CN111217917B - 一种新型冠状病毒SARS-CoV-2疫苗及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种治疗和/或预防新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2)感染或新型冠状病毒疾病(COVID‑19)的疫苗制备方法，所述的疫苗核心抗原包括新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2)的RBD融合蛋白，所述的疫苗形式包括RBD融合蛋白亚单位疫苗、RBD融合蛋白mRNA疫苗或RBD融合蛋白腺病毒载体疫苗。上述疫苗在免疫机体后可产生治疗和/或预防新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2)感染的免疫反应，用于治疗和/或预防新型冠状病毒疾病(COVID‑19)。本发明还涉及新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2)的RBD融合基因、RBD融合蛋白、载体、细胞、制备方法、治疗方法或制药用途。

Description

一种新型冠状病毒SARS-CoV-2疫苗及其制备方法
技术领域
本发明属于疫苗技术领域，具体涉及将新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的RBD融合基因，设计成RBD融合蛋白亚单位疫苗、RBD融合蛋白mRNA疫苗、或者RBD融合蛋白腺病毒载体疫苗，上述疫苗在免疫机体后可产生预防新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的免疫反应，用于预防新型冠状病毒疾病(COVID-19)。
背景技术
冠状病毒为不分节段的单股正链RNA病毒，属于巢病毒(Nidovirales)冠状病毒(Coronaviridae)正冠状病毒亚科(Orthocoronavirinae)，根据血清型和基因组特点，冠状病毒亚科被分为α、β、γ和δ四个属。迄今为止，共有7种冠状病毒可感染人类：包括α属的229E和NL63，β属的OC43和HKU1、中东呼吸综合征相关冠状病毒(MERSr-CoV)、严重急性呼吸综合征相关冠状病毒(SARSr-CoV)和新型冠状病毒(SARS-CoV-2)。
冠状病毒属的病毒是具外套膜的正链单股RNA病毒，直径约80～120nm，基因组为27～32Kb，其遗传物质是所有RNA病毒中最大的，具有正链RNA特有的重要结构特征：即RNA链5’端有甲基化“帽子”，3’端有PolyA“尾巴”结构。这一结构与真核mRNA非常相似，也是其基因组RNA自身可以发挥翻译模板作用的重要结构基础，而省去了RNA- DNA-RNA的转录过程，该特点使其极易变异。冠状病毒可感染人、鼠、猪、猫、犬、禽类等脊椎动物。冠状病毒有包膜，包膜上存在棘突，整个病毒像日冕，不同的冠状病毒的棘突有明显的差异。在冠状病毒感染细胞内有时可以见到管状的包涵体。
S蛋白是冠状病毒最重要的表面蛋白，与病毒的传染能力相关。S蛋白含有两个亚基： S1和S2，其中S1主要包含受体结合区域(RBD)，负责识别细胞受体；S2含有膜融合过程所需的基本元件。S蛋白承担病毒与宿主细胞膜受体结合及膜融合功能；S蛋白决定了病毒的宿主范围和特异性；S蛋白通过受体结合区(RBD)的基因重组或突变可以实现不同宿主间传播，并导致较高致死率；S蛋白可产生中和抗体，因此，S蛋白是疫苗设计的重要候选抗原。
尽管S蛋白是冠状病毒疫苗开发的首选抗原，但是有关SARS-CoV疫苗研究，结果表明，S蛋白诱发的抗体可引发抗体依赖的增强作用(antibody dependent enhancement,ADE)；目前有关新型冠状病毒疫苗开发的报道不多，但是考虑到新型冠状病毒和SARS的同源性很高，因此，针对新型冠状病毒S蛋白设计的疫苗是否可引起ADE，是疫苗设计之初需要考虑的重要问题。
本发明基于RBD设计融合蛋白，该融合蛋白产生的抗体可阻止新型冠状病毒与宿主细胞的识别。新型冠状病毒S蛋白中的RBD功能明确，负责识别受体细胞的ACE区，因此针对RBD产生的抗体功能明确，避免诱导机体产生抗体依赖的增强作用(antibody dependentenhancement,ADE)。
发明内容
本发明提供一种新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的RBD融合蛋白，该融合蛋白的结构形式为RBD-CTB或者RBD-CRM197(A)，其中RBD是受体结合区域，产生的抗体可干扰病毒和宿主细胞的识别，从而阻止病毒进入宿主细胞；CTB为霍乱毒素的B亚单位，有助于将抗原转入细胞内，诱导产生TH1和TH2免疫通路，起粘膜免疫佐剂的功效； CRM197(A)为CRM197的A区域，该区域有很多CTL表位，以CRM197(A)为单体形成的融合蛋白可产生更强的细胞免疫。
优选的，该融合蛋白两个单体的位置可以相互替换，任何一个单体都可以放在另外一个前面，而不影响每一个单体的效果，即RBD-CTB、CTB-RBD或者RBD-CRM197(A)、CRM197(A)-RBD。
优选的，RBD融合蛋白还包括信号肽，更优选的为tPA信号肽，更优选的其基因序列如SEQ ID NO:5所示。
优选的，所述融合蛋白的不同蛋白单体之间还包括连接臂(Linker)，更优选的连接臂为G4S，连接臂的主要作用是保证每一个蛋白都维持自己的构象。
本发明提供一种RBD融合蛋白，除以CTB或者CRM197(A)作为RBD的融合蛋白之外，该融合蛋白还包括分子佐剂，即CPG或TLR(TLR激动剂)。
优选的，含有分子佐剂的RBD融合蛋白还包括信号肽，更优选的信号肽为tPA，更优选的其基因序列如SEQ ID NO:5所示。
优选的，含有分子佐剂的RBD融合蛋白，不同蛋白单体之间还包括连接臂(Linker)，常用的连接臂为G4S，连接臂的主要作用是保证每一个蛋白都维持自己的构象。
在本发明的一个实施方式中，基于该融合蛋白，设计的疫苗形式为重组蛋白亚单位疫苗，将RBD融合基因连接pET9a，构建表达质粒，转入大肠杆菌BL21，纯化目标抗原，得到亚单位疫苗。
在本发明的一个实施方式中，基于该融合蛋白，设计的疫苗形式为腺病毒载体疫苗，将RBD融合基因插入腺病毒载体，可形成腺病毒载体疫苗。
优选的，含有RBD融合蛋白抗原的腺病毒由腺病毒骨架质粒与含有抗原基因的穿梭质粒共转染得到。所述腺病毒骨架质粒选自：pAdEasy-1、pAdEasy-2、pBHG11、pBHG-fiber5 或pBHG-fiber35。所述的包装系统包括：AdEasy或者AdMax。
优选的，含有抗原基因的穿梭质粒的构建方法包括：合成RBD融合基因序列，抗原基因序列两端设计引入和穿梭质粒相同的酶切位点，双酶切目标抗原和穿梭质粒，回收核苷酸片段后，以T4 DNA连接酶连接抗原序列和质粒。
在本发明的一个实施方式中，基于该融合蛋白，设计的疫苗为mRNA疫苗。
优选的，构建含有融合基因的质粒，转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性单斑，接液体培养基，菌种扩大，摇瓶或者发酵罐培养细菌，离心回收菌体，抽提质粒。单酶切将质粒线性化，并以该质粒为模板，合成mRNA。
优选的，合成的mRNA，前面加入帽子，并甲基化修饰，尾巴加入polyA。
本发明提供了一种治疗和/或预防新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染或新型冠状病毒疾病(COVID-19)疫苗的制备方法，包括构建一个含有新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的融合蛋白，其结构形式为融合蛋白的抗原-CTB-TLR或融合蛋白的抗原-CRM197-TLR。
优选的，融合蛋白的抗原为新型冠状病毒上可以产生保护作用的任何抗原或者抗原片段，包括S抗原，S1抗原，E抗原，M抗原或者N抗原，以及不同抗原的组合体，如S+N， S+E+N等。
优选的，融合蛋白的抗原为S1的RBD。
优选的，所述一种治疗和/或预防新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染或新型冠状病毒疾病(COVID-19)疫苗的形式为表达融合基因后，纯化得到的亚单位疫苗。或者为融合蛋白基因插入到腺病毒载体得到腺病毒载体疫苗。或者为融合蛋白基因作为模板，扩增得到mRNA疫苗。
本发明以RBD为目的抗原，产生的抗体可阻止新型冠状病毒(SARS-CoV-2)进入宿主细胞；RBD为受体结合区域(RBD)，负责识别细胞受体，针对RBD的抗体可有效避免潜在的ADE。RBD氨基酸片段分子量比较小，单纯以RBD作为抗原难以产生较高的抗体滴度，本发明以RBD-CTB或RBD-CRM197(A)作为融合蛋白，有助于RBD进入细胞。更为关键的是，本发明构建的融合蛋白中，加入佐剂，极大的提高抗原的免疫原性。
本发明所述的产品、药物、疫苗还可以包含药学上可接受的赋形剂。所述药学上可接受的赋形剂可以是载体、稀释剂、佐剂或编码佐剂核苷酸序列、助悬剂、转染促进剂等。所述的编码佐剂的核苷酸序列为编码如下至少一种佐剂的核苷酸序列：GM-CSF、IL-17、IFNg、IL-15、IL-21、抗PD1/2、乳铁蛋白、鱼精蛋白、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL- 6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、INF-α、INF-γ、Lymphotoxin-α、hGH、MCP-1、MIP- 1a、MIP-1p、IL-8、RANTES、L-选择蛋白、P-选择蛋白、E-选择蛋白、CD34、GlyCAM- 1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、pl50.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM- 3、CD2、LFA-3、M-CSF、CD40、CD40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子、血管内皮生长因子、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、 NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、半胱天冬酶ICE、Fos、c-jun、 Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、无活性的NIK、SAPK、SAP-1、JNK、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、 RANK、RANKLIGAND、Ox40、Ox40LIGAND、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、 NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2以及其功能性片段。
在一些更具体的方案中，本发明的第一个方面涉及一种RBD融合蛋白，包括：
(1)新型冠状病毒SARS-CoV-2的RBD氨基酸片段；
(2)连接臂Linker；
(3)CTB或CRM197(A)氨基酸片段。
优选的，如上所述的融合蛋白，其特征在于，
(1)所述的新型冠状病毒SARS-CoV-2的RBD氨基酸片段，其序列如SEQ ID NO： 6所示，和/或，
(2)所述的连接臂Linker，其序列如SEQ ID NO：7所示，和/或，
(3)所述的CTB氨基酸片段，其序列如SEQ ID NO：8所示，和/或，
(4)所述的CRM197(A)氨基酸片段，其序列如SEQ ID NO：9所示。
更优选的，如上所述的融合蛋白，其特征在于，还包括：信号肽和/或分子佐剂；优选的，所述的信号肽连接在所述融合蛋白的N端，所述的分子佐剂连接在所述融合蛋白的C端；更优选的，所述的信号肽通过序列如SEQ ID NO：7所示的连接臂Linker与所述的融合蛋白连接。
更优选的，所述的融合蛋白，其特征在于，
(1)所述的信号肽为tPA信号肽，和/或，
(2)所述的分子佐剂为CPG或TLR。
本发明的第二个方面涉及一种融合基因，其特征在于，
(1)其编码如上任一项所述的融合蛋白；
或者，
(2)其包括：编码新型冠状病毒SARS-CoV-2的RBD编码基因序列、连接臂Linker 的编码基因序列、CTB或CRM197(A)的编码基因序列。
本发明的第三个方面涉及一种包含如上所述的融合基因的载体。
本发明的第四个方面涉及一种表达如上所述的融合蛋白、包含如上所述的融合基因和 /或包含如上所述的载体的宿主。
优选的，所述的宿主可以是细胞或者细菌。
本发明的第五个方面涉及一种治疗和/或预防新型冠状病毒SARS-CoV-2感染或新型冠状病毒疾病COVID-19的疫苗，其特征在于，包含如上所述的融合蛋白、如上所述的融合基因、如上所述的载体、如上所述的宿主，或者，由如上所述的融合蛋白、如上所述的融合基因、如上所述的载体、如上所述的宿主制备而成。
优选的，如上所述的疫苗，其特征在于，所述的疫苗形式为重组蛋白亚单位疫苗、重组蛋白mRNA疫苗或重组蛋白腺病毒载体疫苗。
本发明的第六个方面涉及一种预防和/或治疗新型冠状病毒SARS-CoV-2感染或冠状病毒疾病COVID-19的疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)构建如上所述的融合基因，
(2)表达如上任一项所述的融合蛋白，
(3)纯化得到亚单位疫苗；
或者，
(1)构建如上所述的融合基因，
(2)将所述的融合基因插入腺病毒载体，
(3)制备得到腺病毒载体疫苗；
或者，
(1)将如上所述的融合基因作为模板，
(2)扩增得到mRNA疫苗。
本发明的第七个方面涉及一种如上所述的融合蛋白、如上所述的融合基因、如上所述的载体、如上所述的宿主和/或如上任一项所述的疫苗在制备预防和/或治疗新型冠状病毒 SARS-CoV-2感染和/或新型冠状病毒疾病COVID-19的药物或产品中的应用。
本发明的第八个方面涉及一种预防和/或治疗新型冠状病毒SARS-CoV-2感染和/或新型冠状病毒疾病COVID-19的方法，其特征在于，包括向个体施加如上所述的融合蛋白、如上所述的融合基因、如上所述的载体、如上所述的宿主和/或如上任一项所述的疫苗任一项所述的疫苗。
本发明的第九个方面涉及一种诱导个体中和抗原特异性免疫应答的方法，其特征在于，向个体施加如上所述的融合蛋白、如上所述的融合基因、如上所述的载体、如上所述的宿主和/或如上任一项所述的疫苗。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：
图1冠状病毒平面图
图2RBD-Linker-CTB融合基因-T载体双酶切结果图
图3RBD-linker-CTB融合基因诱导表达结果图
图4RBD融合蛋白腺病毒载体疫苗包装流程图
图5RBD-Linker-CTB融合蛋白腺病毒载体疫苗纯度分析(HPLC)
图6RBD-Linker-CTB融合蛋白免疫原性(ELISA法)
图7分子佐剂(TLR)对RBD-Linker-CTB融合蛋白免疫原性的影响(ELISA法)
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的RBD-Linker-CTB融合基因的构建
新型冠状病毒(SARS-CoV-2)结构以及外壳蛋白组成如图1所示。S蛋白是冠状病毒最重要的表面蛋白，S蛋白含有两个亚基：S1和S2，其中受体结合区域(RBD)分布在S1 区，负责识别细胞受体；S蛋白可通过受体结合区(RBD)的基因重组或突变实现不同宿主间的传播，并导致较高的致死率。更为关键的是，冠状病毒通过RBD来识别宿主细胞的受体。研究表明，RBD是S蛋白的中和抗体表位。
1-1制备RBD-Linker-CTB融合基因。RBD-Linker-CTB融合基因包括经密码子优化的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)RBD基因、Linker和CTB基因。其中，新型冠状病毒 (SARS-CoV-2)的RBD基因的原始序列来自于NCBI，并经过密码子优化，以提高目标抗原的表达量，具体序列如SEQ ID NO：1所示。其中，Linker的基因如SEQ ID NO：2所示。其中，CTB为霍乱毒素的B亚单位，具体序列如SEQ ID NO：3所示。
在一个优选的方案中，通过在融合基因的两侧加入酶切位点序列，用于将该融合基因连接到克隆载体和表达载体上。
1-2将上述RBD-Linker-CTB融合基因连接到T载体(克隆载体)上。具体步骤如下：将T载体以及RBD-Linker-CTB融合基因分别进行双酶切，酶切反应体系见表1；酶切反应结束后，用胶回收试剂盒回收目的片段。然后，以T4 DNA连接酶连接线性化的 RBD-Linker-CTB融合基因和T载体，反应体系见表2，得到RBD-Linker-CTB融合基因-T 载体。连接结束后转化大肠杆菌DH5α，并涂含有AMP的LB固体抗性平板，37℃培养过夜，挑取阳性克隆接含有AMP的LB液体培养基，提取质粒。
1-3将上述RBD-Linker-CTB融合基因连接到pET9a(表达载体)上。具体步骤如下：将pET9a(表达载体)以及RBD-Linker-CTB融合基因-T载体分别进行双酶切，酶切反应体系见表1，酶切反应结束后，用胶回收试剂盒回收目的片段。然后以T4 DNA连接酶连接线性化的RBD-Linker-CTB融合基因和pET9a，得到RBD-Linker-CTB融合基因-pET9a 表达载体，反应体系见表2。连接结束后转化大肠杆菌DH5α，并涂含有AMP的LB固体抗性平板，37℃培养过夜，挑取阳性克隆接含有AMP的LB液体培养基，提取质粒。
1-4重组质粒的双酶切鉴定。其中，双酶切的反应体系见表1，RBD-Linker-CTB融合基因-T载体的双酶切结果见图2所示RBD-linker-CTB融合抗原两侧引入HindIII和KpnI 酶切位点。
表1：双酶切反应体系(50μl)
Figure BDA0002392755350000091
双酶切反应在37℃，酶切时间至少在4h以上。
表2酶连接反应体系(10μl)
Figure BDA0002392755350000092
连接反应在4℃进行，过夜连接。
实施例2新型冠状病毒SARS-CoV-2的RBD-Linker-CRM197(A)融合基因的构建
具体构建方法参照实施例1，RBD-Linker-CRM197(A)融合基因包括经密码子优化的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)RBD基因、Linker和CRM197(A)基因。
其中，新型冠状病毒(SARS-CoV-2)RBD基因的原始序列来自于NCBI并经过密码子优化，可提高目标抗原的表达量，具体序列如SEQ ID NO：1所示。其中，Linker的基因序列为GGGGS，如SEQ ID NO：2所示。其中，CRM197(A)为CRM197的A区域，具体序列如SEQ ID NO：9所示。
在以下实施例中，将实施例1和实施例2制备的融合基因统称为新型冠状病毒(SARS- CoV-2)的RBD融合基因，简称为RBD融合基因。
实施例3RBD-Linker-CTB融合蛋白亚单位疫苗的开发
将RBD-Linker-CTB融合基因-pET9a表达载体转化大肠杆菌BL21，挑取单克隆，在含AMP的LB液体培养基中复苏后，接种100ml含AMP的LB液体培养基进行扩增，待 OD450＝0.5(或符合0.4-0.6之间)加入0.1mM的IPTG诱导表达。诱导表达结果如图3所示。
实施例4RBD-Linker-CRM197(A)融合蛋白亚单位疫苗的开发
具体参照实施例3，将RBD-Linker-CRM197(A)-pET9a表达载体转化大肠杆菌BL21，并诱导表达。
实施例5RBD-Linker-CTB融合蛋白腺病毒载体疫苗的制备
采用Admax腺病毒载体系统，包装的流程图如图4所示。将包装成功的腺病毒载体疫苗以MOI＝5-10感染293细胞，感染至少40h后8000g离心10min，收集细胞沉淀。细胞沉淀以PB或者裂解(2mM MgCl2，50mM HEPES，PH7.5)缓冲液溶解后，-80℃反复冻融三次裂解细胞，离心去除细胞碎片。
上清过50KD膜包超滤浓缩，浓缩液过CL-4B，收集外水体积洗脱物即可得到目标抗原，中空纤维超滤换液到目标缓冲。
HPLC分析收获的腺病毒载体疫苗纯度，选择TSK5000的柱子，其中，HPLC结果见图5，HPLC结果表明，收集的病毒液纯度很高。
实施例6RBD-Linker-CRM197(A)融合蛋白腺病毒载体疫苗的制备
具体参照实施例5，制备RBD-Linker-CRM197(A)融合蛋白腺病毒载体疫苗。
实施例7RBD-Linker-CTB融合蛋白mRNA的制备
将含有RBD-Linker-CTB融合基因的质粒，转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性单斑，接液体培养基，菌种扩大，发酵罐培养细菌，离心回收菌体，抽提质粒。单酶切将质粒线性化，并以该质粒为模板，合成mRNA。
合成的mRNA，前面加入帽子，并甲基化修饰，尾巴加入polyA。并以脂质体进行包裹。脂质体包裹前以及包裹后的核心参数检定结果如下：
表3mRNA以及脂质体包裹原液检测结果
Figure BDA0002392755350000111
结果表明，合成的mRNA以及包裹后的原液都符合疫苗制备要求。
实施例8RBD-Linker-CRM197(A)融合蛋白mRNA的制备
具体参照实施例7，制备RBD-Linker-CRM197(A)融合蛋白mRNA。
实施例9RBD-Linker-CTB融合蛋白免疫原性的研究
以小鼠为模型，进行RBD-Linker-CTB融合蛋白免疫原性的研究。具体步骤如下：分别制备RBD-Linker-CTB融合蛋白亚单位疫苗、RBD-Linker-CTB融合蛋白腺病毒载体疫苗以及RBD-Linker-CTB融合蛋白mRNA疫苗，进行免疫原性的研究。
实验组：RBD-Linker-CTB融合蛋白亚单位疫苗
RBD-Linker-CTB融合蛋白腺病毒载体疫苗
RBD-Linker-CTB融合蛋白mRNA疫苗
阴性对照组：生理盐水免疫组
实验动物：取NIH小鼠，每组10只，体重为12-14g
免疫方式：肌肉注射，单针免疫
免疫剂量：融合蛋白免疫5μg/只，载体疫苗免疫1×108IFU，mRNA免疫20μg/只。
采用ELISA法检测一针免疫后血清抗体水平，结果如图6所示。
实验结果表明，RBD-Linker-CTB融合蛋白亚单位疫苗、RBD-Linker-CTB融合蛋白腺病毒载体疫苗以及RBD-Linker-CTB融合蛋白mRNA疫苗单针免疫后，都可以产生很好的抗体水平。
实施例10RBD-Linker-CRM197(A)融合蛋白免疫原性的研究
具体参照实施例9，完成RBD-Linker-CRM197(A)融合蛋白免疫原性的研究。实验结果表明，RBD-Linker-CRM197(A)融合蛋白亚单位疫苗、RBD-Linker-CRM197(A) 融合蛋白腺病毒载体疫苗以及RBD-Linker-CRM197(A)融合蛋白mRNA疫苗单针免疫后，都可以产生很好的抗体水平。
实施例11分子佐剂TLR对RBD-Linker-CTB融合蛋白免疫原性的影响
制备含分子佐剂的RBD-Linker-CTB融合蛋白亚单位疫苗、RBD-Linker-CTB融合蛋白腺病毒载体疫苗以及RBD-Linker-CTB融合蛋白mRNA疫苗，进行免疫原性的研究。以研究分子佐剂对免疫原性的影响。
实验组：RBD-Linker-CTB融合蛋白亚单位疫苗(分子佐剂TLR)
RBD-Linker-CTB融合蛋白腺病毒载体疫苗(分子佐剂TLR)
RBD-Linker-CTB融合蛋白mRNA疫苗(分子佐剂TLR)
对照组：RBD-Linker-CTB融合蛋白亚单位疫苗
RBD-Linker-CTB融合蛋白腺病毒载体疫苗
RBD-Linker-CTB融合蛋白mRNA疫苗
阴性对照组：生理盐水免疫组
实验动物：取NIH小鼠，每组10只，体重为12-14g
免疫方式：肌肉注射，单针免疫
免疫剂量：融合蛋白免疫5μg/只，载体疫苗免疫1×108IFU，mRNA免疫20μg/只。
ELISA法检测一针免疫后血清抗体水平，结果如图7所示。
结果表明，分子佐剂TLR可明显提高RBD-Linker-CTB融合蛋白亚单位疫苗、RBD-Linker-CTB融合蛋白腺病毒载体疫苗以及RBD-Linker-CTB融合蛋白mRNA疫苗的抗体水平。
本实施例采用了同样的方法，验证了分子佐剂CPG的作用。结果表明，分子佐剂CPG可明显提高RBD-Linker-CTB融合蛋白亚单位疫苗、RBD-Linker-CTB合蛋白腺病毒载体疫苗以及RBD-Linker-CTB融合蛋白mRNA疫苗的抗体水平。
实施例12分子佐剂TLR对RBD-Linker-CRM197(A)融合蛋白免疫原性的影响
具体参照实施例11，分别制备实验组、对照组、阴性对照组，研究分子佐剂TLR对RBD-Linker-CRM197(A)融合蛋白免疫原性的影响。
结果表明，分子佐剂TLR可明显提高RBD-Linker-CRM197(A)融合蛋白亚单位疫苗、RBD-Linker-CRM197(A)融合蛋白腺病毒载体疫苗以及RBD-Linker-CRM197(A) 融合蛋白mRNA疫苗的抗体水平。
本实施例采用了同样的方法，验证了分子佐剂CPG的作用。结果表明，分子佐剂CPG可明显提高RBD-Linker-CRM197(A)融合蛋白亚单位疫苗、RBD-Linker-CRM197(A) 融合蛋白腺病毒载体疫苗以及RBD-Linker-CRM197(A)融合蛋白mRNA疫苗的抗体水平。
表4RBD融合蛋白的序列组成
Figure BDA0002392755350000131
综上所述，经过实验验证，实施例1-8制备的疫苗可以用于治疗和/或预防新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染或新型冠状病毒疾病(COVID-19)。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
序列表
<110> 康希诺生物股份公司
<120> 一种新型冠状病毒SARS-CoV-2疫苗及其制备方法
<130> 1
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 663
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggacgcca tgaagagggg actgtgctgc gtgctgctgc tgtgcggagc cgtgttcgtg 60
agcaactcca tcaccaacct gtgccccttc ggcgaggtgt ttaacgccac acgctttgcc 120
tccgtgtatg cctggaaccg gaagagaatc tccaattgcg tggccgacta ttctgtgctg 180
tacaattctg ccagcttctc cacctttaag tgctatggcg tgtctcctac caagctgaac 240
gacctgtgct tcacaaacgt gtacgccgac agctttgtga tccggggcga tgaggtgaga 300
cagatcgcac caggacagac cggcaagatc gcagactaca actataagct gcccgacgat 360
ttcacaggct gcgtgatcgc ctggaattct aacaatctgg atagcaaagt gggcggcaac 420
tacaattatc tgtacaggct gttccgcaag agcaacctga agccttttga gcgggacatc 480
agcaccgaga tctaccaggc cggctccaca ccatgcaacg gcgtggaggg cttcaattgt 540
tattttccac tgcagtccta cggcttccag cccaccaatg gcgtgggcta tcagccttac 600
cgggtggtgg tgctgtcttt tgagctgctg cacgcaccag caacagtgtg cggacctaag 660
aag 663
<210> 2
<211> 15
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggaggaggag gatca 15
<210> 3
<211> 375
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgattaaat taaaatttgg tgtttttttt acagttttac tatcttcagc atatgcacat 60
ggaacacctc aaaatattac tgatttgtgt gcagaatacc acaacacaca aatacatacg 120
ctaaatgata agatattttc gtatacagaa tctctagctg gaaaaagaga gatggctatc 180
attactttta agaatggtgc aacttttcaa gtagaagtac caggtagtca acatatagat 240
tcacaaaaaa aagcgattga aaggatgaag gataccctga ggattgcata tcttactgaa 300
gctaaagtcg aaaagttatg tgtatggaat aataaaacgc ctcatgcgat tgccgcaatt 360
agtatggcaa attaa 375
<210> 4
<211> 570
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgagcagaa aactgtttgc gtcaatctta ataggggcgc tactggggat aggggcccca 60
ccttcagccc atgcaggcgc tgatgatgtt gttgattctt ctaaatcttt tgtgatggaa 120
aacttttctt cgtaccacgg gactaaacct ggttatgtag attccattca aaaaggtata 180
caaaagccaa aatctggtac acaaggaaat tatgacgatg attggaaagg gttttatagt 240
accgacaata aatacgacgc tgcgggatac tctgtagata atgaaaaccc gctctctgga 300
aaagctggag gcgtggtcaa agtgacgtat ccaggactga cgaaggttct cgcactaaaa 360
gtggataatg ccgaaactat taagaaagag ttaggtttaa gtctcactga accgttgatg 420
gagcaagtcg gaacggaaga gtttatcaaa aggttcggtg atggtgcttc gcgtgtagtg 480
ctcagccttc ccttcgctga ggggagttct agcgttgaat atattaataa ctgggaacag 540
gcgaaagcgt taagcgtaga acttgagatt 570
<210> 5
<211> 69
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atggatgcaa tgaagagagg gctctgctgt gtgctgctgc tgtgtggagc agtcttcgtt 60
tcgcccagc 69
<210> 6
<211> 224
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Met Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr
1 5 10 15
Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser
20 25 30
Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr
35 40 45
Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly
50 55 60
Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala
65 70 75 80
Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly
85 90 95
Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe
100 105 110
Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val
115 120 125
Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu
130 135 140
Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser
145 150 155 160
Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln
165 170 175
Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg
180 185 190
Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys
195 200 205
Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe
210 215 220
<210> 7
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 8
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Met Ile Lys Leu Lys Phe Gly Val Phe Phe Thr Val Leu Leu Ser Ser
1 5 10 15
Ala Tyr Ala His Gly Thr Pro Gln Asn Ile Thr Asp Leu Cys Ala Glu
20 25 30
Tyr His Asn Thr Gln Ile His Thr Leu Asn Asp Lys Ile Phe Ser Tyr
35 40 45
Thr Glu Ser Leu Ala Gly Lys Arg Glu Met Ala Ile Ile Thr Phe Lys
50 55 60
Asn Gly Ala Thr Phe Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile Asp
65 70 75 80
Ser Gln Lys Lys Ala Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Ala
85 90 95
Tyr Leu Thr Glu Ala Lys Val Glu Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys
100 105 110
Thr Pro His Ala Ile Ala Ala Ile Ser Met Ala Asn
115 120
<210> 9
<211> 188
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Met Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu
1 5 10 15
Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile
20 25 30
Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp
35 40 45
Asp Asp Trp Lys Gly Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala
50 55 60
Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly
65 70 75 80
Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys
85 90 95
Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr
100 105 110
Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe
115 120 125
Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly
130 135 140
Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu
145 150 155 160
Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln
165 170 175
Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala
180 185

Claims (13)

1.一种RBD融合蛋白，包括：
(1)新型冠状病毒SARS-CoV-2的RBD氨基酸片段；
(2)连接臂Linker；
(3)CTB或CRM197(A)氨基酸片段；
其中，所述的新型冠状病毒SARS-CoV-2的RBD氨基酸片段，其序列如SEQ IDNO：6所示。
2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的连接臂Linker，其序列如SEQ IDNO：7所示，和/或，
所述的CTB氨基酸片段，其序列如SEQ ID NO：8所示，和/或，
所述的CRM197(A)氨基酸片段，其序列如SEQ ID NO：9所示。
3.如权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，还包括：信号肽和/或分子佐剂。
4.如权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述的信号肽连接在所述融合蛋白的N端，所述的分子佐剂连接在所述融合蛋白的C端。
5.如权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述的信号肽通过序列如SEQID NO：7所示的连接臂Linker与所述的融合蛋白连接。
6.如权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，
(1)所述的信号肽为tPA信号肽，和/或，
(2)所述的分子佐剂为CPG或TLR激动剂。
7.一种融合基因，其特征在于，
(1)其编码如权利要求1-6任一项所述的融合蛋白；
或者，
(2)其包括：编码新型冠状病毒SARS-CoV-2的RBD编码基因序列、连接臂Linker的编码基因序列、CTB或CRM197(A)的编码基因序列。
8.一种包含权利要求7所述的融合基因的载体。
9.一种表达权利要求1-6任一项所述的融合蛋白、包含权利要求7所述的融合基因和/或包含权利要求8所述的载体的宿主。
10.一种治疗和/或预防新型冠状病毒SARS-CoV-2感染或新型冠状病毒疾病COVID-19的疫苗，其特征在于，包含权利要求1-6任一项所述的融合蛋白、权利要求7所述的融合基因、权利要求8所述的载体、权利要求9所述的宿主，或者，由权利要求1-6任一项所述的融合蛋白、权利要求7所述的融合基因、权利要求8所述的载体、权利要求9所述的宿主制备而成。
11.一种如权利要求10所述的疫苗，其特征在于，所述的疫苗形式为重组蛋白亚单位疫苗、重组蛋白mRNA疫苗或重组蛋白腺病毒载体疫苗。
12.一种预防和/或治疗新型冠状病毒SARS-CoV-2感染或冠状病毒疾病COVID-19的疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)构建如权利要求7所述的融合基因，
(2)表达如权利要求1-6任一项所述的融合蛋白，
(3)纯化得到亚单位疫苗；
或者，
(1)构建如权利要求7所述的融合基因，
(2)将所述融合基因插入腺病毒载体，
(3)制备得到腺病毒载体疫苗；
或者，
(1)将如权利要求7所述的融合基因作为模板，
(2)扩增得到mRNA疫苗。
13.一种权利要求1-6任一项所述的融合蛋白、权利要求7所述的融合基因、权利要求8所述的载体、权利要求9所述的宿主和/或权利要求10-11任一项所述的疫苗在制备预防和/或治疗新型冠状病毒SARS-CoV-2感染和/或新型冠状病毒疾病COVID-19的药物或产品中的应用。
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