CN113249352B - 一种n糖基转移酶突变体p1及其应用 - Google Patents

一种n糖基转移酶突变体p1及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种N糖基转移酶突变体P1，是对来源于胸膜肺炎放线杆菌中的N‑糖基转移酶基因经过S33A、M158L、K203Q三点突变获得；其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还公开了所述突变体P1作为体内多肽糖基化修饰的工具酶在利用UDP‑Glc将含有N‑X‑S/T序列的多肽进行糖基化形成糖肽或糖蛋白中的应用。本发明的突变体P1完全丧失了对UDP‑Gal的利用能力，但仍保留利用UDP‑Glc进行糖基化的能力，能用来构建大肠杆菌表达系统或者枯草芽孢杆菌表达系统利用微生物体内的UDP‑Glc生产带有均一Glc的糖肽或者糖蛋白，避免了比较昂贵的底物UDP‑Glc的使用。这为多肽与蛋白的糖基化修饰提供了一种新的途径，为糖蛋白疫苗的合成提供了一种简便的方法。

Description

一种N糖基转移酶突变体P1及其应用
技术领域
本发明涉及一种糖基转移酶及其应用，尤其涉及一种来源于胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)中的N-糖基转移酶的突变体(命名为P1)及其应用，属于分子生物学中糖工程技术领域。
背景技术
蛋白质的糖基化修饰对蛋白质的功能和理化性质有着极大的影响。通过ER途径合成的蛋白大部分被N-连接聚糖修饰。N-连接的聚糖可以促进蛋白正确折叠、改善蛋白的水溶性、调节药物蛋白代谢半衰期。
目前使用化学合成或者生物体内提取生产糖蛋白的方式成本昂贵且工艺复杂。NGT能够直接将游离的UDP-Glc/UDP-Gal添加到具有N-X-S/T的肽序列上，然而体外利用NGT合成糖肽或者糖蛋白时，UDP-Glc和UDP-Gal成本较高，而利用大肠杆菌或者枯草芽孢杆菌表达系统体内表达NGT合成糖肽或者糖蛋白时NGT识别的糖供体并不专一，导致无法合成均一带有Glc的糖肽或者糖蛋白。经检索，有关完全丧失对UDP-Gal的利用能力，但是仍保留利用UDP-Glc进行糖基化的能力，并可以转入大肠杆菌或者枯草芽孢杆菌体内作为体内糖基化系统生产带有均一Glc的糖肽的专一性提高的N-糖基转移酶还未见报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种完全丧失了对UDP-Gal的利用能力，但是仍保留利用UDP-Glc进行糖基化的能力的N糖基转移酶突变体P1及其应用。
本发明所述的N糖基转移酶突变体，是对NCBI Reference Sequence:WP_005605627.1的来源于胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)中的N-糖基转移酶基因经过S33A、M158L、K203Q三点突变获得；其特征在于：所述突变体命名为N糖基转移酶突变体P1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，该突变体完全丧失了对UDP-Gal的利用能力，但是仍保留利用UDP-Glc进行糖基化的能力。
上述N糖基转移酶突变体P1是通过将野生型N糖基转移酶(NCBI ReferenceSequence:WP_005605627.1)胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)中的N-糖基转移酶基因构建于载体pET45b上，利用诺唯赞一步法多点突变试剂盒(C25-01)构建突变P1(S33A、M158L、K203Q三点突变)，经过生工生物工程股份有限公司测序正确后，通过大肠杆菌BL21发酵诱导表达、纯化回收获得。
本发明所述N糖基转移酶突变体在对多肽进行N连接糖基化修饰中的应用。
进一步的，本发明所述N糖基转移酶突变体作为体内多肽糖基化修饰的工具酶在利用UDP-Glc将含有N-X-S/T序列的多肽进行糖基化形成糖肽或糖蛋白中的应用。
其中：所述的突变体即N糖基转移酶突变体P1完全丧失了对UDP-Gal的利用能力，但仍保留利用UDP-Glc进行糖基化的能力，能用来构建大肠杆菌表达系统或者枯草芽孢杆菌表达系统利用微生物体内的UDP-Glc生产带有均一Glc的糖肽或者糖蛋白。
本发明公开的N糖基转移酶突变体属于N-糖基化修饰的一种重要的糖基转移酶，其可以简单快速的利用UDP-Glc将含有N-X-S/T序列的多肽进行糖基化，并且其专一性提高，只识别UDP-Glc，故可以转入大肠杆菌或者枯草芽孢杆菌利用微生物体内的UDP-Glc生产带有Glc的糖蛋白，而避免体外合成需要使用比较昂贵的UDP-Glc。进一步的可以利用其他的糖基转移酶对糖肽的糖链进行修饰，从而获得目的糖肽。这为多肽与蛋白的糖基化修饰提供了一种新的途径，为糖蛋白疫苗的合成提供了一种简便的方法。
附图说明
图1：P1蛋白的SDS-PAGE考马斯亮蓝染色结果
其中：M为Maker，P1约70KD。
图2：P1蛋白利用UDP-Glc和UDP-Gal的MS结果
其中：a.供体为UDP-Glc；b.供体为UDP-Gal。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，应该说明的是，下述说明仅仅是为了解释本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
下述实施例中，所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均从商业途径得到。其中所涉及的试剂和耗材来源见表1。
表1实施例所涉及的试剂和耗材来源明细
Figure BDA0003066367670000021
实施例1：N糖基转移酶ApNGT突变体P1的构建及P1蛋白的表达与纯化和鉴定
1、表达菌株的构建
野生型N糖基转移酶(NCBI Reference Sequence:WP_005605627.1)胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)中的N-糖基转移酶基因由南京金斯瑞公司合成并构建于载体pET45b上，其商品化菌株为DH5α-pET45b-ApNGT菌株。
使用DH5α-pET45b-ApNGT菌株，提前用含0.1mg/mL的LB液体培养基170rpm，37℃培养DH5α-pET45b-ApNGT菌株至OD600达到0.6，并提质粒作为模板。
按照诺唯赞一步法多点突变试剂盒(C25-01)说明书，结合诺唯赞在线设计引物程CE Design设计诱变引物(见表2)，对来源于胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)中的N-糖基转移酶基因的S33A、M158L、K203Q三点突变，获得N-糖基转移酶的突变体。
表2：构建P1突变体所需要的引物
Figure BDA0003066367670000031
使用诱变引物分段扩增携带突变的片段，并使用琼脂糖凝胶电泳确定扩增片段大小的正确，确定正确后进行Dpn I酶消化，去除甲基化模板质粒。然后按照试剂盒的重组环化系统将携带突变的片段进行重组环化，重组之后转入DH5α感受态细胞，涂含有0.1mg/mL的氨苄青霉素固体LB平板，培养16h后挑取克隆交于上海生工生物工程公司测序，测序正确后确定为是N-糖基转移酶的突变体(命名为P1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)，重新提质粒转入BL21(DE3)感受态细胞进行表达。
2、P1蛋白的表达与纯化和鉴定
待P1突变体转入BL21感受态细胞后，接种于1L含有0.1mg/mL的氨苄青霉素LB液体培养基中，37℃，200rpm下培养至OD600达到0.6，加入IPTG至终浓度0.2mM，16℃培养20h。结束培养后8000rpm，离心10min收集菌体。使用50mL PBS溶液重悬菌体并在冰水环境下中200W，持续2s，间停2s超声30min以破碎细胞释放蛋白，之后12000rpm，离心20min分离沉淀，取上清过Ni-填料柱纯化。
上清过Ni-填料柱后，使用10倍柱体积Washing buffer洗脱杂蛋白。之后用10倍柱体积Elution buffer洗脱并收集目的蛋白。之后收集的洗脱液加入到超滤管，每次离心30min，离心后下管液体弃掉，上管加满PBS，重复离心数次以除净咪唑，获得的目的蛋白4℃保存。
根据生工BAC蛋白浓度测定试剂盒说明书测定蛋白浓度。样品添加SDS-PAGE上样缓冲液后，煮沸10min，上样到12％SDS-PAGE胶中，130V电泳90min，之后染色2h，再脱色。P1蛋白的SDS-PAGE考马斯亮蓝染色结果见图1。
实施例2：N糖基转移酶突变体P1在多肽糖基化修饰中的应用
分别以UDP-Glc/UDP-Gal作为糖供体，以20uL表3所示反应体系在37℃下反应3h，反应结束后100℃加热10min，12000rpm离心10min取上清液稀释100倍，用于ESI-MS检测。
表3：反应体系。
Figure BDA0003066367670000041
P1蛋白利用UDP-Glc和UDP-Gal的MS结果见图2。结果表明：与野生型NGT对比，突变体P1完全丧失了UDP-Gal的识别能力，并且和野生型NGT一样同样能完全糖基化血凝素片段PAVGNCSSALR，因此可以用来构建体内糖基化系统，用于生产均一带有Glc的糖肽或者糖蛋白。避免了体外糖基化修饰需要的比较昂贵的UDP-Glc。在进一步别的糖基转移酶的修饰下，就可以生产带有不同糖基化修饰的糖肽。
序列表
<110>山东大学
<120>一种N糖基转移酶突变体P1及其应用
<141>2021-05-12
<160>1
<210>1
<211> 620
<212>PRT
<213>人工序列
<221>P1的氨基酸序列
<222>（1）…（620）
MENENKPNVA NFEAAVAAKD YEKACSELLL ILAQLDSNFG GIHEIEFEYP AQLQDLEQEK 60
IVYFCTRMAT AITTLFSDPV LEISDLGVQR FLVYQRWLAL IFASSPFVNA DHILQTYNRE 120
PNRKNSLEIH LDSSKSSLIK FCILYLPESN VNLNLDVLWN ISPELCASLC FALQSPRFVG 180
TSTAFNKRAT ILQWFPRHLD QLQNLNNIPS AISHDVYMHC SYDTSVNKHD VKRALNHVIR 240
RHIESEYGWK DRDVAHIGYR NNKPVMVVLL EHFHSAHSIY RTHSTSMIAA REHFYLIGLG 300
SPSVDQAGQE VFDEFHLVAG DNMKQKLEFI RSVCESNGAA IFYMPSIGMD MTTIFASNTR 360
LAPIQAIALG HPATTHSDFI EYVIVEDDYV GSEECFSETL LRLPKDALPY VPSALAPEKV 420
DYLLRENPEV VNIGIASTTM KLNPYFLEAL KAIRDRAKVK VHFHFALGQS NGITHPYVER 480
FIKSYLGDSA TAHPHSPYHQ YLRILHNCDM MVNPFPFGNT NGIIDMVTLG LVGVCKTGAE 540
VHEHIDEGLF KRLGLPEWLI ANTVDEYVER AVRLAENHQE RLELRRYIIE NNGLNTLFTG 600
DPRPMGQVFL EKLNAFLKEN 620

Claims (3)

1.一种N糖基转移酶突变体，其特征在于：所述突变体是对NCBI Reference Sequence:WP_005605627.1的来源于胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae）中的N-糖基转移酶基因经过S33A、M158L、K203Q三点突变获得；所述突变体命名为N糖基转移酶突变体P1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，该突变体完全丧失了对UDP-Gal的利用能力，但是仍保留利用UDP-Glc进行糖基化的能力。
2.权利要求1所述N糖基转移酶突变体作为微生物体内多肽糖基化修饰的工具酶在利用UDP-Glc将含有N-X-S/T序列的多肽进行糖基化形成糖肽中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的突变体即N糖基转移酶突变体P1完全丧失了对UDP-Gal的利用能力，但仍保留利用UDP-Glc进行糖基化的能力，能用来构建大肠杆菌表达系统或者枯草芽孢杆菌表达系统利用微生物体内的UDP-Glc 生产带有均一Glc的糖肽。
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