CN107653257A - 一种烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的编码基因、重组表达载体及应用 - Google Patents

一种烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的编码基因、重组表达载体及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的编码基因，该编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，该编码基因编码的氨基酸或烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示。本发明还公开了含有所述烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的编码基因的重组表达载体。本发明还公开了所述烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的编码基因在酵母发酵生产烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶中的应用。本发明烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的编码基因是根据酵母的密码子偏好性和消除酵母内源蛋白酶识别位点原则，对甲烷嗜热杆菌的烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶基因进行酵母菌DNA序列优化得来的，其所编码的烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶具有较好的热稳定性，同时产量高。

Description

一种烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的编码基因、重组表达载 体及应用
技术领域
本发明属于基因工程和微生物发酵工程技术领域，具体涉及一种烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的编码基因、重组表达载体及应用。
背景技术
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)广泛存在于各种生物体中，对生命活动具有极为重要的作用。而烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶(nicotinamide mononucleotide adenylyltransferase，NMNATs)参与细胞内烟酰胺单核苷酸(NMN)腺苷化，进而合成NAD+，满足生命体的能量传递、物质代谢和信号转导等中对NAD+的需求，一定程度上可以降低生物细胞的衰老和死亡，可以减少肿瘤的发生和发展。
目前合成NAD+的方法主要是生物或化学合成法，生物合成法即通过筛选或诱变获取高NMNATs活力的野生菌株，但这部分菌株的NMNATs产量都比较低，不足够满足生产需求。另外有研究尝试通过大肠杆菌对NMNATs进行重组表达，但也不能获得高表达的菌株。
巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)是近年发展起来的一种以甲醇为碳源的真核表达系统，酵母可对异源蛋白进行修饰，采用有信号肽的质粒时，蛋白能被正确折叠和加工，然后分泌到培养基中。具有操作简便，营养要求低，培养价格低廉，便于高密度发酵，高产量分泌表达外源蛋白以及表达产物易于纯化等优点。
发明内容
基于此，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的编码基因，该编码基因是根据酵母的密码子偏好性和消除酵母内源蛋白酶识别位点原则，对甲烷嗜热杆菌的烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的基因进行酵母菌DNA序列优化得来的，其所表达的烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶具有较好的热稳定性，同时产量高。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
优选地，所述烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的编码基因编码的氨基酸或烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示。
所述烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的编码基因大小为543bp。
所述烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的编码基因命名为nmnT，其表达产物命名为NmnT。
所述烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的编码基因来源于甲烷嗜热杆菌，其基因全长序列或片段可以用PCR扩增法、重组法或人工合成法获得。
本发明还提供一种含有上述烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的编码基因的重组表达载体。
优选地，所述载体为质粒载体。
本发明还提供一种含有上述烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的编码基因重组表达载体的遗传工程化的宿主细胞。
优选地，所述遗传工程化的宿主细胞为巴斯德毕赤酵母。
优选地，所述遗传工程化的宿主细胞为巴斯德毕赤酵母X-33或GS115。
优选地，所述重组表达载体可以用本领域熟知的方法导入宿主细胞中，包括氯化钙热激法、电转化法、PEG介导法和基因枪法等。
本发明的另一目的在于提供一种重组烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的编码基因的异源重组表达方法，包括以下步骤：(1)构建含有所述烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的编码基因的重组表达载体；(2)利用步骤(1)中的重组表达载体转化宿主细胞，获得含有所述重组表达载体的的遗传工程化的宿主细胞；(3)培养步骤(2)中的遗传工程化的宿主细胞，从培养物中分离纯化得到所述重组烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的编码基因的表达产物；(4)对步骤(3)获得的表达产物进行酶活力测定。
优选地，所述遗传工程化的宿主细胞为巴斯德毕赤酵母。
优选地，所述遗传工程化的宿主细胞为巴斯德毕赤酵母X-33或GS115。
酶活力定义为：在37℃，1mL反应体系中，每分钟转化1umol底物所需的酶量为1个活力单位(U)。
比活力定义为：每mg酶蛋白所具有的酶活力，U/mg。酶的比活力越高，酶越纯。
烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶进行酶活力测定方法为：配制包括100mM pH7.4HEPE缓冲液、300mM NMN、50mM ATP、50mM MgCl2、1g/mL待测酶液和7U乙醇脱氢酶的酶活力测定体系，37℃水浴2h后，加入0.155M的EDTA终止反应，5min后，取上清于340nm处测定反应产物的吸光值。
本发明还提供了所述烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的编码基因在制备烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶中的用途。
本发明所述的烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的编码基因的表达产物烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的分子量为20.5kDa，比活力为40.53～45.23U/mg。
本发明还提供了所述的烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的编码基因编码的烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶在催化烟酰胺单核苷酸反应生成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸中的用途。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：本发明提供的烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的编码基因是根据酵母的密码子偏好性和消除酵母内源蛋白酶识别位点原则，对甲烷嗜热杆菌的烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶基因进行酵母菌DNA序列优化得来的，其所表达的烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶具有较好的热稳定性，同时产量高、生产工艺简单、成本低，具有很好的工业化应用前景和远大的经济价值。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
本发明提供的烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示，其编码的氨基酸或烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示。
所述烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的编码基因是人工合成的。
实施例2重组表达载体pPIC9k-nmnT的构建
(1)利用人工合成法合成所述烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的编码基因，合成过程中在烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的编码基因序列的两端加入EcoR I和Not I限制性内切酶识别位点序列。
(2)分别对步骤(1)中的烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的编码基因和质粒载体pPIC9k进行双酶切(酶切位点为EcoR I和Not I)，对两者的酶切产物进行鉴定、纯化和连接。
(3)连接产物转化E.coli DH5α克隆菌株，经菌落PCR和测序鉴定后，获得重组表达载体pPIC9k-nmnT。
实施例3遗传工程化的宿主细胞的制备
(1)将实施例2构建得到的重组表达载体pPIC9k-nmnT进行Sal I线性化处理；
(2)用氯化钙热激法将步骤(1)中的重组表达载体导入宿主细胞巴斯德毕赤酵母GS115中。将转化子涂布于含G418抗生素的筛选YPD平板培养基上，经过菌落PCR筛选和测序鉴定后，获得重组表达宿主。
实施例4遗传工程化的宿主细胞的制备
(1)将实施例2构建得到的重组表达载体pPIC9k-nmnT进行Sal I线性化处理；
(2)用氯化钙热激法将步骤(1)中的重组表达载体导入宿主细胞巴斯德毕赤酵母X-33中。将转化子涂布于含G418抗生素的筛选YPD平板培养基上，经过菌落PCR筛选和测序鉴定后，获得遗传工程化的宿主细胞。
实施例5重组烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的编码基因的异源重组表达方法
本实施例利用实施例3和4制备得到的遗传工程化的宿主细胞进行重组烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的编码基因的异源重组的表达，并对表达效果进行检测。
(一)异源重组表达方法
设置实验组1～2，分别使用实施例3～4制备得到的遗传工程化的宿主细胞来进行重组烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的编码基因的异源重组的表达。
将实施例3和4中的遗传工程化的宿主细胞分别接种于5ml YPD培养基中，于30℃，200rpm/min振荡培养过夜。以1％接种量转接于100ml YPD培养基中，振荡培养96h。发酵液离心后的取上清液，使用制备型高效液相色谱对表达产物烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶进行分离和纯化，冻干干燥后得到纯酶。
(二)表达效果检测
1、烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的表达量检测：利用蛋白含量测定方法检测分离纯化得到的烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的含量。
2、烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的热稳定性检测：检测不同温度条件下，分离纯化得到的烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶对烟酰胺单核苷酸(NMN)腺苷化的催化活性，温度设置为：37℃、40℃、55℃、70℃、72℃。
3、烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的酶活力检测：配制包括100mM pH 7.4HEPE缓冲液、300mM NMN、50mM ATP、50mM MgCl2、1g/mL待测酶液和7U乙醇脱氢酶的酶活力测定体系，37℃水浴2h后，加入0.155M的EDTA终止反应，5min后，取上清于340nm处测定反应产物的吸光值。
(三)检测结果
1、烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的表达量检测结果：对实验组1和2中烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的表达量检测结果如表1所示：
表1表达量检测结果
实验组 烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶表达量
实验组1 118mg/L
实验组2 124mg/L
由表1可知，本发明提供的烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的编码基因在巴斯德毕赤酵母GS115(实施例3)和X-33(实施例4)中的表达量高达110mg/L以上。
2、烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的热稳定性检测结果：对实验组1和2中烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的热稳定性检测结果如表2所示：
表2热稳定性检测结果
实验组 保持正常催化活性的最高温度
实验组1 70℃
实验组2 70℃
由表2可知，本发明提供的烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的编码基因编码得到的烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶具有较好的热稳定性，在70℃时仍然具有催化活性，而现有的烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的最高催化温度约为40℃。
3、烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的酶活力检测结果：对实验组1和2中烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的酶活力性检测结果如表3所示：
表3酶活力检测结果
实验组 比活力
实验组1 40.53U/mg
实验组2 45.23U/mg
由表3可知，本发明提供的烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的编码基因编码得到的烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶比活力可达40U/mg以上。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州大学
<120> 一种烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的编码基因、重组表达载体及应用
<130> 2017.9.30
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 543
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
atgactatga gaggtttgtt ggttggtaga atgcaaccat tccacagagg tcacttgcaa 60
gttattaagt ctattttgga agaagttgat gaattgatta tttgtattgg ttctgctcaa 120
ttgtctcact ctattagaga tccattcact gctggtgaaa gagttatgat gttgactaag 180
gctttgtctg aaaacggtat tccagcttct agatactaca ttattccagt tcaagatatt 240
gaatgtaacg ctttgtgggt tggtcacatt aagatgttga ctccaccatt cgatagagtt 300
tactctggta acccattggt tcaaagattg ttctctgaag atggttacga agttactgct 360
ccaccattgt tctacagaga tagatactct ggtactgaag ttagaagaag aatgttggat 420
gatggtgatt ggagatcttt gttgccagaa tctgttgttg aagttattga tgaaattaac 480
ggtgttgaaa gaattaagca cttggctaag aaggaagttt ctgaattggg tggtatttct 540
tga 543
<210> 2
<211> 180
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 2
Met Thr Met Arg Gly Leu Leu Val Gly Arg Met Gln Pro Phe His Arg
1 5 10 15
Gly His Leu Gln Val Ile Lys Ser Ile Leu Glu Glu Val Asp Glu Leu
20 25 30
Ile Ile Cys Ile Gly Ser Ala Gln Leu Ser His Ser Ile Arg Asp Pro
35 40 45
Phe Thr Ala Gly Glu Arg Val Met Met Leu Thr Lys Ala Leu Ser Glu
50 55 60
Asn Gly Ile Pro Ala Ser Arg Tyr Tyr Ile Ile Pro Val Gln Asp Ile
65 70 75 80
Glu Cys Asn Ala Leu Trp Val Gly His Ile Lys Met Leu Thr Pro Pro
85 90 95
Phe Asp Arg Val Tyr Ser Gly Asn Pro Leu Val Gln Arg Leu Phe Ser
100 105 110
Glu Asp Gly Tyr Glu Val Thr Ala Pro Pro Leu Phe Tyr Arg Asp Arg
115 120 125
Tyr Ser Gly Thr Glu Val Arg Arg Arg Met Leu Asp Asp Gly Asp Trp
130 135 140
Arg Ser Leu Leu Pro Glu Ser Val Val Glu Val Ile Asp Glu Ile Asn
145 150 155 160
Gly Val Glu Arg Ile Lys His Leu Ala Lys Lys Glu Val Ser Glu Leu
165 170 175
Gly Gly Ile Ser
180

Claims (10)

1.一种烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的编码基因编码的氨基酸或烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶，其特征在于，所述氨基酸或烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体含有权利要求1所述的烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的编码基因。
4.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求3所述的重组表达载体。
5.根据权利要求4所述的遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为巴斯德毕赤酵母。
6.根据权利要求5所述的遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为巴斯德毕赤酵母X-33或GS115。
7.一种重组烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的编码基因的异源重组表达方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)构建如权利要求3所述的重组表达载体；(2)利用步骤(1)所述重组表达载体转化宿主细胞，获得如权利要求4所述的遗传工程化的宿主细胞；(3)培养步骤(2)中的遗传工程化的宿主细胞，从培养物中分离纯化得到所述重组烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的编码基因的表达产物；(4)对步骤(3)获得的表达产物进行酶活力测定。
8.根据权利要求7所述的重组烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的编码基因的异源重组表达方法，其特征在于，所述遗传工程化的宿主细胞为巴斯德毕赤酵母X-33或GS115。
9.根据权利要求1所述的烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的编码基因在制备烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶中的用途。
10.根据权利要求1所述的烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的编码基因编码的烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶在催化烟酰胺单核苷酸反应生成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸中的用途。
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