CN108118041B

CN108118041B - 一种磷脂酶d突变体、重组基因工程菌及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN108118041B
Application number: CN201711476894.1A
Authority: CN
Inventors: 王方华; 王永华; 吴宗泽; 杨博; 魏瑞霞
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2017-12-29
Filing date: 2017-12-29
Publication date: 2020-07-28
Anticipated expiration: 2037-12-29
Also published as: CN108118041A

Abstract

本发明公开了一种磷脂酶D突变体、重组基因工程菌及其制备方法和应用，所述的磷脂酶D突变体是在氨基酸序列为SEQ ID NO:1的亲本序列基础上删除C末端12～47个氨基酸所得。本发明获得两个磷脂酶D突变体，实验测定突变体1的酶活力较野生型提高了3.7倍，同时最适反应温度由原来的45℃提高到50℃；突变体2的酶活力较野生型提高了6倍，同时最适反应温度由原来的45℃提高到60℃。本发明突变体在没有改变其最适作用pH的情况下，显著提高了其最适反应温度及其自身酶活力，催化性能的提升进一步提升了该酶的工业利用价值。

Description

一种磷脂酶D突变体、重组基因工程菌及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于酶的基因工程技术领域，具体地说涉及利用分子生物学技术获得催化性能显著提高的磷脂酶D突变体及其大肠杆菌重组表达制备方法。

背景技术

磷脂酶D(Phospholipase D,PLD)(EC 3.1.4.4)是催化磷酸二酯键水解和碱基交换反应的一类酶的总称。PLD分布在从细菌到高等动植物的许多生物类群中，其在生物体内的主要生理功能是参与细胞脂质代谢，信号转导及生物膜形成等；在体外，PLD现已成为合成和改造磷脂质的重要工具酶，基于PLD所特有的碱基交换活性可对磷脂进行改性，制备高纯度的单一磷脂、稀有磷脂及系列功能性磷脂，使其在食品和医药工业中具有极大的应用价值。因此，开发有工业应用价值的PLD具有重要的战略意义和发展前景。

目前，在PLD酶蛋白开发方面，相较于其他类型酶蛋白(蛋白酶、脂肪酶等)，国际上整体还处于起步阶段，存在较大的发展空间。全球可购买到的商品化PLD不超过10种，其中链霉菌来源的占绝大多数，并主要由日本的几个公司所垄断，国内未见有商品化的PLD。磷脂酶D来源单一、酶活力低下、制备难度大、成本高是当前制约该类酶开发的技术瓶颈。原因主要表现在以下几个方面：

首先，从磷脂酶D来源看，尽管已报道PLD在动物、植物组织和一些微生物体内均有存在，然而动物来源的PLD因大多是和细胞膜结合的，难以进行大规模生产，而植物来源的PLD主要采取提取的方法以植物组织(如白菜叶)作为主要原料制备获得，存在产量低、成本高的问题，限制了其工业化生产。与动植物来源磷脂酶D相比，微生物PLD因其具有较强的底物耐受性，较宽广的底物专一性和较高的碱基交换反应催化活性，从上世纪70年代起引起了研究者的高度关注，并由此开始研究开发微生物来源的PLD。至今文献己报道的产磷脂酶D的微生物种类主要有链霉菌、棒状杆菌、大肠杆菌、沙门氏杆菌、假单胞菌等。其中以放线菌中的链霉菌属产酶微生物报道最多，酶源单一性问题突出，仍需进一步拓展酶源空间。

其次，从磷脂酶的制备来看，目前主要通过两种方式进行制备。一种是采用微生物发酵的方式获得，这也是目前商业化PLD的主要制备方式，其主要采用野生链霉菌或经简单物理化学诱变的链霉菌发酵产酶获得，发酵周期长(一般要7天)、产酶水平低、生产成本高，导致价格非常昂贵，给实际应用带来很多困难。第二种方式是利用工程菌进行基因重组表达实现酶蛋白制备。国内的路福平、薛长湖，日本的Yugo Iwasaki，Tadashi Hatanaka等人分别尝试将链霉菌的PLD基因在大肠杆菌中进行表达，但是PLD在大肠杆菌大部分以无活性的包涵体存在，经过发酵条件优化得到的酶活也只与野生菌相当或略高，仍然无法实现大规模生产。除此之外，还有研究者尝试将PLD在毕赤酵母、枯草芽孢杆菌、链霉菌等进行表达，虽然能够成功表达目的蛋白，但至今未见有商品化产品。

最后，PLD自身酶学性质好坏是决定该酶是否可用于商品化酶制剂开发的关键因素，其中酶活力低下成为主要的制约因素，离工业化应用的需求还有很大的差距。利用蛋白质工程对酶分子进行改造成为解决该问题的主要方案，如中国发明专利201610402557.7中利用重组DNA技术对野生型磷脂酶D基因进行定点突变，得到活力较高的磷脂酶D基因。重组表达后，检测高活力磷脂酶D的比酶活较野生型磷脂酶D提高38-140％。

国内对磷脂酶D的研究起步较晚，在磷脂酶D发酵菌种、酶学性质等方面与国外的先进技术有很大的差距。当前，国内未见有PLD商品化酶出现，酶制剂主要依赖进口，商品化酶源的高度依赖性严重影响了我国下游酶法磷脂改性工业的健康发展。因此，急需开发新的酶学性质优良的磷脂酶D，并降低生产成本，从而促进磷脂酶D的广泛应用。实现新酶自主研发、高效制备等关键技术突破是改变当前现状的有效途径。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供一种酶活力及最适温度显著提高的哈维氏弧菌来源磷脂酶D突变体。本发明通过理性设计构建活力及最适反应温度提高的磷脂酶D突变体。由氨基酸序列为SEQ ID No.1(GenBank:WP_005435673.1)的哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)作为亲本，在此基础上，通过信号肽在线分析软件Signal P分析其信号肽序列，将去除信号肽后的蛋白序列进行同源建模，获得其三维结构，对其蛋白结构进行分析，设计将C末端12个氨基酸(WIFKKLNGEFEL)或47个氨基酸(FWRVSRDGQGQTQWQSMNEIHTKNPNYGGWHKAPNWIFKKLNGEFEL)删除，以最终得到突变体1和突变体2。

SEQ ID No.1

YPQVEPDFEANWQTTQHQADVYLIPTAPEAFARRVELVRSAQQSIDMTYFSWESDTLGLMLLNELKQAADRGVQVRLTLDDLLVFNEKWLADLSAHDNIQIRLFNPFDSRKSGWIGRAVNFSTHQQRLDNRLHEKYFNVDHQWMILGGRNIGNDYFGYSRKANFFDMDVLYKGSIIRTFDQNYQQLWDSEHVTPIENIVNVTPNYSAFTQALNKGEKDKSIILAEVEKQVKHLTSPDFITAQVTPVFDSLNKLENNKPYFRKRAEHQVWQQIATASKAVISTPYVVPSDGEFAFIDTLMEQKADITLMTNSSASNDSGFIPAYYEEHRQTLLDKGVHILEYKNQAKNDDHYFHADTYYHNKTVILDDRLTYIGSSNFDPRSDFLNVEFGVLVQSEAFAEHVMHYLTRQQDELFWRVSRDGQGQTQWQSMNEIHTKNPNYGGWHKAPNWIFKKLNGEFEL

本发明的技术方案如下：

一种磷脂酶D突变体，是在氨基酸序列为SEQ ID NO:1的亲本序列基础上删除C末端12～47个氨基酸所得。

一种磷脂酶D突变体，其氨基酸序列为SEQID NO:2或SEQID NO:3。

一种编码所述磷脂酶D突变体的基因，其核酸序列为SEQID NO:5或SEQID NO:6。

一种所述基因的重组基因工程菌，将所述基因克隆到表达载体pET-21a、pET28a或pET32a上，转化大肠杆菌SHuffle T7感受态细胞，获得重组基因工程菌。以获得的重组基因工程菌为发酵菌株进行液体发酵，制备重组磷脂酶D。以分光光度法测定突变体的酶活及最适反应温度。酶的最适温度通过将酶在相同的标准条件下采用分光光度法来测定酶对磷脂酰对硝基苯酚(P-pNP)的水解活力，酶催化活力最高时的反应温度即为该酶的最适温度。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

相比于野生型，本发明突变体1的酶活力较野生型提高了3.7倍，同时最适反应温度由原来的45℃提高到50℃；突变体2的酶活较野生型提高了6倍，同时最适反应温度由原来的45℃提高到60℃。分别在野生型及突变体酶的最适温度和pH条件下测定其酶活力，得到野生型酶活力为0.56U/g，而突变体1的比酶活为2.08U/g，突变体1的比酶活比野生型提高了3.7倍；突变体2的比酶活力为3.36U/g，突变体2的比酶活比野生型提高了6倍，说明本发明获得的磷脂酶突变体活力得到显著提高。本发明获得的磷脂酶突变体在没有改变其最适作用pH的情况下，显著提高了其最适反应温度及其自身酶活力，催化性能的提升进一步提升了该酶的工业利用价值，可用于食品、制药生产中。

附图说明

图1为野生型PLD-VH及突变体蛋白纯化SDS-PAGE检测结果图。

图2.磷脂酶D突变体1(b)、突变体2(c)与野生型(a)相对酶活一温度变化曲线。

图3为磷脂酶D突变体1(b)、突变体2(c)与野生型(a)相对酶活一pH变化曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步具体详细描述，但本发明的实施方式不限于此，对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。

实施例1：磷脂酶PLD-VH突变体表达载体及表达菌株的构建

(1)参照哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)磷脂酶PLD-VH完整氨基酸序列(GenBank登录号：WP_005435673.1)，通过信号肽在线分析软件Signal P分析其信号肽序列，将1-24位氨基酸从完整序列中进行删除，获得磷脂酶PLD-VH成熟肽编码序列(SEQ ID NO.1)；

(2)根据(1)所得氨基酸序列，按照大肠杆菌密码子偏好性设计磷脂酶PLD-VH基因编码序列，其碱基序列如附图SEQ ID NO.4所示(野生型)。在序列上游引入Nde I，下游引入Xho I酶切位点，所得磷脂酶PLD-VH基因序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；

(3)将(2)所合成的磷脂酶PLD-VH基因用限制性内切酶Nde I和Xho I分别对纯化的基因片段和质粒pET21a进行双酶切消化，连接，转化至大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞。涂布于LB(含100μg/mL氨苄青霉素)平板。挑取阳性克隆通过Nde I和Xho I双酶切鉴定及基因测序，获得野生型PLD-VH的pET21a-PLD-VH重组质粒；

(4)采用两步重叠延伸PCR方法构建本发明所述突变体SEQ ID NO.5，SEQ IDNO.6，首先进行引物全长的拼接，然后以含有目的基因的质粒模板进行扩增。反应条件如下：

反应条件1：

其中突变体1构建所用上游引物和下游引物序列为：

上游引物：CCAAATTATGGTGGGTGGCACAAAGCCCCAAATCTCGAGCACCACCAC

下游引物：CGGATCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGATTTGGGGCTTTGTG

突变体2构建所用上游引物和下游引物序列为：

上游引物：

ATGCATTATTTGACTAGGCAGCAGGACGAATTGCACCACCACCACCA

下游引物：AGCAGCCGGATCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCAATTCGTCCTGCTGCCPCR扩增条件:98℃，3min；98℃，10s；58℃，15s；72℃，10s；20个循环；72℃，2min。扩增产物经DNA纯化试剂盒纯化得到全长引物。

反应条件2：

PCR扩增条件:98℃，3min；98℃，10s；58℃，15s；72℃，408s；31个循环；72℃，2min。PCR产物利用DNA纯化试剂盒进行产物纯化得到磷脂酶突变基因。

用Dpn I酶切消化模板质粒，Dpn I酶切消化体系如下：

将Dpn I酶切消化体系置于37℃条件下，2h。将消化产物转化至E.coli DH5α感受态细胞。涂布于LB(含100μg/mL氨苄青霉素)平板。挑取阳性克隆通过Nde I和Xho I双酶切鉴定及基因测序，获得pET21a-PLD-VH-突变体质粒。

(5)分别将(3)、(4)所得的重组质粒转化到大肠杆菌SHuffle T7感受态细胞，挑选阳性克隆并测序验证，即获得重组pET21a-PLD-VH野生型及突变体的SHuffle T7大肠杆菌表达菌株。

实施例2：野生型PLD-VH及其突变体重组表达菌株发酵及重组蛋白纯化

(1)将重组大肠杆菌PLD-VH野生型及突变体表达菌株接种于含氨苄青霉素100μg/mL的种子培养基(NaCl 10g/L，蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，pH7.2～7.4)中，于37℃，200r/min摇瓶培养至对数生长期，作为种子液；

(2)将(1)中所述种子液按5％的接种量接种到自诱导液体发酵培养基(酶水解酪蛋白10g/L，酵母浸膏5g/L，葡萄糖0.5g/L，乳糖2g/L，甘油5g/L，磷酸氢二钠3.6g/L，磷酸二氢钾3.4g/L，氯化铵2.7g/L，硫酸钠0.7g/L，硫酸镁1g/L，pH 7.2～7.4)中，于37℃，200r/min摇瓶培养至OD₆₀₀＝0.6～0.8，再于20℃，200r/min条件下诱导培养24h；(3)将(2)中所得发酵液离心(8000r/min,5min)，收集菌体沉淀，用Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)重悬并超声破碎细胞，将细胞破碎液离心(10000r/min,20min)，取上清，即为制备得到的磷脂酶PLD-VH粗酶液；

(4)将(3)中所得磷脂酶粗酶液，用0.45μm的滤膜抽滤。滤液利用镍柱亲和层析柱纯化，流速4mL/min，最后用含10-500mM咪唑的Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)梯度洗脱，目标蛋白在100mM咪唑浓度处被洗脱下来。将洗脱下来的目的蛋白过G-25脱盐柱后，上样Q柱层析，用含有300mM NaCl的Tris-HCl缓冲液(pH 7.3)洗脱得到目的蛋白(见附图1)。

实施例3:磷脂酶酶学性质分析

(1)磷脂酶活力的测定方法

野生型磷脂酶PLD-VH及突变体磷脂酶活力的测定均采用标准的分光光度法进行测定，以磷脂酰对硝基苯酚(P-pNP)作为反应底物。取纯化后的磷脂酶酶液480μL，再加入20μLP-pNP溶液，在一定温度下反应适当时间，加入10％SDS终止反应，在405nm处测吸光值。以加热灭活的酶蛋白溶液作为反应对照组。磷脂酶活力定义为：在特定温度与pH条件下，每分钟释放1μmol对硝基酚所需要的酶量即为一个磷脂酶活力单位。用U表示。计算出比酶活(U/g)。

(2)酶最适反应温度测定

野生型及突变体磷脂酶的最适反应温度条件测定方法如下：按照上述磷脂酶活力的测定方法，固定反应pH条件为7.3，以P-pNP为底物，加入适量的酶液，使酶分别在不同温度条件下进行反应(25-70℃)，分别测定野生型及突变体的磷脂酶活力。对照组和样品组均做三组平行。以活力最高点为100％，计算不同温度条件下磷脂酶的相对酶活。以温度设定值为横坐标，相对活力为纵坐标作图。结果如图2所示，野生型磷脂酶的最适反应温度为45℃，而突变体1最适作用温度为50℃，比野生型高出5℃；突变体2最适作用温度为60℃，比野生型高出15℃。

(3)酶最适反应pH测定

野生型及突变体磷脂酶最适反应pH条件的测定方法如下：按照上述磷脂酶活力的测定方法，在各自最适反应温度条件下，以P-pNP为底物，加入不同pH值的缓冲液(4.0～13.0)(不同pH缓冲液：pH 4.0-5.0，1M柠檬酸-1M柠檬酸钠；pH6.0-7.0，1M磷酸二氢钠-1M磷酸氢二钠；pH 8.0，1M Tris-HCl；pH 9.0-10.0，1M Gly-NaOH；pH 11.0-12.0，1M磷酸氢二钠-1M氢氧化钠缓冲液；pH 13.0，1M氯化钾-1M氢氧化钠缓冲液)，使酶在不同pH环境条件下进行反应，测定不同pH环境条件下各突变体酶液的磷脂酶活力。对照组和样品组均做三组平行。以pH值为横坐标，对应的酶比活力为纵坐标作图。以活力最高点为100％，计算不同pH条件下野生型及突变体的相对酶活。结果如附图3所示，野生型磷脂酶与突变体1,2的最适作用pH均为8.0，截短突变未造成最适反应pH的改变(附图3)。

分别在野生型及突变体酶的最适温度和pH条件下测定其酶活力，得到野生型酶活力为0.56U/g，而突变体1的比酶活为2.08U/g，突变体1的比酶活比野生型提高了3.7倍；突变体2的比酶活力为3.36U/g，突变体2的比酶活比野生型提高了6倍，从而说明本发明获得的磷脂酶突变体活力得到显著提高。

综上所述，与野生型相比，本发明获得的磷脂酶突变体在没有改变其最适作用pH的情况下，显著提高了其最适反应温度及其自身酶活力，更适合应用于食品、医药等工业领域，具有广阔的市场空间。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<120> 一种磷脂酶D突变体、重组基因工程菌及其制备方法和应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 459

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Tyr Pro Gln Val Glu Pro Asp Phe Glu Ala Asn Trp Gln Thr Thr Gln

1 5 10 15

His Gln Ala Asp Val Tyr Leu Ile Pro Thr Ala Pro Glu Ala Phe Ala

20 25 30

Arg Arg Val Glu Leu Val Arg Ser Ala Gln Gln Ser Ile Asp Met Thr

35 40 45

Tyr Phe Ser Trp Glu Ser Asp Thr Leu Gly Leu Met Leu Leu Asn Glu

50 55 60

Leu Lys Gln Ala Ala Asp Arg Gly Val Gln Val Arg Leu Thr Leu Asp

65 70 75 80

Asp Leu Leu Val Phe Asn Glu Lys Trp Leu Ala Asp Leu Ser Ala His

85 90 95

Asp Asn Ile Gln Ile Arg Leu Phe Asn Pro Phe Asp Ser Arg Lys Ser

100 105 110

Gly Trp Ile Gly Arg Ala Val Asn Phe Ser Thr His Gln Gln Arg Leu

115 120 125

Asp Asn Arg Leu His Glu Lys Tyr Phe Asn Val Asp His Gln Trp Met

130 135 140

Ile Leu Gly Gly Arg Asn Ile Gly Asn Asp Tyr Phe Gly Tyr Ser Arg

145 150 155 160

Lys Ala Asn Phe Phe Asp Met Asp Val Leu Tyr Lys Gly Ser Ile Ile

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225 230 235 240

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245 250 255

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275 280 285

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305 310 315 320

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325 330 335

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355 360 365

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370 375 380

Asn Val Glu Phe Gly Val Leu Val Gln Ser Glu Ala Phe Ala Glu His

385 390 395 400

Val Met His Tyr Leu Thr Arg Gln Gln Asp Glu Leu Phe Trp Arg Val

405 410 415

Ser Arg Asp Gly Gln Gly Gln Thr Gln Trp Gln Ser Met Asn Glu Ile

420 425 430

His Thr Lys Asn Pro Asn Tyr Gly Gly Trp His Lys Ala Pro Asn Trp

435 440 445

Ile Phe Lys Lys Leu Asn Gly Glu Phe Glu Leu

450 455

<210> 2

<211> 447

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Tyr Pro Gln Val Glu Pro Asp Phe Glu Ala Asn Trp Gln Thr Thr Gln

1 5 10 15

His Gln Ala Asp Val Tyr Leu Ile Pro Thr Ala Pro Glu Ala Phe Ala

20 25 30

Arg Arg Val Glu Leu Val Arg Ser Ala Gln Gln Ser Ile Asp Met Thr

35 40 45

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50 55 60

Leu Lys Gln Ala Ala Asp Arg Gly Val Gln Val Arg Leu Thr Leu Asp

65 70 75 80

Asp Leu Leu Val Phe Asn Glu Lys Trp Leu Ala Asp Leu Ser Ala His

85 90 95

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100 105 110

Gly Trp Ile Gly Arg Ala Val Asn Phe Ser Thr His Gln Gln Arg Leu

115 120 125

Asp Asn Arg Leu His Glu Lys Tyr Phe Asn Val Asp His Gln Trp Met

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165 170 175

Arg Thr Phe Asp Gln Asn Tyr Gln Gln Leu Trp Asp Ser Glu His Val

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His Ala Asp Thr Tyr Tyr His Asn Lys Thr Val Ile Leu Asp Asp Arg

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Leu Thr Tyr Ile Gly Ser Ser Asn Phe Asp Pro Arg Ser Asp Phe Leu

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Asn Val Glu Phe Gly Val Leu Val Gln Ser Glu Ala Phe Ala Glu His

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<210> 3

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

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1 5 10 15

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Arg Arg Val Glu Leu Val Arg Ser Ala Gln Gln Ser Ile Asp Met Thr

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340 345 350

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405 410

<210> 4

<211> 1377

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

taccctcaag tagagccaga ttttgaggca aactggcaaa caacacaaca tcaagcagat 60

gtatacctaa tccctacagc accagaagct tttgcaagaa gagttgaact agtaagatct 120

gcacagcaat ctatcgatat gacatacttc tcctgggaat ctgatactct gggacttatg 180

ctattgaacg aactgaagca agctgctgat agaggagttc aagttagatt gactctagat 240

gaccttcttg ttttcaatga gaagtggctt gctgacttat ccgcacatga taacatccag 300

attagactgt tcaacccttt cgattctagg aaatcaggat ggatcggaag ggcagtaaac 360

tttagtacac accaacaaag attggataac agactgcatg agaaatactt caacgtcgat 420

catcaatgga tgatccttgg tggtcgtaat atcggtaacg attactttgg atactccaga 480

aaggctaact tcttcgatat ggacgttctg tacaagggtt ctatcatcag aacgttcgat 540

cagaactacc aacaactttg ggattccgaa catgttacgc caattgagaa cattgttaac 600

gtcacgccta actactctgc tttcacacaa gctttgaaca aaggagagaa ggataaatcc 660

attatactgg ccgaggttga gaaacaagtt aaacacctga cctcaccaga ctttattacc 720

gctcaagtta cccctgtttt tgattccttg aacaagttgg agaacaataa gccttacttc 780

cgtaaacgag ctgagcatca agtttggcaa caaatagcta ccgcttcaaa ggctgtcatt 840

tctactccct atgtcgtgcc atctgatggt gagttcgctt ttattgatac tttaatggaa 900

cagaaagctg atattaccct aatgaccaat tcatcagcca gtaatgactc cggtttcata 960

cccgcctatt atgaggaaca tcgacaaact ttgttagata aaggcgtgca tattttggaa 1020

tacaagaatc aggccaagaa tgacgaccac tattttcacg ccgacactta ttatcacaat 1080

aagaccgtga tattggacga ccgattgact tatattggct cttcaaattt tgacccccgt 1140

agtgactttt taaatgtgga atttggcgtc ttagtccaga gtgaagcctt tgccgaacac 1200

gtgatgcatt atttgactag gcagcaggac gaattgtttt ggagggtcag tcgtgacggt 1260

cagggtcaga ctcagtggca gtcaatgaat gaaattcaca ctaagaatcc aaattatggt 1320

gggtggcaca aagccccaaa ttggattttt aagaaattga atggggaatt tgaatta 1377

<210> 5

<211> 1341

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

taccctcaag tagagccaga ttttgaggca aactggcaaa caacacaaca tcaagcagat 60

gtatacctaa tccctacagc accagaagct tttgcaagaa gagttgaact agtaagatct 120

gcacagcaat ctatcgatat gacatacttc tcctgggaat ctgatactct gggacttatg 180

ctattgaacg aactgaagca agctgctgat agaggagttc aagttagatt gactctagat 240

gaccttcttg ttttcaatga gaagtggctt gctgacttat ccgcacatga taacatccag 300

attagactgt tcaacccttt cgattctagg aaatcaggat ggatcggaag ggcagtaaac 360

tttagtacac accaacaaag attggataac agactgcatg agaaatactt caacgtcgat 420

catcaatgga tgatccttgg tggtcgtaat atcggtaacg attactttgg atactccaga 480

aaggctaact tcttcgatat ggacgttctg tacaagggtt ctatcatcag aacgttcgat 540

cagaactacc aacaactttg ggattccgaa catgttacgc caattgagaa cattgttaac 600

gtcacgccta actactctgc tttcacacaa gctttgaaca aaggagagaa ggataaatcc 660

attatactgg ccgaggttga gaaacaagtt aaacacctga cctcaccaga ctttattacc 720

gctcaagtta cccctgtttt tgattccttg aacaagttgg agaacaataa gccttacttc 780

cgtaaacgag ctgagcatca agtttggcaa caaatagcta ccgcttcaaa ggctgtcatt 840

tctactccct atgtcgtgcc atctgatggt gagttcgctt ttattgatac tttaatggaa 900

cagaaagctg atattaccct aatgaccaat tcatcagcca gtaatgactc cggtttcata 960

cccgcctatt atgaggaaca tcgacaaact ttgttagata aaggcgtgca tattttggaa 1020

tacaagaatc aggccaagaa tgacgaccac tattttcacg ccgacactta ttatcacaat 1080

aagaccgtga tattggacga ccgattgact tatattggct cttcaaattt tgacccccgt 1140

agtgactttt taaatgtgga atttggcgtc ttagtccaga gtgaagcctt tgccgaacac 1200

gtgatgcatt atttgactag gcagcaggac gaattgtttt ggagggtcag tcgtgacggt 1260

cagggtcaga ctcagtggca gtcaatgaat gaaattcaca ctaagaatcc aaattatggt 1320

gggtggcaca aagccccaaa t 1341

<210> 6

<211> 1236

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

taccctcaag tagagccaga ttttgaggca aactggcaaa caacacaaca tcaagcagat 60

gtatacctaa tccctacagc accagaagct tttgcaagaa gagttgaact agtaagatct 120

gcacagcaat ctatcgatat gacatacttc tcctgggaat ctgatactct gggacttatg 180

ctattgaacg aactgaagca agctgctgat agaggagttc aagttagatt gactctagat 240

gaccttcttg ttttcaatga gaagtggctt gctgacttat ccgcacatga taacatccag 300

attagactgt tcaacccttt cgattctagg aaatcaggat ggatcggaag ggcagtaaac 360

tttagtacac accaacaaag attggataac agactgcatg agaaatactt caacgtcgat 420

catcaatgga tgatccttgg tggtcgtaat atcggtaacg attactttgg atactccaga 480

aaggctaact tcttcgatat ggacgttctg tacaagggtt ctatcatcag aacgttcgat 540

cagaactacc aacaactttg ggattccgaa catgttacgc caattgagaa cattgttaac 600

gtcacgccta actactctgc tttcacacaa gctttgaaca aaggagagaa ggataaatcc 660

attatactgg ccgaggttga gaaacaagtt aaacacctga cctcaccaga ctttattacc 720

gctcaagtta cccctgtttt tgattccttg aacaagttgg agaacaataa gccttacttc 780

cgtaaacgag ctgagcatca agtttggcaa caaatagcta ccgcttcaaa ggctgtcatt 840

tctactccct atgtcgtgcc atctgatggt gagttcgctt ttattgatac tttaatggaa 900

cagaaagctg atattaccct aatgaccaat tcatcagcca gtaatgactc cggtttcata 960

cccgcctatt atgaggaaca tcgacaaact ttgttagata aaggcgtgca tattttggaa 1020

tacaagaatc aggccaagaa tgacgaccac tattttcacg ccgacactta ttatcacaat 1080

aagaccgtga tattggacga ccgattgact tatattggct cttcaaattt tgacccccgt 1140

agtgactttt taaatgtgga atttggcgtc ttagtccaga gtgaagcctt tgccgaacac 1200

gtgatgcatt atttgactag gcagcaggac gaattg 1236

Claims

1.一种磷脂酶D突变体，其特征在于，所述的磷脂酶D突变体是在氨基酸序列为SEQ IDNO:1的亲本序列基础上删除C末端12或47个氨基酸所得，其氨基酸序列为SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3。

2.一种编码权利要求1所述磷脂酶D突变体的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，其核酸序列为SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6。

4.一种含权利要求2或3所述基因的重组基因工程菌。

5.权利要求4所述重组基因工程菌的制备方法，其特征在于，将权利要求3或4所述基因克隆到表达载体pET-21a、pET28a或pET32a上，转化大肠杆菌SHuffle T7感受态细胞，获得重组基因工程菌。

6.权利要求1所述磷脂酶D突变体的应用，其特征在于，所述的磷脂酶D突变体应用于食品、制药生产中。