CN113073107B - 一种甘露聚糖酶基因AbMan5、重组表达质粒、重组表达菌株、甘露聚糖酶及其应用 - Google Patents

一种甘露聚糖酶基因AbMan5、重组表达质粒、重组表达菌株、甘露聚糖酶及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种甘露聚糖酶基因AbMan5、重组表达质粒、重组表达菌株、甘露聚糖酶及其应用，其中，所述甘露聚糖酶基因AbMan5用于编码甘露聚糖酶，所述甘露聚糖酶基因AbMan5的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，编码所得的甘露聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明提供的甘露聚糖酶基因AbMan5，由其编码所得的甘露聚糖酶在高温下具有高活性，且pH稳定性良好，可用于动物饲料添加剂、食品添加剂以及甘露寡糖的制备。

Description

一种甘露聚糖酶基因AbMan5、重组表达质粒、重组表达菌株、 甘露聚糖酶及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种甘露聚糖酶基因AbMan5、重组表达质粒、重组表达菌株、甘露聚糖酶及其应用。
背景技术
利用甘露聚糖酶专一性地催化甘露糖的降解具有巨大的应用价值，然而，由于蛋白质序列的差异，来自不同微生物的甘露聚糖酶往往具有不同的酶学性质，例如，不同的反应温度和pH，不一样的温度、酸碱度以及盐度的耐受性，以及不同的产物类型(产物为不同长度的甘露寡糖)等，但是在高温条件下具有高活性的甘露聚糖较为少见。
发明内容
本发明的主要目的是提出一种甘露聚糖酶基因AbMan5、重组表达质粒、重组表达菌株、甘露聚糖酶及其应用，旨在提供一种在高温下具有高活性的甘露聚糖酶。
为实现上述目的，本发明提出一种甘露聚糖酶基因AbMan5，用于编码甘露聚糖酶，所述甘露聚糖酶基因AbMan5的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明还提出一种甘露聚糖酶，所述甘露聚糖酶由如上所述的甘露聚糖酶基因AbMan5编码所得，且所述甘露聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明还提出一种重组表达质粒，所述重组表达质粒包括如上所述的甘露聚糖酶基因AbMan5。
可选地，所述重组表达质粒还包括表达载体pET-28a。
本发明还提出一种如上所述的重组表达质粒的制备方法，包括以下步骤：
将甘露聚糖酶基因通过酶切位点EcoR I和Not I连接到载体pET-28a上，连接产物转化到大肠杆菌DH5α中，用试剂盒提取质粒，获得重组表达质粒pET-28a-AbMan5。
本发明还提出一种重组表达菌株，所述重组表达菌株包括如上所述的甘露聚糖酶基因AbMan5。
可选地，所述重组表达菌株的宿主细胞为大肠杆菌。
本发明还提出一种如上所述的重组表达菌株的制备方法，包括以下步骤：
将甘露聚糖酶基因AbMan5通过酶切位点EcoR I和Not I连接到载体pET-28a上，连接产物转化到大肠杆菌DH5α中，用试剂盒提取质粒，获得重组表达质粒pET-28a-AbMan5；
将重组表达质粒pET-28a-AbMan5采用CaCl2法转化大肠杆菌BL21(Rosetta)，得到含有质粒pET-28a-AbMan5的重组大肠杆菌BL21(Rosetta)，即为重组表达菌株。
本发明还提出一种如上所述得甘露聚糖酶的制备方法，包括如下步骤：
将甘露聚糖酶基因通过酶切位点EcoR I和Not I连接到载体pET-28a上，连接产物转化到大肠杆菌DH5α中，用试剂盒提取质粒，获得重组表达质粒pET-28a-AbMan5；
将重组表达质粒pET-28a-AbMan5采用CaCl2法转化大肠杆菌BL21(Rosetta)，得到含有质粒pET-28a-AbMan5的重组大肠杆菌BL21(Rosetta)；
将含有质粒pET-28a-AbMan5的大肠杆菌BL21(Rosetta)按1：(90～110)的比例接种至ZYP-5052培养基中，于37℃、180～220rpm条件下培养至OD600为0.95～1.05，然后将温度降低至18～22℃，继续培养20～26h后，离心收集菌体，将菌体悬浮液于HisTrap A缓冲液，然后通过压力破碎后离心离心取上清液；
在8～10℃的温度环境下，将上清液通过HisTrap亲和层析柱后，使用HisTrap B缓冲液在AKTA蛋白纯化仪上梯度洗脱层析柱上的重组蛋白，然后使用截留分子量为10KDa的Millipore浓缩管将重组蛋白换液至磷酸盐缓冲液中浓缩至蛋白浓度为1mg/mL，得到纯化的甘露聚糖酶。
可选地，所述HisTrap A缓冲液的pH值为7.4，所述HisTrap A缓冲液包括以下摩尔浓度的组分：500mM的NaCl、20mM的咪唑和20mM的Na2HPO4。
可选地，所述HisTrap B缓冲液的pH值为7.4，所述HisTrap B缓冲液包括以下摩尔浓度的组分500mM的NaCl、500mM的咪唑和20mM的Na2HPO4。
可选地，所述ZYP-5052培养基包括以下浓度的组分：1％酵母提取物、5％蛋白胨、50mM Na2HPO4、50mM KH2PO4、25mM(NH4)2SO4、0.5％丙三醇、0.05％葡萄糖、0.2％乳糖、2mMMgSO4、100μg/mL卡那霉素和34μg/mL氯霉素。
可选地，所述磷酸盐缓冲液包括以下摩尔浓度的组分：137mM NaCl、2.7mM KCL、10mM Na2HPO4和1.8mM KH2PO4。
此外，本发明还提出一种制备甘露寡糖的方法，包括以下步骤：采用如上所述的甘露聚糖酶水解甘露糖，得到甘露寡糖。
进一步地，本发明还提出一种饲料添加剂，所述饲料添加剂包括如上所述的甘露聚糖酶。
更进一步地，本发明还提出一种食品添加剂，所述食品添加剂包括如上所述的甘露聚糖酶。
本发明提供的甘露聚糖酶基因AbMan5，由其编码所得的甘露聚糖酶在高温下具有高活性，且pH稳定性良好，可用于动物饲料添加剂、食品添加剂以及甘露寡糖的制备。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实施例4制备的甘露聚糖酶中，甘露聚糖酶基因AbMan5的蛋白表达分析结果图；
图2为实施例4制备的甘露聚糖酶在不同pH值条件下的相对酶活；
图3为实施例4制备的甘露聚糖酶在不同温度条件下的相对酶活；
图4为实施例4制备的甘露聚糖酶的pH稳定性分析结果图；
图5为实施例4制备的甘露聚糖酶的温度稳定性分析结果图。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
由于蛋白质序列的差异，来自不同微生物的甘露聚糖酶往往具有不同的酶学性质，例如，不同的反应温度和pH，不一样的温度、酸碱度以及盐度的耐受性，以及不同的产物类型(产物为不同长度的甘露寡糖)等，但是在高温条件下具有高活性的甘露聚糖较为少见。
鉴于此，本发明提出一种甘露聚糖酶基因AbMan5，用于编码甘露聚糖酶，所述甘露聚糖酶基因AbMan5的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明提供的甘露聚糖酶基因AbMan5在GenBank基因数据库中通过对比探索(BLASTp,为美国国立生物信息研究中心开发的免费序列相似性探索程序网址为：https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)找到一种来源于海洋微生物(Alteromonadaceaebacterium Bs31)的甘露聚糖酶基因，然后通过人工合成得到其密码子并优化核苷酸，得到如SEQ ID NO：1所示的甘露聚糖酶基因AbMan5的核苷酸序列，所述甘露聚糖酶基因AbMan5共912个碱基。
具体操作时，可以通过以下方式实现：首先，以甘露聚糖酶蛋白质序列为查询序列，用BLASTp程序搜索微生物基因组编码的蛋白质产物，找到本发明所提出的甘露聚糖酶基因；然后根据大肠杆菌密码子的偏好性，对该甘露聚糖酶基因密码子进行优化设计，得到甘露聚糖酶基因AbMan5，甘露聚糖酶基因在苏州金唯智公司合成，合成基因的5’端和3’端带有限制性酶切位点EcoR I和Not I。该两个限制性酶切位点将用于把甘露聚糖酶基因克隆至大肠杆菌表达载体pET-28a。
需要说明的是，上述来源于海洋微生物的甘露聚糖酶编码基因序列虽然已经存在于公用、免费基因资源库(GenBank)中，并且被自动基因组注释预测为编码某种甘露聚糖酶的序列(GenBank中没有其登录号)，但是该基因所编码蛋白质的功能并没有通过任何实验进行证实。而本发明中根据大肠杆菌作为表达载体的特性，为了使该基因更好地在大肠杆菌中表达，对该基因序列的密码子进行人工优化设计，进而得到如SEQ ID NO：1所示的甘露聚糖酶基因AbMan5的核苷酸序列，然后将所述的甘露聚糖酶基因AbMan5导入大肠杆菌后进行发酵培养和提纯，得到由甘露聚糖酶基因AbMan5所编码的甘露聚糖酶，且其内切型、高温酶活、最适反应温度、最适pH、以及酶的各项动力参数在本发明中均为第一次证实。由本发明提供的甘露聚糖酶基因AbMan5编码所得的甘露聚糖酶，在高温下具有高活性，且pH稳定性良好，可用于动物饲料添加剂、食品添加剂以及甘露寡糖的制备。
本发明还提出一种甘露聚糖酶，所述甘露聚糖酶由如上所述的甘露聚糖酶基因AbMan5编码所得，且所述甘露聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。该甘露聚糖酶含有303个氨基酸残基，理论分子量为32784.17道尔顿，等电点为4.597，通过载体转入大肠杆菌后，获得重组表达菌株，然后重组表达菌株经过高密度发酵工艺、亲和纯化方法后，制得甘露聚糖酶在高温下具有高活性，可用于饲料的添加以及食品加工。
合成的甘露聚糖酶基因AbMan5位于pU57载体上，合成基因的5’端和3’端带有限制性酶切位点EcoR I和Not I，用于将甘露聚糖酶基因AbMan5克隆只合适的表达载体上，从而构建重组表达质粒。基于此，本发明还提出一种重组表达质粒，所述重组表达质粒包括如上所述的甘露聚糖酶基因AbMan5。
进一步地，所述重组表达质粒中的表达载体优选为大肠杆菌表达载体pET-28a。对应地，所述重组表达质粒的制备可通过以下步骤实现：
将人工合成获得的甘露聚糖酶基因AbMan5通过酶切位点EcoR I和Not I连接到载体pET-28a上，连接产物转化到大肠杆菌DH5α中，试剂盒提取质粒，用EcoR I和Not I双酶切质粒进行鉴定，酶切正确的即为重组表达质粒pET-28a-AbMan5。
本发明还提出一种重组表达菌株，所述重组表达菌株包括如上所述的甘露聚糖酶基因AbMan5。
将上述的重组表达质粒pET-28a-AbMan5导入表达细胞中获得重组表达菌株，目的基因即可随着宿主细胞的繁殖而复制。通常来说，所述表达细胞可以是大肠杆菌，也可以是酵母等细胞，或者是其它类型的细胞例如动物细胞等，在本实施例中，表达细胞优选为大肠杆菌BL21(Rosetta)。
进一步地，上述重组表达菌株可以通过下述步骤制得：
步骤S1、将甘露聚糖酶基因AbMan5通过酶切位点EcoR I和Not I连接到载体pET-28a上，连接产物转化到大肠杆菌DH5α中，用试剂盒提取质粒，通过EcoR I和Not I双酶切进行鉴定，酶切正确的即为重组表达质粒pET-28a-AbMan5；
步骤S2、将重组表达质粒pET-28a-AbMan5采用CaCl2法转化大肠杆菌BL21(Rosetta)，得到含有质粒pET-28a-AbMan5的重组大肠杆菌BL21(Rosetta)，即为重组表达菌株。
本发明进一步提出一种由甘露聚糖酶基因AbMan5制备甘露聚糖酶的方法，具体操作步骤如下：
步骤S10、将甘露聚糖酶基因AbMan5通过酶切位点EcoR I和Not I连接到载体pET-28a上，连接产物转化到大肠杆菌DH5α中，用试剂盒提取质粒，通过EcoR I和Not I双酶切进行鉴定，酶切正确的即为重组表达质粒pET-28a-AbMan5；
步骤S20、将重组表达质粒pET-28a-AbMan5采用CaCl2法转化大肠杆菌BL21(Rosetta)，得到含有质粒pET-28a-AbMan5的重组大肠杆菌BL21(Rosetta)，即为重组表达菌株；
步骤S30、将含有质粒pET-28a-AbMan5的大肠杆菌BL21(Rosetta)按1：(90～110)的比例(优选为1：100)接种至ZYP-5052培养基中，于37℃、180～220rpm(优选为200rpm)条件下培养至OD600(波长600nm处的吸光度)为0.95～1.05，然后将温度降低至18～22℃(优选为20℃)，继续培养20～26h(优选为24h)后，离心收集菌体，将菌体悬浮于HisTrap A缓冲液，然后通过压力破碎后离心离心取上清液(上清液中即包含由重组表达菌株发酵形成的重组蛋白)；
步骤S40、在8～10℃的温度环境下，将上清液通过HisTrap亲和层析柱后，使用HisTrap B缓冲液在AKTA蛋白纯化仪上梯度洗脱层析柱上的重组蛋白，然后使用截留分子量为10kDa的Millipore浓缩管将重组蛋白换液至磷酸盐缓冲液中浓缩至蛋白浓度为1mg/mL，得到纯化的甘露聚糖酶AbMan5。
其中，所述HisTrap A缓冲液的pH值为7.4，所述HisTrap A缓冲液包括以下摩尔浓度的组分：500mM的NaCl、20mM的咪唑和20mM的Na2HPO4；所述HisTrap B缓冲液的pH值为7.4，所述HisTrap B缓冲液包括以下摩尔浓度的组分500mM的NaCl、500mM的咪唑和20mM的Na2HPO4。
ZYP-5052培养基的具体配方如下：1％酵母提取物、5％蛋白胨、50mM Na2HPO4、50mMKH2PO4、25mM(NH4)2SO4、0.5％丙三醇、0.05％葡萄糖、0.2％乳糖、2mM MgSO4、卡那霉素100μg/mL和氯霉素34μg/mL。
所述磷酸盐缓冲液含有以下摩尔浓度的组分：137mM NaCl、2.7mM KCL、10mMNa2HPO4和1.8mM KH2PO4。
所制得的甘露聚糖酶的生化特征表现为：最适反应温度为70℃，在40℃的低温环境中能够维持高达90％的酶活；最适反应pH为6.0，在pH为4～11都具有较高的催化活性；稳定性方面，在40℃温度下孵育1h后能够维持约90％的酶活，在pH为4～11条件下孵育2h后保持约80％的酶活。说明本发明提供的甘露聚糖酶具有高温甘露聚糖酶所有的典型特征、及高温高活性。
本发明提供的甘露聚糖酶的生化特征还表现为：一些常见的金属离子在5mM的浓度下对甘露聚糖酶没有明显的抑制或激活效果。
此外，本发明提供的甘露聚糖酶的酶促动力学测定在70℃条件下测定，甘露聚糖酶的最大反应速度(Vmax)、转换数(kcat)和催化效率(kcat/Km)分别是649.61U/mg、312.13s-1和0.64mg/mL。
需要说明的是，上述涉及到基因合成、重组表达质粒以及重组表达菌株制备、以及重组表达菌株发酵培养获得重组蛋白等实施方式中，未说明具体实验方式、实验原材料者，均按照基因工程及基于基因工程进行微生物发酵培养制备蛋白质的常规方法进行。
由上述提供的方法制备所得的甘露聚糖酶在高温下具有高活性，能够有效降解甘露糖，可用于动物饲料或食品加工中。基于此，本发明还提出一种制备甘露寡糖的方法，包括以下步骤：采用如上所述的甘露聚糖酶水解甘露糖，得到甘露寡糖。
进一步地，本发明还提出一种饲料添加剂，所述饲料添加剂包括如上所述的甘露聚糖酶。由此获得的饲料添加剂有助于为所饲养的动物提供更丰富的营养成分，提高饲料在动物体内的消化吸收率，进而改善动物的生长性能。
更进一步地，本发明还提出一种食品添加剂，所述食品添加剂包括如上所述的甘露聚糖酶。由此获得的食品添加剂有助于改善所加工食品在人体内的消化吸收率等。
以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1甘露聚糖酶基因AbMan5的获得
以甘露聚糖酶蛋白质序列为查询序列，用BLASTp程序搜索微生物基因组编码的蛋白质产物，找到本发明所提出的甘露聚糖酶基因；然后根据大肠杆菌密码子的偏好性，对该甘露聚糖酶基因密码子进行优化设计，得到甘露聚糖酶基因AbMan5，其核苷酸序列如SEQID NO：1所示。甘露聚糖酶基因AbMan5在苏州金唯智公司合成，合成的甘露聚糖酶基因AbMan5位于pU57载体上，合成基因的5’端和3’端带有限制性酶切位点EcoR I和Not I。
实施例2重组表达质粒的制备
(1)用限制性内切酶EcoR I和Not I(均购自Takara公司)将实施例1获得的甘露糖酶基因AbMan5从pU57载体上切下来，割胶回收切下的AbMan5 DNA片段，将AbMan5 DNA片段通过T4 DNA连接酶(购自Takara公司)连接到pET-28a载体(一种用于在大肠杆菌中重组表达外源基因的商业化载体，购自Novagen公司，该载体上带有卡那霉素抗性基因)上；
(2)将连接产物通过CaCl2法转化到大肠杆菌DH5α(一种生物学实验室常规的克隆菌株，购自Invitrogen公司，保存于武汉轻工大学实验室)感受态细胞中。将转化的细胞涂布在含有100μg/mL卡那霉素(购自Sigma公司)的LB琼脂平板上进行阳性转化子筛选；其中涉及到的大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备及CaCl2转化方法是生物学实验室的常规操作，具体方法可参考Current Protocols in Molecular Biology一书中关于的章节(doi.org/10.1002/0471142727.mb0108s37)；其中用到的LB琼脂平板是通过在LB培养基(每升中含有10g NaCl、5g酵母提取物和10g蛋白胨)加入2.5％的琼脂制备而成。
(3)挑取单克隆接种至含有100μg/mL卡那霉素的LB培养基中，过夜培养，然后用试剂盒提取质粒，通过EcoR I和Not I双酶切进行鉴定，酶切结果正确的即为重组表达质粒pET-28a-AbMan5。
实施例3重组表达菌株的制备
(1)将实施例2获得的重组表达质粒pET-28a-AbMan5采用CaCl2法转化到大肠杆菌BL21(Rosetta)(购自Novagen公司，为实验室常见的基因工程表达菌，该菌株自带有氯霉素抗性，保存于武汉轻工大学实验室)感受态细胞；其中感受态大肠杆菌BL21(Rosetta)的制备及转化方法与实施例2步骤(2)中的方法相同；
(2)将转化后的大肠杆菌BL21(Rosetta)涂布在含有卡那霉素(100μg/mL)和氯霉素(34μg/mL，购自Sigma公司)的LB琼脂平板上。在此双抗性平板上生长的菌落为重组表达菌株。
实施例4甘露聚糖酶的制备
(1)将实施例3制备的重组表达菌株过夜培养后(培养基中加100μg/mL卡那霉素和34μg/mL氯霉素)，按1：100的比例接种至ZYP-5052培养基中，于37℃、200rpm条件下培养至OD600(600nm处的吸光度)为0.95～1.05，然后将温度降至20℃，继续培养24h后，5000rpm离心收集菌体，将菌体悬浮于HisTrap A缓冲液，然后通过压力破碎后离心取上清液(含有由重组表达菌株发酵形成的重组蛋白)；其中，HisTrap A缓冲液的pH值为7.4，包括以下摩尔浓度的组分：500mM的NaCl、20mM的咪唑和20mM的Na2HPO4；ZYP-5052培养基的具体配方如下：1％酵母提取物、5％蛋白胨、50mM Na2HPO4、50mM KH2PO4、25mM(NH4)2SO4、0.5％丙三醇、0.05％葡萄糖、0.2％乳糖、2mM MgSO4、100μg/mL卡那霉素和34μg/mL氯霉素；
(2)在8～10℃的温度环境下，取步骤(1)制得的上清液通过HisTrap亲和层析柱(购自通用公司)后，使用HisTrap B缓冲液在AKTA上梯度洗脱上清液中的重组蛋白，然后使用Millipore浓缩管将重组蛋白换液至磷酸盐缓冲液中浓缩至蛋白浓度为1mg/mL，得到纯化的甘露聚糖酶；其中，HisTrap B缓冲液的pH值为7.4，包括以下摩尔浓度的组分：500mM的NaCl、500mM的咪唑和20mM的Na2HPO4；磷酸缓冲液含有以下摩尔浓度的组分：137mM NaCl、2.7mM KCL、10mM Na2HPO4和1.8mM KH2PO4。
对实施例4制备的甘露聚糖酶的甘露聚糖酶基因AbMan5的蛋白表达、酶活、最适反应条件及酶促动力学进行分析测定，测定方法及结果如下：
1、甘露聚糖酶基因AbMan5的蛋白表达分析
对实施例3步骤(2)中诱导表达的细胞上清液和实施例4步骤(2)中纯化后的甘露聚糖酶AbMan5，分别进行SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)测试，结果如图1所示(图1中：泳道1为蛋白质Marker，泳道2为经过纯化获得的重组AbMan5)。
由图1可知，在纯化后的甘露糖酶中，甘露聚糖酶基因AbMan5在大肠杆菌中得到了高效的表达。
2、甘露聚糖酶的酶活分析(还原糖法，也即DNS法)
配制标准的反应体系为2mL，包括：0.05mL约1：200稀释的甘露聚糖酶AbMan5、0.1mL反应缓冲液以及0.1mL魔芋葡甘聚糖(购自Megazyme公司)溶液(2.5mg/mL)；将该反应体系在水浴中孵育10min后加入DNS试剂(3,5-二硝基水杨酸)，沸水水浴5min，然后冷却至室温；再将该反应体系定容至2mL，在52nm测定吸光度。还原糖的定量采用甘露糖标准品做标准曲线，1单位(U)甘露聚糖酶活的活性定义为每分钟能够释放1μmol还原糖所需的甘露聚糖酶的毫克数。
经DNS法测定，纯化后的甘露聚糖酶的酶活约为3000U/mg。
3、甘露聚糖酶最适反应pH温度分析
将甘露聚糖酶AbMan5分散在pH值分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0的缓冲液(pH 3～8的缓冲液由McIlvaine缓冲液制备，pH 9～11的缓冲液由甘氨酸-氢氧化钠(50mM)缓冲液制备)中，于70℃温度下，分别通过上述DNS法测定酶活，以测得的最高酶活值设定为100％，计算其他各pH反应区间的相对酶活。
其中，pH 3～8的缓冲液由McIlvaine缓冲液制备的方法如下：用摩尔浓度为200mM的Na2HPO4溶液和摩尔浓度为100mM的柠檬酸溶液进行勾对配制至所需要的pH值，具体比例如下表1所示：
表1由McIlvaine缓冲液制备对应pH值缓冲液的比例
pH Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>体积(mL) 柠檬酸体积(mL)
3.0 04.11 15.89
4.0 07.71 12.29
5.0 10.30 09.70
6.0 12.63 07.37
7.0 16.47 03.53
8.0 19.45 00.55
pH 9～11的缓冲液由甘氨酸-氢氧化钠(50mM)缓冲液制备的方法如下：将甘氨酸溶解在水中，用氢氧化钠滴定到需要的pH(9.0，10.0，11.0)。
各pH反应区间的相对酶活的计算结果如图2所示。由图2可知，本实施例制备的甘露聚糖酶在pH值为5～10区间都具有较高的活性，其最适pH为6.0。
4、甘露聚糖酶最适反应温度分析
将甘露聚糖酶分散在pH值为6.0的缓冲液体系中，分别于20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃和90℃温度下，通过上述DNS法测定酶活，以测得的最高酶活值设定为100％，计算其他各温度反应区间的相对酶活，结果如图3所示。
由图3可知，本实施例制备的甘露聚糖酶在50～90℃温度区间都具有较高的活性，其最适温度为70℃。
5、甘露聚糖酶的pH稳定性分析
将甘露聚糖酶分散在不同pH(pH值为3～11)的缓冲液体系中，于室温孵育2h后，在70℃、pH值为6.0的条件下，通过上述DNS法测定酶活，以测得的最高酶活值设定为100％，计算其他各pH反应区间的相对酶活，结果如图4所示。
由图4可知，本实施例制备的甘露聚糖酶在pH为5～11条件下，孵育2h后能够维持大于50％的最适酶活。
6、甘露聚糖酶的温度稳定性分析
将甘露聚糖酶分散在pH值为6.0的缓冲液体系中，分别置于40℃、50℃、60℃、70℃、80℃和90℃温度下孵育1h后，在70℃、pH值为6.0的条件下，通过上述DNS法测定酶活，以测得的最高酶活值设定为100％，计算其他各pH反应区间的相对酶活。以未孵育的储藏没测得的值设定为100％。结果如图5所示。
由图5可知，本实施例制备的甘露聚糖酶在40℃温度下孵育1h后保持约90％的酶活。
7、甘露聚糖酶的酶促动力学测定
以浓度分别为0.5mg/mL、1.0mg/mL、2.0mg/mL、3.0mg/mL、4.0mg/mL、5.0mg/mL的魔芋葡甘聚糖为底物，分别在70℃温度和pH值为6.0的条件下进行酶促反应，然后采用双倒数作图法计算其动力学参数，包括Michaelis-Menten常数(Km)、最大反应速度(Vmax)、转换数(kcat)以及催化效率(kcat/Km)。经计算得出，甘露聚糖酶的Michaelis-Menten常数(Km)为15.41mg/ml，最大反应速度(Vmax)为649.61U/mg，转换数(kcat)为312.13s-1，催化效率(kcat/Km)为0.64mg/mL。
综上所述，本发明提供的甘露聚糖酶基因AbMan5，通过载体转入大肠杆菌后，获得重组表达菌株，然后重组表达菌株经过高密度发酵工艺、亲和纯化方法后，制得高纯度的甘露聚糖酶，所制得的甘露聚糖酶在高温下具有高活性，可用于饲料及食品的加工。
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 武汉轻工大学
<120> 一种甘露聚糖酶基因AbMan5、重组表达质粒、重组表达菌株、甘露聚糖酶及
其应用
<130> 20200220
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 912
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
ggcttcagcg ttagcggtac ccagctgctg gacgcgaacg gcaacaactt tatcattcgt 60
ggtgtgaacc acccgcacac ctggtacacc caacagaccg gtgcgtttgc ggacattgcg 120
gcgaccggta gcaacgcggt tcgtgtggtt ctgagcaacg gccaccgttg gaaccgtaac 180
agcgcgagcg atgtggcgaa cgttatcacc ctgtgcaaga acaacaaact gatttgcgtt 240
ctggaagtgc atgatgcgac cggtggcggt gaggaaggtg ctgcggatag catcgcgaac 300
gtggcgaact attgggttga cattgcgagc gtgctgaagg gccaggaaga ctttgtgatc 360
attaacatcg cgaacgaacc gattggtaac agccagaccg acgagaaatg gaccaacgaa 420
caccgtgatg cgatccaaac cctgcgtaac gcgggtctga cccacaccct gctgattgac 480
gcgagcaact ggggtcagga ttggcaagag gttatgctga aacatgcgag ccaagtggct 540
gcggcggaca gcctgagcaa caccatgttc agcgttcaca tgtaccaggt gtatcaaaac 600
cgtaacacca tcgagaacta cgttagcagc tttctgagca cccacaacct gccgctgatc 660
attggcgagt tcggtgcgga ccaccagggc gagtttgttg atgcggaaag catcctggcg 720
gtggcggaac aatacggcat tggttatatg ggctggagct ggagcggtaa cggcggttgc 780
tgcaccagcc tggatatggt taacaacttc aacgcgaacg acctgaccag ctggggcgat 840
cgtctgatca acggcgcgaa cggtattcgt gagaccagcg aaccggcgag cgtgtttggt 900
gcggcgagct aa 912
<210> 2
<211> 303
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 2
Gly Phe Ser Val Ser Gly Thr Gln Leu Leu Asp Ala Asn Gly Asn Asn
1 5 10 15
Phe Ile Ile Arg Gly Val Asn His Pro His Thr Trp Tyr Thr Gln Gln
20 25 30
Thr Gly Ala Phe Ala Asp Ile Ala Ala Thr Gly Ser Asn Ala Val Arg
35 40 45
Val Val Leu Ser Asn Gly His Arg Trp Asn Arg Asn Ser Ala Ser Asp
50 55 60
Val Ala Asn Val Ile Thr Leu Cys Lys Asn Asn Lys Leu Ile Cys Val
65 70 75 80
Leu Glu Val His Asp Ala Thr Gly Gly Gly Glu Glu Gly Ala Ala Asp
85 90 95
Ser Ile Ala Asn Val Ala Asn Tyr Trp Val Asp Ile Ala Ser Val Leu
100 105 110
Lys Gly Gln Glu Asp Phe Val Ile Ile Asn Ile Ala Asn Glu Pro Ile
115 120 125
Gly Asn Ser Gln Thr Asp Glu Lys Trp Thr Asn Glu His Arg Asp Ala
130 135 140
Ile Gln Thr Leu Arg Asn Ala Gly Leu Thr His Thr Leu Leu Ile Asp
145 150 155 160
Ala Ser Asn Trp Gly Gln Asp Trp Gln Glu Val Met Leu Lys His Ala
165 170 175
Ser Gln Val Ala Ala Ala Asp Ser Leu Ser Asn Thr Met Phe Ser Val
180 185 190
His Met Tyr Gln Val Tyr Gln Asn Arg Asn Thr Ile Glu Asn Tyr Val
195 200 205
Ser Ser Phe Leu Ser Thr His Asn Leu Pro Leu Ile Ile Gly Glu Phe
210 215 220
Gly Ala Asp His Gln Gly Glu Phe Val Asp Ala Glu Ser Ile Leu Ala
225 230 235 240
Val Ala Glu Gln Tyr Gly Ile Gly Tyr Met Gly Trp Ser Trp Ser Gly
245 250 255
Asn Gly Gly Cys Cys Thr Ser Leu Asp Met Val Asn Asn Phe Asn Ala
260 265 270
Asn Asp Leu Thr Ser Trp Gly Asp Arg Leu Ile Asn Gly Ala Asn Gly
275 280 285
Ile Arg Glu Thr Ser Glu Pro Ala Ser Val Phe Gly Ala Ala Ser
290 295 300

Claims (9)

1.一种甘露聚糖酶基因AbMan5，用于编码甘露聚糖酶，其特征在于，所述甘露聚糖酶基因AbMan5的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种甘露聚糖酶，其特征在于，所述甘露聚糖酶由如权利要求1所述的甘露聚糖酶基因AbMan5编码所得，且所述甘露聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
3.一种重组表达质粒，其特征在于，所述重组表达质粒包括如权利要求1所述的甘露聚糖酶基因AbMan5。
4.如权利要求3所示的重组表达质粒，其特征在于，所述重组表达质粒还包括表达载体pET-28a。
5.一种重组表达菌株，其特征在于，所述重组表达菌株包括如权利要求1所述的甘露聚糖酶基因AbMan5。
6.如权利要求5所述的重组表达菌株，其特征在于，所述重组表达菌株的宿主细胞为大肠杆菌。
7.一种制备甘露寡糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：采用如权利要求2所述的甘露聚糖酶水解甘露糖，得到甘露寡糖。
8.一种饲料添加剂，其特征在于，所述饲料添加剂包括如权利要求2所述的甘露聚糖酶。
9.一种食品添加剂，其特征在于，所述食品添加剂包括如权利要求2所述的甘露聚糖酶。
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