CN102392002A - 一种改进的大肠杆菌植酸酶htp6m及其基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程领域。本发明提供了提高大肠杆菌植酸酶耐温性的氨基酸突变方法及新型耐高温植酸酶及其编码基因和应用。通过对大肠杆菌植酸酶APPA氨基酸序列中的第47位用F替代A，第92位用E替代G，第136位用H替代T，第159位用V替代N，第164位用R替代D，第237位用R替代G。改良后的植酸酶HTP6M其热稳定性有明显提高。本发明还提供了可高效表达该植酸酶的方法及重组酵母细胞。其表达的植酸酶在饲料、食品工业中显示出巨大的应用潜力。

Description

一种改进的大肠杆菌植酸酶HTP6M及其基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及提高大肠杆菌植酸酶耐温性的方法及一种突变改良的耐温植酸酶HTP6M及其编码基因和应用。 

背景技术

植酸酶是一种能水解植酸的酶类。植酸(Phytate，Phytic acid，IP6)又称肌醇六磷酸脂，结构复杂。植酸分子含有6个磷酸基团，带有丰富的磷，植酸是饲料中磷的重要贮存形式。植酸酶(EC3.1.3.8)即肌醇六磷酸水解酶，催化植酸及植酸盐水解成肌醇与磷酸。 

磷是动物机体必需矿物元素，单胃动物体内缺乏分解植酸的植酸酶。造成饲料中磷的利用率仅有1/3或更低，为了补充有效磷的不足，必须在饲料中添加无机磷酸盐，常用的为磷酸氢钙和骨粉。这样不仅大大增加了饲料的成本，而且大量的植酸磷不能被利用而直接排出体外，造成磷源的浪费和严重的环境问题。单胃动物饲料中通过添加植酸酶，可以提高饲料中植酸磷的利用率，减少磷的排出对环境的污染。 

通过基因工程手段，特别是DNA重组技术的应用，使各种微生物来源的植酸酶大规模廉价生产和实际应用成为可能。现工业化生产的植酸酶主要有来源于黑曲霉的真菌植酸酶和来源于大肠杆菌的细菌植酸酶两种。其中来源于大肠杆菌的植酸酶APPA具有高比活性及良好的消化道稳定性等特点。目前主要通过在粉末饲料直接添加或颗粒饲料后喷涂的方法应用在饲料行业。 

在颗粒饲料生产过程中有一个短暂的80-90℃的高温阶段。细菌植酸酶APPA热稳定性较差，其水溶液在70℃下保温5分钟剩余酶活性低于30％，直接添加到动物饲料中进行制粒后存留酶活一般低于20％，使APPA植酸酶在颗粒饲料的应用受到限制。采用饲料制粒后植酸酶液体喷涂到饲料上的方法不仅增加设备投入，而且对酶制剂的稳定性、饲料中分布均一性都无法很好的保证。因此，利用生物工程手段提高植酸酶热稳定性是目前饲料用植酸酶的研究热点之一。 

发明内容

本发明总的目的是通过基因突变的方法对植酸酶氨基酸序列进行改造，使改造后的植酸酶在温度的耐受性方面更加优良。构建基因重组克隆，使改造后的植酸酶高效表达，最终达到工业化生产的要求。 

本发明是以大肠杆菌植酸酶APPA为模型植酸酶进行突变筛选。来源于大肠杆菌的植酸酶APPA已经被克隆并测序(The complete Nucleotide sequence of the Escherichia coli gene appA reveals significant homology between pH2.5 Acid phosphatase and glucose-1-phosphatase.Journal of Bacteriology，Sept.1990，p.5497-5500)。该基因全长1299bp，(GeneBank号码：M58708).编码432个氨基酸(见图2)。[魏春宝1]N端的22个氨基酸为信号肽，去除信号肽的大肠杆菌植酸酶可以在毕赤酵母细胞分泌表达获得具有植酸酶活性的成熟蛋白。Ostanin，K.通过基因突变，高效表达APPA植酸酶，提高表达效率400倍，达到400mU/mg蛋白。(Ostanin，K.et al.Overexpression，Site Directed Mutagenesis，and Mechanism of Escherichia Coli Acid Phosphatase.J.Biol.Chem.267：22830-36，1992).姚斌等在中国发明专利ZL 02137869.X公布了一种大肠杆菌植酸酶APPB，其于来源于大肠杆菌的植酸酶APPA基因有较高同源性，氨基酸序列同源性达到97.9％，有9个氨基酸的差异，分别对应APPA的第51，53，101，151，201，251，252，301，302位。如图2.该植酸酶具有良好的胰蛋白酶稳定性。其活性的最适温度范围和APPA植酸酶相似，为35-60℃。 

本发明提供了一种突变改造的植酸酶，它是以来源于大肠杆菌的植酸酶APPA为模型植酸酶，通过对第47、92、136、159、164、237位氨基酸残基进行取代得到的。本发明获得的植酸酶耐温性较现有技术中的植酸酶有明显提高，经70℃热处理后存留酶活在90％以上。在80℃饲料制粒时，存留植酸酶酶活超过80％， 

在本发明的一个优选实施方案中，本发明所述植酸酶序列如SEQID NO：2所示。 

另一方面，本发明同时提供了一种改善来源于大肠杆菌的植酸酶的酶学性质的方法，该方法包括：通过在大肠杆菌植酸酶的多个氨基酸残基位点引入突变。所述突变包括但不限于氨基酸残基的取代、缺失和添加。在本发明的一个实施方案中，于来源于大肠杆菌的植酸酶APPA氨基酸序列的第47、92、136、159、164、237位进行氨基酸取代。特别优选的方法是：在第47位的氨基酸取代是用苯丙氨酸取代丙氨酸，在第92位的氨基酸取代是用谷氨酸取代甘氨酸，在第136位的氨基酸取代是用组氨酸取代丝氨酸，在第159位的氨基酸取代是用缬 氨酸取代天冬酰胺，在第164位的氨基酸取代是用精氨酸取代天冬氨酸，在第237位的氨基酸取代是用精氨酸取代甘氨酸；所述的氨基酸取代并去除N端信号肽序列产生具有SEQ ID No：2氨基酸序列的植酸酶。 

本发明同时提供了一种提高植酸酶耐热性的方法，该方法包括：在模型植酸酶或与模型植酸酶氨基酸序列同源性超过90％以上植酸酶氨基酸序列中引入一个或多个氨基酸突变来提高其耐温性。例如，在植酸酶第47、92、136、159、164、237位。优选第47位用F替代A，第92位用E替代G，第136位用H替代T，第159位用V替代N，第164位用R替代D，第237位用R替代G。 

另一方面，本发明提供了本发明所述植酸酶的编码基因。 

在一个优选实施方案宗，所述植酸酶的编码基因具有SEQID No：1所示的核苷酸序列。该核苷酸序列根据表达宿主酵母偏爱密码子设计，有效提高该基因的表达效率。该序列在起始密码子后或蛋白表达系统正确阅读框内编码成熟的植酸酶。 

另一方面，本发明提供了一种耐温性能优化改良的植酸酶的制备方法，该方法包括：编码基因的克隆，重组载体的构建，受体细胞的转化，耐温突变菌株的筛选，及最佳表达菌株大规模发酵表达。在本发明的一个实施方案中，编码基因克隆中使用的引物对如SEQ ID NO：3和SEQID NO：4所示。 

作为本发明的一个最优选的实施方案，为了使植酸酶基因在毕赤酵母中高效表达，我们将APPA原有的信号肽序列去除，使改造后植酸酶基因插入到带有alpha因子信号肽序列的酵母表达载体pPIC9K上的EcoR I和NotI限制性酶切位点之间。经转化酵母细胞，稳定整合到酵母染色体上。优选重组菌株是毕赤酵母菌株GS115。用高浓度的抗生素平板筛选高拷贝的转化子，将筛选到的转化子进行摇瓶及发酵实验，最终筛选确定高表达菌株。 

本发明还提供了本发明所述耐温植酸酶HTP6M在颗粒饲料中的应用。本发明获得的植酸酶耐温性较模型大肠杆菌植酸酶有明显提高。经颗粒饲料机80℃制粒实验，存留植酸酶酶活超过80％，可以满足国内大多数饲料厂制粒要求。 

本发明还提供了该耐高温植酸酶HTP6M的动物饲养试验结果。研究结果表明：该耐高温植酸酶实验组与空白对照组相比，日增重、日采食分别提高12.11％、8.18％(P＜0.05)，料 肉比在对照组基础上显著降低。实验结果表明该耐高温植酸酶可以直接添加到颗粒饲料中，部分替代磷酸氢钙，降低饲养成本。 

本发明的优化改良的植酸酶在饲料、食品行业具有巨大的应用潜力。 

附图说明

图1图示的为含本发明所述植酸酶HTP6M编码基因的重组载体pPIC9K-HTP6M。 

图2图示的为本发明所述植酸酶HTP6M氨基酸序列与现有大肠杆菌植酸酶APPA、APPB氨基酸序列间的比对。 

图3图示的为酵母菌株HTP6M-GS115在50升发酵罐中的发酵情况。 

图4图示的为植酸酶APPA和HTP6M经不同温度处理后的相对存留酶活曲线图。 

除另有说明外，本申请中的所有科技术语的都具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。尽管与本申请中描述类似或等同的方法及材料都可用于实施或检验本发明，但是下文仍还是对合适的方法和材料进行了描述。本申请中引用的全部出版物、专利申请、专利及其他参考文献其全部内容在此引入作为参考。如有抵触，包括定义，以本申请为准。 

下列实施例旨在进一步举例说明实现本发明的具体方式，而决不构成对本发明的限制。本领域技术人员应该理解的是，在不违背本发明的精神和原则的前提下，对本发明进行改动得到的技术方案都将落入本发明的待批权利要求范围内。 

实施例

实验材料和试剂： 

1、菌株与载体 

大肠杆菌菌株Topl0、BL21，毕赤酵母GS115，、载体pPIC9K，均购自Invitrogen公司，载体pET28a购自Novagen公司。 

2、酶与试剂盒 

PCR酶，质粒提取，胶纯化，限制性内切酶、试剂盒，6418等抗生素均购自上海生工公司。

3、培养基 

大肠杆菌培养基为LB(1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，pH7.0)。LB-Kan为LB 培养基加50ug/mL卡那霉素。LB-Amp为LB培养基加100ug/mL氨苄青霉素。 

酵母培养基为YPD(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖)。酵母筛选培养基为YPD-G418(YPD+0.5mg/ml g418)。 

酵母培养基BMGY(1％酵母提取物、2％蛋白胨、1.34％YNB、0.00004％Biotin、1％甘油(V/V))和诱导培养基BMMY(除以0.5％甲醇代替甘油，其余成份相与BMGY相同)。 

重组酵母发酵培养基本盐培养基：磷酸氢二铵5％、磷酸二氢钾0.5％、七水硫酸镁1.5％、硫酸钾1.95％、硫酸钙0.1％、氢氧化钾0.1％、消泡剂0.03％。高压后每升加4.35毫升PTM1。 

PTM1(微量盐溶液)：硫酸铜0.6％、碘化钾0.018％、一水硫酸锰0.3％、二水钼酸钠0.02％、硼酸0.002％、六水氯化钴0.05％、氯化锌2％、七水硫酸铁6.5％、浓硫酸0.5％、生物素0.02％。 

实施例1 

大肠杆菌植酸酶APPA-M基因合成及克隆 

利用连续延伸PCR合成去除了22个信号肽序列的大肠杆菌植酸酶基因appA-M。 

根据毕赤酵母最适密码子人工合成短基因片段，长度为50-59bp，基因片段间连接通过20-30bp重叠序列。Tm值为50-60℃.基因两端引物分别含有EcoRI和NotI酶切位点。 

5’端引物HTP-F1：gacGAATTCcagagtgaaccagagttgaagttggag 

3’端引物HTP-R1：attGCGGCCGCttactacaaggaacaggctgggattc 

将所有合成的基因片段加入100微升PCR反应体系，进行第一次PCR扩增。PCR反应为95℃30秒，50℃30秒，72℃2分钟，20个循环。第二次PCR反应以HTP-F1和HTP-R1为PCR引物，终浓度1μM，取0.5微升第一次PCR反应产物为模板，于100微升PCR反应体系反应。PCR反应条件为95℃30秒，55℃30秒，72℃2分钟，30个循环。PCR纯化试剂盒纯化，EcoRI和NotI双酶切，凝胶电泳纯化获得的条带。将扩增得到的片段克隆到pET28A的EcoRI和NotI位点，得到重组载体pET28-APPAM。测序确定其氨基酸序列的正确性。 

实施例2 appA-M基因突变文库构建 

以测序确定的pET28-APPAM质粒DNA为模板，HTP-F1和HTP-R1为引物扩增获得约1.2kb的APPAM全长基因。回收1毫克APPAM全长基因片段以0.1单位的DNase I，25℃处理30分钟，每5分钟取样电泳观察DNA酶切片段大小以确定最佳反应时间。通过DNA胶回收试剂盒回收20-50bp的DNA片段。回收的片段进行无引物PCR扩增。 

无引物PCR反应体系：5ul小片段DNA+4ul 2.5mM dNTPs+4.5ul 25mM MgCL2+Taq 2U +ddH20到50ul。反应程序为：94℃30s，40℃20s，72℃30s，共45个循环。2％琼脂糖电泳检测PCR扩增结果，回收大于1.2Kb的DNA片段。纯化后作为模板，以HTP-F1和HTP-R1为引物进行PCR扩增。回收大小与appA基因相同的约1.2kb DNA片段。这些片段含有大量突变的植酸酶基因分子。 

将回收DNA片段通过限制性内切酶EcoRI和NotI双酶切，构建入原核表达载体pET28a。该载体具有卡那霉素抗性基因。电击转化大肠杆菌菌株BL21获得突变体表达文库APPA-M-LIB用于植酸酶突变筛选，获得突变文库达到10E7cfu/ul。 

实施例3突变文库APPA-M-LIB筛选 

从突变文库取1ul菌液加入200毫升LB/Kan培养基，混匀后取50ul每孔加入到384孔细菌培养板(母板)。共10个384孔培养板。每孔约含2.5X10E3CFU。37℃培养4小时后用12通道移液器从每孔取20ul菌液到对应加有20ul LB/Kan+0.2mM IPTG每孔的384孔平板(子板)，37℃过夜培养。 

含有过夜培养诱导表达植酸酶的菌液平板(子板)在70℃水浴锅加热处理5分钟后细胞裂解，检测培养液中存留植酸酶活性。植酸酶初步耐热活性检测根据中华人民共和国国家标准《GB/T 18634-2002》进行。 

根据子板70℃热处理后存留酶活结果将对应母板菌液稀释，分装到10个384孔培养板(二代母板)，重复上述培养，热处理，存留酶活筛选过程。两轮筛选后从二代母板阳性孔取菌液涂布LB/Kan固体培养平板，挑选单菌落进行耐热性比较，从而获得耐温性提高的单菌落突变菌株。随机突变筛选确定了9个氨基酸位点与大肠杆菌植酸酶耐温性有关。对阳性突变位点进行随机重组得到最优组合，其含有6个突变位点的重组菌株具有最佳耐温性和表达量。其氨基酸突变位点对应APPA氨基酸序列第47、92、136、159、164、237位。该克隆命名为pET28-HTP6M。 

实施例4植酸酶HTP6M酵母表达载体的构建及工程菌株的筛选 

提取pET28-HTP6M质粒DNA，限制性内切酶EcoRI和NotI双酶切后纯化含有HTP6M基因的DNA片段，连接到pPIC9K载体EcoRI和NotI位点，使植酸酶基因HTP6M插入到上述表达载体的信号肽序列的下游，与信号肽形成正确的阅读框架，通过载体与酵母P.pastoris染色体基因组之间的同源重组使目的基因稳定整合到酵母染色体上。 

具体过程是：连接产物转化TOP10大肠杆菌，LB-Amp琼脂糖平板培养获得pPIC9K-HTP6M阳性菌落。提取pPIC9K-HTP6M阳性菌落质粒(图1)，取5ug质粒DNA用Pme I酶切线性化 后电击转化酵母GS115感受态细胞，涂布含MD，No His平板。30℃培养2-3天。挑取单菌落在0.5-4mg/ml YPD-G418平板培养。在高浓度抗生素平板上生长速度较快的菌落可能含有多拷贝的转化子。挑选这些转化子进行摇瓶及小规模发酵实验以确定高表达菌株。 

实施例5重组菌株的高密度发酵 

挑取最佳酵母表达菌株HTP6M-GS115接种到300ml YPD-G418培养基。30℃、240rpm培养到OD600＝5.0时转入上海保兴50L发酵罐进行高密度发酵。发酵温度控制在30℃。通气量维持在2vvm，转速控制在500-800rpm之间以维持溶氧20％以上。植酸酶发酵曲线见图4. 

发酵分为三个阶段。 

1)菌体培养阶段。本阶段用氨水调节pH维持在4.6，从加入种子菌，培养约16-24h，直到将发酵罐中甘油耗尽，表现为溶氧突然上升到80％以上。此时菌体湿重达到100g/l。 

2)碳源饲喂阶段。补加50％甘油(含有PTM1，12mL/L)，补料速度为18mL/L·h，持续4-6h；此阶段结束湿重达到160-180g/l. 

3)诱导表达阶段。流加100％甲醇(含有PTM1，12mL/L)，维持溶氧大于20％。持续120小时。每12小时取样检测植酸酶酶活以确定发酵终止时间。发酵结束湿重达到400-500g/l. 

发酵过程中，每隔12h取发酵液测定OD₆₀₀以及菌体湿重，取上清液进行植酸酶活性检测。植酸酶测定按照中华人民共和国国家标准《GB/T 18634-2002》进行。发酵结束最终平均发酵酶活达到11，500U/mL，发酵过程曲线如图3所示。 

实施例6植酸酶HTP6M的酶学特性分析 

植酸酶HTP6M和模型植酸酶APPA耐温性曲线如图4所示。两种植酸酶酶液在60-82℃区域加热处理5分钟，以未加热处理样品酶活为100％，测定在不同温度处理5分钟后的液体存留酶活。如图所示，本发明获得的大肠杆菌植酸酶经70℃处理后存留酶活保留在90％以上。而APPA植酸酶经70℃热处理5分钟酶活存留在30％以下。本发明获得的改良植酸酶耐温性较模板植酸酶有明显提高。 

植酸酶HTP6M饲料制粒实验结果如表1所示。植酸酶HTP6M添加到511饲料中，在饲料加工过程中对两种样品分别取混合制粒前和制粒后样品各10个，测定酶活并计算收率。实验条件：制粒机类型：申德520；调质条件：80℃；环模压缩比：1∶12；调质时间：35s。结果表明改良的植酸酶HTP6M耐受80℃制粒温度，存留酶活达到80％，适应颗粒饲料生产要求。 

表1： 

样品	混合后酶活	调制后酶活	制粒后酶活
				1	10.58	9.59	8.30
2	10.19	7.12	5.69
				3	11.90	10.28	8.72
4	11.46	10.25	9.09
				5	11.38	9.20	9.05
6	/	/	7.55
				7	/	/	8.64
8	/	/	8.35
				9	/	/	8.37
10	/	/	8.87
				平均酶活	11.102	9.288	8.253
标准偏差	0.624	1.158	0.958
				变异系数	5.62％	12.47％	11.60％
残存酶活		83.66％	76.90％

实施例7植酸酶HTP6M动物试验结果 

试验研究罗斯肉鸡在低磷日粮中添加耐温植酸酶HTP6M对生产性能及钙磷代谢的影响。试验动物：山东六和集团种鸡场罗斯肉鸡。本试验在生物代谢实验室进行。试验分0～18d、18～35d两个饲养阶段，分别饲喂处理A(正对照组)、处理B(负对照组)、处理C(HTP6M植酸酶)和处理D(国外某植酸酶)组日粮。试验分成4个处理，每个处理144只肉鸡，每个处理6个重复，每个重复24只肉鸡，分别饲喂不同处理的日粮。 

试验鸡舍为有窗封闭式鸡舍，三层笼养，每个重复按上、中、下3个笼。鸡舍进行常规消毒，自由采食，自动饮水线供水。试验鸡免疫程序：7日龄新城疫弱毒苗滴眼，14日龄法氏囊点眼滴鼻，21日龄新城疫饮水加强免疫1次。分别在0、18d、35d早晨空腹称重，记录各组各期肉鸡重量、饲料添加量、剩料量、成活率及腿病鸡数。 

由表2可知，耐温植酸酶HTP6M(处理C)在0-18d及18-35d两个阶段的日采食、日增重均在对照组B组基础上有显著提高(P＜0.05)，料肉比显著降低(P＜0.05)。从试验结果分析，该耐高温植酸酶对于生产性能的影响效果优于国外某耐高温植酸酶(处理D)。 

表2两种耐高温植酸酶对肉鸡生产性能的影响 

注：不同肩标字母代表差异显著(P＜0.05)，下表同。 

处理A(正对照组)、处理B(负对照组)、处理C(HTP6M植酸酶)和处理D(国外某植酸酶)组日粮。 

Claims (10)

1.一种优化改良的耐高温植酸酶，其通过氨基酸突变获得，在80℃饲料制粒时，存留植酸酶酶活大于80％。

2.如权利要求1所述的耐高温植酸酶，其中所述的氨基酸突变对应模型植酸酶APPA为第47位用F替代A，第92位用E替代G，第136位用H替代T，第159位用V替代N，第164位用R替代D，第237位用R替代G。

3.权利要求1所述的耐高温植酸酶，，其氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示。

4.一种优化改良的耐高温植酸酶的编码基因，其具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

5.一种重组载体，其中含有权利要求3所述的耐高温植酸酶编码基因。

6.一种宿主，其被权利要求4所述的重组载体转化。

7.一种提高植酸酶耐热性的方法，该方法包括：在模型植酸酶或与模型植酸酶氨基酸序列同源性超过90％的植酸酶氨基酸序列引入氨基酸取代。

8.权利要求7所述的方法，其中所述的氨基酸取代位点对应APPA氨基酸序列位点为第47位，第92位，第136位，第159位，第164位，第237位，优选为第47位用F替代A，第92位用E替代G，第136位用H替代T，第159位用V替代N，第164位用R替代D，第237位用R替代G。

9.权利要求7或8所述的方法，其中所述的氨基酸取代是通过基因突变实现的，基因突变包括但不限于定点突变、PCR致错突变或DNA shuffling和密码子同义突变。

10.权利要求1至3中任一项所述的植酸酶HTP6M在饲料添加剂及食品添加剂中的应用。

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