CN110484521B

CN110484521B - 高热稳定性的植酸酶突变体KsPHY9及其基因和应用

Info

Publication number: CN110484521B
Application number: CN201810454330.6A
Authority: CN
Inventors: 李阳源; 黄江; 何小梅; 江民华; 陈丽芝; 高芝; 刘金山; 唐业; 王勇; 王平
Original assignee: Guangdong Vtr Bio Tech Co ltd
Current assignee: Guangdong Vtr Bio Tech Co ltd
Priority date: 2018-05-14
Filing date: 2018-05-14
Publication date: 2022-09-23
Anticipated expiration: 2038-05-14
Also published as: CN110484521A

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及高热稳定性的植酸酶突变体KsPHY9及其基因和应用。所述植酸酶突变体KsPHY9的氨基酸序列为氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的植酸酶KsPHY包含以下突变位点：A73P，A80P，D107K，N203D，G211S，Q224E，Q252V，T326Y，K379P。与亲本植酸酶KsPHY的23.7％残留酶活相比，所述植酸酶突变体KsPHY9的残余酶活为56.9％，耐热性大大提高。

Description

高热稳定性的植酸酶突变体KsPHY9及其基因和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及高热稳定性的植酸酶突变体KsPHY9及其基因和应用。

背景技术

植酸(Phytate，Phytic acid，IP6)又称肌醇六磷酸脂，含有6个磷酸基团，带有丰富的磷，是饲料中磷的重要贮存形式。植酸是豆类及谷类等作物种子中磷的主要储存形式，但是单胃动物(如家禽、猪等)由于体内缺乏分解植酸的酶，所以难以有效利用植酸磷，大部分以植酸形式存在的磷被动物直接排出体外，造成严重的环境污染。另外，植酸磷还是一种抗营养因子，它可以和多种金属离子(如Ca²⁺、Mn²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺等)以及许多蛋白质螯合成相应的不溶性络合物，降低了这些营养物质的生物有效利用率以及动物对营养物质的有效利用率。

植酸酶(phytase),即肌醇六磷酸水解酶(myo-inositol hexakisphosphatephosphohydrolase,EC 3.1.3.8)，是催化植酸(肌醇六磷酸)及其植酸盐水解生成肌醇与磷酸(或磷酸盐)的一类酶的总称，属于组氨酸磷酸酶家族。在饲料中添加植酸酶，不仅可以提高动物对饲料中植酸磷的利用率，减少磷对环境的污染，还可以降低植酸磷的抗营养作用。植酸酶在动物饲料、人类健康和资源环境保护等方面显现出巨大的应用前景和研究价值。

目前市场上商品化的植酸酶制剂大多数都是经过基因优化改良的。植酸酶在饲料制粒工艺中通常需在较高温度下进行，热稳定性差的植酸酶易失活变性，因此筛选出具有高热稳定性的植酸酶在科学研究与工业应用中具有重要的意义。

可以采用分子生物学技术对现有产业化的酶蛋白进行改造，获得能够适应不同产业需求的酶。理性设计是通过研究酶蛋白的三维空间结构与作用机理，找出可能影响酶活性或酶特性的关键氨基酸，并对这些氨基酸进行定点突变，从而得到更优的酶蛋白。与非理性设计相比，理性设计效率更高，往往也更能得到好的结果。

但是相比随机基因突变，理性设计只是提高实验的成功率，序列分析软件不能保证突变的可靠性。理论预测只是提供了一些可能性，这些预测并不能保证绝对准确，尤其是突变的情况比较复杂的时候，对于其性质和功能的研究还需要详细实验验证。

发明内容

本发明的目的是提供高热稳定性的植酸酶KsPHY9。所述高热稳定性植酸酶KsPHY9，是对亲本植酸酶KsPHY进行定点突变，获得的植酸酶突变体。

本发明的目的是提供一种具有高耐热性的植酸酶突变体KsPHY9的编码基因。

本发明的再一目的是提供包含上述的耐热提高的植酸酶突变体KsPHY9基因的重组载体。

本发明的再一目的是提供包含上述耐热提高的植酸酶突变体KsPHY9基因的重组菌株。

本发明的再一目的是提供获得一种表达高耐热的植酸酶突变体KsPHY9的方法。

本发明采用定点饱和突变的方法对SEQ ID NO.1所示的植酸酶KsPHY进行分子改造，经过高通量筛选得到耐热提高的植酸酶突变体KsPHY9，本发明的耐热提高的植酸酶突变体KsPHY9和原有的Kosakonia sacchari植酸酶KsPHY相比，有9个氨基酸的差异，突变的氨基酸位点包括A73P、A80P、D107K、N203D、G211S、Q224E、Q252V、T326Y、K379P，突变后的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了包含上述耐热提高的植酸酶突变体KsPHY9的重组载体，将本发明的耐热提高的植酸酶突变体KsPHY9连接到酵母表达载体pPICzαA上的EcoR I和Not I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPICzαA-KsPHY9。

本发明还提供了包含上述耐热提高的植酸酶突变体KsPHY9的重组菌株。根据本发明的具体实施方式，用于表达所述植酸酶突变体的表达载体为pPICZαA；用于所述表达载体转化的宿主细胞是毕赤酵母X33和GS115。

本发明还提供了表达上述耐热提高的植酸酶突变体KsPHY9的方法，包括以下步骤：

1)用上述重组载体转化宿主细胞，获得重组菌株；

2)对重组菌株进行发酵，诱导重组植酸酶的表达；

3)发酵结束后，回收并纯化所表达的植酸酶突变体KsPHY9。

本发明通过定点饱和突变对Kosakonia sacchari植酸酶KsPHY进行分子改造，结合高通量筛选技术筛选出耐热性提高的植酸酶突变体KsPHY9。与亲本植酸酶KsPHY的23.7％残留酶活相比，所述植酸酶突变体KsPHY9的残余酶活为56.9％，耐热性大大提高。

附图说明

图1为含pPICzαA-KsPHY9的毕赤酵母X33重组菌7L罐发酵图。

图2显示KsPHY9酶液与亲本KsPHY酶液80水浴酶活保留率。

图3显示原始植酸酶及突变植酸酶的最适反应pH。

图4显示原始植酸酶及突变植酸酶的酸碱耐受性比较

具体实施方式

以下将详述本发明改造植酸酶的方法及所获得的热稳定性提高的植酸酶。

以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实验材料和试剂：

1、菌株与载体

大肠杆菌Topl0、OrigamiB、毕赤酵母X33、载体pPICZαA、Zeocin购自Invitrogen公司。

2、酶与试剂

超保真2×Master Mix PCR聚合酶、限制性内切酶购自NEB(北京)有限公司；universai DNA Purification Kit、TIANprep Mini Plasmid Kit购自天根生化(北京)科技有限公司，其它试剂均为国产分析纯。

3、培养基

大肠杆菌培养基为LB培养基(1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，pH7.0)。LB+Amp培养基为LB培养基加入终浓度为100ug/mL的氨苄青霉素。LB+Zeo培养基为LB培养基加入终浓度为25ug/mL的Zeocin。

酵母培养基为YPD培养基(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖)。酵母筛选培养基为YPD+Zeo培养基(YPD+Zeo培养基为YPD培养基加入终浓度为100ug/mL的Zeocin)。

酵母诱导培养基BMGY培养基(1％酵母提取物、2％蛋白胨、1.34％YNB、0.00004％Biotin、1％甘油(V/V))和BMMY培养基(除以0.5％甲醇代替甘油，其余成份相与BMGY相同)。

重组酵母发酵培养基本盐培养基：磷酸氢二铵5％、磷酸二氢钾0.5％、七水硫酸镁1.5％、硫酸钾1.95％、硫酸钙0.1％、氢氧化钾0.1％、消泡剂0.03％。高压后1L加4.35mlPTM1。

PTM1(微量盐溶液)：硫酸铜0.6％、碘化钾0.018％、一水硫酸锰0.3％、二水钼酸钠0.02％、硼酸0.002％、六水氯化钴0.05％、氯化锌2％、七水硫酸铁6.5％、浓硫酸0.5％、生物素0.02％。

实施例1、植酸酶基因的合成及克隆

以Kosakonia sacchari植酸酶KsPHY的氨基酸序列作为参考(如SEQ ID NO.1所示)，人工合成KsPHY基因。

根据基因序列设计引物，5'端引入Nde I酶切位点，3'端引入EcoR I酶切位点，引物序列如下：

5'端引物Nde I-KsPHY-F1：

GGATTACCATATGAAAGAAGACTCCGCAATGAAGCTGG

3'端引物EcoR I-KsPHY-R1：CGGAATTCTCATAAGCCGCAATCAGCGACGCGC

以合成的KsPHY基因为模板，进行PCR扩增，获得大小约为1.2kb的DNA条带，回收目的片段，用Nde I和EcoR I进行双酶切，连接到具有相同酶切位点的线性pET-22b(+)载体上，转化至Top10大肠杆菌，LB+Amp平板培养获得pET-22b-KsPHY阳性菌落。

实施例2、基因定点饱和突变

确定植酸酶12个待突变位点，分别为：第73位的A，第80位的A，第107位的D，第203位的N，第211位的G，第224的Q，第253位的Q，第290位的I，第326的Y，第340位的V，第379位的K，针对性的设计了12对饱和突变引物，目的基因突变位点统一为NNS，NNS左右各取15个碱基构成正向引物；反向引物与正向引物完全互补，其中，N代表A、T、C、G四种碱基，S代表C、G两种碱基。

以重组载体pET-22b-KsPHY为模板，加入突变位点的正反向引物，

超保真2×Master Mix PCR聚合酶进行PCR扩增，产物经Dpn I酶切处理后电击转化OrigamiB大肠杆菌感受态细胞，在LB+Amp平板筛选阳性突变重组克隆。每个突变位点挑取186个单克隆接种到96孔深孔板。每个平板挑选3个未突变的克隆为对照。每孔含500uL培养基LB+Amp。37℃摇床200rpm培养5h，转移50uL菌液到新的96孔深孔板保藏菌种后，在剩余菌液中添加含有IPTG的50uL LB+Amp培养基，并使每孔的IPTG终浓度为0.5mM，37℃摇床200rpm过夜诱导表达植酸酶。含有过夜培养诱导表达植酸酶的酶液在80℃水浴锅加热处理5min后，检测粗酶液中残留植酸酶活性。植酸酶初步耐热活性检测根据中华人民共和国国家标准《GB/T 18634-2002》进行。

根据植酸酶活性检测结果，将植酸酶耐温性高于对照的克隆组挑选为阳性克隆。从菌种板上挑选阳性克隆集中到一个96孔深孔板重复上述的培养、诱导表达、酶活测定筛选试验。确定耐温性提高的为阳性突变克隆，提取阳性克隆质粒DNA进行基因测序。

通过定点饱和突变后获得18个阳性克隆，分别是:A73F、A73V、A73P、T73D、A80P、A80Y、D107K、D107P、D107A、N203D、G211S、Q224E、Q252V、Q253E、T326Y、K379P、K379A、K379Q。为进一步获得高耐温的植酸酶突变体，本发明对这些突变位点进行两点或多点间的随机组合，并进行了突变位点间的重组筛选。多点突变按照单点定点突变的方法进行逐步的突变，根据植酸酶耐热活性检测结果来确定正向突变，结合高通量筛选，获得一株高耐温的植酸酶突变体KsPHY9。

实施例3、植酸酶KsPHY9毕赤酵母表达载体的构建

根据植酸酶KsPHY9基因设计引物，5'端引入EcoR I酶切位点，3'端引入Not I酶切位点，引物序列如下：

5'端引物EcoR I-KsPHY9-F1：GTAGAATTCAAAGAAGACTCCGCAATGAAGCTGG

3'端引物Not I-KsPHY9-R1：ATTGCGGCCGCTCATAAGCCGCAATCAGCGACGCGC

以植酸酶突变体KsPHY9基因为模板，用上述引物进行PCR扩增，获得大小约为1.2kb的DNA条带，回收目的片段，用EcoR I和Not I进行双酶切，连接到具有相同酶切位点的线性pPICZαA载体上，使植酸酶突变体KsPHY9基因插入到上述表达载体的信号肽序列的下游。连接产物转化Top10大肠杆菌，LB+Zeo平板培养获得pPICZαA-PHd阳性菌落，提取pPICZαA-KsPHY9阳性菌落质粒。经过Pme I限制性内切酶线性化后，电击转化毕赤酵母X33感受态细胞，涂布含100ug/mL Zeocin的YPDS固体培养平板，30℃培养2-3d。尽量挑取Zeocin YPDS平板上生长速度快及菌落较大的转化子，每个平板挑取66个转化子于24孔深孔板，每个深孔板含22个转化子，2个改造前的原始转化菌作为对照。每孔含2mL酵母培养基BMGY，待其生长至饱和状态，离心弃去BMGY培养基，换上酵母诱导培养基BMMY，诱导24小时后，取上清液进行植酸酶酶活性检测和耐热活性检测。

实施例4、原始植酸酶及突变植酸酶的热稳定性比较

植酸酶的活性测定按照中华人民共和国国家标准《GB/T 18634-2009》进行。植酸酶活性定义是指样品在温度37℃、pH值5.5的条件下，每分钟从浓度为5.0mmol/L植酸钠中释放lμmol无机磷，即为一个植酸酶活性单位，以U表示。

U＝FxC/(Vx30)

式中：U-试样中植酸酶的活性，U/mL；C-根据实际样液的吸光值由直线回归方程计算出的酶活性，U；F-试样溶液反应前的总稀释倍数；V-试样体积，mL；30-反应时间，min。

标准曲线的制定如表1：

磷浓度(μmol/L)	0	1.5625	3.125	6.25	12.5	25
							OD值	0	0.054	0.109	0.212	0.437	0.942

将植酸酶酶液置于玻璃试管中，在80℃下热处理5min，以未处理的酶活力为对照，测定残留植酸酶活力，热处理后的酶活与之相比，即得到该温度下残留酶活。

酶种	80℃水浴5min酶活保留率
		KsPHY9酶液	56.9％
亲本KsPHY酶液	23.7％

实施例5、原始植酸酶及突变植酸酶的最适反应pH比较

植酸酶最适pH：将已知酶活的植酸酶用不同pH缓冲液提取并稀释到一定酶活，并用对应pH底物按照国标法测定并计算相对酶活(％)。每组对三个平行。如图3所示，原始植酸酶与突变体的最适pH一致。

实施例6、原始植酸酶及突变植酸酶的酸碱耐受性比较

将已知酶活的植酸酶用不同pH缓冲液提取并稀释到20U，置于37℃150rpm摇床中4小时后马上放在冰水混合物中，按照国标法稀释测定并计算相对酶活(％)。每组对三个平行。如图4所示，原始植酸酶与突变体的酸碱耐受性一致。

实施例7、7L发酵罐小试

从YPD+Zeo平板上挑取工程菌KsPHY9的单菌落，接种于20mL BMGY培养基中，30℃、240rpm培养20h。以1:50的比例接种到300mL BMGY培养基中，30℃、240rpm培养，待菌液OD₆₀₀约为0.5时，用于接种至发酵罐中。发酵过程中，温度控制在30℃，通气量维持在2vvm，转速控制在500-800rpm之间以维持溶氧20％以上。

发酵过程分为三个阶段：

1)菌株培养阶段：在国产的7L发酵罐中加入3L发酵基础培养基，121℃灭菌20min，调节温度至30℃，用氨水调节pH至4.6，加入PTMl(4.35mL/L)，接入种子菌(1:10)，通气搅拌培养约18-24h，直到将发酵罐中甘油耗尽，表现为溶氧突然上升；

2)进入甘油促生长期，补加50％甘油(含有PTMl，12mL/L)，补料速度为18mL/L·h，持续4-6h；

3)最后进入诱导期，用氨水或磷酸调节pH至所需值，流加100％甲醇(含有PTMl，12mL/L)，流速从1mL/L·h经15hr线性升至4mL/L·h，持续120h。

发酵过程中，每隔24h取发酵液测定OD₆₀₀以及菌体湿重，取上清液进行植酸酶活性检测。发酵结束最终平均发酵酶活达到19700U/mL。

序列表

<110> 广东溢多利生物科技股份有限公司

<120> 高热稳定性的植酸酶突变体KsPHY9及其基因和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 409

<212> PRT

<213> Kosakonia sacchari

<400> 1

Lys Glu Asp Ser Ala Met Lys Leu Glu Arg Val Val Ile Val Ser Arg

1 5 10 15

His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Phe Thr Pro Gln Met Arg Glu Val

20 25 30

Thr Pro Phe Gln Trp Pro Gln Trp Glu Val Pro Leu Gly Trp Leu Thr

35 40 45

Pro Arg Gly Gly Gln Leu Ile Ser Ala Leu Gly His Tyr Gln Arg Leu

50 55 60

Arg Leu Ala Asp Ala Gly Leu Leu Thr Asp Lys Thr Cys Pro Asp Ala

65 70 75 80

Gly Arg Val Ala Val Ile Ala Asp Thr Asp Gln Arg Thr Arg Lys Thr

85 90 95

Gly Glu Ala Phe Leu Thr Gly Leu Ala Pro Asp Cys Pro Ile Pro Val

100 105 110

His Tyr Gln Gln Glu Lys Ser Lys Thr Asp Pro Leu Phe Asn Pro Ile

115 120 125

Lys Thr Gly Lys Cys Ala Phe Asn Thr Ser Ala Val Lys Glu Ala Ile

130 135 140

Leu Thr Lys Ala Gly Gly Asn Ile Glu Gln Tyr Thr Gln Lys Tyr Gln

145 150 155 160

Pro Ala Phe Gln Ala Leu Glu His Val Leu Asn Phe Pro Val Ser Glu

165 170 175

Lys Cys Lys Thr Ala Gly Glu Asn His Val Cys Ser Phe Thr Arg Asp

180 185 190

Ile Pro Thr Lys Leu Asn Ile Arg Pro Asp Asn Val Ser Leu Pro Gly

195 200 205

Ala Trp Gly Leu Ser Ser Thr Leu Thr Glu Ile Phe Leu Leu Gln Gln

210 215 220

Ala Gln Gly Met Thr Asp Val Ala Trp Gly Arg Ile Ala Gly Asp Lys

225 230 235 240

Glu Trp Gln Ser Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Gln Phe Asp Leu Leu

245 250 255

Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg Ala Thr Pro Leu Leu Asp

260 265 270

Leu Ile Arg Thr Ala Leu Thr Thr Asn Gly Ala Asp Gln Asn His Tyr

275 280 285

Gly Ile Thr Phe Pro Val Ser Val Leu Phe Ile Ala Gly His Asp Thr

290 295 300

Asn Leu Ala Asn Leu Ser Gly Ala Leu Asp Leu Asn Trp Ser Leu Pro

305 310 315 320

Ser Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Glu Leu Val Phe Glu Arg

325 330 335

Trp Lys Arg Val Ser Asp Asn Thr Asp Trp Val Gln Val Ser Phe Val

340 345 350

Tyr Gln Thr Leu Gln Glu Met Arg Glu Met Arg Ala Phe Ser Arg Asp

355 360 365

Asn Pro Pro Gly Arg Val Asp Leu Ala Leu Lys Ala Cys Ser Glu Lys

370 375 380

Asn Ala Gln Gly Met Cys Ser Leu Ser Ser Phe Ala Lys Leu Ile Glu

385 390 395 400

Ser Leu Arg Val Ala Asp Cys Gly Leu

405

<210> 2

<211> 409

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Lys Glu Asp Ser Ala Met Lys Leu Glu Arg Val Val Ile Val Ser Arg

1 5 10 15

His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Phe Thr Pro Gln Met Arg Glu Val

20 25 30

Thr Pro Phe Gln Trp Pro Gln Trp Glu Val Pro Leu Gly Trp Leu Thr

35 40 45

Pro Arg Gly Gly Gln Leu Val Ser Ala Leu Gly His Tyr Gln Arg Leu

50 55 60

Arg Leu Ala Asp Ala Gly Leu Leu Thr Asp Lys Thr Cys Pro Asp Pro

65 70 75 80

Gly Arg Val Ala Val Ile Ala Asp Thr Asp Gln Arg Thr Arg Lys Thr

85 90 95

Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Asp Cys Pro Ile Pro Val

100 105 110

His Tyr Gln Gln Glu Lys Ser Lys Thr Asp Pro Leu Phe Asn Pro Ile

115 120 125

Lys Thr Gly Lys Cys Ala Phe Asn Thr Ser Ala Val Lys Glu Ala Ile

130 135 140

Leu Thr Lys Ala Gly Gly Asn Ile Glu Gln Tyr Thr Gln Lys Tyr Gln

145 150 155 160

Pro Ala Phe Gln Ala Leu Glu His Val Leu Asn Phe Pro Val Ser Glu

165 170 175

Lys Cys Lys Thr Ala Gly Glu Asn His Val Cys Ser Phe Thr Arg Asp

180 185 190

Ile Pro Thr Lys Leu Asn Ile Arg Pro Asp Asp Val Ser Leu Pro Gly

195 200 205

Ala Trp Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Glu Ile Phe Leu Leu Gln Glu

210 215 220

Ala Gln Gly Met Thr Asp Val Ala Trp Gly Arg Ile Ala Gly Asp Lys

225 230 235 240

Glu Trp Gln Ser Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Val Phe Asp Leu Leu

245 250 255

Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg Ala Thr Pro Leu Leu Asp

260 265 270

Leu Ile Arg Thr Ala Leu Thr Thr Asn Gly Ala Asp Gln Asn His Tyr

275 280 285

Gly Ile Thr Phe Pro Val Ser Val Leu Phe Ile Ala Gly His Asp Thr

290 295 300

Asn Leu Ala Asn Leu Ser Gly Ala Leu Asp Leu Asn Trp Ser Leu Pro

305 310 315 320

Ser Gln Pro Asp Asn Tyr Pro Pro Gly Gly Glu Leu Val Phe Glu Arg

325 330 335

Trp Lys Arg Val Ser Asp Asn Thr Asp Trp Val Gln Val Ser Phe Val

340 345 350

Tyr Gln Thr Leu Gln Glu Met Arg Glu Met Arg Ala Phe Ser Arg Asp

355 360 365

Asn Pro Pro Gly Arg Val Asp Leu Ala Leu Pro Ala Cys Ser Glu Lys

370 375 380

Asn Ala Gln Gly Met Cys Ser Leu Ser Ser Phe Ala Lys Leu Ile Glu

385 390 395 400

Ser Leu Arg Val Ala Asp Cys Gly Leu

405

Claims

1.热稳定性提高的植酸酶突变体KsPHY9，其特征在于，所述植酸酶突变体KsPHY9的氨基酸序列为如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列发生以下突变：A73P、A80P、D107K、N203D、G211S、Q224E、Q252V、T326Y和K379P。

2.热稳定性提高的植酸酶突变体基因，其特征在于，所述基因编码权利要求1所述的热稳定性提高的植酸酶突变体KsPHY9。

3.包含权利要求2所述的热稳定性提高的植酸酶突变体基因的重组载体。

4.包含权利要求2所述的热稳定性提高的植酸酶突变体基因的重组菌株。

5.含权利要求2所述的热稳定性提高的植酸酶突变体基因的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株为重组毕赤酵母X33或GS115。

6.一种制备权利要求1所述热稳定性提高的植酸酶突变体KsPHY9的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1）用权利要求3所述的重组载体转化宿主细胞，获得重组菌株；

2）对重组菌株进行发酵，诱导重组植酸酶的表达。