來自欲提高免疫反應之病毒之一或多種抗原。通常，若病患曝露於野生型病毒(即感染疾病)或用減毒活或不活化疫苗接種，則該一或多種抗原係將產生免疫反應之關鍵抗原。該抗原可為蛋白質抗原或其片段、或多醣抗原或其片段。該抗原可經重組表現或表現為結合或融合蛋白。

不活化疫苗包含已殺死或去活化(例如藉由熱或化學處理)之完整病毒顆粒或病毒體。不活化病毒體無法感染宿主細胞或在其中複製且不引起疾病。

次單元疫苗包含欲提高免疫反應之病毒之一或多種組分。通常，若病患曝露於野生型病毒(即感染疾病)或用減毒活或不活化疫苗接種，則該一或多種組分係將產生免疫反應之關鍵抗原。該組分可為蛋白質抗原或其片段、或多醣抗原或其片段。該組分可經重組表現或表現為結合或融合蛋白。

提供本文討論之公開案僅用於其等在本申請案之申請日前揭示。本文中之任何內容均不應解釋為承認此等公開案構成隨附申請專利範圍之先前技術。

組合疫苗當嘗試產生組合疫苗組合物時，常見併發症係稱為組分抑制(亦稱為抗原組合物)之現象。組分抑制描述同時投與兩種或更多種疫苗或疫苗抗原(通常來自不同病原體)且相較於當分開投與疫苗或疫苗抗原時激發之免疫反應，由一或多種疫苗或疫苗抗原激發之免疫反應受損之情況。該免疫反應可以數種方式受損。例如，相較於當分開投與疫苗或疫苗抗原時引起之免疫反應，由一或多種疫苗或疫苗抗原引起之免疫反應可減少。相較於當分開投與疫苗或疫苗抗原時之血清轉化及/或血清陽性，血清轉化及/或血清陽性亦可減少。關於對抗細菌病原體之疫苗(例如對於百日咳-白喉-破傷風(DTaP)疫苗及b型流感嗜血桿菌(Hib)疫苗)及對抗病毒病原體之疫苗(例如黃熱病疫苗及麻疹-腮腺炎-風疹(MMR)疫苗，亦已觀測到組分抑制之現象。當以相同組合物投與疫苗抗原時，及甚至當同時投與預先存在之有效疫苗組合物時，亦已觀測到組分抑制。組分抑制之風險意謂不可能預測組合疫苗是否臨床有效，或甚至兩種不同之疫苗組合物是否可一起投與。組分抑制之風險在免疫學領域中係眾所周知的，且納入疫苗計劃之考慮因素中，及組分抑制之評估係醫療監管機構之要求。

發明人已首次證實，可能投與包含流感抗原及來源於SARS-CoV-2之抗原之疫苗並達成對抗流感及SARS-CoV-2兩者之良好免疫原性，即在流感及SARS-CoV-2之情境中不發生組分抑制。

因此，本發明提供包含以下之流感-COVID-19組合疫苗(combined influenza-COVID-19 vaccine)(在本文中亦可互換稱為流感-COVID-19組合疫苗(combination influenza-COVID-19 vaccine))：(a)流感血球凝集素(HA)或其免疫原性片段；及(b)一或多種來源於SARS-CoV-2之抗原或其免疫原性片段；其中該等抗原能夠激發對抗流感及COVID-19 (如本文描述)兩者之免疫反應及保護。通常該流感-COVID-19組合疫苗進一步包含流感神經胺糖酸酶(NA)或其免疫原性片段。

如本文描述，本發明之流感-COVID-19組合疫苗與組分抑制無關，或針對以下具有最小組分抑制：(i)流感HA或其免疫原性片段；(ii)一或多種來源於SARS-CoV-2之抗原(例如SARS-CoV-2棘蛋白)或其免疫原性片段；(iii)可選流感NA或其免疫原性片段；或其任何組合。較佳地，本發明之流感-COVID-19組合疫苗與組分抑制無關，或針對以下中之各者具有最小組分抑制：(i)流感HA或其免疫原性片段；(ii)一或多種來源於SARS-CoV-2之抗原(例如SARS-CoV-2棘蛋白)或其免疫原性片段；及(iii)可選流感NA或其免疫原性片段。

如本文使用，術語「與組分抑制無關」意謂對作為本發明之流感-冠狀病毒-19組合疫苗之部分投與之(i)流感HA或其免疫原性片段；(ii)一或多種來源於SARS-CoV-2之抗原(例如SARS-CoV-2棘蛋白)或其免疫原性片段；(iii)可選流感NA或其免疫原性片段；或其任何組合之免疫反應基本上激發與當分開投與(i)流感HA或其免疫原性片段；(ii)來源於SARS-CoV-2之抗原(例如SARS-CoV-2棘蛋白)或其免疫原性片段；及/或(iii)可選流感NA或其免疫原性片段時達成之免疫反應相同。

如本文使用，術語「具有最小組分抑制」意謂對作為本發明之流感-冠狀病毒-19組合疫苗之部分投與之(i)流感HA或其免疫原性片段；(ii)一或多種來源於SARS-CoV-2之抗原(例如SARS-CoV-2棘蛋白)或其免疫原性片段；(iii)可選流感NA或其免疫原性片段；或其任何組合之免疫反應激發當分開投與(i)流感HA或其免疫原性片段；(ii)一或多種來源於SARS-CoV-2之抗原(例如SARS-CoV-2棘蛋白)或其免疫原性片段；及/或(iii)可選流感NA或其免疫原性片段時達成之免疫反應之至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更大。

本發明之流感-COVID-19組合疫苗之另一優點在於可增加病患依從性。本發明之流感-COVID-19組合疫苗容許病患接受單一疫苗投與，其將提供對流感及SARS-CoV-2感染兩者之免疫力。減少所需疫苗接種之數量及門診就診次數將增加疫苗接種率及病患依從性。另外，許多國家具有完善之公共衛生程序及每年流感疫苗接種計劃之時間表。本發明之流感-COVID-19組合疫苗容許利用此等現存程序及規程協調對抗SARS-CoV-2感染之大規模疫苗接種，此亦將促進對抗SARS-CoV-2感染之大規模疫苗接種而無需新穎公共衛生計劃或基礎設施。另外，一些證據表明氣候及季節性與COVID-19感染及傳播之潛在相關性。因此，本發明可能容許對抗如本文描述之COVID-19之定期(例如季節性或每年)疫苗接種，並因此減輕季節性感染及傳播。此外，此可潛在地可藉由使用現存公共衛生計劃及程序(特別彼等已針對季節性流感疫苗接種進行者)促進COVID-19疫苗接種達成。

流感HA或其免疫原性片段及可選流感NA或其免疫原性片段可各由熟練技術人員使用慣例技能容易選擇。本文描述流感HA (或其免疫原性片段)及流感NA (或其免疫原性片段)之非限制性實例。

一或多種SARS-CoV-2抗原或其免疫原性片段可由熟練技術人員使用慣例技能容易選擇。本文描述SARS-CoV-2抗原(或其免疫原性片段)之非限制性實例。通常，一或多種SARS-CoV-2抗原包含至少一種SARS-CoV-2抗原棘蛋白或其免疫原性片段，如本文描述。

流感HA或其免疫原性片段及/或可選流感NA或其免疫原性片段可包含於現存流感疫苗組合物中。該流感疫苗組合物可與一或多種SARS-CoV-2抗原(例如至少一種SARS-CoV-2棘蛋白)或其免疫原性片段，或現存COVID-19疫苗組合，以產生根據本發明之流感-COVID-19組合疫苗。

一或多種來源於SARS-CoV-2之抗原(例如至少一種SARS-CoV-2棘蛋白)或其免疫原性片段可包含於現存COVID-19疫苗組合物中。該COVID-19疫苗組合物可與流感HA或其免疫原性片段及/或可選流感NA或其免疫原性片段，或現存流感疫苗組合，以產生根據本發明之流感-COVID-19組合疫苗。通常當使用活(減毒或載體) COVID-19疫苗時，使用活(減毒或載體)流感疫苗。通常當使用不活化或次單元COVID-19疫苗時，使用不活化或次單元流感疫苗。較佳地，使用次單元(包括如本文描述之融合蛋白及VLP) COVID-19疫苗或組分及使用不活化流感疫苗。

因此，包含於本發明之流感-COVID-19組合疫苗中之流感HA或其免疫原性片段可為：(i)包含於不活化流感病毒體中；(ii)重組HA或其免疫原性片段；(iii)包含HA或其免疫原性片段之融合蛋白；或(iv)由RNA或DNA疫苗編碼。本文描述流感HA、其免疫原性片段及包含HA之流感疫苗之非限制性實例。

包含於本發明之流感-COVID-19組合疫苗中之(可選)之流感NA或其免疫原性片段可為：(i)包含於不活化流感病毒體中；(ii)重組NA或其免疫原性片段；(iii)包含NA或其免疫原性片段之融合蛋白；或(iv)由RNA或DNA疫苗編碼。本文描述流感NA、其免疫原性片段及包含NA之流感疫苗之非限制性實例。

包含於本發明之流感-COVID-19組合疫苗中之一或多種來源於SARS-CoV-2之抗原或其免疫原性片段較佳係：(i)至少一種重組SARS-CoV-2棘蛋白或其免疫原性片段；(ii)至少一種包含SARS-CoV-2棘蛋白或其免疫原性片段之融合蛋白；(iii)至少一種包含SARS-CoV-2棘蛋白或其免疫原性片段之病毒樣顆粒(VLP)；(iv) 至少一種編碼重組SARS-CoV-2棘蛋白或其免疫原性片段之多核苷酸；或(v)由RNA或DNA疫苗編碼。本文描述此等SARS-CoV-2抗原(特別SARS-CoV-2棘蛋白及其免疫原性片段)及COVID-19疫苗之非限制性實例。

(i)流感HA、其免疫原性片段及包含HA之流感疫苗；(ii)一或多種SARS-CoV-2抗原(特別SARS-CoV-2棘蛋白)及其免疫原性片段及COVID-19疫苗；及視需要(iii)流感NA、其免疫原性片段及包含NA之流感疫苗之任何組合可用於根據本發明之流感-COVID-19組合疫苗中，條件為HA、(可選)之NA及SARS-CoV-2抗原能夠激發對抗流感及COVID-19兩者之免疫反應及保護。

本發明之流感-COVID-19組合疫苗之流感組分可包含活(減毒或載體)流感疫苗、不活化流感疫苗或次單元流感疫苗。

減毒活流感疫苗之非限制性實例包括：季節性流感疫苗，諸如季節性四價(4價)流感疫苗。以特定非限制性實例說明之，季節性四價流感疫苗(例如2019至2020季節)可包含減毒A型流感H1N1病毒、減毒A型流感H3N2病毒及兩種B型流感病毒(B/科羅拉多/06/2017樣(維多利亞譜系)病毒及B/普吉島/3073/2013樣病毒(山形譜系))。

不活化流感疫苗之非限制性實例包括：季節性流感疫苗，諸如季節性三價(3價)流感疫苗及季節性四價(4價)流感疫苗。以特定非限制性實例說明之，季節性三價流感疫苗(例如2019至2020季節)可包含減毒A型流感H1N1病毒、減毒A型流感H3N2病毒及B型流感病毒(B/科羅拉多/06/2017樣(維多利亞譜系))。以另一特定非限制性實例說明之，季節性四價流感疫苗(例如2019至2020季節)可包含減毒A型流感H1N1病毒、減毒A型流感H3N2病毒及兩種B型流感病毒(B/科羅拉多/06/2017樣(維多利亞譜系)病毒及B/普吉島/3073/2013樣病毒(山形譜系))。

可用於本發明之流感-COVID-19組合疫苗中之流感疫苗之其他實例包括單價大流行流感疫苗(經EMA預先批准之當前大流行流感疫苗包括減毒活或不活化疫苗)及通用流感疫苗(正在開發中之實例包括次單元疫苗及包含引發DNA疫苗(priming DNA vaccine)及活載體疫苗之兩階段疫苗)。

較佳地，本發明之流感-COVID-19組合疫苗之流感組分係減毒活或不活化流感疫苗。

本發明之流感-COVID-19組合疫苗之SARS-CoV-2組分可包含活(減毒或載體) SARS-CoV-2/COVID-19疫苗、不活化SARS-CoV-2/COVID-19疫苗或次單元SARS-CoV-2/COVID-19疫苗。

較佳地，本發明之流感-COVID-19組合疫苗之SARS-CoV-2組分係包含SARS-CoV-2棘蛋白或其片段之次單元疫苗、或包含該SARS-CoV-2棘蛋白或其片段之融合蛋白或VLP。

特別佳係其中流感組分係活減毒或不活化流感疫苗及SARS-CoV-2組分係包含SARS-CoV-2棘蛋白或其片段之次單元疫苗、或包含該SARS-CoV-2棘蛋白或其片段之融合蛋白或VLP之流感-COVID-19組合疫苗。

通常當本發明之流感-COVID-19組合疫苗之流感組分包含活(減毒或載體)流感疫苗時，SARS-CoV-2組分包含活(減毒或載體) SARS-CoV-2/COVID-19疫苗。

通常當本發明之流感-COVID-19組合疫苗之流感組分包含不活化流感疫苗時，SARS-CoV-2組分包含不活化SARS-CoV-2/COVID-19疫苗。或者，當本發明之流感-COVID-19組合疫苗之流感組分包含不活化流感疫苗時，SARS-CoV-2組分包含次單元SARS-CoV-2/COVID-19疫苗，或反之亦然。

通常當本發明之流感-COVID-19組合疫苗之流感組分包含次單元流感疫苗時，SARS-CoV-2組分包含次單元SARS-CoV-2/COVID-19疫苗。或者，當本發明之流感-COVID-19組合疫苗之流感組分包含次單元流感疫苗時，SARS-CoV-2組分包含不活化SARS-CoV-2/COVID-19疫苗，或反之亦然。

通常當本發明之流感-COVID-19組合疫苗之流感組分包含核酸(DNA或RNA，較佳DNA)流感疫苗時，SARS-CoV-2組分包含核酸(DNA或RNA，較佳DNA) SARS-CoV-2/COVID-19疫苗。

本發明提供一種流感-COVID-19組合疫苗，其中流感HA或其免疫原性片段及流感NA或其免疫原性片段包含於不活化流感病毒體中，及一或多種來源於SARS-CoV-2之抗原(例如至少一種SARS-CoV-2棘蛋白)或其免疫原性片段係：(i)至少一種包含SARS-CoV-2棘蛋白或其免疫原性片段之融合蛋白；(ii)至少一種包含SARS-CoV-2棘蛋白或其免疫原性片段之病毒樣顆粒(VLP)；或不活化SARS-CoV-2病毒體。

本發明提供一種流感-COVID-19組合疫苗，其中流感HA或其免疫原性片段及視需要流感NA或其免疫原性片段包含於次單元疫苗中，及一或多種來源於SARS-CoV-2之抗原(例如至少一種SARS-CoV-2棘蛋白)或其免疫原性片段係：(i)至少一種包含SARS-CoV-2棘蛋白或其免疫原性片段之融合蛋白；(ii)至少一種包含SARS-CoV-2棘蛋白或其免疫原性片段之病毒樣顆粒(VLP)；或不活化SARS-CoV-2病毒體。

本發明提供一種流感-COVID-19組合疫苗，其中：流感HA或其免疫原性片段包含於減毒活流感病毒體中；流感NA或其免疫原性片段包含於減毒活流感病毒體中；及/或一或多種來源於SARS-CoV-2之抗原或其免疫原性片段包含於活病毒載體中(即於活載體疫苗中)。包含一或多種來源於SARS-CoV-2之抗原或其免疫原性片段之活病毒載體可為臨床用於疫苗之任何病毒載體。非限制性實例包括腺病毒載體、麻疹病毒載體、腮腺炎病毒載體、風疹病毒載體、水痘病毒載體、小兒麻痺病毒載體及黃熱病病毒載體。

冠狀病毒抗原冠狀病毒(CoV)在所有RNA病毒中具有最大基因體，通常在27至32 kb之範圍內。該CoV基因體編碼至少四種主要結構蛋白：棘(S)、膜(M)、包膜(E)、核蛋白衣(N)蛋白及其他輔助蛋白，該等蛋白幫助複製過程並促進進入細胞內。圖1概述冠狀病毒之結構及結構蛋白之功能。簡而言之，CoV基因體包裝在由核蛋白衣形成之螺旋蛋白衣內部並由包膜進一步包圍。與病毒包膜相關聯的係至少三種結構蛋白：參與病毒組裝之膜蛋白及包膜蛋白，及介導病毒進入宿主細胞內之棘蛋白。一些冠狀病毒亦編碼包膜相關血球凝集素-酯酶蛋白(HE)。棘蛋白自病毒表面形成大突出物，使冠狀病毒具有冠冕之外觀，名稱「冠狀病毒」有此而來。除介導病毒進入外，棘蛋白係病毒宿主範圍及組織趨性之關鍵決定因子及宿主免疫反應之主要誘導物。

2019-nCoV (正式命名為嚴重急性呼吸系統症候群冠狀病毒2，SARS-CoV-2)係2019年冠狀病毒疾病(COVID-19)之病原體且在人類中具有接觸傳染性。據信SARS-CoV-2起源於動物，鑒於SARS-CoV-2與SARS-CoV (79.5%)及蝙蝠冠狀病毒(96%)之遺傳相似性，蝙蝠係可能之來源。本文中與CoV相關之任何揭示內容亦直接且無限制地適用於SARS-CoV-2。

本發明之流感-COVID-19組合疫苗中之一或多種來源於SARS-CoV-2之抗原或其免疫原性片段可為能夠激發對抗SARS-CoV-2感染之免疫反應及/或保護之任何SARS-CoV-2抗原。較佳地，該另一種抗原係：(i)至少一種重組SARS-CoV-2棘蛋白或其免疫原性片段；(ii)至少一種包含SARS-CoV-2棘蛋白或其免疫原性片段之融合蛋白；(iii)至少一種包含SARS-CoV-2棘蛋白或其免疫原性片段之病毒樣顆粒(VLP)；(iv)至少一種編碼重組SARS-CoV-2棘蛋白或其免疫原性片段之多核苷酸；或(v)由至少一種RNA或DNA疫苗編碼。

本發明之流感-COVID-19組合疫苗之SARS-CoV-2組分可包含至少一種、至少兩種、至少三種、至少四種或更多種SARS-CoV-2抗原。以非限制性實例說明之，各SARS-CoV-2抗原可為不同之棘蛋白抗原，諸如野生型棘蛋白抗原及/或本文描述之變體棘蛋白中之一者。本發明之流感-COVID-19組合疫苗中可包括之SARS-CoV-2抗原之其他非限制性實例包括來自2019-CoV蛋白衣、膜蛋白或包膜蛋白之此等抗原。一或多種SARS-CoV-2抗原中之各者可以以下形式獨立地提供：(i)重組抗原或其免疫原性片段；(ii)融合蛋白或其免疫原性片段；(iii)包含該抗原或其免疫原性片段之病毒樣顆粒(VLP)；或(iv)編碼該抗原或其免疫原性片段之多核苷酸。本文關於包含SARS-CoV-2棘蛋白抗原之重組、融合蛋白、VLP、多核苷酸及載體之揭示內容同樣適用於可包含於本發明之流感-COVID-19組合疫苗中之其他SARS-CoV-2抗原。

棘蛋白 CoV棘蛋白包含三個域：(i)大胞外域；(ii)跨膜域(其單次通過病毒包膜)；及(iii)短細胞內尾。該胞外域由三個受體結合次單元(3 x S1)構成及三聚體柄由三個膜融合次單元(3 x S2)組成。因此，SARS-CoV-2棘蛋白係同源三聚體。在病毒進入期間，S1結合至宿主細胞表面上之受體以進行病毒附著，及S2融合宿主及病毒膜，容許病毒基因體進入宿主細胞內。受體結合及膜融合係冠狀病毒感染週期中之初始及關鍵步驟。不同CoV靶向之受體存在顯著差異。

SARS-CoV-2棘蛋白之結構描述(例如)於Cai等人，(Science (2020) 369:1586-1592))中，該案係以全文引用之方式併入本文中。SARS-CoV-2棘蛋白之各S1次單元包含N末端域(NTD)、受體結合域(RBD)、兩個C末端域(CTD)。在與宿主細胞膜融合之前，SARS-CoV-2棘蛋白之S1次單元保護S2次單元。一經結合至ACE2，該SARS-CoV-2棘蛋白以「水手刀」方式重新折疊，形成長中心捲曲螺旋並最終導致膜融合及病毒進入宿主細胞內。

發明人先前已顯示，SARS-CoV-2棘蛋白及其免疫原性片段具有作為對抗SARS-CoV-2/COVID-19感染之疫苗之抗原之治療潛力(包括預防潛力)。

因此，如本文描述，本發明之流感-COVID-19組合疫苗中所含有之一或多種來源於SARS-CoV-2之抗原較佳係一或多種SARS-CoV-2棘蛋白或其免疫原性片段。通常該一或多種SARS-CoV-2棘蛋白與SEQ ID NO: 1具有至少70%、至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更大一致性，或其與該棘蛋白具有共同抗原交叉反應性之片段。較佳地，一或多種來自SARS-CoV-2之棘蛋白與SEQ ID NO: 1具有至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更大一致性，或其與該棘蛋白具有共同抗原交叉反應性之片段。更佳地，一或多種來自SARS-CoV-2之棘蛋白與SEQ ID NO: 1具有至少98%、至少99%或更大一致性，或其與該棘蛋白具有共同抗原交叉反應性之片段。一或多種來自SARS-CoV-2之棘蛋白可包含SEQ ID NO: 1或由SEQ ID NO: 1構成，或其與該棘蛋白具有共同抗原交叉反應性之片段(本文中亦稱為免疫原性片段)。

根據本發明之SARS-CoV-2棘蛋白或其免疫原性片段通常保留與天然SARS-CoV-2棘蛋白相同之對其受體之結合親和力。在本發明之內文中，此可意謂對SARS-CoV-2棘蛋白受體之結合親和力為天然SARS-CoV-2棘蛋白之結合親和力之至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%或更大。較佳地，本發明之SARS-CoV-2棘蛋白或其免疫原性片段對SARS-CoV-2棘蛋白受體之結合親和力為天然SARS-CoV-2棘蛋白之結合親和力之至少90%、至少95%、至少99%或更大。

在一些實施例中，本發明之SARS-CoV-2棘蛋白或其免疫原性片段對2019-nCoV棘蛋白受體之結合親和力大於全長蛋白之結合親和力。例如，本發明之SARS-CoV-2棘蛋白或其免疫原性片段可具有天然SARS-CoV-2棘蛋白之結合親和力之至少100%、至少110%、至少120%或至少150%或更大之結合親和力。

在其他實施例中，本發明之SARS-CoV-2棘蛋白或其免疫原性片段對SARS-CoV-2棘蛋白受體之結合親和力可小於天然SARS-CoV-2棘蛋白之結合親和力。例如，本發明之SARS-CoV-2棘蛋白或其免疫原性片段可具有天然SARS-CoV-2棘蛋白之結合親和力之小於80%、小於70%、小於60%、小於50%或更小之結合親和力。

由本發明之多核苷酸表現之SARS-CoV-2棘蛋白或其免疫原性片段對其受體之結合親和力可根據解離常數(K_d )定量。K_d 可使用任何適當之技術測定，但在本發明之內文中，一般較佳為表面電漿子共振(SPR)。

一或多種SARS-CoV-2棘蛋白之免疫原性片段之長度通常大於200個胺基酸。本發明之SARS-CoV-2棘蛋白片段可包含至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、至少1000、至少1100個或更多個胺基酸殘基長度或由其構成。本發明之片段與SARS-CoV-2棘蛋白具有共同抗原交叉反應性(且因此稱為免疫原性片段)。

根據本發明，一或多種SARS-CoV-2棘蛋白或其片段維持天然(野生型) SARS-CoV-2棘蛋白中存在之一或多個構象抗原決定基。因此，一或多種SARS-CoV-2棘蛋白或其片段能夠產生免疫保護效應。通常該免疫保護效應包括產生特異性結合至SARS-CoV-2棘蛋白或其片段之一或多個構象抗原決定基之中和抗體(nAb)。CoV棘蛋白之構象抗原決定基具有該CoV棘蛋白之三級結構中發現之特定三維結構。該一或多個構象抗原決定基通常係於該棘蛋白之胞外域內。較佳地，該一或多種SARS-CoV-2棘蛋白或其片段保留天然SARS-CoV-2棘蛋白中存在之所有構象抗原決定基。

SARS-CoV-2蛋白之免疫原性片段可包含RBD、NTD、CTD1、CDT2、FP及/或FPPR或其任何組合或由其構成。較佳地，SARS-CoV-2棘蛋白之免疫原性片段包含該SARS-CoV-2棘蛋白之受體結合域(RBD)或由其構成。此RBD負責將SARS-CoV-2結合至宿主細胞並因此促進SARS-CoV-2顆粒進入宿主細胞內。該RBD對應於SEQ ID NO: 1之胺基酸殘基319至529，如本文描述稱為SEQ ID NO: 15。該RBD由對應於SARS-CoV-2病毒之基因體中之位置955至1597之鹼基編碼(基因庫登錄號MN908947，其第3版(MN908947.3)於2020年1月17日寄存)。因此，如本文描述，本發明係關於該SARS-CoV-2棘蛋白之RBD與SEQ ID NO: 15具有至少70%、至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更大一致性。較佳地，SARS-CoV-2棘蛋白之免疫原性片段包含與SEQ ID NO: 15具有至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更大一致性之SARS-CoV-2棘蛋白之RBD或由其構成。更佳地，SARS-CoV-2棘蛋白之免疫原性片段包含與SEQ ID NO: 15具有至少98%、至少99%或更大一致性之SARS-CoV-2棘蛋白之RBD或由其構成。該SARS-CoV-2棘蛋白之RBD可包含SEQ ID NO: 15或由其構成。本文關於該SARS-CoV-2棘蛋白(例如關於多核苷酸、病毒載體、DNA質體、RNA疫苗、病毒樣顆粒(VLP)、融合蛋白、抗體、組合物及醫藥組合物、調配物及治療適應症)之任何及所有揭示內容同樣且無保留地適用於該SARS-CoV-2棘蛋白之RBD。

CoV係大包膜之單一正義RNA病毒。RNA病毒之突變率大於DNA病毒，表明存活之適應過程更高效。因此，存在抗原漂移之風險，與針對流感病毒觀測到之抗原漂移類似，其亦將成為SARS-CoV-2之特徵，或大流行一經消退，該SARS-CoV-2即在人群中變得流行。事實上，迄今為止的研究已鑑別SARS-CoV-2之棘蛋白之受體結合域(RBD)內之突變(特別G476S及V483A/G)，及S1/S2位點附近普遍存在之D614G突變(Saha等人，ChemRxiv^TM http://doi.org/10.26434/chemrxiv.12320567.v1)，證據表明可增強SARS-CoV-2病毒體之細胞進入，且亦拓寬宿主細胞趨性。該SARS-CoV-2棘蛋白中報導之其他突變包括S943 (特別S943P)、L5 (特別L5F)、L8 (特別L8F)、V367 (特別V367F)、H49 (特別H49Y)、Y145 (特別Y145H/del)、Q239 (特別Q239K)、A831 (特別A831V)、D839 (特別D839Y/N/E)及P1263 (特別P1263L)，或其任何組合(Korber等人，BioRxiv^TM https://doi.org/10.1101/2020.04.29.069054)。

因此，本發明有利地容許視需要修飾SARS-CoV-2疫苗抗原，以提供增強之對抗棘蛋白出現突變之毒株之免疫力。以非限制性實例說明之，根據本發明之任何SARS-CoV-2棘蛋白或其片段可於位置(i) D614、(ii) V483、(iii) G476、(iv) K417、(v)、E484、(vi) N501、(vii) A570及(viii) P681，或(i)至(viii)之任何組合(包括任何兩個、任何三個、任何四個、任何五個、任何六個、任何七個或所有八個)處經修飾(特別經取代)。或者或另外，該SARS-CoV-2棘蛋白或其片段可包含缺失突變，包括於胺基酸殘基69、70及/或144中之一或多者處之缺失。如本文描述，突變/修飾之位置通常對應於本發明之SEQ ID NO: 1中之胺基酸之編號。

於位置D614處之修飾(特別D614G取代)較佳。特定言之，根據本發明之任何SARS-CoV-2棘蛋白或其片段可包含下列取代(i) G476S、(ii) V483A/G、(iii) D614G、(iv) K417N/T、(v) E484K、(vi) N501Y、(vii) A570D及(viii) P681H，或(i)至(viii)之任何組合(包括任何兩個、任何三個、任何四個、任何五個、任何六個、任何七個或所有八個)。

本發明亦係關於來自變體SARS-CoV-2之SARS-CoV-2棘蛋白或其片段。特定言之，本發明可關於來自B.1.1.7毒株(亦稱為201/501Y.V1，其係在英國首次偵測到，現稱為α變體)；B.1.351毒株(亦稱為20H/501.V2，其係在南非首次偵測到，現稱為β變體)、P1毒株(亦稱為20J/501Y.V3，其係在日本及巴西首次偵測到，現稱為γ變體)、B1.427及B1.429毒株(其係在加利福尼亞首次偵測到，現稱為ε變體)及/或B.1.617.2毒株(其係在印度首次偵測到，現稱為δ變體)之SARS-CoV-2棘蛋白或其片段。根據CDC (SARS-CoV-2變體分類及定義(cdc.gov) (SARS-CoV-2 Variant Classifications and Definitions(cdc.gov)))，已發現該α變體包含下列突變：69缺失、70缺失、144缺失、(E484K*)、(S494P*)、N501Y、A570D、D614G、P681H、T716I、S982A、D1118H及(K1191N*)。該α變體之關鍵突變包含殘基69/70及144Y之缺失，及N501Y、A570D、D614G及P681H取代。根據CDC (SARS-CoV-2變體分類及定義(cdc.gov))，已發現該β變體包含下列突變：D80A、D215G、241缺失、242缺失、243缺失、K417N、E484K、N501Y、D614G及A701V。該β變體之關鍵突變包含K417N、E484K、N501Y及D614G取代。根據CDC (SARS-CoV-2變體分類及定義(cdc.gov))，已發現該γ變體包含下列突變：L18F、T20N、P26S、D138Y、R190S、K417T、E484K、N501Y、D614G、H655Y、T1027I。該γ變體之關鍵突變包含E484K、K417N/T、N501Y及D614G。根據CDC (SARS-CoV-2變體分類及定義(cdc.gov))，已發現該δ變體包含下列突變：T19R、(G142D*)、156缺失、157缺失、R158G、L452R、T478K、D614G、P681R及D950N。該δ變體之關鍵突變包含L452R、E484Q及T478K。根據CDC (SARS-CoV-2變體分類及定義(cdc.gov))，已發現該ε變體包含下列突變：S13I、W152C、L452R、D614G。該ε變體之關鍵突變係L452R。

除非另有明確規定，否則本文關於組合疫苗、多核苷酸、棘蛋白及其片段、VLP、融合蛋白及DNA/RNA疫苗之所有揭示內容同樣適用於SARS-CoV-2之不同變體及毒株。

因此，可安全重複投與之疫苗組合物之開發不僅可增強免疫反應以解決保護性免疫力隨時間喪失之問題(如本文描述及如臨床中觀測到)，亦將有利地容許視需要修飾SARS-CoV-2疫苗抗原以提供增強之對抗棘蛋白出現突變之毒株之免疫力。以非限制性實例說明之，用作一或多種根據本發明之SARS-CoV-2抗原之任何SARS-CoV-2棘蛋白或其片段可於以下位置處經修飾(特別經取代)：(i) 417；(ii) 452；(iii) 478；(iv) 484；(v) 201；(vi) 570；(vii) 614；及/或(viii) 681；或其任何組合。以另一非限制性實例說明之，用作一或多種根據本發明之SARS-CoV-2抗原之任何SARS-CoV-2棘蛋白或其片段可於位置(i) D614、(ii) V483、(iii) G476、(iv) G476及V483、(v) G476及D614、(vi) V483及D614或(vii) G476、V483及D614處經修飾(特別經取代)。位置D614處之修飾(特別D614G取代)可較佳。位置L452處之修飾(特別L452R取代)可較佳。特定言之，用作一或多種根據本發明之SARS-CoV-2抗原之任何SARS-CoV-2棘蛋白或其片段可包含下列取代：(i) G476S、(ii) V483A/G、(iii) D614G、(iv) G476S及V483A/G、(v) G476S及D614G、(vi) V483A/G及D614G、(vii) G476S、V483A/G及D614G、(viii) L452R及E484Q，且視需要T478K；或(ix) L452R。多種變體SARS-CoV-2棘蛋白(以本文描述之形式中之任一者，特別呈融合蛋白或VLP)可包含於本發明之流感-COVID-19組合疫苗中。

多核苷酸一或多種來源於SARS-CoV-2之抗原或其免疫原性片段可由一或多種多核苷酸疫苗編碼或表現(術語「編碼」及「表現」在本文中可互換使用)以產生抗原或其免疫原性片段。術語多核苷酸包含DNA及RNA序列兩者。本文中，術語「核酸」、「核酸分子」及「多核苷酸」可互換使用。因此，來源於SARS-CoV-2之抗原(例如SARS-CoV-2棘蛋白)或其免疫原性片段可由DNA或RNA疫苗編碼或表現。

本發明之流感-COVID-19組合疫苗中之表現一或多種SARS-CoV-2棘蛋白或其免疫原性片段之一或多種多核苷酸可表現與SEQ ID NO: 1具有至少70%、至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更大一致性之來自SARS-CoV-2之棘蛋白，或其與該棘蛋白具有共同抗原交叉反應性之片段。較佳地，該一或多種多核苷酸表現一或多種與SEQ ID NO: 1具有至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更大一致性之來自SARS-CoV-2之棘蛋白，或其與該棘蛋白具有共同抗原交叉反應性之片段。更佳地，該一或多種多核苷酸表現一或多種與SEQ ID NO: 1具有至少98%、至少99%或更大一致性之來自SARS-CoV-2之棘蛋白，或其與該棘蛋白具有共同抗原交叉反應性之片段。該一或多種多核苷酸可表現包含SEQ ID NO: 1或由SEQ ID NO: 1構成之來自SARS-CoV-2之棘蛋白，或其與該棘蛋白具有共同抗原交叉反應性之片段。多種SARS-CoV-2抗原(特別是一或多種SARS-CoV-2棘蛋白)可由多核苷酸或由多種多核苷酸或其組合表現。作為非限制性實例，該一或多種SARS-CoV-2抗原(特別是一或多種SARS-CoV-2棘蛋白)可由單一多核苷酸表現，或該等SARS-CoV-2抗原(特別是一或多種SARS-CoV-2棘蛋白)各可由各別多核苷酸表現。

通常該多核苷酸包含編碼與SEQ ID NO: 1具有至少90%一致性之來自SARS-CoV-2之棘蛋白，或其與該棘蛋白具有共同抗原交叉反應性之片段，或其如本文描述之任何變體之經分離之多核苷酸。例如，該多核苷酸可編碼該SARS-CoV-2棘蛋白之RBD，較佳其中該RBD與SEQ ID NO: 15具有至少90%一致性。編碼該RBD之例示性多核苷酸顯示於SEQ ID NO: 13，及SEQ ID NO: 14之密碼子最佳化序列中。因此，本發明之多核苷酸可包含與SEQ ID NO: 13具有至少70%、至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更大一致性之核酸序列或由其構成。較佳地，本發明之多核苷酸可包含與SEQ ID NO: 13具有至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更大一致性之核酸序列或由其構成。更佳地，本發明之多核苷酸可包含與SEQ ID NO: 13具有至少98%、至少99%或更大一致性之核酸序列或由其構成。本發明之多核苷酸可包含SEQ ID NO: 13之核酸序列或由其構成。

本發明亦包含編碼來自SARS-CoV-2之變體棘蛋白(如上文描述)或其與該變體棘蛋白具有共同抗原交叉反應性之片段之多核苷酸。該等變體棘蛋白通常與SEQ ID NO: 1或其片段(諸如SEQ ID NO: 15之RBD)具有至少90%一致性。

編碼一或多種SARS-CoV-2棘蛋白或其免疫原性片段之一或多種多核苷酸(例如DNA或RNA疫苗)可經最佳化以用於在病患中之表現。如本文使用之術語「最佳化」係關於針對一或多種SARS-CoV-2棘蛋白或其免疫原性片段之表現最佳化，且包括密碼子最佳化及/或對多核苷酸之其他修飾(均根據核酸序列及其他修飾)兩者，其等均增加一或多種來自該多核苷酸之SARS-CoV-2棘蛋白於病患內之表現之含量及/或持續時間，或當自DNA或RNA疫苗表現一或多種SARS-CoV-2棘蛋白或其片段時，其等另外提供優點。發明人先前已在英國專利申請案第2002166.3號中描述編碼SARS-CoV-2棘蛋白及片段之最佳化多核苷酸，該案係以全文引用之方式併入本文中。

因此，一或多種來源於SARS-CoV-2之抗原或其免疫原性片段，特別一或多種SARS-CoV-2棘蛋白或其免疫原性片段可由一或多種多核苷酸(例如DNA或RNA疫苗)編碼，該等多核苷酸包含與SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、7、8、13、14、26、27、29、30或32中之任一者具有至少70%、至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更大一致性之核酸序列。較佳地，該一或多種多核苷酸包含與SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、7、8、13、14、26、27、29、30或32中之任一者具有至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更大一致性之核酸序列。更佳地，該一或多種多核苷酸包含與SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、7、8、13、14、26、27、29、30或32中之任一者具有至少98%、至少99%或更大一致性之核酸序列。該一或多種多核苷酸可包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、7、8、13、14、26、27、29、30或32中之任一者之核酸序列。另外，在多核苷酸(例如DNA或RNA疫苗)中可刪除如本文描述之SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、7、8、13、14、26、27、29、30或32中之任一者或其任何變體中鑑別之5’選殖位點、3’選殖位點或5’及3’選殖位點。因此，該一或多種多核苷酸(例如DNA或RNA疫苗)可包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、7、8、13、14、26、27、29、30或32中之任一者，但缺乏SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、7、8、13、14、26、27、29、30或32之任一者中鑑別之5’選殖位點、3’選殖位點或5’及3’選殖位點。或者，如本文描述之SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、7、8、13、14、26、27、29、30或32中之任一者或其任何變體中鑑別之5’選殖位點、3’選殖位點或5’及3’選殖位點可獨立地經另一適當之選殖位點置換。合適之替代選殖位點為此項技術中熟知。

本發明特別係關於來源於SARS-CoV-2之抗原或包含SARS-CoV-2棘蛋白之RBD或由其構成之免疫原性片段。因此，本發明之多核苷酸可包含與SEQ ID NO: 13，或與SEQ ID NO: 14之密碼子最佳化序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更大一致性之核酸序列或由其構成。較佳地，本發明之多核苷酸可包含與SEQ ID NO: 13，或與SEQ ID NO: 14之密碼子最佳化序列具有至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更大一致性之核酸序列或由其構成。更佳地，本發明之多核苷酸可包含與SEQ ID NO: 13，或與SEQ ID NO: 14之密碼子最佳化序列具有至少98%、至少99%或更大一致性之核酸序列或由其構成。本發明之多核苷酸可包含SEQ ID NO: 13，或SEQ ID NO: 14之密碼子最佳化序列之核酸序列或由其構成。

一或多種根據本發明之多核苷酸(例如DNA或RNA疫苗)通常編碼至少一種SARS-CoV-2棘蛋白或其免疫原性片段，其：(a)保留天然SARS-CoV-2棘蛋白中存在之構象抗原決定基；及/或(b)當對病患投與該核酸時，導致產生對棘蛋白或其片段具特異性之中和抗體。

一或多種多核苷酸(例如DNA或RNA疫苗)通常表現至少一種來自SARS-CoV-2之棘蛋白或其免疫原性片段，特別至少一種來自如本文描述之SARS-CoV-2之棘蛋白或其免疫原性片段(包括以VLP或融合蛋白之形式)。

一或多種根據本發明之多核苷酸(例如DNA或RNA疫苗)可包含於表現構築體中以促進一或多種SARS-CoV-2棘蛋白或其片段之表現。通常，在此表現構築體中，該一或多種多核苷酸係可操作地連接至合適之啟動子。該一或多種多核苷酸可連接至合適之終止子序列。該一或多種多核苷酸可連接至啟動子及終止子兩者。合適之啟動子及終止子序列為此項技術中熟知。

一或多種多核苷酸(例如DNA或RNA疫苗)可編碼至少一種SARS-CoV-2棘蛋白或其免疫原性片段，其另外包含前導序列，例如以幫助分泌至少一種SARS-CoV-2棘蛋白或其免疫原性片段。可使用任何合適之前導序列，包括此項技術中已知的習知前導序列。合適之前導序列包括人類組織纖維蛋白溶酶原活化劑前導序列(tPA)，其例行用於基於病毒及DNA之疫苗中，及以幫助自哺乳動物細胞分泌蛋白質疫苗。

至少一種SARS-CoV-2棘蛋白或其免疫原性片段可另外包含N或C末端標識，例如以幫助至少一種SARS-CoV-2棘蛋白或其免疫原性片段之重組產生及/或純化。可使用任何N或C末端標識，包括此項技術中已知的習知標識。合適之標識序列包括C末端六組胺酸標識及「C標識」(C末端處之四種胺基酸EPEA)，其等常用於此項技術中以幫助自異源性表現系統(例如昆蟲細胞、哺乳動物細胞、細菌或酵母菌)純化。在其他實施例中，本發明之至少一種SARS-CoV-2棘蛋白或其免疫原性片段係自異源性表現系統純化而無需使用純化標識。

本發明之至少一種SARS-CoV-2棘蛋白或其免疫原性片段可包含如本文定義之前導序列及/或標識。

病毒載體、DNA質體及RNA疫苗在本發明之流感-COVID-19組合疫苗中，一或多種來源於SARS-CoV-2之抗原(例如SARS-CoV-2棘蛋白)或其免疫原性片段可由一或多種病毒載體、DNA載體(或DNA質體)或RNA疫苗編碼或表現。如本文使用之術語「載體」係指病毒載體、DNA載體(或DNA質體)或RNA疫苗。

該一或多種病毒載體、DNA載體(或DNA質體)或RNA疫苗可包含一或多種編碼至少一種來源於如本文描述之SARS-CoV-2之抗原之多核苷酸。較佳地，該一或多種病毒載體、DNA載體(或DNA質體)或RNA疫苗編碼至少一種如本文描述之SARS-CoV-2棘蛋白或其免疫原性片段。多種SARS-CoV-2抗原(特別一或多種SARS-CoV-2棘蛋白)可由單一病毒載體、DNA載體(或DNA質體)或RNA疫苗表現或由多種病毒載體、DNA載體(或DNA質體)或RNA疫苗或其組合表現。以非限制性實例說明之，該一或多種SARS-CoV-2抗原(特別一或多種SARS-CoV-2棘蛋白)可由單一病毒載體、DNA載體(或DNA質體)或RNA疫苗表現，或該等SARS-CoV-2抗原(特別一或多種SARS-CoV-2棘蛋白)中之各者可由不同之病毒載體、DNA載體(或DNA質體)或RNA疫苗表現。

本發明之流感-COVID-19組合疫苗中之表現一或多種SARS-CoV-2棘蛋白或其免疫原性片段之一或多種病毒載體、DNA載體(或DNA質體)或RNA疫苗可表現至少一種與SEQ ID NO: 1具有至少70%、至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更大一致性之來自SARS-CoV-2之棘蛋白，或其與該棘蛋白具有共同抗原交叉反應性之片段。較佳地，該一或多種病毒載體、DNA載體(或DNA質體)或RNA疫苗表現至少一種與SEQ ID NO: 1具有至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更大一致性之來自SARS-CoV-2之棘蛋白，或其與該棘蛋白具有共同抗原交叉反應性之片段。更佳地，該一或多種病毒載體、DNA載體(或DNA質體)或RNA疫苗表現至少一種與SEQ ID NO: 1具有至少98%、至少99%或更大一致性之來自SARS-CoV-2之棘蛋白，或其與該棘蛋白具有共同抗原交叉反應性之片段。該一或多種病毒載體、DNA載體(或DNA質體)或RNA疫苗可表現至少一種包含SEQ ID NO: 1或由SEQ ID NO: 1構成之來自SARS-CoV-2之棘蛋白，或其與該棘蛋白具有共同抗原交叉反應性之片段。在一些較佳實施例中，至少一種由本發明之載體表現之來自SARS-CoV-2之棘蛋白或其免疫原性片段係如本文定義之SARS-CoV-2棘蛋白之RBD，較佳其中該RBD與SEQ ID NO: 15具有至少90%一致性。

通常該一或多種病毒載體、DNA載體(或DNA質體)或RNA疫苗表現至少一種與SEQ ID NO: 1具有至少90%一致性之來自SARS-CoV-2之棘蛋白，或其與該棘蛋白具有共同抗原交叉反應性之片段，或其如本文描述之任何變體。一較佳片段係與SEQ ID NO: 15具有至少90%一致性之RBD。

本發明之流感-COVID-19組合疫苗中之表現至少一種SARS-CoV-2棘蛋白或其免疫原性片段之一或多種病毒載體、DNA載體(或DNA質體)或RNA疫苗可表現如本文定義之至少一種棘蛋白或其免疫原性片段，其進一步包含信號肽。通常該信號肽引導自受關注之宿主細胞(諸如欲治療之病患之細胞)分泌至少一種SARS-CoV-2棘蛋白或其片段。

本發明之流感-COVID-19組合疫苗中之表現至少一種SARS-CoV-2棘蛋白或其免疫原性片段之一或多種病毒載體、DNA載體(或DNA質體)或RNA疫苗可進一步表現一或多種另外抗原或其片段。該棘蛋白或其片段及一或多種另外抗原或其片段可表現為融合蛋白。或者，可使用表現SARS-CoV-2棘蛋白或其片段及一或多種另外抗原或其片段之不同載體。在此等情況下，該等不同之載體可組合使用，較佳同時使用。該一或多種另外抗原可為來自SARS-CoV-2之相同抗原或不同抗原或其片段。更佳地，該一或多種另外抗原係來自SARS-CoV-2之不同抗原，諸如來自2019-CoV蛋白衣、膜蛋白或包膜蛋白之抗原。

本發明之流感-COVID-19組合疫苗中之表現至少一種SARS-CoV-2棘蛋白或其免疫原性片段之一或多種病毒載體、DNA載體(或DNA質體)或RNA疫苗可包含如本文定義之任何一多種多核苷酸或表現構築體，或其任何組合。

一或多種載體可為病毒載體。此病毒載體可為腺病毒(人類血清型(諸如AdHu5)、猿猴血清型(諸如ChAd63、ChAdOX1或ChAdOX2)或另一形式)、腺相關病毒(AAV)或痘病毒載體(諸如經修飾之安卡拉牛痘病毒(MVA))或腺相關病毒(AAV)。ChAdOX1及ChAdOX2揭示於WO2012/172277中(該案以全文引用之方式併入本文中)。ChAdOX2係BAC衍生並經E4修飾之基於AdC68之病毒載體。較佳地，該一或多種病毒載體係AAV載體腺病毒。病毒載體之其他非限制性實例包括麻疹病毒載體、腮腺炎病毒載體、風疹病毒載體、水痘病毒載體、小兒麻痺病毒載體及黃熱病病毒載體。

病毒載體通常係非複製或複製受損之載體，此意謂該病毒載體無法在正常細胞(例如正常人類細胞)中複製至任何顯著程度，如藉由習知方式量測，例如經由量測DNA合成及/或病毒效價。非複製或複製受損之載體可變得如此天然(即其等已因此自自然分離)或人造(例如藉由活體外接種或藉由基因操作)。一般將存在至少一種其中可使複製受損之病毒載體生長之細胞類型，例如，經修飾之安卡拉牛痘病毒(MVA)可在CEF細胞中生長。以非限制性實例說明之，該載體可選自人類或猿猴腺病毒或痘病毒載體。

通常，一或多種病毒載體在人類個體中(通常在哺乳動物個體(諸如人類或其他靈長類動物)中)無法引起顯著感染。

一或多種載體可為DNA載體，諸如DNA質體。該一或多種載體可為RNA載體，諸如mRNA載體或自擴增RNA載體。一或多種本發明之DNA及/或RNA載體通常能夠於真核細胞，特別本文描述之任何宿主細胞，或欲治療之病患中表現。

通常DNA及/或RNA載體能夠於人類、大腸桿菌或酵母菌細胞中表現。

一或多種載體可為噬菌體載體，諸如如Hajitou等人，Cell 2006；125(2)，第385至398頁中描述之AAV/噬菌體雜交載體；該案係以引用之方式併入本文中。

本發明之核酸分子及載體可使用此項技術中已知的任何合適之方法製造。因此，該等核酸分子可使用化學合成技術製造。或者，本發明之核酸分子及載體可使用分子生物學技術製造。

本發明之載體可在電腦上設計，及然後藉由習知多核苷酸合成技術合成。

病毒樣顆粒在本發明之流感-COVID-19組合疫苗中，一或多種來源於SARS-CoV-2之抗原(例如至少一種SARS-CoV-2棘蛋白)或其免疫原性片段可包含於病毒樣顆粒(VLP)中。

病毒樣顆粒(VLP)係類似於病毒但不含有病毒核酸且因此係非傳染性之顆粒。病毒樣顆粒通常含有一或多種病毒蛋白衣或包膜蛋白，其等能夠自組裝以形成VLP。VLP已自各種病毒家族之組分產生(Noad及Roy (2003), Trends in Microbiology, 11:438-444；Grgacic等人，(2006), Methods, 40:60-65)。一些VLP已批准作為治療性疫苗，例如Engerix-B (用於B型肝炎)、Cervarix及Gardasil (用於人類乳頭狀瘤病毒)。

多種SARS-CoV-2抗原(特別一或多種SARS-CoV-2棘蛋白)可包含於VLP或其組合中。以非限制性實例說明之，該一或多種SARS-CoV-2抗原(特別一或多種SARS-CoV-2棘蛋白)可包含於單一VLP中，或該等SARS-CoV-2抗原(特別一或多種SARS-CoV-2棘蛋白)中之各者可包含於不同之VLP中。

因此，一或多種來源於SARS-CoV-2之抗原(例如至少一種SARS-CoV-2棘蛋白)或其免疫原性片段可包含於一或多種VLP中。

本發明之流感-COVID-19組合疫苗中之包含至少一種SARS-CoV-2棘蛋白或其免疫原性片段之一或多種VLP可包含一或多種與SEQ ID NO: 1具有至少70%、至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更大一致性之來自SARS-CoV-2之棘蛋白，或其與該棘蛋白具有共同抗原交叉反應性之片段。較佳地，該一或多種VLP包含一或多種與SEQ ID NO: 1具有至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更大一致性之來自SARS-CoV-2之棘蛋白，或其與該棘蛋白具有共同抗原交叉反應性之片段。更佳地，該一或多種VLP包含一或多種與SEQ ID NO: 1具有至少98%、至少99%或更大一致性之來自SARS-CoV-2之棘蛋白，或其與該棘蛋白具有共同抗原交叉反應性之片段。該一或多種VLP可包含至少一種包含SEQ ID NO: 1或由SEQ ID NO: 1構成之來自SARS-CoV-2之棘蛋白，或其與該棘蛋白具有共同抗原交叉反應性之片段。在一些較佳實施例中，包含於本發明之VLP中之SARS-CoV-2棘蛋白之免疫原性片段係如本文定義之SARS-CoV-2棘蛋白之RBD，較佳其中該RBD與SEQ ID NO: 15具有至少90%一致性。

通常該一或多種VLP包含至少一種與SEQ ID NO: 1具有至少90%一致性之來自SARS-CoV-2之棘蛋白，或其與該棘蛋白具有共同抗原交叉反應性之片段，或其如本文描述之任何變體。一較佳片段係與SEQ ID NO: 15具有至少90%一致性之RBD。

熟練技術人員將瞭解，VLP可經由病毒結構蛋白之個別表現合成，該等病毒結構蛋白然後可自組裝成病毒樣結構。來自不同病毒之結構蛋白衣蛋白之組合可用於產生重組VLP。另外，抗原或其免疫原性片段可融合至VLP之表面。以非限制性實例說明之，本發明之抗原或其免疫原性片段可使用SpyCatcher-SpyTag系統(如由Brune、Biswas、Howarth描述)偶合至VLP。

該一或多種VLP可包含一或多種另外蛋白抗原。該一或多種另外抗原可為來自SARS-CoV-2或其片段之相同抗原或不同抗原。更佳地，該一或多種另外抗原係來自SARS-CoV-2之不同抗原，諸如來自SARS-CoV-2蛋白衣、膜蛋白或包膜蛋白之抗原。

該一或多種VLP可包含至少一種如本文描述之融合蛋白。該一或多種VLP可包含SARS-CoV-2棘蛋白或其免疫原性片段與B型肝炎表面抗原(HBSAg)、人類乳頭狀瘤病毒(HPV) 18 L1蛋白、HPV 16 L1蛋白及/或E型肝炎P239(較佳B型肝炎表面抗原)之融合蛋白。

因此，該一或多種VLP可由多核苷酸編碼，該多核苷酸包含與SEQ ID NO: 3、5、6或8中之任一者具有至少70%、至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更大一致性之核酸序列或由其構成。較佳地，該一或多種VLP可由多核苷酸編碼，該多核苷酸包含與SEQ ID NO: 3、5、6或8中之任一者具有至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更大一致性之核酸序列或由其構成。更佳地，該一或多種VLP可由多核苷酸編碼，該多核苷酸包含與SEQ ID NO: 3、5、6或8中之任一者具有至少98%、至少99%或更大一致性之核酸序列或由其構成。該一或多種VLP可由多核苷酸編碼，該多核苷酸包含SEQ ID NO: 3、5、6或8中之任一者之核酸序列或由其構成。

本發明之VLP可由多核苷酸編碼，該多核苷酸包含與SEQ ID NO: 26、27、29、30或32中之任一者具有至少70%、至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更大一致性之核酸序列或由其構成。較佳地，本發明之VLP可由多核苷酸編碼，該多核苷酸包含與SEQ ID NO: 26、27、29、30或32中之任一者具有至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更大一致性之核酸序列或由其構成。更佳地，本發明之VLP可由多核苷酸編碼，該多核苷酸包含與SEQ ID NO: 26、27、29、30或32中之任一者具有至少98%、至少99%或更大一致性之核酸序列或由其構成。本發明之VLP可由多核苷酸編碼，該多核苷酸包含SEQ ID NO: 26、27、29、30或32中之任一者之核酸序列或由其構成。

該一或多種VLP可包含與SEQ ID NO: 9、10、11或12中之任一者具有至少70%、至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更大一致性之胺基酸序列或由其構成。較佳地，該VLP可包含與SEQ ID NO: 9、10、11或12中之任一者具有至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更大一致性之胺基酸序列或由其構成。更佳地，該一或多種VLP包含與SEQ ID NO: 9、10、11或12中之任一者具有至少98%、至少99%或更大一致性之胺基酸序列或由其構成。該VLP可包含SEQ ID NO: 9、10、11或12中之任一者之胺基酸序列或由其構成。

本發明之VLP可包含與SEQ ID NO: 28、31或33中之任一者具有至少70%、至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更大一致性之胺基酸序列或由其構成。較佳地，本發明之VLP可包含與SEQ ID NO: 28、31或33中之任一者具有至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更大一致性之胺基酸序列或由其構成。更佳地，本發明之VLP可包含與SEQ ID NO: 28、31或33中之任一者具有至少98%、至少99%或更大一致性之胺基酸序列或由其構成。本發明之VLP可包含SEQ ID NO: 28、31或33中之任一者之胺基酸序列或由其構成。

使用一或多種VLP可增加由SARS-CoV-2棘蛋白或免疫原性片段誘導之免疫保護反應之效用及/或可增加如本文定義之免疫保護反應之持續時間。

融合蛋白在本發明之流感-COVID-19組合疫苗中，一或多種來源於SARS-CoV-2之抗原(例如一或多種SARS-CoV-2棘蛋白)或其免疫原性片段可包含於融合蛋白中。

因此，一或多種來源於SARS-CoV-2之抗原(例如一或多種SARS-CoV-2棘蛋白)或其免疫原性片段可包含於一或多種融合蛋白中。

多種SARS-CoV-2抗原(特別一或多種SARS-CoV-2棘蛋白)可包含於融合蛋白或其組合中。以非限制性實例說明之，該一或多種SARS-CoV-2抗原(特別一或多種SARS-CoV-2棘蛋白)可包含於單一融合蛋白中，或該等SARS-CoV-2抗原(特別一或多種SARS-CoV-2棘蛋白)中之各者可包含於不同之融合蛋白中。

本發明之組合流感-COVID-19疫苗中之包含至少一種SARS-CoV-2棘蛋白或其免疫原性片段之一或多種融合蛋白可包含一或多種與SEQ ID NO: 1具有至少70%、至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更大一致性之來自SARS-CoV-2之棘蛋白，或其與該棘蛋白具有共同抗原交叉反應性之片段。較佳地，該一或多種融合蛋白包含一或多種與SEQ ID NO: 1具有至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更大一致性之來自SARS-CoV-2之棘蛋白，或其與該棘蛋白具有共同抗原交叉反應性之片段。更佳地，該一或多種融合蛋白包含一或多種與SEQ ID NO: 1具有至少98%、至少99%或更大一致性之來自SARS-CoV-2之棘蛋白，或其與該棘蛋白具有共同抗原交叉反應性之片段。該一或多種融合蛋白可包含至少一種包含SEQ ID NO: 1或由SEQ ID NO: 1構成之來自SARS-CoV-2之棘蛋白，或其與該棘蛋白具有共同抗原交叉反應性之片段。

通常該一或多種融合蛋白包含至少一種與SEQ ID NO: 1具有至少90%一致性之來自SARS-CoV-2之棘蛋白，或其與該棘蛋白具有共同抗原交叉反應性之片段，或其如本文描述之任何變體。

在一些較佳實施例中，包含於本發明之融合蛋白中之SARS-CoV-2棘蛋白之免疫原性片段係如本文定義之SARS-CoV-2棘蛋白之RBD，較佳其中該RBD與SEQ ID NO: 15具有至少90%一致性。

本發明之融合蛋白通常亦包含非SARS-CoV-2域或元件，通常非SARS-CoV-2蛋白、多肽或肽域或元件。

該一或多種融合蛋白可包含至少一種SARS-CoV-2棘蛋白或其免疫原性片段及以下中之一或多種：B型肝炎表面抗原(HBSAg)；人類乳頭狀瘤病毒(HPV) 18 L1蛋白；HPV 16 L1蛋白；及/或E型肝炎P239，較佳B型肝炎表面抗原。

該一或多種融合蛋白可由多核苷酸編碼，該多核苷酸包含與SEQ ID NO: 3、5、6或8中之任一者具有至少70%、至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更大一致性之核酸序列或由其構成。較佳地，該一或多種融合蛋白可由多核苷酸編碼，該多核苷酸包含與SEQ ID NO: 3、5、6或8中之任一者具有至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更大一致性之核酸序列或由其構成。更佳地，該一或多種融合蛋白可由多核苷酸編碼，該多核苷酸包含與SEQ ID NO: 3、5、6或8中之任一者具有至少98%、至少99%或更大一致性之核酸序列或由其構成。該一或多種融合蛋白可由多核苷酸編碼，該多核苷酸包含SEQ ID NO: 3、5、6或8中之任一者之核酸序列或由其構成。

本發明之融合蛋白可由多核苷酸編碼，該多核苷酸包含與SEQ ID NO: 26、27、29、30或32中之任一者具有至少70%、至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更大一致性之核酸序列或由其構成。較佳地，本發明之融合蛋白可由多核苷酸編碼，該多核苷酸包含與SEQ ID NO: 26、27、29、30或32中之任一者具有至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更大一致性之核酸序列或由其構成。更佳地，本發明之融合蛋白可由多核苷酸編碼，該多核苷酸包含與SEQ ID NO: 26、27、29、30或32中之任一者具有至少98%、至少99%或更大一致性之核酸序列或由其構成。本發明之融合蛋白可由多核苷酸編碼，該多核苷酸包含SEQ ID NO: 26、27、29、30或32中之任一者之核酸序列或由其構成。

該一或多種融合蛋白可包含與SEQ ID NO: 9、10、11或12中之任一者具有至少70%、至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更大一致性之胺基酸序列或由其構成。較佳地，該一或多種融合蛋白可包含與SEQ ID NO: 9、10、11或12中之任一者具有至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更大一致性之胺基酸序列或由其構成。更佳地，該一或多種融合蛋白可包含與SEQ ID NO: 9、10、11或12中之任一者具有至少98%、至少99%或更大一致性之胺基酸序列或由其構成。該一或多種融合蛋白可包含SEQ ID NO: 9、10、11或12中之任一者之胺基酸序列或由其構成。

本發明之融合蛋白可包含與SEQ ID NO: 28、31或33中之任一者具有至少70%、至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更大一致性之胺基酸序列之或由其構成。較佳地，本發明之融合蛋白可包含與SEQ ID NO: 28、31或33中之任一者具有至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更大一致性之胺基酸序列或由其構成。更佳地，本發明之融合蛋白可包含與SEQ ID NO: 28、31或33中之任一者具有至少98%、至少99%或更大一致性之胺基酸序列或由其構成。本發明之融合蛋白可包含SEQ ID NO: 28、31或33中之任一者之胺基酸序列或由其構成。

該一或多種融合蛋白可較佳採取VLP之形式。不受理論之束縛，此係因為已知當重組表現時，HPSAg、HPV 18 L1蛋白、HPB 16 L1蛋白及E型肝炎P239蛋白自發形成VLP，且當HPSAg、HPV 18 L1蛋白、HPB 16 L1蛋白及/或E型肝炎P239蛋白以與本發明之SARS-CoV-2棘蛋白(或其免疫原性片段)組合之融合蛋白形式存在時，保留此結構。

本發明之融合蛋白可包含連接子(本文中亦可互換稱為連接子肽、間隔子或間隔肽)。連接子可用於連接本發明之融合蛋白之兩個或更多個功能域。通常，在存在連接子之情況下，其用於將融合蛋白之SARS-CoV-2棘蛋白或其免疫原性片段域連接至該融合蛋白之非SARS-CoV-2棘蛋白域。在融合蛋白中使用連接子為此項技術中的慣例，且任何習知連接子蛋白均可用於本發明之融合蛋白中，條件為所得融合蛋白保留該SARS-CoV-2棘蛋白或其免疫原性片段之所需功能性質及非2 SARS-CoV-2棘蛋白域之所需功能性質。

連接子可為多達約30個胺基酸，諸如約5至30個胺基酸、約5至25個胺基酸、約5至20個胺基酸、約10至20個胺基酸、約5至15個胺基酸或約10至15個胺基酸長度之短肽。在一些實施例中，該連接子係約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19或約20個胺基酸長度。

在一些實施例中，剛性連接子可用於本發明之融合蛋白中。當必須在融合蛋白之不同域/部分之間保持固定距離並維持其等獨立功能時，習知使用剛性連接子。當融合蛋白域之空間分離對保持該等融合蛋白之穩定性或生物活性而言至關重要時，亦可使用剛性連接子。具有A(EAAAK)_n A (n = 2至5) (SEQ ID NO: 16)序列之經驗剛性連接子顯示α-螺旋構象，該構象由Glu⁻ -Lys⁺ 鹽橋穩定。剛性連接子之非限制性實例係EAAAKEAAAKEAAAK (亦稱為(EAAAK)₃ ，SEQ ID NO: 18)，其可由該核酸序列(SEQ ID NO: 17)編碼。剛性連接子可較佳用於本發明之融合蛋白於哺乳動物細胞(諸如HEK 293細胞)中之表現。

在一些實施例中，可撓性連接子可用於本發明之融合蛋白中。當連接域需一定程度之移動或相互作用時，習知使用可撓性連接子。可撓性連接子通常包含諸如以下之小胺基酸殘基或由其構成：甘胺酸、蘇胺酸、精胺酸、絲胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、丙胺酸、天冬胺酸、脯胺酸、麩胺酸、離胺酸、白胺酸及/或纈胺酸，特別甘胺酸、絲胺酸、丙胺酸、白胺酸及/或纈胺酸。包含甘胺酸、絲胺酸及/或丙胺酸或由其構成之可撓性連接子較佳，其中以甘胺酸及絲胺酸特別佳。因此，最常用之可撓性連接子具有主要由Gly及Ser殘基之延伸(「GS」連接子)構成之序列，其等包含(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)_n (SEQ ID NO: 19)序列。GS連接子之非限制性實例包括GS5或(GGGGS)₁ (SEQ ID NO: 20)；GS10或(GGGGS)₂ (SEQ ID NO: 21)；GS15或(GGGGS)₃ (SEQ ID NO: 23)；GS20或(GGGGS)₄ (SEQ ID NO: 24)；及GS25或(GGGGS)₅ (SEQ ID NO: 25)。較佳地，可使用GS15，其可由(SEQ ID NO: 22)編碼。可撓性連接子可較佳用於本發明之融合蛋白於細菌細胞(諸如大腸桿菌細胞)中之表現。

任何適當之連接子(諸如本文描述之例示性連接子)可與本發明之任何融合蛋白(包含任何SARS-CoV-2棘蛋白或免疫原性片段域及任何非SARS-CoV-2棘蛋白域)一起使用。以非限制性實例說明之，本發明之融合蛋白可包含HBSAg-(EAAAK)₃ -RBD (SEQ ID NO: 28)或與其具有至少90%序列一致性之變體，或由HBSAg-(EAAAK)₃ -RBD (SEQ ID NO: 28)或與其具有至少90%序列一致性之變體構成，HBSAg-(EAAAK)₃ -RBD可由(SEQ ID NO: 26或27)或與其具有至少90%序列一致性之變體編碼。以另一非限制性實例說明之，本發明之融合蛋白可包含HBSAg-(EAAAK)₃ -全長2019-nCoV棘蛋白(SEQ ID NO: 33)或與其具有至少90%序列一致性之變體，或由HBSAg-(EAAAK)₃ -全長2019-nCoV棘蛋白(SEQ ID NO: 33)或與其具有至少90%序列一致性之變體構成，HBSAg-(EAAAK)₃ -全長2019-nCoV棘蛋白可由SEQ ID NO: 32或與其具有至少90%序列一致性之變體編碼。以另一非限制性實例說明之，本發明之融合蛋白可包含HEV-GS15-RBD (SEQ ID NO: 31)或與其具有至少90%序列一致性之變體，或由HEV-GS15-RBD (SEQ ID NO: 31)或與其具有至少90%序列一致性之變體構成，HEV-GS15-RBD可由(SEQ ID NO: 29或30)或與其具有至少90%序列一致性之變體編碼。

融合蛋白可較佳採取VLP之形式。不受理論之束縛，此係因為已知當重組表現時，HBSAg、HPV 18 L1蛋白、HPB 16 L1蛋白及E型肝炎P239蛋白自發形成VLP，且當HBSAg、HPV 18 L1蛋白、HPB 16 L1蛋白及/或E型肝炎P239蛋白以與本發明之SARS-CoV-2棘蛋白(或其免疫原性片段)之組合之融合蛋白形式存在時，保留此結構。

流感血球凝集素(HA)及神經胺糖酸酶(NA)抗原本發明之流感-COVID-19組合疫苗包含流感血球凝集素(HA)或其免疫原性片段。視需要，本發明之流感-COVID-19組合疫苗可進一步包含流感神經胺糖酸酶(NA)或其免疫原性片段。

HA之免疫原性片段與衍生其之HA具有共同抗原交叉反應性。同樣地，NA之免疫原性片段與衍生其之NA具有共同抗原交叉反應性。

流感HA或其免疫原性片段(及視需要流感NA或其免疫原性片段)可以任何適當之形式存在於流感-COVID-19組合疫苗中。

流感HA或其免疫原性片段及/或流感NA或其免疫原性片段將通常自流感病毒體製備，但作為一替代，此等抗原可以其他形式提供，諸如多核苷酸、病毒載體、DNA載體(或DNA質體)或RNA疫苗、VLP及融合蛋白。

本文有關多核苷酸、病毒載體、DNA載體(或DNA質體)或RNA疫苗、VLP及融合蛋白之一般揭示內容亦適用於如本文描述之流感HA或其免疫原性片段及流感NA或其免疫原性片段。在來源於SARS-Cov-2之抗原(例如SARS-CoV-2棘蛋白)之內文中，本文有關多核苷酸、病毒載體、DNA載體(或DNA質體)或RNA疫苗、VLP及融合蛋白之任何一般揭示內容同樣且無限制地適用於如本文描述之流感HA或其免疫原性片段及流感NA或其免疫原性片段。

如本文描述，(a)流感HA或其免疫原性片段可(i)包含於不活化流感病毒體中；(ii)重組HA或其免疫原性片段；(iii)包含HA或其免疫原性片段之融合蛋白；或(iv)由RNA或DNA疫苗編碼。

如本文描述，(a)流感NA或其免疫原性片段可(i)包含於不活化流感病毒體中；(ii)重組NA或其免疫原性片段；(iii)包含NA或其免疫原性片段之融合蛋白；或(iv)由RNA或DNA疫苗編碼。

流感HA或其免疫原性片段及/或流感NA或其免疫原性片段可採取現存流感疫苗之形式。該流感HA或其免疫原性片段及/或該流感NA或其免疫原性片段可採取活(減毒或載體)疫苗、不活化疫苗或次單元疫苗之形式。不活化流感疫苗包括不活化完整病毒體疫苗及不活化分裂病毒體疫苗兩者，較佳為完整病毒體不活化疫苗。分裂病毒體係藉由用清潔劑(例如乙醚、聚山梨酯80、脫氧膽酸鹽、磷酸三正丁酯、Triton X-100、Triton N101、溴化鯨蠟基三甲基銨、Tergitol NP9等)處理病毒體以產生子病毒體製劑而獲得。分裂流感病毒之方法為此項技術中熟知。

不活化疫苗可藉由任何適當之方式產生。用於去活化流感病毒體之習知方式包括用有效量之下列藥劑中之一或多者處理：清潔劑、甲醛、福爾馬林、β-丙內酯或UV光。用於去活化之另外化學方式包括用亞甲藍、補骨脂素、羧基富勒烯(C60)或其任何組合處理。病毒去活化其他方法為此項技術中已知，諸如，例如二乙胺、乙醯乙亞胺或γ照射。

本發明之流感-COVID-19組合疫苗可包含任何流感疫苗或使用其產生，包括任何市售流感疫苗、通用流感疫苗及/或大流行流感疫苗。

通常用於疫苗中之流感病毒株隨季節改變。在當前流感大流行期間，疫苗通常包括兩種A型流感毒株(H1N1及H3N2)及一種B型流感毒株(B/科羅拉多/06/2017樣(維多利亞譜系)病毒)，及對抗季節性流感之三價疫苗(季節性三價流感疫苗)係典型的。對抗季節性流感之四價疫苗(季節性四價流感疫苗)亦係常見用法。當前該等季節性四價流感疫苗包括與季節性三價流感疫苗相同之毒株，及包括另外B型流感毒株(B/普吉島/3073/2013樣病毒(山形譜系))。任何季節性流感疫苗(包括季節性三價及四價流感疫苗)可包含於本發明之流感-COVID-19組合疫苗中或用於產生本發明之流感-COVID-19組合疫苗。在疾病控制及預防中心(CDC) (此處提供CDC 2019-2020列表：https://www.cdc.gov/flu/professionals/acip/summary/summary-recommendations.htm#composition)及歐洲藥品管理局(EMA)網站上鑑定經監管機構批准之季節性流感疫苗。

或者，大流行流感疫苗可包含於本發明之流感-COVID-19組合疫苗中或用於產生本發明之流感-COVID-19組合疫苗。大流行流感疫苗係針對大流行流感毒株產生，該等毒株係疫苗受體及一般人類群體在免疫學上未感染之毒株，諸如H2、H5、H7或H9子類型毒株(特定言之A型流感病毒之毒株)。大流行流感病毒株通常出現在非人類物種中，然後跨越物種屏障至人類。最近潛在大流行流感毒株之實例係基因型4 (G4)歐亞禽樣(EA) H1N1豬流感毒株。本發明之流感-COVID-19組合疫苗可包含關於此等跨物種大流行毒株(諸如G4 EA H1N1)之流感組分。大流行流感疫苗可為單價或可基於三價疫苗，由大流行毒株補充。單價大流行流感疫苗可較佳。

通用流感疫苗可包含於本發明之流感-COVID-19組合疫苗中或用於產生本發明之流感-COVID-19組合疫苗。處於開發中之通用流感疫苗之實例包括次單元疫苗及包含引發DNA疫苗及活載體疫苗之兩階段疫苗。

取決於季節及疫苗中所包括之HA及/或NA之性質，本發明之流感-COVID-19組合疫苗之流感組分可保護對抗A型流感病毒血球凝集素子類型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15或H16中之一或多者。本發明可保護對抗A型流感病毒NA子類型N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8或N9中之一或多者。

本發明之流感-COVID-19組合疫苗之流感組分可包括來自一或多種(例如1、2、3、4或更多種)流感毒株(包括A型流感病毒及/或B型流感病毒)之HA及/或NA (或其免疫原性片段)。

用作形成流感-COVID-19組合疫苗之流感組分之流感HA及/或NA或流感疫苗之來源之病毒可在雞蛋上或在細胞培養物上生長。流感病毒生長之當前標準方法使用無特異性病原體(SPF)胚化雞蛋，其中病毒自雞蛋內容物(尿囊液)純化。然而，最近，病毒已在動物細胞培養物中生長，且出於速度及病患過敏之原因，此生長方法較佳。若使用基於雞蛋之病毒生長，則可將一或多種胺基酸連同病毒一起引入雞蛋之尿囊液內。當使用細胞培養物時，病毒生長受質將通常係哺乳動物來源之細胞系。合適之哺乳動物來源細胞包括(但不限於)倉鼠、牛、靈長類動物(包括人類及猴)及狗細胞。可使用各種細胞類型，諸如腎細胞、纖維母細胞、視網膜細胞、肺細胞等。合適之細胞系包括(但不限於)：MDCK；CHO；293T；BHK；Vero；MRC-5；PER.C6；WI-38等。用於生長流感病毒之較佳哺乳動物細胞系包括：可(例如)自美國典型細胞培養(ATCC)收藏以CCL-34獲得之來源於麥丁那美犬腎之MDCK細胞。亦可使用MDCK細胞系之衍生物。

當病毒已在哺乳動物細胞系上生長時，該組合物將有利地不含卵蛋白質(例如卵清蛋白及卵類黏蛋白)及雞DNA，藉此降低致敏性。

組合物及治療適應症如本文描述，發明人已證實，包含SARS-CoV-2抗原(特別SARS-CoV-2棘蛋白)之疫苗組合物可與流感病毒疫苗成功組合，以產生對SARS-CoV-2及流感兩者之穩健抗體反應。因此，本發明已意外證實，可產生流感-COVID-19組合疫苗及無生產組合疫苗產品中常見之疫苗組分抑制之預期問題。

因此，本發明提供如本文描述之流感-COVID-19組合疫苗。本發明提供包含以下之組合物：(i)流感HA抗原或其免疫原性片段；(ii)一或多種來源於SARS-CoV-2之抗原(特別至少一種SARS-CoV-2棘蛋白)或其免疫原性片段；及視需要(iii)流感NA抗原或其免疫原性片段；其中該組合物能夠誘導對抗SARS-CoV-2 (特別針對SARS-CoV-2棘蛋白)及流感(特別流感HA及視需要NA)之免疫反應。本發明亦提供此組合物作為疫苗之用途。

本發明亦提供包含以下之疫苗組合物：(i)流感HA抗原或其免疫原性片段；(iii)一或多種來源於SARS-CoV-2之抗原(特別至少一種SARS-CoV-2棘蛋白)或其免疫原性片段；及視需要(iii)流感NA抗原或其免疫原性片段。該疫苗組合物可視需要包含醫藥上可接受之賦形劑、稀釋劑、載劑、推進劑、鹽及/或添加劑。

如本文描述，疫苗組合物可包含至少兩種來源於根據本發明之SARS-CoV-2或其免疫原性片段之不同抗原，及/或至少兩種編碼至少兩種來源於SARS-CoV-2或免疫原性片段之不同抗原之不同多核苷酸分子。以非限制性實例說明之，該疫苗組合物可包含編碼SARS-CoV-2棘蛋白之多核苷酸及編碼SARS-CoV-2膜蛋白之多核苷酸。

如本文描述，疫苗組合物可包含至少兩種來源於根據本發明之流感或其免疫原性片段之不同抗原，及/或至少兩種編碼至少兩種來源於流感或免疫原性片段之不同抗原之不同多核苷酸分子。通常該疫苗組合物包含流感HA抗原或其免疫原性片段及視需要流感NA抗原或其免疫原性片段。由於本發明之流感-COVID-19組合疫苗之流感組分通常由包含完整或分裂流感病毒體之活(減毒或載體)或不活化流感疫苗提供，因此亦可包括其他流感抗原。

本發明亦提供使用本發明之流感-COVID-19組合疫苗或組合物(如上文描述)在病患中刺激或誘導免疫反應之方法。本發明之疫苗及組合物通常刺激或誘導對抗流感及COVID-19兩者之免疫反應及/或保護。

在個體中刺激或誘導免疫反應之該方法可包括對個體投與本發明之流感-COVID-19組合疫苗或組合物(如上文描述)。

在治療用途及方法之內文中，「個體」係將自刺激或誘導對抗SARS-CoV-2及流感之免疫保護反應獲益之任何動物個體。典型動物個體係哺乳動物，諸如靈長類動物(例如，人類)。

因此，本發明提供一種用於治療或預防SARS-CoV-2感染(COVID-19)及流感感染之方法。該方法通常包括向有需要個體投與本發明之流感-COVID-19組合疫苗或組合物。

本發明亦提供本發明之流感-COVID-19組合疫苗或組合物，其用於預防或治療SARS-CoV-2感染。

本發明亦提供(i)表現一或多種SARS-CoV-2棘蛋白或其免疫原性片段之一或多種多核苷酸、表現構築體、病毒載體、DNA質體或RNA疫苗、或一或多種SARS-CoV-2棘蛋白或其免疫原性片段、本發明之一或多種SARS-CoV-2疫苗組合物；及(ii)流感HA或其免疫原性片段(及視需要流感NA或其免疫原性片段)，較佳包含於如本文描述之流感疫苗中，於製造用於預防或治療SARS-CoV-2感染及流感感染之藥劑中之用途。

如本文使用，術語「治療(treatment)」或「治療(treating)」包含治療性或預防/預防性措施，且包括SARS-CoV-2感染及流感感染之感染後療法及改善。術語「療法」及「治療性」包含預防性療法。

如本文使用，術語「預防」包括預防由SARS-CoV-2及流感開始之感染及/或降低由SARS-CoV-2及流感感染之嚴重程度或強度。術語「預防」包括誘導或提供對抗由SARS-CoV-2引起之感染及流感感染之保護性免疫力。對由SARS-CoV-2引起之感染及流感感染之免疫力可使用任何適當之技術(其等實例為此項技術中已知)定量。

本發明之較佳組合物滿足效用之CPMP標準中之1、2或3者。在成人(18至60歲)中，此等標準係：(1) ≥70%血清保護；(2) ≥40%血清轉化；及/或(3) ≥2.5倍之GMT增加。在老年人(＞60歲)中，此等標準係：(1) ≥60%血清保護；(2) ≥30%血清轉化；及/或(3) ≥2倍之GMT增加。

此等標準係基於具有至少50個病患之開放標籤研究。

可對已患有SARS-CoV-2感染及/或流感感染、與由SARS-CoV-2引起之感染及/或流感感染相關聯之病症或症狀之個體(通常哺乳動物個體，諸如人類或其他靈長類動物)投與如本文定義之本發明之流感-COVID-19組合疫苗或組合物，以治療或預防由SARS-CoV-2及或流感引起之感染。例如，該個體可疑似已與SARS-CoV-2或流感接觸，或已知與SARS-CoV-2或流感接觸，但尚未顯示曝露之症狀。

當對已患有SARS-CoV-2感染及/或流感感染，或顯示與SARS-CoV-2感染及/或流感感染相關聯之症狀之個體(例如哺乳動物，諸如人類或其他靈長類動物)投與時，如本文定義之本發明之流感-COVID-19組合疫苗或組合物可治癒、延遲、降低一或多種症狀之嚴重程度或減輕一或多種症狀，及/或延長個體之存活使其超過在缺乏此治療之情況下預期之存活。

或者，可對最終可感染SARS-CoV-2及/或流感之個體(例如哺乳動物諸如人類或其他靈長類動物)投與如本文定義之本發明之流感-COVID-19組合疫苗或組合物，以預防、治癒、延遲、降低該SARS-CoV-2感染及/或流感之一或多種症狀之嚴重程度，或減輕該SARS-CoV-2感染及/或流感之一或多種症狀，或以延長個體之存活使其超過在缺乏此治療之情況下預期之存活，或幫助防止該個體傳播SARS-CoV-2感染及/或流感感染。

本發明之治療及預防療法適用於各種不同年齡之不同個體。在人類之情境中，該等療法適用於兒童(例如嬰兒、5歲以下之兒童、較大兒童或青少年)及成人。在其他動物個體(例如哺乳動物，諸如靈長類動物)之情境中，該等療法適用於不成熟個體及成熟/成年個體。如本文使用，術語「預防」包括預防SARS-CoV-2感染及/或流感感染之開始；及/或降低SARS-CoV-2感染及/或流感感染之嚴重程度或強度。術語「預防」包括誘導或提供對抗SARS-CoV-2感染及/或流感感染之保護性免疫力。對SARS-CoV-2感染及/或流感感染之免疫力可使用任何適當之技術(其等實例為此項技術中已知)定量。

如本文使用，「疫苗」係當對動物個體諸如哺乳動物(例如人類或其他靈長類動物)投與時，刺激對抗SARS-CoV-2感染及/或流感感染之保護性免疫反應之調配物。該免疫反應可為由體液及/或細胞介導之免疫反應。可使用本發明之疫苗(例如)以保護個體免受SARS-CoV-2感染及/或流感感染之影響。

如本文描述，迄今為止可獲得之證據指示，SARS-CoV-2感染後之免疫力可為相對短暫的。因此，本發明提供藉由定期重複投與COVID-19/SARS-CoV-2疫苗(特定言之本發明之流感-COVID-19組合疫苗)增加對SARS-CoV-2感染之免疫力之方法。此重複投與可使用或整合至季節性流感疫苗接種之現存公共衛生計劃/時間表內。

因此，本發明提供本發明之流感-COVID-19組合疫苗，其用於治療及/或預防COVID-19及流感，其中該組合疫苗係用於以約六個月、約七個月、約八個月、約九個月、約十個月、約11個月、約12個月、約13個月、約14個月或約15個月之間隔投與。較佳地，該組合疫苗係用於以約11個月、約12個月、約13個月，最佳約12個月之間隔投與。本發明亦提供一種使個體針對流感及COVID-19兩者免疫之方法，其包括以此等相同間隔對該個體投與治療有效量之本發明之流感-COVID-19組合疫苗。本發明亦提供流感HA或其免疫原性片段；來源於SARS-CoV-2之抗原或其免疫原性片段，及視需要流感NA或其免疫原性片段，於製造用於治療及/或預防COVID-19及流感之藥劑中之用途，其中該藥劑係用於以此等相同間隔投與。

組合疫苗可以如本文描述之間隔投與至少兩次、至少五次、至少十次、至少15次、至少20次或更多次。

組合疫苗可以如本文描述之間隔投與至少兩年、至少五年、至少十年或以上、長達病患之一生之持續時間。

醫藥組合物及調配物術語「疫苗」在本文中可與術語「治療性/預防性組合物」、「調配物」或「藥劑」互換使用。

除醫藥上可接受之載劑外，本發明之疫苗(如上文定義)可組合或投與。或者或另外，本發明之疫苗可與鹽、賦形劑、稀釋劑、佐劑、免疫調節劑及/或抗菌化合物中之一或多者進一步組合。

醫藥上可接受之鹽包括與無機酸(諸如，例如，鹽酸或磷酸)，或與有機酸(諸如乙酸、草酸、酒石酸、馬來酸，及類似物)形成之酸加成鹽。與游離羧基形成之鹽亦可來源於無機鹼(諸如，例如，氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵)及有機鹼(諸如異丙胺、三甲胺、2-乙胺基乙醇、組胺酸、普魯卡因，及類似物)。

免疫原性組合物、治療性調配物、藥劑及預防性調配物(例如疫苗)之投與係通常藉由習知途徑，例如靜脈內、皮下、腹膜內或經黏膜(特別經鼻)途徑。該投與可藉由非經腸注射，例如，皮下、皮內或肌內注射。

因此，本發明之免疫原性組合物、治療性調配物、藥劑及預防性調配物(例如疫苗)係通常製備成可注射劑，呈液體溶液或懸浮液。或者可製備適用於在注射前溶解或懸浮於液體中之固體形式。亦可將製劑乳化，或將肽囊封於脂質體或微膠囊中。

活性免疫原性成分(諸如如本文描述之SARS-CoV-2棘蛋白、其片段、編碼該等棘蛋白之核酸、表現載體、病毒載體、DNA質體、RNA疫苗、融合蛋白及疫苗組合物及流感HA及/或NA抗原或流感疫苗)通常與載劑、稀釋劑、賦形劑或醫藥上可接受且可與該活性成分相容之類似物混合。合適之賦形劑係(例如)水、生理鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇，或類似物及其組合。另外，視需要，該疫苗可含有少量輔助物質，諸如潤濕劑或乳化劑、pH緩衝劑及/或增強該疫苗有效性之佐劑。

一般而言，載劑、稀釋劑、賦形劑或類似物係醫藥上可接受之載劑。醫藥上可接受之載劑之非限制性實例包括水、生理鹽水及磷酸鹽緩衝鹽水。然而，在一些實施例中，該組合物係呈凍乾形式，在此情況下，該組合物可包括穩定劑(諸如BSA)。在一些實施例中，可需要以防腐劑(諸如硫柳汞或疊氮化鈉)調配該組合物，以促進長期儲存。

緩衝劑之實例包括(但不限於)琥珀酸鈉(pH 6.5)及磷酸鹽緩衝鹽水(PBS；pH 6.5及7.5)。

適用於其他投與模式之另外調配物包括栓劑，及在一些情況下，經口調配物或適用於呈氣溶膠分配之調配物。對於栓劑，傳統黏合劑及載劑可包括(例如)聚烷二醇或甘油三酯；此等栓劑可自含有在0.5%至10%，較佳1%至2%之範圍內之活性成分之混合物形成。

經口調配物包括此等通常採用之賦形劑，例如，醫藥級甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂，及類似物。此等組合物可採取溶液、懸浮液、錠劑、丸劑、膠囊、緩釋調配物或粉末之形式。

佐劑儘管習知流感疫苗不包含佐劑，但本發明之流感-COVID-19組合疫苗可進一步包含佐劑。該佐劑可為細胞(Th1)及/或體液(Th2)免疫反應之刺激物。

可有效之另外佐劑之實例包括(但不限於)：完全弗氏佐劑(CFA)、不完全弗氏佐劑(IFA)、皂甙、皂甙之純化提取物溶離份(諸如Quil A)、皂甙之衍生物(諸如QS-21)、基於皂甙之脂質顆粒(諸如ISCOM/ISCOMATRIX)、大腸桿菌熱不穩定毒素(LT)突變體(諸如LTK63及/或LTK72)、氫氧化鋁、N-乙醯基-胞壁醯基-L-蘇胺醯基-D-異麩醯胺酸(thr-MDP)、N-乙醯基-降-胞壁醯基-L-丙胺醯基-D-異麩醯胺酸(CGP 11637，稱為降-MDP)、N-乙醯基胞壁醯基-L-丙胺醯基-D-異麩醯胺醯基-L-丙胺酸-2-(1'-2'-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-羥基磷醯氧基)-乙胺(CGP 19835A，稱為MTP-PE)、及RIBI (其含有自細菌提取之三種組分 (單磷醯脂質A、海藻糖二黴菌酸酯及細胞壁骨架(MPL+TDM+CWS))於2%鯊烯/吐溫80乳液中)、由諾華公司開發之MF59調配物，及由GSK Biologicals (Rixensart, Belgium)開發之AS02、AS01、AS03及AS04佐劑調配物。通常存在於本發明之流感-COVID-19組合疫苗中之佐劑可選自鯊烯水包油乳液、鋁鹽及單磷醯脂質A (MPL)。特別佳之佐劑包括Addavax®、5%鯊烯(MF59)、MPL及氫氧化鋁及磷酸鋁凝膠。

套組本發明提供包含本發明之流感-COVID-19組合疫苗，視需要具有使用說明之套組。任何佐劑可與組合疫苗分開包含於套組內或可與組合疫苗組合。套組中之組合疫苗可隨時使用(例如包括佐劑)，或可在遞送時隨時臨時製備(例如以併入佐劑)。此臨時安排容許分開保存佐劑及抗原直至使用時，此在使用水包油乳劑佐劑之情況下特別有用。

本發明亦提供包含組合疫苗之SARS-CoV-2組分及該組合疫苗之流感組分之部件套組。該等兩種組分可於該套組內分開。任何佐劑均可單獨包含於該套組內或可與該SARS-CoV-2組分或該流感組分組合。在此等情況下，該等組分可在對病患投與前混合，或該等組分可保持分開，但大體上相同時間或同時對病患投與。

本發明亦提供包含組合疫苗之SARS-CoV-2組分及佐劑，較佳鯊烯水包油乳液、鋁鹽或MPL，更佳Addavax®、MF59、MPL或氫氧化鋁及磷酸鋁凝膠之部件套組。視需要該部件套組可包括關於將該SARS-CoV-2組分及佐劑與現存流感疫苗(本文描述其等實例)組合並將該組合流感-COVID-19疫苗作為單一單元投與，或與該流感疫苗大體上相同時間或同時對病患投與該混合SARS-CoV-2及佐劑之說明書。

套組中之SARS-CoV-2組分及/或流感組分可隨時使用，或可在遞送時隨時臨時製備。此臨時安排容許分開保存佐劑及SARS-CoV-2及/或流感組分直至使用時，此在使用水包油乳劑佐劑之情況下特別有用。

在臨時製備疫苗之情況下，其組分於套組內彼此物理分開，且此分離可以各種方法達成。例如，該等兩種組分可含於兩個獨立容器(諸如小瓶)中。然後可(例如)藉由移除一個小瓶之內容物並將其等添加至另一小瓶，或藉由分別移除兩個小瓶之內容物並將其等混合於第三個容器中，混合該等兩個小瓶之內容物。以非限制性實例說明之，該等套組組件中之一者係含於注射器中及另一者係含於容器(諸如小瓶)中。可使用該注射器(例如具有針頭)以將其內容物添加至第二個容器內以混合，且然後該混合物可抽出至該注射器內。該注射器之混合內容物可然後通常通過新無菌針對病患投與。將一種組分包裝於注射器中消除對使用獨立注射器用於病患投與之需求。以另一非限制性實例說明之，使疫苗之兩種組分保持在一起但分別在相同注射器(例如雙腔注射器)中。當致動該注射器時(例如在對病患投與期間)，則該等兩個室之內容物混合。此安排避免在使用時需單獨混合步驟。

在臨時製備疫苗之情況下(藉由混合組合疫苗與佐劑，或藉由混合SARS-CoV-2組分及流感組分，視需要與佐劑)，其組分將一般呈水性形式。在一些安排中，組分(通常組合疫苗或該疫苗之SARS-CoV-2組分及/或流感組分，而非佐劑組分)係呈乾燥形式(例如呈凍乾形式)，其中其他組分中之一或多者係呈水性形式。該等組分可混合以再活化乾燥組分並產生水性組合物用於對病患投與。

序列同源性可使用各種序列比對方法中之任一者以測定一致性百分比，包括(但不限於)全域方法、局部方法及雜交方法，諸如，例如，分段逼近法。測定一致性百分比之方案係熟習此項技術者之範圍內之例行性程序。全域方法自分子之開始至末端比對序列並藉由將個別殘基對之分數相加並藉由施加間隙罰分確定最佳比對。非限制性方法包括(例如) CLUSTAL W，參見例如Julie D. Thompson等人，CLUSTAL W: Improving the Sensitivity of Progressive Multiple Sequence Alignment Through Sequence Weighting, Position-Specific Gap Penalties and Weight Matrix Choice, 22 (22) Nucleic Acids Research 4673-4680 (1994)；及迭代優化，參見例如Osamu Gotoh, Significant Improvement in Accuracy of Multiple Protein. Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessed by Reference to Structural Alignments, 264(4) J. Mol. Biol. 823-838 (1996)。局部方法藉由鑑別一或多種所有輸入序列共用之保守結構組元比對序列。非限制性方法包括(例如)匹配箱(Match-box)，參見例如Eric Depiereux及Ernest Feytmans, Match-Box: A Fundamentally New Algorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences, 8(5) CABIOS 501-509 (1992)；Gibbs取樣，參見例如C. E. Lawrence等人，Detecting Subtle Sequence Signals: A Gibbs Sampling Strategy for Multiple Alignment, 262 (5131 ) Science 208-214 (1993)；Align-M，參見例如Ivo Van Walle等人，Align-M - A New Algorithm for Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences, 20(9) Bioinformatics: 1428-1435 (2004)。

因此，藉由習知方法測定序列一致性百分比。參見例如Altschul等人，Bull. Math. Bio. 48: 603-16, 1986及Henikoff及Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-19, 1992。簡而言之，使用間隙開放罰分10，間隙延伸罰分1及如下文顯示之Henikoff及Henikoff (同上)之「blosum 62」評分矩陣，比對兩個胺基酸序列以最佳化比對分數(胺基酸由標準單字母密碼指示)。

用於測定序列一致性之比對分數 BLOSUM62表

然後將該一致性百分比計算為：

大體上同源多肽之特徵在於具有一或多個胺基酸取代、缺失或添加。此等變化較佳係次要性質，即保守胺基酸取代(參見下文)及不顯著影響多肽之折疊或活性之其他取代；小缺失，通常係一至約30個胺基酸；及小胺基-或羧基末端延伸，諸如胺基末端甲硫胺酸殘基、多達約20至25個殘基之小連接子肽或親和力標識。

保守胺基酸取代鹼性：精胺酸離胺酸組胺酸酸性：麩胺酸天冬胺酸極性：麩醯胺酸天冬醯胺酸疏水性：白胺酸異白胺酸纈胺酸芳族：苯丙胺酸色胺酸酪胺酸小：甘胺酸丙胺酸絲胺酸蘇胺酸甲硫胺酸除20個標準胺基酸外，非標準胺基酸(諸如4-羥基脯胺酸、6-N-甲基離胺酸、2-胺基異丁酸、異纈胺酸及-甲基絲胺酸)可代替本發明之多肽之胺基酸殘基。數量有限之非保守胺基酸、非由遺傳密碼編碼之胺基酸及非天然胺基酸可代替本發明之SARS-CoV-2抗原中之多肽胺基酸殘基。本發明之多肽亦可包含非天然生成之胺基酸殘基。

非天然生成之胺基酸包括(但不限於)反式3-甲基脯胺酸、2,4-甲橋-脯胺酸、順式-4-羥基脯胺酸、反式-4-羥基-脯胺酸、N-甲基甘胺酸、別蘇胺酸、甲基-蘇胺酸、羥乙基半胱胺酸、羥乙基高半胱胺酸、硝基麩醯胺酸、高麩醯胺酸、哌啶酸、第三白胺酸、正纈胺酸、2-氮雜苯丙胺酸、3-氮雜苯丙胺酸、4-氮雜苯丙胺酸及4-氟苯丙胺酸。此項技術中已知用於將非天然生成之胺基酸殘基併入蛋白質內之數種方法。例如，可採用活體外系統，其中使用化學胺基醯化抑制因子tRNA抑制無義突變。用於合成胺基酸及胺基醯化tRNA之方法為此項技術中已知。在包含大腸桿菌S30提取物及市售酶及其他試劑之無細胞系統中進行含有無義突變之質體之轉錄及轉譯。藉由層析術純化蛋白質。參見例如Robertson等人，J. Am. Chem. Soc. 113:2722, 1991；Ellman等人，Methods Enzymol. 202:301, 1991；Chung等人，Science 259:806-9, 1993；及Chung等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10145-9, 1993)。在第二種方法中，在爪蟾卵母細胞中藉由顯微注射突變之mRNA及化學胺基醯化抑制tRNA進行轉譯(Turcatti等人，J. Biol. Chem. 271:19991-8, 1996)。於第三種方法內，在缺乏欲置換之天然胺基酸(例如，苯丙胺酸)之情況下及在存在所需非天然生成之胺基酸(例如，2-氮雜苯丙胺酸、3-氮雜苯丙胺酸、4-氮雜苯丙胺酸或4-氟苯丙胺酸)之情況下培養大腸桿菌細胞。將該非天然生成之胺基酸併入該多肽內以代替其天然對應體。參見Koide等人，Biochem. 33:7470-6, 1994。藉由活體外化學修飾可將天然生成之胺基酸殘基轉化為非天然生成之種類。化學修飾可與定點誘變組合以進一步擴大取代之範圍(Wynn及Richards, Protein Sci. 2:395-403, 1993)。

數量有限之非保守胺基酸、非由遺傳密碼編碼之胺基酸、非天然生成之胺基酸及非天然胺基酸可代替本發明之多肽之胺基酸殘基。

本發明之多肽中之必需胺基酸可根據此項技術中已知的程序鑑別，諸如定點誘變或丙胺酸掃描誘變(Cunningham及Wells, Science 244: 1081-5, 1989)。生物相互作用之位點亦可由結構之物理分析確定，如藉由諸如核磁共振、晶體學、電子繞射或光親和標記之技術，結合推定之接觸位點胺基酸之突變一起確定。參見例如de Vos等人，Science 255:306-12, 1992；Smith等人，J. Mol. Biol. 224:899-904, 1992；Wlodaver等人，FEBS Lett. 309:59-64, 1992。亦可自與本發明之多肽之相關組分(例如易位或蛋白酶組分)之同源性之分析推斷必需胺基酸之一致性。

可進行多個胺基酸取代並使用誘變及篩選之已知方法測試，諸如彼等由Reidhaar-Olson及Sauer (Science 241 :53-7, 1988)或Bowie及Sauer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2152-6, 1989)揭示者。簡而言之，此等作者揭示用於同時隨機化多肽中之兩個或更多個位置，選擇功能多肽，及然後定序誘變多肽以確定各位置上容許取代之範圍之方法。可使用之其他方法包括噬菌體顯示(例如，Lowman等人，Biochem. 30: 10832-7, 1991；Ladner等人，美國專利第5,223,409號；Huse, WIPO公開案WO 92/06204)及區域定向誘變(Derbyshire等人，Gene 46:145, 1986；Ner等人，DNA 7:127, 1988)。

下列實例闡述本發明。

實例實例 1 ： 單獨三價商業流感疫苗 (Addavax 輔助 ) ， 及單獨 COVID-19 疫苗 (HEK 細胞中結合產生及 Addavax 輔助之 RBD-HB) 與流感 -COVID-19 組合疫苗 (Addavax 輔助 ) 之免疫原性之比較

製備三種疫苗製劑： 1. 商業流感疫苗3 µg/ml (分裂型) Addavax輔助(20 µl/ml) 2. COVID-19疫苗(HEK細胞中結合產生之RBD-HB) 3 µg/ml Addavax輔助(20 µl/ml) 3. 流感-COVID-19組合疫苗(3 µg各組分/ml) Addavax輔助(20 µl/

對三組5隻Balb/c小鼠接種0.5 ml各上文之疫苗(第0天)。在第0天及第14天自小鼠採集血清樣本。

藉由ELISA量測對抗SARS-CoV-2棘蛋白(COVID-19抗原)之受體結合域(RBD)及對抗流感病毒之H1N1、H3N2及B抗原之抗體效價。對抗流感抗原之抗體效價顯示於表1中。對抗SARS-CoV-2棘蛋白之抗體效價顯示於表2中。所有疫苗均引起強抗體反應。使用含有佐劑之流感-COVID-19組合疫苗可引起對抗流感及SARS-CoV-2棘蛋白兩者之強抗體反應，且無組分抑制之證據。表 1 ：對抗 流感抗原之抗體效價

疫苗組 (每組5隻Balb/c小鼠)	對抗流感抗原之ELISA抗體效價
PBS對照	0
COVID-19第0天	0
COVID-19第14天	0
流感H1N1第0天	0
流感H1N1第14天	67.1
流感H3N2第0天	0
流感H3N2第14天	43.1
B型流感第0天	0
B型流感第14天	40.5
COVID-19 +流感H1N1第0天	0
COVID-19 +流感H1N1第14天	69.3
COVID-19 +流感H3N2第0天	0
COVID-19 +流感H3N2第14天	50.3
COVID-19 +B型流感第0天	0
COVID-19 +B型流感第14天	39.4

表 2 ：對抗 SARS-CoV-2 棘蛋白之抗體效價

疫苗組 (每組5隻Balb/c小鼠)	對抗SARS-CoV-2棘蛋白之ELISA抗體效價
PBS對照	0
COVID-19第0天	0
COVID-19第14天	3.2
流感H1N1第0天	0
流感H1N1第14天	0
流感H3N2第0天	0
流感H3N2第14天	0
B型流感第0天	0
B型流感第14天	0
COVID-19 +流感H1N1第0天	0
COVID-19 +流感H1N1第14天	3.5
COVID-19 +流感H3N2第0天	0
COVID-19 +流感H3N2第14天	3.6
COVID-19 +B型流感第0天	0
COVID-19 +B型流感第14天	3.4

實例 2 ：單獨商業流感疫苗 (V axi grip) ，及單獨 COVID-19 疫苗 ( 結合至 HBSAg 之全尺寸棘蛋白 ) 與流感 -COVID-19 組合疫苗之免疫原性之比較 使HBSAg及全長SARS-CoV-2棘蛋白(具有(EAAAK)₃ 連接子)之融合蛋白重組表現於HEK細胞中。如圖2中顯示，在兩個獨立實驗中進行重組表現，及混合來自5個純系(實驗1)及4個純系(實驗2)之介質並評估融合蛋白表現。

來自5個純系(實驗1)之混合介質命名為HBSAg-(EAAAK)₃ -Cov-S D8-SA01-02-01 (5x) HBSAg。來自4個純系(實驗2)之混合介質命名為HBSAg-(EAAAK)₃ -Cov-S D8-SA01-01-01 (4x) HBSAg。

藉由布拉德福德(Bradford)檢定測定兩個融合蛋白池之總蛋白含量並在100 ml之總體積中調整至1 mg/ml。

Balb/c小鼠用HBSAg-(EAAAK)₃ -Cov-S D8-SA01-02-01 (5x) HBSAg或HBSAg-(EAAAK)₃ -Cov-S D8-SA01-01-01 (4x) HBSAg單獨或與Vaxigrip流感疫苗組合免疫。如下表3中顯示，COVID-19/’流感/組合疫苗係以無佐劑、與Alu-280佐劑或Adda-Vax佐劑投與。

使用50 µg/劑量(體積100 µl)進行HBSAg-(EAAAK)₃ -Cov-S D8-SA01-02-01 (5x)或HBSAg-(EAAAK)₃ -Cov-S D8-SA01-01-01 (4x)之免疫。使用1.5 µg/劑量(體積50 µl)進行流感疫苗之免疫。在使用任一佐劑下，使用1:1 v/v疫苗:佐劑比(對於佐劑+1疫苗，總計100 µl；或對於佐劑+2疫苗，總計150 µl)。小鼠係在第0天免疫，及在第7、14及28天加強。在第14天獲得血清樣本，及隨後在第42天處死。處死後亦分離免疫化小鼠之脾以用於測試。

藉由ELISA量測對抗SARS-CoV-2棘蛋白(COVID-19抗原)之受體結合域(RBD)之抗體效價。如下圖3中顯示，相較於PBS對照組(組10)或單獨流感疫苗(組2)，在所有實驗組(組1、3至9及11)中，在促發免疫(priming immunisation)後14天存在可觀測之抗HBSAg-(EAAAK)₃ -Cov-S IgG效價。顯著地，當任一HBSAg-(EAAAK)₃ -Cov-S融合蛋白與流感疫苗一起投與時，未觀測到明顯之組分抑制，其支持COVID-19/流感組合疫苗之潛在臨床效用。如圖3亦顯示，使用佐劑(特別是Adda-Vax)進一步增加IgG產生，特別對於HBSAg-(EAAAK)₃ -Cov-S D8-SA01-02-01 (5x)，及HBSAg-(EAAAK)₃ -Cov-S D8-SA01-01-01 (4x)與Vaxigrip之組合。

使用ELISA定量之抗COVID棘蛋白IgG之效價(單獨或與Vaxigrip組合)與針對僅含有SARS-CoV-2棘蛋白之受體結合域(RBD)之相似融合蛋白HBSAg-(EAAAK)₃ -Cov-S產生之IgG比較。單獨HBSAg-(EAAAK)₃ -Cov-S之資料顯示於圖4A中，並與圖4B中之HBSAg-(EAAAK)₃ -Cov-S D8-SA01-02-01 (5x)比較。使用RBD-融合物獲得較高之效價(圖4B)。在促發免疫後42天再次量測抗體效價。同樣，如在第14天，相較於PBS對照組(組10)或單獨流感疫苗(組2)，在所有實驗組(組1、3至9及11)中，在促發免疫後14天存在抗HBSAg-(EAAAK)₃ -Cov-S IgG之可觀測效價。顯著地，當任一HBSAg-(EAAAK)₃ -Cov-S融合蛋白與流感疫苗一起投與時，未觀測到明顯之組分抑制，其支持COVID-19/流感組合疫苗之潛在臨床效用。實際上，組3(用HBSAg-(EAAAK)₃ -Cov-S D8-SA01-02-01 (5x)及Vaxigrip免疫)之抗HBSAg-(EAAAK)₃ -Cov-S IgG效價大於組1 (用單獨HBSAg-(EAAAK)₃ -Cov-S D8-SA01-02-01 (5x)免疫)。

表3：HBSAg-(EAAAK)₃ -CoV-S、流感及HBSAg-(EAAAK)₃ -CoV-S/流感免疫

組	動物N^o Balb/c	籠子	疫苗	佐劑	注射體積/途徑
1	5	A/B	HBSAg-(EAAAK)₃ - CoV-S (HEK) D8-SA01-02-01 (5x)	無	50 µl (i.p.)
2	5	C/D	流感(VAXIGRIP 0.5 ml)	無	50 µl (i.p.)
3	5	E/F	HBSAg-(EAAAK)₃ -CoV-S (HEK) D8-SA01-02-01 (5x) + 流感(VAXIGRIP 0.5 ml)	無	100 µl (i.p.)
4	5	G/H	HBSAg-(EAAAK)₃ -CoV-S (HEK) D8-SA01-02-01 (5x)	Alu-280	100 µl (i.p.)
5	5	I/L	HBSAg-(EAAAK)₃ -CoV-S (HEK) D8-SA01-02-01 (5x)	Adda-Vax	100 µl (i.p.)
6	5	M/N	HBSAg-(EAAAK)₃ -CoV-S (HEK) D8-SA01-02-01 (5x) + 流感(VAXIGRIP 0.5 ml)	Alu-280	150 µl (i.p.) (50 µl + 50 µl + 50 µl)
7	5	O/P	HBSAg-(EAAAK)₃ -CoV-S (HEK) D8-SA01-02-01 (5x) + 流感(VAXIGRIP 0.5 ml)	Adda-Vax	150 µl (i.p.) (50 µl + 50 µl + 50 µl)
8	5	Q/R	HBSAg-CoV-S (HEK) D8-SA01-01-01 (4x)	無	50 µl (i.p.)
9	5	S/T	HBSAg-CoV-S (HEK) D8-SA01-01-01 (4x) + 流感(VAXIGRIP 0.5 ml)	無	100 µl (i.p.)
10	5	U/V	PBS	無	50 µl (i.p.)
11	4	Z	HBSAg-CoV-S (HEK) D8-SA01-01-01 (4x) + 流感(VAXIGRIP 0.5 ml)	Adda-Vax	150 µl (i.p.) (50 µl + 50 µl + 50 µl)

如圖5亦顯示，使用佐劑(特別Adda-Vax)進一步增加IgG產生，特別對於單獨BSAg-(EAAAK)₃ -Cov-S D8-SA01-02-01 (5x)，或與Vaxigrip組合。

將使用ELISA定量之抗COVID棘蛋白IgG之效價(單獨或與Vaxigrip組合)與對抗僅含有SARS-CoV-2棘蛋白之受體結合域(RBD)之相似融合蛋白BSAg-(EAAAK)₃ -Cov-S產生之IgG比較。第42天單獨HBSAg-(EAAAK)₃ -Cov-S之資料顯示於圖5A中，並與圖5B中之HBSAg-(EAAAK)₃ -Cov-S D8-SA01-02-01 (5x)及HBSAg-(EAAAK)₃ -Cov-S D8-SA01-01-01 (4x)比較。使用RBD融合物(圖5B)獲得最高效價，然而，當用Adda-Vax調配時，用HBSAg-(EAAAK)₃ -Cov-S D8-SA01-01-01 (4x)與Vaxigrip之組合維持高效價。

此等實驗證實，包含SARS-CoV-2棘蛋白融合物之疫苗組合物可與流感病毒疫苗成功組合，而無生產組合疫苗產品中常見之疫苗組分抑制之預期問題。因此，使用該等組合疫苗計劃中和檢定。

實例 3 ：比較單獨商業流感疫苗 (Vaxigrip) ，及單獨 COVID-19 疫苗 ( 結合至 HBSAg 之全尺寸棘蛋白 ) 及流感 -COVID-19 組合疫苗之中和 檢定本發明之SARS-CoV-2融合蛋白、‘流感疫苗及COVID-19-‘流感組合疫苗產生對抗其等各別抗體之中和抗體之能力可使用微量中和檢定基於細胞病變效應(MN-CPE)測試。

5隻Balb/c小鼠組接種0.5 ml各上文之疫苗(第0天)。在第0、14及42天自小鼠採集血清樣本。 1. 商業流感疫苗(例如Vaxigrip) 2. COVID-19疫苗(例如HBSAg-(EAAAK)₃ -Cov-S) 3. 流感-COVID-19組合疫苗此等可在有或無佐劑(例如Addavax)之情況下重複。

將Vero E6細胞接種於96孔盤內並培養以達成近匯合度(sub-confluency)。

使用標準滴定檢定計算SARS-CoV-2之效價，並製備該SARS-CoV-2之十倍連續稀釋(log10)。或者可進行3.16倍連續稀釋(0.5Log10)。

將連續稀釋之SARS-CoV-2施覆於96孔盤中之匯合Vero細胞。該盤之一行未經SARS-CoV-2處理作為細胞對照。另外，可使用含有已知SARS-CoV-2特異性中和抗體之樣本作為陽性對照，及可使用人類或動物消耗之樣本作為陰性對照(例如不含IgA/IgM/IgG之人類血清)。

在添加SARS-CoV-2後，在37℃，5% CO₂ 下將盤培養3天(培養時間可取決於SARS-CoV-2毒株及變體而變化)。培養後，在倒置顯微鏡下觀測該等盤並對孔評分為SARS-CoV-2陽性(即觀測到CPE)或SARS-CoV-2陰性(即細胞係活的且無CPE)。

倘若已計算50%組織培養感染劑量(TCID50)，則可進行MN-CPE檢定。

對於MN-CPE，如先前培養Vero E6細胞並接種於96孔盤中。在56 ± 1℃下將來自接種疫苗之小鼠之血清樣本熱處理30分鐘± 10分鐘。將來自經處理之小鼠之血清樣本連續稀釋，首次稀釋1:10，及然後在盤之列上進行2倍連續稀釋。將所需病毒效價(一個盤用於SARS-CoV-2，一個盤用於流感)添加至該盤之各孔，然後在37 ± 1℃，5 ± 1% CO₂ 下將該等盤培養1小時。然後將病毒-血清混合物施覆於近匯合預培養之Vero E6細胞，並在37 ± 1℃，5% ± 1 CO₂ 下將該等盤培養3天(培養時間可取決於SARS-CoV-2毒株及變體而變化)。

微量中和效價(MNt)係最高樣本稀釋度之倒數，其保護至少50%之細胞免受CPE影響。若未觀測到中和，則假定MNt ＜ 10，其低於偵測之下限。

來自經HBSAg-(EAAAK)₃ -Cov-S處理之小鼠之血清證實CPE於Vero細胞中之有效中和及抑制。同樣地，經流感疫苗處理之小鼠產生具有對抗流感之中和活性之血清。當用HBSAg-(EAAAK)₃ -Cov-S及流感疫苗之組合處理小鼠時，達成對抗SARS-CoV-2及流感兩者之中和，證實當使用SARS-CoV-2及流感組合疫苗時，不存在組分抑制。

使用SARS-CoV-2 RBD片段疫苗及流感疫苗之組合重複實驗。同樣，未觀測到組分抑制。

序列資訊 SEQ ID NO: 1–SARS-CoV-2棘蛋白胺基酸序列

棘蛋白之RDB域(殘基319至529)加底線。

SEQ ID NO: 2–SARS-CoV-2棘蛋白核酸序列–經最佳化以用於在大腸桿菌中之表現且含有SacI及NotI單選殖位點。

5’ SacI單選殖位點加單底線

3’ NotI單選殖位點加虛底線

ATG起始密碼子以粗體及斜體顯示

SEQ ID NO: 2之核酸序列轉譯成SEQ ID NO: 1之天然SARS-CoV-2棘蛋白

SEQ ID NO: 3–編碼融合蛋白HEV-SARS-CoV-2棘蛋白之核酸–經最佳化以用於在大腸桿菌中之表現且含有SacI及NotI單選殖位點。

5’ SacI單選殖位點加單底線

HEV (p239片段)序列以大寫字母顯示

SARS-CoV-2棘蛋白編碼序列以小寫字母顯示

3’ NotI單選殖位點加虛底線

SEQ ID NO: 4–SARS-CoV-2棘蛋白核酸序列–經最佳化以用於在巴斯德克馬格特勒酵母(Komagataella pastoris)中之表現且含有BstB1及NotI單選殖位點。

5’ BstBI單選殖位點加單底線

3’ NotI單選殖位點加虛底線

緊隨5’ SacI後係ACG密碼子(編碼序列需與緊隨該ACG後之ATG起始密碼子同框)。此等兩個密碼子以粗體及斜體顯示。

SEQ ID NO: 4之核酸序列轉譯成SEQ ID NO: 1之天然SARS-CoV-2棘蛋白

SEQ ID NO: 5–編碼融合蛋白HPV18L1/SARS-CoV-2棘蛋白之核酸–經最佳化以用於在巴斯德克馬格特勒酵母(K. pastoris )中之表現且含有BstB1及NotI單選殖位點。

5’ BstBI單選殖位點加單底線

HPV18L1序列以小寫字母顯示

SARS-CoV-2棘蛋白編碼序列以大寫字母顯示

3’ NotI單選殖位點加虛底線

緊隨5’ BstBI後係ACG密碼子(編碼序列需與緊隨該ACG後之ATG起始密碼子同框)。此等兩個密碼子以粗體及斜體顯示。

SEQ ID NO: 6–編碼融合蛋白HPV16L1/SARS-CoV-2棘蛋白核之核酸–經最佳化以用於在巴斯德克馬格特勒酵母中之表現且含有BstB1及NotI單選殖位點。

5’ BstBI單選殖位點加單底線

HPV16L1序列以小寫字母顯示

SARS-CoV-2棘蛋白編碼序列以大寫字母顯示

3’ NotI單選殖位點加虛底線

SEQ ID NO: 7–SARS-CoV-2棘蛋白核酸序列–經最佳化以用於在人類(293F)中之表現且含有NheI及NotI單選殖位點。

5’ NheI單選殖位點加單底線

3’ NotI單選殖位點加虛底線

緊隨5’ NheI後係GAC密碼子(編碼序列需與緊隨該GAC後之ATG起始密碼子同框)。此等兩個密碼子以粗體及斜體顯示。

SEQ ID NO: 7之核酸序列轉譯成SEQ ID NO: 1之天然SARS-CoV-2棘蛋白

SEQ ID NO: 8–編碼融合蛋白HBSAg/SARS-CoV-2棘蛋白之核酸–經最佳化以用於在人類(293F)中之表現且含有NheI及NotI單選殖位點。

5’ NheI單選殖位點加單底線

HSBAg序列以小寫字母顯示

SARS-CoV-2棘蛋白編碼序列以大寫字母顯示

3’ NotI單選殖位點加虛底線

SEQ ID NO: 9–對應於SEQ ID NO: 3之胺基酸序列 (融合蛋白HEV-SARS-CoV-2棘蛋白–經最佳化以用於在大腸桿菌中之表現且含有SacI及NotI單選殖位點)。

SEQ ID NO: 10–對應於SEQ ID NO: 5之胺基酸序列 (融合蛋白HPV18L1/SARS-CoV-2棘蛋白–經最佳化以用於在巴斯德克馬格特勒酵母中之表現且含有BstB1及NotI單選殖位點)。

SEQ ID NO: 11–對應於SEQ ID NO: 6之胺基酸序列 (融合蛋白HPV16L1/SARS-CoV-2棘蛋白核–經最佳化以用於在巴斯德克馬格特勒酵母中之表現且含有BstB1及NotI單選殖位點)。

SEQ ID NO: 12–對應於SEQ ID NO: 8之胺基酸序列 (融合蛋白HBSAg/SARS-CoV-2棘蛋白–經最佳化以用於在人類(293F)中之表現且含有NheI及NotI單選殖位點)。

SEQ ID NO: 13–RBD SARS-CoV-2棘蛋白核酸序列

在起始ATG (粗體)之前添加KOZAC序列(gcc acc，加底線)。

在NotI之前添加分泌形式tga taa (加雙底線)，此tga taa序列係「雙終止密碼子」結構組元，該結構組元中斷蛋白質合成、促進分泌至細胞外介質內(如下文描述，亦包括在其他序列中)。

已分別於5’端NheI處及於3’端NotI處添加獨特之限制性位點(加虛底線)

SEQ ID NO: 14–RBD SARS-CoV-2棘蛋白核酸序列–經人類密碼子最佳化以用於293F (HEK)細胞表現。

在起始ATG (粗體)之前添加KOZAC序列(gcc acc，加底線)。

在NotI之前添加分泌形式tga taa (加雙底線)

SEQ ID NO: 15–對應於SEQ ID NO: 13及14之RBD SARS-CoV-2棘蛋白胺基酸序列

SEQ ID NO: 16–剛性EAAAK連接子一致胺基酸序列 A(EAAAK)_n A (n = 2至5)

SEQ ID NO: 17–剛性(EAAAK)₃ 連接子核酸序列 GAA GCC GCC GCT AAA GAG GCC GCT GCC AAA GAA GCT GCT GCT AAG

SEQ ID NO: 18–剛性(EAAAK)₃ 連接子胺基酸序列 EAAAKEAAAKEAAAK

SEQ ID NO: 19–可撓性GS_n 連接子一致胺基酸序列 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)_n (n=1至6)

SEQ ID NO: 20–可撓性GS5 ((GGGGS)₁ )連接子胺基酸序列 GGGGS

SEQ ID NO: 21–可撓性GS10 ((GGGGS)₂ )連接子胺基酸序列 GGGGSGGGGS

SEQ ID NO: 22–可撓性GS15 ((GGGGS)₃ )連接子核酸序列 GGT GGT GGT GGT AGC GGT GGT GGC GGT TCA GGT GGC GGT GGT TCA

SEQ ID NO: 23–可撓性GS15 ((GGGGS)₃ )連接子胺基酸序列 GGGGSGGGGSGGGGS

SEQ ID NO: 24–可撓性GS20 ((GGGGS)₄ )連接子胺基酸序列 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS

SEQ ID NO: 25–可撓性GS25 ((GGGGS)₅ )連接子胺基酸序列 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS

SEQ ID NO: 26–HBSAg-(EAAAK)₃ -RBD核酸序列

在起始ATG (粗體)之前添加KOZAC序列(gcc acc，加底線)。

在NotI之前添加分泌形式tga taa (加雙底線)

加粗且加虛線底線之序列對應於(EAAAK)₃ 連接子。

SEQ ID NO: 27–HBSAg-(EAAAK)₃ -RBD核酸序列，經人類密碼子最佳化以用於293f (HEK)細胞表現

在起始ATG (粗體)之前添加KOZAC序列(gcc acc，加底線)。

在NotI之前添加分泌形式tga taa (加雙底線)

已分別於5’端NheI處及於3’端NotI處添加獨特之限制性位點(加短底線)

加粗且加虛線底線之序列對應於(EAAAK)₃ 連接子。

SEQ ID NO: 28–對應於SEQ ID NO: 26及 27之HBSAg-(EAAAK)₃ -RBD胺基酸序列

(EAAAK)₃ 連接子加底線。

SEQ ID NO: 29–HEV-GS15-RBD核酸序列

起始ATG (粗體)

已分別於5’端SacI處及於3’端NotI處添加獨特之限制性位點(加虛底線)

在NotI之前添加分泌形式tga taa (加雙底線)

加粗且加虛線底線之序列對應於GS15連接子。

SEQ ID NO: 30–HEV-GS15-RBD核酸序列，經最佳化以用於大腸桿菌(E.coli)表現

起始ATG (粗體)

在NotI之前添加分泌形式tga taa (加雙底線)

加粗且加虛線底線之序列對應於GS15連接子。

SEQ ID NO: 31–對應於SEQ ID NO: 29及30之HEV-GS15-RBD胺基酸序列

GS15連接子加底線

SEQ ID NO: 32–HBSAg-(EAAAK)₃ -全長SARS-CoV-2棘蛋白核酸序列，經人類密碼子最佳化以用於293f (HEK)細胞表現

在起始ATG (粗體)之前添加KOZAC序列(gcc acc，加底線)。

加粗且加虛線底線之序列對應於(EAAAK)₃ 連接子。

SEQ ID NO: 33–對應於SEQ ID NO: 32之HBSAg-(EAAAK)₃ -全長2019-nCoV棘蛋白胺基酸序列

(EAAAK)₃ 連接子加底線。

圖1：冠狀病毒之結構及結構蛋白之功能之示意圖。

圖2：使用兔抗CoV-S (1:250，中)及小鼠抗HBSAg-(EAAAK)₃ -RBD (1:1000，右)之HBSAg-(EAAAK)₃ -CoV-S之SDS頁(左)及西方墨點(western blot)(中及右)。

圖3：顯示免疫14天後，藉由ELISA檢定對單獨用HBSAg-(EAAAK)₃ -CoV-S蛋白及與流感疫苗VAXIGRIP之組合(以兩種不同佐劑(Alu-280及Addavax)調配)免疫之小鼠血清定量之抗HBSAg-(EAAAK)₃ -CoV-S IgG效價之圖。

圖4：A 顯示免疫14天後，藉由ELISA檢定對用HBSAg-(EAAAK)₃ -RBD (以兩種不同之佐劑(Alu-280及Addavax)調配)免疫之小鼠血清定量之抗HBSAg-(EAAAK)₃ -RBD IgG效價之圖。B 免疫14天後，藉由ELISA檢定對用HBSAg-(EAAAK)₃ -CoV-S或HBSAg-(EAAAK)₃ -RBD (以兩種不同之佐劑(Alu-280及Addavax)調配)免疫之小鼠血清定量之抗HBSAg-(EAAAK)₃ -CoV-S IgG及抗HBSAg-(EAAAK)₃ -RBD IgG效價之比較。

圖5：顯示免疫42天後，藉由ELISA檢定對單獨用HBSAg-(EAAAK)₃ -CoV-S蛋白及與流感疫苗VAXIGRIP之組合(以兩種不同之佐劑(Alu-280及Addavax)調配)免疫之小鼠血清定量之抗HBSAg-(EAAAK)₃ -CoV-S IgG效價之圖。

圖6：A 顯示免疫42天後，藉由ELISA檢定對用HBSAg-(EAAAK)₃ -RBD (以兩種不同之佐劑(Alu-280及Addavax)調配)免疫之小鼠血清定量之抗HBSAg-(EAAAK)₃ -RBD IgG效價之圖。B 免疫42天後，藉由ELISA檢定對用HBSAg-(EAAAK)₃ -CoV-S (單獨或與流感疫苗VAXIGRIP之組合)或HBSAg-(EAAAK)₃ -RBD (以兩種不同之佐劑(Alu-280及Addavax)調配)免疫之小鼠血清定量之抗HBSAg-(EAAAK)₃ -CoV-S IgG及抗HBSAg-(EAAAK)₃ -RBD IgG效價之比較。

Claims

一種流感-COVID-19組合疫苗，其包含： (a) 流感血球凝集素(HA)或其免疫原性片段；及 (b) 一或多種來源於SARS-CoV-2之抗原或其免疫原性片段；其中該等抗原能夠激發對抗流感及COVID-19兩者之免疫反應及保護。
如請求項1之流感-COVID-19組合疫苗，其進一步包含流感神經胺糖酸酶(NA)或其免疫原性片段。
如請求項1或2之流感-COVID-19組合疫苗，其中： (a)該流感HA或其免疫原性片段係： (i)包含於不活化流感病毒體中； (ii)重組HA或其免疫原性片段； (iii)包含HA或其免疫原性片段之融合蛋白；或 (iv)由RNA或DNA疫苗編碼；及/或 (b)該流感NA或其免疫原性片段係： (i)包含於不活化流感病毒體中； (ii)重組NA或其免疫原性片段； (iii)包含NA或其免疫原性片段之融合蛋白；或 (iv)由RNA或DNA疫苗編碼；及/或 (c)該一或多種來源於SARS-CoV-2之抗原或其免疫原性片段係： (i)至少一種重組SARS-CoV-2棘蛋白或其免疫原性片段； (ii)至少一種包含SARS-CoV-2棘蛋白或其免疫原性片段之融合蛋白； (iii)至少一種包含SARS-CoV-2棘蛋白或其免疫原性片段之病毒樣顆粒(VLP)； (iv)至少一種編碼重組SARS-CoV-2棘蛋白或其免疫原性片段之多核苷酸；或 (v)由至少一種RNA或DNA疫苗編碼。
如前述請求項中任一項之流感-COVID-19組合疫苗，其中該流感HA或其免疫原性片段及該流感NA或其免疫原性片段係包含於不活化流感病毒體中且該一或多種來源於SARS-CoV-2之抗原或其免疫原性片段係：(i)至少一種包含SARS-CoV-2棘蛋白或其免疫原性片段之融合蛋白，或(ii)至少一種包含SARS-CoV-2棘蛋白或其免疫原性片段之病毒樣顆粒(VLP)。
如請求項1或2之流感-COVID-19組合疫苗，其中： (a) 該流感HA或其免疫原性片段係包含於減毒活流感病毒體中； (b) 該流感NA或其免疫原性片段係包含於減毒活流感病毒體中；及/或 (c) 該一或多種來源於SARS-CoV-2之抗原或其免疫原性片段係包含於活病毒載體中。
如請求項5之流感-COVID-19組合疫苗，其中包含該一或多種來源於SARS-CoV-2之抗原或其免疫原性片段之活病毒載體係： (a) 腺病毒載體； (b) 麻疹病毒載體； (c) 腮腺炎病毒載體； (d) 風疹病毒(rubella virus)載體； (e) 水痘病毒載體； (f) 小兒麻痺病毒載體；或 (g) 黃熱病病毒載體。
如前述請求項中任一項之流感-COVID-19組合疫苗，其進一步包含佐劑。
如請求項7之流感-COVID-19組合疫苗，其中該佐劑係細胞(Th1)及體液(Th2)免疫反應之刺激物。
如前述請求項中任一項之流感-COVID-19組合疫苗，其中該佐劑包含鯊烯水包油乳液、鋁鹽或單磷醯脂質A (MPL)。
如前述請求項中任一項之流感-COVID-19組合疫苗，其中該一或多種來源於SARS-CoV-2之抗原係選自： (a) 與SEQ ID NO: 1具有至少90%一致性之來自SARS-CoV-2之棘蛋白，或其與該棘蛋白具有共同抗原交叉反應性之片段； (b) 包含與SEQ ID NO: 1具有至少90%一致性之來自SARS-CoV-2之棘蛋白，或其與該棘蛋白具有共同抗原交叉反應性之片段之融合蛋白； (c) 包含與SEQ ID NO: 1具有至少90%一致性之來自SARS-CoV-2之棘蛋白，或其與該棘蛋白具有共同抗原交叉反應性之片段之VLP； (d) 編碼與SEQ ID NO: 1具有至少90%一致性之來自SARS-CoV-2之棘蛋白，或其與該棘蛋白具有共同抗原交叉反應性之片段之多核苷酸；或 (e) 表現與SEQ ID NO: 1具有至少90%一致性之來自SARS-CoV-2之棘蛋白，或其與該棘蛋白具有共同抗原交叉反應性之片段之病毒載體、RNA疫苗或DNA質體其中視需要該SARS-CoV-2棘蛋白之片段包含該SARS-CoV-2棘蛋白之受體結合域(RBD)或由其構成，較佳與SEQ ID NO: 15具有至少90%一致性。
如前述請求項中任一項之流感-COVID-19組合疫苗，其中該一或多種來源於SARS-CoV-2之抗原係包含SARS-CoV-2棘蛋白或其免疫原性片段之融合蛋白且進一步包含： (a) B型肝炎表面抗原，或其與該B型肝炎表面抗原具有共同抗原交叉反應性之片段； (b) HPV 18 L1蛋白，或其與該HPV 18 L1蛋白具有共同抗原交叉反應性之片段； (c) E型肝炎P239蛋白，或其與該E型肝炎P239蛋白具有共同抗原交叉反應性之片段；及/或 (d) HPV 16 L1蛋白，或其與該HPV 16 L1蛋白具有共同抗原交叉反應性之片段。
如請求項11之流感-COVID-19組合疫苗，其中： (a) 該融合蛋白係由包含與SEQ ID NO: 3、5、6、8、26、27、29、30或32中之任一者具有至少90%一致性之核酸序列或由其構成之多核苷酸編碼；及/或 (b) 該融合蛋白包含與SEQ ID NO: 9、10、11、12、28、31或33中之任一者具有至少90%一致性之胺基酸序列或由其構成。
如前述請求項中任一項之流感-COVID-19組合疫苗，其中該一或多種來源於SARS-CoV-2之抗原係包含SARS-CoV-2棘蛋白或其免疫原性片段之VLP，其中該VLP包含如請求項11或12中所定義之融合蛋白或由其構成。
如前述請求項中任一項之流感-COVID-19組合疫苗，其中該流感HA或其免疫原性片段及該流感NA或其免疫原性片段係包含於： (a) 季節性流感疫苗，特別是季節性3價流感疫苗或季節性4價流感疫苗； (b) 單價大流行流感疫苗；或 (c) 通用流感疫苗。
如前述請求項中任一項之流感-COVID-19組合疫苗，其用於治療及/或預防COVID-19及流感之方法中。
一種流感HA或其免疫原性片段及來源於SARS-CoV-2之抗原或其免疫原性片段及視需要流感NA或其免疫原性片段於製造用於治療及/或預防COVID-19及流感之藥劑之用途，其中該藥劑係如請求項1至14中任一項之流感-COVID-19組合疫苗。
一種使個體對流感及COVID-19兩者免疫之方法，其包括對該個體投與治療有效量之如請求項1至14中任一項之流感-COVID-19組合疫苗。
如請求項15之流感-COVID-19組合疫苗、如請求項16之用途或如請求項17之方法，其中該流感-COVID-19組合疫苗係以10至14個月之間隔投與，視需要其中該流感-COVID-19組合疫苗係以約12個月之間隔投與。