CN110656100A - 一种解淀粉芽胞杆菌来源的耐热酸性β-甘露聚糖酶及其编码基因 - Google Patents

一种解淀粉芽胞杆菌来源的耐热酸性β-甘露聚糖酶及其编码基因 Download PDF

Info

Publication number
CN110656100A
CN110656100A CN201810706211.5A CN201810706211A CN110656100A CN 110656100 A CN110656100 A CN 110656100A CN 201810706211 A CN201810706211 A CN 201810706211A CN 110656100 A CN110656100 A CN 110656100A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mannase
gly
beta
ala
asn
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201810706211.5A
Other languages
English (en)
Inventor
郑宏臣
宋诙
徐健勇
谭明
甄杰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Original Assignee
Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS filed Critical Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority to CN201810706211.5A priority Critical patent/CN110656100A/zh
Publication of CN110656100A publication Critical patent/CN110656100A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2477—Hemicellulases not provided in a preceding group
    • C12N9/2488—Mannanases
    • C12N9/2494—Mannan endo-1,4-beta-mannosidase (3.2.1.78), i.e. endo-beta-mannanase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01078—Mannan endo-1,4-beta-mannosidase (3.2.1.78), i.e. endo-beta-mannanase

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种解淀粉芽胞杆菌来源的耐热酸性β‑甘露聚糖酶及其编码基因。该耐热酸性β‑甘露聚糖酶及其编码基因来源于Bacillus amyloliquefaciens 66菌株（CGMCC No.14363），其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2，编码基因序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。本发明的耐热酸性β‑甘露聚糖酶具有以下突出性质：该酶最适反应pH为3，且当pH在2.5‑7.0范围内具有较好的稳定性，在动物胃液(pH 2.5)和肠道(pH 5.5)中均能保持较好的酶活性。最适作用温度为60oC，在75oC高温下3min可保持80%的酶活，可广泛应用于饲料、食品和医药等领域。另外，本发明基于该酶的编码基因分别构建了大肠杆菌、枯草芽胞杆菌和毕赤酵母的工程菌株，其中，毕赤酵母工程菌发酵最高可达10000U/ml酶活，显示了良好的工业化生产前景。

Description

一种解淀粉芽胞杆菌来源的耐热酸性β-甘露聚糖酶及其编码 基因
技术领域
本发明属于基因工程及生物技术领域，涉及一种解淀粉芽胞杆菌来源的耐热酸性β-甘露聚糖酶及其编码基因。。
背景技术
β-甘露聚糖酶是第二大半纤维素酶类，在食品、医药、纺织、洗涤剂、造纸、饲料、石油开采等方面具有广泛的应用。近年来，随着甘露寡糖生理功能的发现，绿色饲料的兴起以及人们环保意识的增强，能源的再生利用研究，人们对β-甘露聚糖酶的研究和利用已经进入了一个新的阶段，具有很大的应用价值。尤其在饲料领域，谷类、豆类及其副产品中普遍存在一种抗营养因子-β-1, 4-D-甘露聚糖，它不能被动物体内的消化酶所分解，造成肠道内容物勃度增加，降低动物对饲料中营养物质的消化吸收，使饲料的利用率不高。不仅如此，不被动物吸收利用的甘露聚糖进入动物肠道可为厌氧有害的微生物增殖发酵提供碳源并产生毒素，造成雏鸡、仔猪肠道疾病，抑制畜禽生长。β-甘露聚糖酶可分解甘露聚糖，降低肠道内容物的勃度;它能破坏饲料中植物的细胞壁结构，使营养物质能与消化酶充分接触，提高饲料的利用率;β-甘露聚糖酶可促进营养成分消化，改善动物肠道微生物生态及动物体的健康状况;还可提高微量元素的生物利用率，并且降解产物-甘露寡糖可吸附真菌毒素;在饲料中添加甘露聚糖酶，还可减少抗生素等化学药物的使用。
然而，虽然目前国内外已有很多β-甘露聚糖酶基因得到克隆表达，但现有的β-甘露聚糖酶均会存在诸如pH作用范围不合适、热稳定性差以及表达量低等缺陷，在一定程度上限制了该酶的应用。尤其在饲料行业中的应用不仅要求β-甘露聚糖酶能够耐受胃部的极酸环境，还要在造粒过程中耐受高温处理，同时还要在动物体温及肠道的中性环境下保持高活力，目前基本没有β-甘露聚糖酶能够同时具备以上三个条件，从而制约了β-甘露聚糖酶在饲料领域的应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种解淀粉芽胞杆菌来源的耐热酸性β-甘露聚糖酶及其编码基因，并且本发明所述的耐热酸性β-甘露聚糖酶具有耐酸耐高温的优良性质，在饲料领域具有良好的应用潜力。
本发明从解淀粉芽胞杆菌（B.amyloliquefaciens 66）基因组中PCR得到一种耐热酸性β-甘露聚糖酶编码基因man5A，该菌已于2017年06月28日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）进行了菌株保藏，并证明了存活，其保藏登记号为CGMCCNo.14363。保存地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
本发明提供的一种耐热酸性β-酸性甘露聚糖酶Man5A，其成熟肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
SEQ ID NO.1
1 TGFYVNGGKL YDSTGKPFYI RGINHGHSWF KNDTATAIPA IAKTGANTVR IVLSNGTQYT
61 KDDLNSVKNI INLAEENKII AVLEVHDATG KDDFNSLDAA VNYWISIKEA LIGKEDRVIV
121 NIANEWYGTW NGSAWADGYK KAIPKLRDAG IKNTLIVDAA GWGQYPQSIV DYGQSVFAAD
181 SQKNTAFSIH IYEYAGKDAA TVKSNIENVL NKGLALIIGE FGGYHTNGDV DEYAIIKYGL
241 EKGVGWLAWS WYGNGIKWNY LDLATGPNGS LTSYGNTVVN DTYGIKNTSQ KAGIFDGDDG
301 VGDGGPGDSN GTKTTLYNFE TGTEGWSGKN IETGPWSVNE WAAKGNHSLK ADVNLGDNSE
361 HYLKLTQNLN FSGKSQLTAT VKHADWGNFG DEINAKLYVK TESDW
该成熟肽由405个氨基酸组成，理论分子量为44kDa。
本发明在出发菌株B.amyloliquefaciens 66中同时得到了该耐热酸性β-酸性甘露聚糖酶Man5A的自身信号肽序列，该信号肽序列由33个氨基酸组成“MLAAQKGTLVSVIAALIFFSVILGSAAPKA AAA”。因此，来源B.amyloliquefaciens 66的耐热酸性β-酸性甘露聚糖酶全长序列为438个氨基酸，序列如SEQ ID NO.2所示。
SEQ ID NO.2
1 MLAAQKGTLV SVIAALIFFS VILGSAAPKA AAATGFYVNG GKLYDSTGKP FYIRGINHGH
61 SWFKNDTATA IPAIAKTGAN TVRIVLSNGT QYTKDDLNSV KNIINLAEEN KIIAVLEVHD
121 ATGKDDFNSL DAAVNYWISI KEALIGKEDR VIVNIANEWY GTWNGSAWAD GYKKAIPKLR
181 DAGIKNTLIV DAAGWGQYPQ SIVDYGQSVF AADSQKNTAF SIHIYEYAGK DAATVKSNIE
241 NVLNKGLALI IGEFGGYHTN GDVDEYAIIK YGLEKGVGWL AWSWYGNGIK WNYLDLATGP
301 NGSLTSYGNT VVNDTYGIKN TSQKAGIFDG DDGVGDGGPG DSNGTKTTLY NFETGTEGWS
361 GKNIETGPWS VNEWAAKGNH SLKADVNLGD NSEHYLKLTQ NLNFSGKSQL TATVKHADWG
421 NFGDEINAKL YVKTESDW
本发明还提供了上述β-甘露聚糖糖酶编码基因man5A的核酸序列，基因全长1317 bp，序列如SEQ ID NO.4所示；其N端99bp为信号肽编码序列，因此，该耐热酸性β-甘露聚糖酶的成熟肽编码序列如SEQ ID NO.3所示，全长为1218bp。
SEQ ID NO.3
1 ACAGGTTTCT ACGTGAATGG AGGCAAATTG TACGATTCTA CGGGTAAACC ATTTTACATA
61 AGGGGTATCA ATCATGGGCA CTCCTGGTTT AAGAATGATA CAGCAACGGC TATCCCTGCG
121 ATCGCAAAGA CGGGTGCCAA TACGGTACGA ATTGTATTAT CAAACGGTAC ACAATACACC
181 AAGGATGATC TGAATTCCGT AAAAAACATC ATTAATTTGG CAGAAGAAAA CAAGATTATT
241 GCTGTGCTTG AAGTACACGA TGCCACTGGG AAAGATGACT TCAACTCGTT GGATGCAGCG
301 GTCAACTACT GGATAAGCAT CAAAGAAGCA CTGATCGGGA AGGAAGATCG GGTTATTGTA
361 AACATTGCAA ACGAGTGGTA CGGAACATGG ACGGAAGCG CGTGGGCTGA CGGGTACAAG
421 AAGGCTATTC CGAAATTAAG AGATGCGGGT ATTAAGAATA CCTTGATTGT AGATGCAGCA
481 GGCTGGGGTC AGTACCCTCA ATCGATCGTC GATTACGGAC AAAGCGTATT CGCCGCGGAT
541 TCACAGAAGA ATACGGCGTT TTCCATTCAC ATTTATGAGT ATGCAGGCAA GGATGCGGCC
601 ACCGTCAAAT CCAATATCGA AAATGTGCTG AATAAAGGGC TGGCCTTAAT CATTGGTGAG
661 TTCGGAGGAT ATCACACCAA TGGAGATGTC GATGAATATG CAATCATCAA ATATGGTCTG
721 GAGAAAGGAG TAGGATGGCT TGCATGGTCT TGGTACGGTA ATGGTATCAA ATGGAACTAT
781 CTTGATTTGG CAACAGGACC TAACGGCAGT TTGACGAGCT ATGGTAATAC GGTTGTCAAT
841 GATACTTACG GAATTAAAAA TACGTCCCAG AAAGCGGGAA TCTTTGATGG AGATGATGGT
901 GTCGGTGATG GTGGACCCGG TGATAGCAAT GGTACAAAAA CGACGTTGTA CAATTTTGAA
961 ACGGGAACGG AAGGATGGTC TGGAAAAAAT ATCGAAACGG GACCCTGGAG CGTCAATGAA
1021 TGGGCAGCAA AGGGTAATCA TAGCTTGAAG GCAGATGTCA ATTTGGGTGA TAATTCTGAA
1081 CATTACTTGA AATTGACACA AAATTTGAAT TTTAGCGGAA AGTCTCAATT GACGGCAACA
1141 GTCAAGCACG CAGATTGGGG AAATTTTGGA GATGAAATCA ATGCAAAGTT GTACGTGAAG
1201 ACAGAAAGCG ATTGGTAA
SEQ ID NO.4
1 ATGTTGGCAG CCCAAAAGGG TACATTGGTC TCTGTCATTG CAGCACTGAT CTTCTTCAGC
61 GTCATTTTGG GGAGCGCGGC GCCCAAAGCC GCAGCAGCTA CAGGTTTCTA CGTGAATGGA
121 GGCAAATTGT ACGATTCTAC GGGTAAACCA TTTTACATAA GGGGTATCAA TCATGGGCAC
181 TCCTGGTTTA AGAATGATAC AGCAACGGCT ATCCCTGCGA TCGCAAAGAC GGGTGCCAAT
241 ACGGTACGAA TTGTATTATC AAACGGTACA CAATACACCA AGGATGATCT GAATTCCGTA
301 AAAAACATCA TTAATTTGGC AGAAGAAAAC AAGATTATTG CTGTGCTTGA AGTACACGAT
361 GCCACTGGGA AAGATGACTT CAACTCGTTG GATGCAGCGG TCAACTACTG GATAAGCATC
421 AAAGAAGCAC TGATCGGGAA GGAAGATCGG GTTATTGTAA ACATTGCAAA CGAGTGGTAC
481 GGAACATGGA ACGGAAGCGC GTGGGCTGAC GGGTACAAGA AGGCTATTCC GAAATTAAGA
541 GATGCGGGTA TTAAGAATAC CTTGATTGTA GATGCAGCAG GCTGGGGTCA GTACCCTCAA
601 TCGATCGTCG ATTACGGACA AAGCGTATTC GCCGCGGATT CACAGAAGAA TACGGCGTTT
661 TCCATTCACA TTTATGAGTA TGCAGGCAAG GATGCGGCCA CCGTCAAATC CAATATCGAA
721 AATGTGCTGA ATAAAGGGCT GGCCTTAATC ATTGGTGAGT TCGGAGGATA TCACACCAAT
781 GGAGATGTCG ATGAATATGC AATCATCAAA TATGGTCTGG AGAAAGGAGT AGGATGGCTT
841 GCATGGTCTT GGTACGGTAA TGGTATCAAA TGGAACTATC TTGATTTGGC AACAGGACCT
901 AACGGCAGTT TGACGAGCTA TGGTAATACG GTTGTCAATG ATACTTACGG AATTAAAAAT
961 ACGTCCCAGA AAGCGGGAAT CTTTGATGGA GATGATGGTG TCGGTGATGG TGGACCCGGT
1021 GATAGCAATG GTACAAAAAC GACGTTGTAC AATTTTGAAA CGGGAACGGA AGGATGGTCT
1081 GGAAAAAATA TCGAAACGGG ACCCTGGAGC GTCAATGAAT GGGCAGCAAA GGGTAATCAT
1141 AGCTTGAAGG CAGATGTCAA TTTGGGTGAT AATTCTGAAC ATTACTTGAA ATTGACACAA
1201 AATTTGAATT TTAGCGGAAA GTCTCAATTG ACGGCAACAG TCAAGCACGC AGATTGGGGA
1261 AATTTTGGAG ATGAAATCAA TGCAAAGTTG TACGTGAAGA CAGAAAGCGA TTGGTAA
另外，本发明的耐热酸性β-甘露聚糖酶Man5A在高温及低pH条件下具有良好的稳定性和高酶活，其最适反应pH为3，且当pH在2.5-7.0范围内具有较好的稳定性，在动物胃液(pH2.5)和肠道(pH 5.5)中均能保持较好的酶活性。最适作用温度为60oC，在75oC高温下3min可保持80%的残余酶活，在饲料、食品和医药等领域将具有广泛的应用前景。
本发明目的之二是提供应用该编码基因分别构建的大肠杆菌、枯草芽胞杆菌及毕赤酵母菌基因工程菌及其产酶情况。
本发明应用SEQ ID NO.3所示序列成功构建了表达外源耐热酸性β-甘露聚糖酶的大肠杆菌工程菌，所用大肠杆菌表达载体为pET22b，表达菌株为E.coli BL21(DE3)，所得重组菌株E.coli BL21(pET22b-man5A)在TB培养基中摇瓶发酵48h产酶量为567.22 U/mL。
本发明同时应用SEQ ID NO.3所示序列成功构建了表达外源耐热酸性β-甘露聚糖酶的枯草芽胞杆菌工程菌，所用枯草芽孢杆菌表达载体为pWB980，表达菌株为B.subtilisWB800，所得重组菌株B.subtilisWB800 (pWB980-man5A)在LB培养基中摇瓶发酵96h产酶量为618.96 U/mL。
同时，本发明还将SEQ ID NO.3所示的耐热酸性β-甘露聚糖酶编码基因插入到毕赤酵母表达载体pPIC9k的多克隆位点中，并成功整合到毕赤酵母GS115基因组的相应位置，得到具有单拷贝的重组菌P. pastoris GS115(AOX-man5A)经鉴定为甲醇利用快型，摇瓶发酵5d的产酶量达到2894.66 U/mL。
本发明目的之三是提供毕赤酵母工程菌10L发酵罐放大发酵产酶情况。
本发明又进一步针对工程菌P. pastoris GS115(AOX-man5A)的发酵产酶条件进行了优化，得到最优产酶条件为甲醇添加量2.28%、培养时间127.29 h、生物素含量4 mg/L。在摇瓶基础上，进行了10L发酵罐的放大发酵产酶实验，重组毕赤酵母P. pastoris GS115(AOX-man5A) 发酵198 h时，菌体生长趋于稳定，细胞湿重达到384 g/L，重组β-甘露聚糖酶的酶活达到10078 U/mL，较摇瓶发酵酶活提高了3.48倍。并且重组酶蛋白量占该毕赤酵母表达胞外蛋白90%以上，杂蛋白极少，具有良好的工业生产潜力。
附图说明
图1 重组β-甘露聚糖酶的最适作用pH
图2 重组β-甘露聚糖酶的pH稳定性
图3重组β-甘露聚糖酶的最适作用温度
图4 重组β-甘露聚糖酶的温度稳定性。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1 耐热酸性β-甘露聚糖酶基因man5A的克隆
应用基因组小提试剂盒提取B.amyloliquefaciens66基因组DNA，根据β-甘露聚糖酶第5家族的保守序列设计简并引物P1(5’-GAYCGRGMWGGWRGATMGG -3’)和P2(5’-TCRACRATSGATNGARGGT-3’)；以B.amyloliquefaciens66基因组DNA为模板，应用引物P1和P2进行PCR扩增，PCR反应参数为：95oC变性5min；94oC变性30s，55oC降落到50oC（每个循环降落0.5oC）退火30s，72oC延伸30s，10个循环后接着94oC变性30，50oC退火30s，72oC延伸30s，一共30个循环；72oC维持10min。成功扩增得到179bp的DNA片段。
根据以上DNA片段的测序结果，分别设计上游和下游各3条TAIL-PCR的特异性引物：usp1：5’-GCAATGTTTACAATAACCCGAT-3’；usp2：5’-GGTGTATTGTGTACCGTTTGATA-3’； usp3：5’-GGTTTCTACGTGAATGGAGGCAAATTGTACG-3’；dsp1：5’-AGTACCCTCAATCGATCGTCGA -3’； dsp2：5’- GGTATCAAATGGAACTATCTTGATTT -3’；dsp3：5’-AAACGGGACCCTGGAGCGTCAATGAATGGGCA-3’。退火温度为55-60oC，72oC延伸1min。将每一步的PCR产物进行测序，根据测序结果，拼接得到编码耐热酸性β-甘露聚糖酶的基因man5A，基因全长1317bp，编码438个氨基酸和一个终止密码子。用SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)分析，该酶N端的33个氨基酸为信号肽序列，其成熟肽的理论分子量为44kDa。
实施例2 耐热酸性β-甘露聚糖酶基因man5A在大肠杆菌中的表达
以B.amyloliquefaciens66基因组DNA为模板，应用引物EP1(5’-CCCAAGCTTACAGGTTTCTACGTGAATGGA-3’)和EP2(5’-CCGCTCGAGTTACCAATCGCTTTCTGTCTTC-3’)进行PCR扩增，对PCR克隆获得的man5A基因和pET22b(+)载体DNA分别用限制性内切酶HindIII和XhoI同步双酶切，酶切反应体系为（50μL）：20μL目的基因（质粒30μL），5μL 10×MBuffer，3μL HindIII，3μL XhoI，加无菌水补足50μL；酶切反应条件为：37℃恒温反应过夜（目的基因）或2h（质粒）；将酶切后的目的基因和质粒DNA分别切胶回收，回收后的质粒与目的基因按比例混合（1:1～10）并加入等体积的Solution I，在16℃下连接2~4h构建重组质粒。将构建好的重组质粒应用化学转化法转入克隆宿主E. coli DH5α中，挑取阳性转化子进行测序，测序正确的重组质粒命名为pET22b-man5A，并转化到表达宿主E. coli BL21(DE3)中，所得重组菌株E.coli BL21(pET22b-man5A)，该工程菌在TB培养基中，经终浓度为0.05mM的IPTG在25oC下诱导表达，摇瓶发酵48h产酶量为567.22 U/mL。
实施例3 耐热酸性β-甘露聚糖酶基因man5A在枯草芽胞杆菌中的表达
以B.amyloliquefaciens66基因组DNA为模板，应用引物BP1(5’-CCGCTCGAGACAGGTTTCTACGTGAATGGA-3’)和BP2(5’-CGCGGATCCTTACCAATCGCTTTCTGTCTTC-3’)进行PCR扩增，对PCR克隆获得的man5A基因和pWB980(+)载体DNA分别用限制性内切酶XhoI和BamH I同步双酶切，将酶切后的目的基因和质粒DNA分别切胶回收，回收后的质粒与目的基因按比例混合（1:1～10）并加入等体积的Solution I，在16℃下连接2~4h构建重组质粒。将构建好的重组质粒应用电转化法转入表达宿主B.subtilisWB800中，得到重组菌株B.subtilisWB800 (pWB980-man5A)，该工程菌在LB培养基中摇瓶发酵96h产酶量为618.96U/mL。
实施例4 耐热酸性β-甘露聚糖酶基因man5A在毕赤酵母中的表达
以B.amyloliquefaciens66基因组DNA为模板，应用引物PP1(5’-ATAAGAATGCGGCCGCACAGGTTTCTACGTG-3’)和PP2(5’-GACCTACGTATTACCAATCGCTTTCTGTC-3’)进行PCR扩增，对PCR克隆获得的man5A基因和pPIC9K(+)载体DNA分别用限制性内切酶SnaBI和Not I同步双酶切，连接到pPIC9k表达载体，得到重组质粒pPIC9k-man5A，重组质粒经SacI线性化后，电转化到毕赤酵母GS115细胞中，应用AOX引物和甘露聚糖酶基因引物PCR验证转化子，得到重组菌P. pastoris GS115(AOX-man5A)。
实施例5 毕赤酵母工程菌发酵生产耐热酸性β-甘露聚糖酶Man5A
通过平板划线法将重组毕赤酵母P. pastoris GS115(AOX-man5A)接种至YPD固体培养基，30 oC培养至单克隆出现，挑取单克隆菌落至BMGY培养基中，30 oC 250 r/min培养至一定浓度。离心弃上清，将菌体转移至等体积BMMY培养基中，28 oC 250 r/min培养。每隔24 h取样1 ml，并添加2.28%的甲醇，生物素含量为4 mg/L，样品离心，将上清稀释适当倍数测定酶活，培养时间为127.29 h时酶活最高达到2894.66 U/mL。
挑取重组毕赤酵母P. pastoris GS115(AOX-man5A)的单克隆菌落于100 ml YPD液体培养基中，30 oC 250 r/min培养至OD600nm=10左右，并将种子液加到含3 L初始培养基的10 L发酵罐中，发酵过程分为甘油单批培养，甘油分批补料培养和甲醇分批补料培养三个不同阶段。每隔一段时间取样并测OD600nm、细胞湿重和酶活，发酵198 h时，菌体生长趋于稳定，细胞湿重达到384 g/L，重组β-甘露聚糖酶的酶活达到10078 U/mL，较摇瓶发酵酶活提高了3.48倍。并且重组酶蛋白量占该毕赤酵母表达胞外蛋白90%以上。
实施例6 重组耐热酸性β-甘露聚糖酶的部分酶学性质分析
酶活定义：在该甘露聚糖酶最适作用条件下，1min从浓度为3 mg/ml的甘露聚糖（LBG，槐豆胶，Sigma G0753）溶液中降解释放1μmol还原糖所需酶量为一个酶活力单位U。
本发明对重组耐热酸性β-甘露聚糖酶的酶学性质做了初步测定：
在不同pH（pH2.5~7.5范围内，间隔0.5个单位）以及Man5A的最适作用温度条件下，测定重组甘露聚糖酶的酶活力，酶活最高为100%，计算各条件下相对酶活。结果如图1所示，该酶的最适反应pH为3，在pH2.5-7.0范围内其相对酶活在50%以上；将该酶在pH2.0-7.0的不同pH条件下分别保存0.5h，1h和1.5h，结果如图2所示，保存1h以内在pH2.0-7.0条件下，其残余酶活均在60%以上，并且在pH2.5（胃液pH）保存1.5h其残余酶活为66%，在pH5.5（肠道pH）保存1.5h其残余酶活为73%。
重组耐热酸性β-甘露聚糖酶Man5A分别置于40oC-80oC的不同温度下和pH3.0条件下测定酶活，酶活最高为100%，计算各条件下相对酶活。结果如图3所示，该酶的最适反应温度为60oC，在高温条件下相对酶活较高，80oC时的相对酶活为68%；将该重组酶在不同温度下分别保温1min，3min和5min，结果如图4所示，在75oC高温下保温3min该酶可保持80%的酶活。
以上说明对本发明而言只是说明性的，而非限制性的，对于本领域普通技术人员来说，在不脱离所附权利要求限定的精神和范围情况下，可做成许多修改、变化或等效，但都将落在本发明的保护范围和公开范围之内。
序列表
<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所
<120> 一种解淀粉芽胞杆菌来源的耐热酸性β-甘露聚糖酶及其编码基因
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 405
<212> PRT
<213> 解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)
<400> 1
Thr Gly Phe Tyr Val Asn Gly Gly Lys Leu Tyr Asp Ser Thr Gly Lys
1 5 10 15
Pro Phe Tyr Ile Arg Gly Ile Asn His Gly His Ser Trp Phe Lys Asn
20 25 30
Asp Thr Ala Thr Ala Ile Pro Ala Ile Ala Lys Thr Gly Ala Asn Thr
35 40 45
Val Arg Ile Val Leu Ser Asn Gly Thr Gln Tyr Thr Lys Asp Asp Leu
50 55 60
Asn Ser Val Lys Asn Ile Ile Asn Leu Ala Glu Glu Asn Lys Ile Ile
65 70 75 80
Ala Val Leu Glu Val His Asp Ala Thr Gly Lys Asp Asp Phe Asn Ser
85 90 95
Leu Asp Ala Ala Val Asn Tyr Trp Ile Ser Ile Lys Glu Ala Leu Ile
100 105 110
Gly Lys Glu Asp Arg Val Ile Val Asn Ile Ala Asn Glu Trp Tyr Gly
115 120 125
Thr Trp Asn Gly Ser Ala Trp Ala Asp Gly Tyr Lys Lys Ala Ile Pro
130 135 140
Lys Leu Arg Asp Ala Gly Ile Lys Asn Thr Leu Ile Val Asp Ala Ala
145 150 155 160
Gly Trp Gly Gln Tyr Pro Gln Ser Ile Val Asp Tyr Gly Gln Ser Val
165 170 175
Phe Ala Ala Asp Ser Gln Lys Asn Thr Ala Phe Ser Ile His Ile Tyr
180 185 190
Glu Tyr Ala Gly Lys Asp Ala Ala Thr Val Lys Ser Asn Ile Glu Asn
195 200 205
Val Leu Asn Lys Gly Leu Ala Leu Ile Ile Gly Glu Phe Gly Gly Tyr
210 215 220
His Thr Asn Gly Asp Val Asp Glu Tyr Ala Ile Ile Lys Tyr Gly Leu
225 230 235 240
Glu Lys Gly Val Gly Trp Leu Ala Trp Ser Trp Tyr Gly Asn Gly Ile
245 250 255
Lys Trp Asn Tyr Leu Asp Leu Ala Thr Gly Pro Asn Gly Ser Leu Thr
260 265 270
Ser Tyr Gly Asn Thr Val Val Asn Asp Thr Tyr Gly Ile Lys Asn Thr
275 280 285
Ser Gln Lys Ala Gly Ile Phe Asp Gly Asp Asp Gly Val Gly Asp Gly
290 295 300
Gly Pro Gly Asp Ser Asn Gly Thr Lys Thr Thr Leu Tyr Asn Phe Glu
305 310 315 320
Thr Gly Thr Glu Gly Trp Ser Gly Lys Asn Ile Glu Thr Gly Pro Trp
325 330 335
Ser Val Asn Glu Trp Ala Ala Lys Gly Asn His Ser Leu Lys Ala Asp
340 345 350
Val Asn Leu Gly Asp Asn Ser Glu His Tyr Leu Lys Leu Thr Gln Asn
355 360 365
Leu Asn Phe Ser Gly Lys Ser Gln Leu Thr Ala Thr Val Lys His Ala
370 375 380
Asp Trp Gly Asn Phe Gly Asp Glu Ile Asn Ala Lys Leu Tyr Val Lys
385 390 395 400
Thr Glu Ser Asp Trp
405
<210> 2
<211> 438
<212> PRT
<213> 解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)
<400> 2
Met Leu Ala Ala Gln Lys Gly Thr Leu Val Ser Val Ile Ala Ala Leu
1 5 10 15
Ile Phe Phe Ser Val Ile Leu Gly Ser Ala Ala Pro Lys Ala Ala Ala
20 25 30
Ala Thr Gly Phe Tyr Val Asn Gly Gly Lys Leu Tyr Asp Ser Thr Gly
35 40 45
Lys Pro Phe Tyr Ile Arg Gly Ile Asn His Gly His Ser Trp Phe Lys
50 55 60
Asn Asp Thr Ala Thr Ala Ile Pro Ala Ile Ala Lys Thr Gly Ala Asn
65 70 75 80
Thr Val Arg Ile Val Leu Ser Asn Gly Thr Gln Tyr Thr Lys Asp Asp
85 90 95
Leu Asn Ser Val Lys Asn Ile Ile Asn Leu Ala Glu Glu Asn Lys Ile
100 105 110
Ile Ala Val Leu Glu Val His Asp Ala Thr Gly Lys Asp Asp Phe Asn
115 120 125
Ser Leu Asp Ala Ala Val Asn Tyr Trp Ile Ser Ile Lys Glu Ala Leu
130 135 140
Ile Gly Lys Glu Asp Arg Val Ile Val Asn Ile Ala Asn Glu Trp Tyr
145 150 155 160
Gly Thr Trp Asn Gly Ser Ala Trp Ala Asp Gly Tyr Lys Lys Ala Ile
165 170 175
Pro Lys Leu Arg Asp Ala Gly Ile Lys Asn Thr Leu Ile Val Asp Ala
180 185 190
Ala Gly Trp Gly Gln Tyr Pro Gln Ser Ile Val Asp Tyr Gly Gln Ser
195 200 205
Val Phe Ala Ala Asp Ser Gln Lys Asn Thr Ala Phe Ser Ile His Ile
210 215 220
Tyr Glu Tyr Ala Gly Lys Asp Ala Ala Thr Val Lys Ser Asn Ile Glu
225 230 235 240
Asn Val Leu Asn Lys Gly Leu Ala Leu Ile Ile Gly Glu Phe Gly Gly
245 250 255
Tyr His Thr Asn Gly Asp Val Asp Glu Tyr Ala Ile Ile Lys Tyr Gly
260 265 270
Leu Glu Lys Gly Val Gly Trp Leu Ala Trp Ser Trp Tyr Gly Asn Gly
275 280 285
Ile Lys Trp Asn Tyr Leu Asp Leu Ala Thr Gly Pro Asn Gly Ser Leu
290 295 300
Thr Ser Tyr Gly Asn Thr Val Val Asn Asp Thr Tyr Gly Ile Lys Asn
305 310 315 320
Thr Ser Gln Lys Ala Gly Ile Phe Asp Gly Asp Asp Gly Val Gly Asp
325 330 335
Gly Gly Pro Gly Asp Ser Asn Gly Thr Lys Thr Thr Leu Tyr Asn Phe
340 345 350
Glu Thr Gly Thr Glu Gly Trp Ser Gly Lys Asn Ile Glu Thr Gly Pro
355 360 365
Trp Ser Val Asn Glu Trp Ala Ala Lys Gly Asn His Ser Leu Lys Ala
370 375 380
Asp Val Asn Leu Gly Asp Asn Ser Glu His Tyr Leu Lys Leu Thr Gln
385 390 395 400
Asn Leu Asn Phe Ser Gly Lys Ser Gln Leu Thr Ala Thr Val Lys His
405 410 415
Ala Asp Trp Gly Asn Phe Gly Asp Glu Ile Asn Ala Lys Leu Tyr Val
420 425 430
Lys Thr Glu Ser Asp Trp
435
<210> 3
<211> 1218
<212> DNA
<213> 解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)
<400> 3
<210> 4
<211> 1317
<212> DNA
<213> 解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)
<400> 4

Claims (10)

1.一种耐热酸性β-甘露聚糖酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种耐热酸性β-甘露聚糖酶编码基因，其特征在于，其序列如SEQ ID NO.3所示，该基因编码权利要求1所述的耐热酸性β-甘露聚糖酶成熟肽。
3.一种包含权利要求1所述序列的全长序列，其特征在于，其N端带有该酶自身信号肽序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.一种权利要求3所述氨基酸序列的基因编码序列，其特征在于，其序列如SEQ IDNO.4所示。
5.一种基因工程菌，其特征在于，该工程菌中带有如权利要求2或权利要求4所述的基因序列。
6.权利要求6所述基因工程菌为大肠杆菌。
7.一种基因工程菌，其特征在于，该工程菌中带有如权利要求2或权利要求4所述的基因序列。
8.权利要求8所述基因工程菌为枯草芽胞杆菌。
9.一种基因工程菌，其特征在于，该工程菌中带有如权利要求2或权利要求4所述的基因序列。
10.权利要求9所述基因工程菌为毕赤酵母菌。
CN201810706211.5A 2018-06-29 2018-06-29 一种解淀粉芽胞杆菌来源的耐热酸性β-甘露聚糖酶及其编码基因 Pending CN110656100A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810706211.5A CN110656100A (zh) 2018-06-29 2018-06-29 一种解淀粉芽胞杆菌来源的耐热酸性β-甘露聚糖酶及其编码基因

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810706211.5A CN110656100A (zh) 2018-06-29 2018-06-29 一种解淀粉芽胞杆菌来源的耐热酸性β-甘露聚糖酶及其编码基因

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110656100A true CN110656100A (zh) 2020-01-07

Family

ID=69027149

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810706211.5A Pending CN110656100A (zh) 2018-06-29 2018-06-29 一种解淀粉芽胞杆菌来源的耐热酸性β-甘露聚糖酶及其编码基因

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110656100A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113502249A (zh) * 2021-07-28 2021-10-15 河南省科学院生物研究所有限责任公司 一株解淀粉芽孢杆菌HTGC-10及其产β-甘露聚糖酶的发酵应用方法
WO2023242777A1 (en) * 2022-06-17 2023-12-21 Elanco Tiergesundheit Ag FORMULATIONS COMPRISING β-MANNANASE ENZYME AND METHODS THEREOF

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113502249A (zh) * 2021-07-28 2021-10-15 河南省科学院生物研究所有限责任公司 一株解淀粉芽孢杆菌HTGC-10及其产β-甘露聚糖酶的发酵应用方法
WO2023242777A1 (en) * 2022-06-17 2023-12-21 Elanco Tiergesundheit Ag FORMULATIONS COMPRISING β-MANNANASE ENZYME AND METHODS THEREOF

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108929878B (zh) 褐藻胶裂解酶的编码基因及其应用
CN110042092B (zh) 一类稳定性提高的木聚糖酶突变体及其编码基因和应用
CN111893126A (zh) 碱性蛋白酶基因、碱性蛋白酶及其制备方法和应用
CN112111472B (zh) 一种新型β-木糖苷酶及其制备
CN111549018B (zh) 一类热稳定性提高的蛋白酶突变体及其编码基因和应用
CN107384902A (zh) 一种麦芽糖转化率提高的海藻糖合酶及其制备方法和应用
CN113801240B (zh) 一种d-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体及其制备方法与应用
CN113234699A (zh) α-1,2-岩藻糖基转移酶及其应用
CN110656100A (zh) 一种解淀粉芽胞杆菌来源的耐热酸性β-甘露聚糖酶及其编码基因
CN112410322B (zh) 一种地衣芽孢杆菌β-甘露聚糖酶突变体及应用
CN108250278A (zh) 生产l-谷氨酸的菌株和生产l-谷氨酸的方法
CN111424048B (zh) 一种表达酸性β-甘露聚糖酶的基因及其载体和应用
CN109022396A (zh) 一种酶活提高的α-淀粉酶突变体及其应用
CN107858364A (zh) 一种适于甲醇酵母表达的耐高温高比活细菌植酸酶基因
CN109997970B (zh) 一类酶活和耐热性提高的酸性木聚糖酶突变体及其编码基因和应用
CN111172089A (zh) 一种利用重组海藻糖合成酶合成海藻糖的方法
CN107201375B (zh) 生产(r,r)-2,3-丁二醇基因工程菌株的构建方法及其应用
CN112725315B (zh) 一种壳聚糖酶及其突变体在制备壳寡糖中的应用
CN109371047A (zh) 一种利用蛋白IHF-α构建和表达耐热性抗菌肽融合蛋白的方法
CN114774396A (zh) 角蛋白酶突变体及与胆汁酸的复配制剂和在添加剂的应用
CN107653257A (zh) 一种烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的编码基因、重组表达载体及应用
CN110106159B (zh) 一种耐高温纤维素酶、编码基因及其制备方法
CN106434710A (zh) 一种耐热精氨酸酶的基因表达序列和应用
CN109385411B (zh) 一种β-甘露糖苷酶及其应用
CN110862952A (zh) 5-氨基乙酰丙酸生产菌株及其构建方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20200107

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication