CN112831523A - 一种SARS-CoV-2-RBD真核蛋白表达载体及其制备方法和用途 - Google Patents

一种SARS-CoV-2-RBD真核蛋白表达载体及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种SARS‑CoV‑2‑RBD真核蛋白表达载体及其制备方法和用途。其中真核蛋白表达载体为含有tPA信号肽的pcDNA3.1，信号肽序列后面连接SEQ ID NO:2所示的基因序列。本发明通过引入tPA信号肽，同时人工优化得到SEQ ID NO:2，使得SARS‑CoV‑2‑RBD在真核细胞中大量表达，并且可以分泌到293F细胞外。

Description

一种SARS-CoV-2-RBD真核蛋白表达载体及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种SARS-CoV-2-RBD真核蛋白表达载体及其制备方法和用途。
背景技术
冠状病毒是一个大型病毒家族，已知可引起感冒以及中东呼吸综合征(MERS)和严重急性呼吸综合征(SARS)等较严重疾病。新型冠状病毒是以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株。2020年1月12日，世界卫生组织正式将其命名2019-nCoV。2019-nCoV有四种主要的结构蛋白：刺突蛋白(Spike protein，S蛋白)，核衣壳蛋白(Nucleocapsid，N蛋白)，膜蛋白(Membrane protein，M蛋白)，包膜蛋白(Envelope protein，E蛋白)。感染过程中，S蛋白被宿主蛋白酶(如TMPRSS2)裂解为N端S1亚基和C端S2亚基，S1和S2分别介导受体结合和膜融合。其中，S1包含N末端结构域(NTD)和受体结合结构域(RBD)，RBD是新冠病毒特异性所在，在病毒入侵人体时，RBD会与人类受体ACE2(血管紧张素转化酶2)结合。新冠病毒刺突蛋白S蛋白有两个亚基：S1和S2，受体结合位点(RBD)位于S1亚基上。RBD是引起宿主免疫反应和产生中和抗体的主要靶抗原，也是疫苗研发和病原检测的重要靶标，选用适宜的真核表达系统高效表达RBD蛋白是进行相关研究的基础。
蛋白质糖基化是生物体内最重要的翻译后修饰形式之一，可发生在细胞中50％-70％的蛋白质上。对于病毒，其自身结构蛋白的糖基化修饰与病毒生成、病毒感染和机体免疫应答均有密切关系。有研究表明，2019-nCoV的S蛋白存在22个糖基化位点。由于在2019-nCoV-RBD蛋白上存在糖基化位点，所以RBD蛋白的大量外源表达不适合通过原核表达系统，而是需要通过哺乳动物细胞真核表达系统。
信号肽(Signal peptide，SP)是引导细胞内新合成蛋白质转移到内质网进而分泌到细胞外的一段短肽，由15～30个氨基酸残基组成，通常位于新合成肽链的N端。由于信号肽序列在不同蛋白之间可以通用，筛选实用性广、可高效引导蛋白质分泌表达的信号肽序列是优化蛋白质外源表达的关键策略之一。高斯荧光素酶(Gaussia luciferase，GLuc)、组织纤溶酶原激活剂(tissue plasminogen activator，tPA)及小鼠免疫球蛋白G 2a亚型(mouse immunoglobular G subtype 2a，MIgG2a)的信号肽序列常用于真核系统中蛋白的分泌表达。
抗体是大多数疫苗必不可少的元素，可能会成为抗SARS-CoV-2的有效疫苗的关键组成部分。观察表明，大多数恢复期患者的血浆中和活性较低，但是在血浆中和活性异常的患者中可以发现具有有效中和活性的抗SARS-CoV-2RBD复发的抗体，这表明人类具有内在的能力产生抗RBD能有效中和SARS-CoV-2的抗体。因此，特异性和有效地诱导靶向SARS-CoV-2-RBD的抗体的疫苗可能是特别有效的。RBD是引起宿主免疫反应和产生中和抗体的主要靶抗原，也是疫苗研发和病原检测的重要靶标，选用适宜的真核表达系统高效表达RBD蛋白是进行相关研究的基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种在真核细胞中大量表达，并且可以分泌到293F细胞外的SARS-CoV-2-RBD真核蛋白表达载体。
为实现上述目的，本发明提供一种SARS-CoV-2-RBD真核蛋白表达载体，其特征在于，真核蛋白表达载体为含有tPA信号肽的pcDNA3.1，信号肽序列后面连接SEQ ID NO:2所示的基因序列。
进一步，其制备方法为，
人工合成SEQ ID NO:2所示序列，引入酶切位点后酶切人工合成序列，再与同样酶切的pcDNA3.1-tPA载体连接，转化即得到pcDNA3.1-tPA-SARS-CoV-2-RBD-opt真核表达载体。
本发明还提供所述SARS-CoV-2-RBD真核蛋白表达载体用于表达SARS-CoV-2-RBD的用途。
由于自然界生物体存在密码子的偏好性，从病原体来源的SARS-CoV-2-RBD基因克隆在异源宿主体内难以有效表达，因此就不能有效的刺激异源宿主的免疫系统，使之产生较好的免疫保护作用。为使目标蛋白表达，且提高目标蛋白的表达，本发明的发明人以SARS-CoV-2-RBD基因为基础，对SARS-CoV-2-RBD基因的密码子进行优化，由上海生物工程公司合成密码子优化后的SARS-CoV-2-RBD基因序列。同时，发明人在SARS-CoV-2-RBD基因前引入tPA信号肽。与野生型基因相比，经过tPA信号肽引入及密码子优化的基因中哺乳动物细胞偏好的密码子出现频率增加，但是其编码的SARS-CoV-2-RBD氨基酸序列不变。利用体外基因重组将目的蛋白的基因序列克隆入真核表达载体pcDNA3.1中。
通过体外转染的方法研究SARS-CoV-2-RBD的表达，发明人发现pcDNA3.1-SARS-CoV-2-RBD均能够在真核细胞293F悬浮细胞中大量表达，并且可以分泌到293F细胞外。由此可见，相较于野生型的SARS-CoV-2-RBD表达载体，经过基因改造后的表达载体更便于在哺乳动物细胞中的蛋白表达。
附图说明
图1是pcDNA3.1-tPA-SARS-CoV-2-RBD-opt表达载体构建流程示意图。
图2是pcDNA3.1-tPA-SARS-CoV-2-RBD-opt真核表达载体酶切验证电泳结果图。
图3是Western Blot检测pcDNA3.1-tPA-SARS-CoV-2-RBD-opt的体外表达结果图。
图4是Western Blot检测pcDNA3.1-tPA-SARS-CoV-2-RBD-opt体外蛋白表达情况的量化结果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：密码子优化的SARS-CoV-2-RBD基因序列的设计和合成
首先用软件OptimumGeneTM分析编码蛋白SARS-CoV-2-RBD的RBD的基因序列SEQ IDNO：1，发明人再人工合成SEQ ID NO：2，即密码子优化的SARS-CoV-2-RBD蛋白RBD基因序列。由上海生工生物工程科有限公司合成，用EcoRI酶和BamHI酶双酶切后装入同样酶切的载体pCDNA3.1中，构建成重组质粒pCDNA3.1-SARS-CoV-2-RBD-opt。经测序证实合成的序列正确。
SEQ ID NO：1序列如下：
TTCACTGTAGAAAAAGGAATCTATCAAACTTCTAACTTTAGAGTCCAACCAACAGAATCTATTGTTAGATTTCCTAATATTACAAACTTGTGCCCTTTTGGTGAAGTTTTTAACGCCACCAGATTTGCATCTGTTTATGCTTGGAACAGGAAGAGAATCAGCAACTGTGTTGCTGATTATTCTGTCCTATATAATTCCGCATCATTTTCCACTTTTAAGTGTTATGGAGTGTCTCCTACTAAATTAAATGATCTCTGCTTTACTAATGTCTATGCAGATTCATTTGTAATTAGAGGTGATGAAGTCAGACAAATCGCTCCAGGGCAAACTGGAAAGATTGCTGATTATAATTATAAATTACCAGATGATTTTACAGGCTGCGTTATAGCTTGGAATTCTAACAATCTTGATTCTAAGGTTGGTGGTAATTATAATTACCTGTATAGATTGTTTAGGAAGTCTAATCTCAAACCTTTTGAGAGAGATATTTCAACTGAAATCTATCAGGCCGGTAGCACACCTTGTAATGGTGTTGAAGGTTTTAATTGTTACTTTCCTTTACAATCATATGGTTTCCAACCCACTAATGGTGTTGGTTACCAACCATACAGAGTAGTAGTACTTTCTTTTGAACTTCTACATGCACCAGCAACTGTTTGTGGACCTAAAAAGTCTACTAATTTGGTTAAAAACAAATGTGTCAATTTCAACTTC。
SEQ ID NO：2序列如下：
TTTACAGTGGAGAAGGGTATTTACCAAACATCAAACTTTAGAGTGCAACCTACAGAATCAATCGTGAGATTTCCTAACATCACAAACCTTTGCCCTTTCGGAGAAGTATTTAACGCAACAAGATTTGCATCAGTGTACGCATGGAACAGAAAGCGTATATCAAACTGCGTGGCAGATTACTCAGTGCTTTACAACTCAGCATCATTCTCTACGTTTAAATGCTACGGAGTGTCACCTACCAAACTCAACGACTTGTGCTTTACAAACGTGTACGCAGATTCATTTGTGATCAGAGGAGATGAAGTGAGACAAATCGCACCTGGACAAACAGGAAAGATTGCCGATTACAACTACAAACTTCCTGATGATTTCACCGGTTGCGTGATCGCATGGAACTCAAACAACCTTGATTCAAAGGTAGGTGGCAATTATAATTATTTGTATCGTCTATTTAGAAAGTCCAACTTGAAACCTTTCGAGCGAGATATCTCAACAGAAATCTACCAAGCAGGATCAACACCTTGCAACGGAGTGGAAGGATTTAACTGCTACTTTCCTCTTCAATCATACGGATTTCAACCTACAAACGGAGTGGGATACCAACCTTACAGAGTGGTGGTGCTTTCATTTGAACTTCTTCACGCACCTGCAACAGTGTGCGGACCTAAGAAGAGCACGAACCTTGTGAAGAATAAGTGCGTGAACTTTAACTTT。
实施例2：真核表达载体pCNDA3.1-tPA的构建
2.1目的片段和载体的获得
SARS-CoV-2-RBD-opt片段、质粒pcDNA3.1-tPA线性大片段的获得：以上述pcDNA3.1-SARS-CoV-2-RBD-opt为模板，用RBD-opt-F(CCGGATCCTTTACA GTGGAGAAGGGTAT，SEQ ID NO：3)和RBD-opt-R(CCGAATTCAAAGTTA AAGT CACGCACTTA，SEQ ID NO：4)为上下游引物进行PCR扩增密码子优化的SARS-CoV-2-RBD蛋白RBD基因序列，扩增产物用BamHI和EcoRI进行双酶切。并用BamHI和EcorI双酶切载体质粒pcDNA3.1-tPA。酶切反应体系为：10×Buffer 2μl，pcDNA3.1-tPA或相应PCR产物10μl，EcoRI 1μl，BamHⅠ1μl，补水至20μl，37℃，1h。
2.2酶切产物纯化：
TAE缓冲液制作1％琼脂糖凝胶，酶切产物进行电泳，120V，1h；称重空1.5mlEp管，紫外灯下切下含目的DNA的凝胶置入Ep管；分析天平称胶块的质量，按100mg＝100μl进行计算胶块的体积；加入至少1倍等体积的Binding Buffer；把混合物置于60℃水浴中温浴10min至凝胶完全融化，其间每隔2-3分钟混匀一次；转移溶解好的的DNA-琼脂糖溶液到一个DNA胶回收柱子，室温下，8,000×g离心1min，弃去液体；将柱子重新套回收集管中加入700μl SPW Wash buffer至HiBind DNA柱子中，室温下，8,000×g离心1分钟，弃滤出液；重复洗涤一次，将空柱子重新套回收集管中，8,000×g离心2min以甩干柱基质残余的液体；把柱子装在一个干净的1.5ml离心管上，加入30～50μl灭菌水在柱子膜上，8,000×g离心1分钟，离心管中的溶液就是纯化的DNA产物，测定DNA浓度并保存。
于-20℃。
2.3连接反应：
用T4DNA连接酶将目的片段与载体质粒pcDNA3.1-tPA线性大片段连接，得到重组表达质粒pcDNA3.1-tPA-SARS-CoV-2-RBD-opt。连接反应体系为：10×T4DNA LigaseBuffer 1μl，线性化的pcDNA3.1-tPA 1μl，纯化的SARS-CoV-2-RBD-opt片段7μl，T4DNALigase 1μl，混匀，14℃放置16h。连接物转化TOP10感受态细胞。
pcDNA3.1-tPA-SARS-CoV-2-RBD-opt真核表达载体具体构建流程如图1所示。
实施例3：重组质粒pcDNA3.1-tPA-SARS-CoV-2-RBD-opt的鉴定
3.1将pcDNA3.1-tPA-SARS-CoV-2-RBD-opt转化TOP10感受态细胞
1)无菌条件下，将5μl的pcDNA3.1-tPA-SARS-CoV-2-RBD-opt质粒加入到100μl大肠杆菌TOP10感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min。
2)将加入质粒和TOP10菌液的Ep管置于42℃水浴热击90s。
3)热冲击处理后细胞迅速置于冰上4～5min。
4)加入不含氨苄青霉素的LB培养液500μl，置于恒温振荡培养箱中，37℃，180rpm，培养30min。
5)用移液器取200μl转化菌液涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的琼脂培养板上。
6)将培养皿正面朝上并置于室温20min左右，待涂布的菌液干燥后倒置放于隔水式恒温箱中，37℃培养过夜。
3.2筛选阳性克隆
按照TIANGEN公司的Mini Plasmid Purification Kit质粒小量提取试剂盒说明书操作。
1)细菌接种：挑取pcDNA3.1-tPA-SARS-CoV-2-RBD-opt转化平皿上的单菌落接种于5ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养液中，37℃，220rpm，过夜培养。
2)将小摇过夜的细菌在无菌超净台中缓慢吸到1.5ml离心管中，培养试管中剩下少量菌液保存于4℃。
3)菌体收集：离心管中菌液，常温下5,000g离心3min，弃上清。
4)悬浮菌体：加入250μl buffer P1充分悬浮细菌沉淀。
5)碱变性：加入250μl buffer P2，温和颠倒6-8次，形成透明溶液。
6)复性：加入400μl 4℃预冷的buffer P3，温和颠倒6-8次，然后室温静置2min。
7)质粒与蛋白、基因组核酸的分离：室温13,000g，离心10min。
8)质粒的吸附：Spin Column安置于Collection Tube上，将步骤7中上清液加入到Spin Column中，12000g离心1min，弃滤液。
9)洗涤：将700μl wash buffer加入Spin Column中，12,000g离心1min，弃滤液。
10)重复洗涤一次：重复步骤11。
11)将Spin Column安置在1.5ml Ep上，在膜中央滴加50μl的灭菌蒸馏水，室温静置1min。
12)12000g离心1min，洗脱液即为含有质粒的溶液。
3.3酶切鉴定质粒pcDNA3.1-tPA-SARS-CoV-2-RBD-opt
pcDNA3.1-tPA-SARS-CoV-2-RBD-opt用ECORI和BamHⅠ进行双酶切，总反应体系(10μl)：10×Buffer 1μl，质粒(约100ng/μl)2μl，用灭菌ddH2O补足反应体系至10μl。37℃，孵育2h，10g/L琼脂糖凝胶电泳观察结果，酶切后电泳图谱见图2。图2显示pcDNA3.1-tPA-SARS-CoV-2-RBD-opt构建正确。将酶切鉴定正确的pcDNA3.1-tPA-SARS-CoV-2-RBD-opt质粒送上海生工生物公司测序，测序正确的质粒-80℃保存。
实施例4：细胞转染
293F细胞用含奥浦迈公司OPM-293CD05培养基在37℃，5﹪CO2饱和湿度120rpm摇床培养箱中培养至密度为1×106个每毫升，更换新鲜的培养基至次日，pcDNA3.1-tPA-SARS-CoV-2-RBD-opt和2.5mg/mL PEI水溶液匀后室温孵育205min，然后将上述混合液加到细胞培养摇瓶中同时以pcDNA3.1-tpA空质粒以及pcDNA3.1-SARS-CoV-2-RBD和pcDNA3.1-SARS-CoV-2-RBD-opt转染293F细胞作为对照。
实施例5：Western Blot检测pcDNA3.1-tPA-SARS-CoV-2-RBD-opt的体外表达
1)样品的制备：转染pcDNA3.1-tPA-SARS-CoV-2-RBD-opt293T细胞的裂解物20μl，加入5x上样缓冲液5μl和培养液上清20μl，加入5x上样缓冲液5μl，100℃，煮沸10min。
2)制备分离胶：制备10％分离胶，将11.9ml ddH2O，10ml 30％丙烯酰胺溶液，7.5ml Tris-HCl PH8.8，300μl 10％SDS，300μl 10％过硫酸铵，12μl TEMED，混匀，灌胶，在分离胶上方加入无水乙醇液封，室温下聚合30min。
3)制备浓缩胶：制备5％的浓缩胶，将6.8ml ddH2O，1.7ml 30％丙烯酰胺溶液，1.25ml Tris-HCl pH6.8，100μl 10％SDS，100μl 10％过硫酸铵，16μl TEMED，混匀,倒弃液封无水乙醇。)，灌胶，插入梳齿，待胶完全凝聚后，拔下梳齿，将胶转移固定至电泳槽中。
4)上样：将上述处理好的蛋白样品加入到加样孔中进行电泳，先80V 1h，然后120V继续电泳2h。
5)转膜：甲醇激活PVDF膜，在Tris-Glycine缓冲液中平衡，以300mA，1h将胶上的蛋白转到PVDF膜上。
6)封闭：转好的膜用5％脱脂奶粉封闭，室温，1h。
7)用PBST洗膜三次。
8)孵育抗体：将膜浸在BSA 1:2000稀释的带HRP的His标签抗体中，室温孵育2小时。
9)洗膜：PBST洗膜3次，每次10min。
10)ECL化学发光底物均匀加到膜上，压片显影。
结果见图3和图4，图3是Western Blot检测pcDNA3.1-tPA-SARS-CoV-2-RBD-opt的体外表达结果图。图4是其体外蛋白表达情况的量化结果图。其中空载组：真核表达载体为pcDNA3.1；RBD组：真核表达载体pcDNA3.1-SARS-CoV-2-RBD；RBD-opt组：真核表达表达载体pcDNA3.1-SARS-CoV-2-RBD-opt；tPA-RBD-opt组：真核表达载体pcDNA3.1-tPA-SARS-CoV-2-RBD-opt。从图中可以看出，空载体组的培养基上清和细胞裂解液均没有蛋白表达，RBD组只有细胞裂解液中有少量的细胞表达，RBD-opt组也只有细胞裂解液中有细胞表达，tPA-RBD-opt组的培养基上清和细胞裂解液均有大量的蛋白表达。说明SARS-CoV-2-RBD蛋白的基因序列经过密码子优化后构建的pcDNA3.1-SARS-CoV-2-RBD-opt真核表达载体转染293F悬浮细胞后可以在细胞内大量表达RBD蛋白，在SARS-CoV-2-RBD-opt序列前引入tPA信号肽后构建的pcDNA3.1-tPA-SARS-CoV-2-RBD-opt真核表达载体转染293F细胞后可以大量表达RBD蛋白并分泌到培养基中去。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Figure BDA0002977706370000081
Figure BDA0002977706370000091
Figure BDA0002977706370000101
Figure BDA0002977706370000111
SEQUENCE LISTING
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gaagtgagac aaatcgcacc tggacaaaca ggaaagattg ccgattacaa ctacaaactt 360
cctgatgatt tcaccggttg cgtgatcgca tggaactcaa acaaccttga ttcaaaggta 420
ggtggcaatt ataattattt gtatcgtcta tttagaaagt ccaacttgaa acctttcgag 480
cgagatatct caacagaaat ctaccaagca ggatcaacac cttgcaacgg agtggaagga 540
tttaactgct actttcctct tcaatcatac ggatttcaac ctacaaacgg agtgggatac 600
caaccttaca gagtggtggt gctttcattt gaacttcttc acgcacctgc aacagtgtgc 660
ggacctaaga agagcacgaa ccttgtgaag aataagtgcg tgaactttaa cttt 714
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
ccggatcctt tacagtggag aagggtat 28
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
ccgaattcaa agttaaagtc acgcactta 29

Claims (3)

1.一种SARS-CoV-2-RBD真核蛋白表达载体，其特征在于，真核蛋白表达载体为含有tPA信号肽的pcDNA3.1，信号肽序列后面连接SEQ ID NO:2所示的基因序列。
2.如权利要求1所述SARS-CoV-2-RBD真核蛋白表达载体，其特征在于，其制备方法为，
人工合成SEQ ID NO:2所示序列，引入酶切位点后酶切人工合成序列，再与同样酶切的pcDNA3.1-tPA载体连接，转化即得到pcDNA3.1-tPA-SARS-CoV-2-RBD-opt真核表达载体。
3.权利要求1所述SARS-CoV-2-RBD真核蛋白表达载体用于表达SARS-CoV-2-RBD的用途。
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