CN110229774B

CN110229774B - 一种精氨酸脱羧酶基因工程菌及其高密度发酵培养方法

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Publication number: CN110229774B
Application number: CN201910596902.9A
Authority: CN
Inventors: 袁建国; 张言慧; 高先岭
Original assignee: Shandong National Biotechnology Research Institute; Shandong Guoli Biological Science And Technology Co ltd
Current assignee: Shandong National Biotechnology Research Institute; Shandong Guoli Biological Science And Technology Co ltd
Priority date: 2019-07-02
Filing date: 2019-07-02
Publication date: 2020-12-08
Anticipated expiration: 2039-07-02
Also published as: CN110229774A

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种高密度细胞发酵方法，尤其涉及一种精氨酸脱羧酶基因工程菌及其高密度发酵培养方法。所述基因工程菌以E.coliK12为宿主，以pET28A为载体，表达adiA基因；所述adiA基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述工程菌可分泌高活性重组精氨酸脱羧酶，并且该工程菌可应用于中试高密度发酵培养，使重组精氨酸脱羧酶工业化生产成为可能。本发明发酵培养方法通过对发酵培养基的筛选及发酵诱导培养条件的优化，通过控制甘油、氨水的补加时间、补加速率及用量控制碳源与氮源的供应，通过调整搅拌转速，通气量控制氧的供应，从而实现菌体高密度生长和目标蛋白酶大量表达。

Description

一种精氨酸脱羧酶基因工程菌及其高密度发酵培养方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种高密度细胞发酵方法，尤其涉及一种精氨酸脱羧酶基因工程菌及其高密度发酵培养方法。

背景技术

精氨酸脱羧酶(Arginine decarboxylase,ADC)，是一种磷酸吡哆醛(PLP)依赖型脱羧酶，以L-精氨酸为底物，脱去羧基后生成胍基丁胺(见图1)。胍基丁胺作为一种重要的生物胺，具有很大的生理功能和医药价值，而目前企业主要采用化学法生产胍丁胺，生产过程复杂，对环境污染严重。生物酶法具有环保、高效等特点，如何采用精氨酸脱羧酶大规模生产胍基丁胺，是人们研究的热点。

大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)体内存在两种精氨酸脱羧酶基因，一种编码基因为adiA；另一种编码基因为speA。中国专利申请(CN105062943A)公开了一种利用高产精氨酸脱羧酶的重组菌生产胍基丁胺的方法，所述重组菌以E.coli BL21(DE3)为宿主、pET20b(+)为表达载体，表达来源于E.coli BL21的精氨酸脱羧酶基因speA。利用所述重组菌生产精氨酸脱羧酶的方法，是将重组菌种子液接种至发酵培养基(SOC培养基)，培养至OD₆₀₀为0.7，然后加入终浓度为0.4mmol/L的IPTG诱导，所得精氨酸脱羧酶的比酶活可达0.53U/mg。王鹏根据NCBI发表的E.coli MG1655中精氨酸脱羧酶基因adiA序列和pET-28a载体多克隆位点构建得到精氨酸脱羧酶基因工程菌(王鹏.氨基酸脱羧酶重组表达及应用研究[D].南京大学,2015.)。中国专利申请(CN105861529A)将来源于腐败西瓦氏菌的精氨酸脱羧酶在大肠杆菌内表达，产生的精氨酸脱羧酶用于转化L-精氨酸生产胍基丁胺，产量为61～71g/L，转化率为68～82％。

综合现有技术报道并结合实际生产经验，发明人发现以不同来源的编码精氨酸脱羧酶的基因构建基因工程菌，所得重组精氨酸脱羧酶的酶活及转化能力存在明显不同，且现有技术中的培养方法所得到的发酵液中菌体浓度不高，进而导致精氨酸脱羧酶表达量不高。目前几乎未见将所得重组菌用于高密度发酵生产精氨酸脱羧酶的报道。此外，不同发酵培养基，不同诱导培养方式以及不同的发酵调控方式也会影响基因工程菌的发酵生产能力。因此开发一种高效的精氨酸脱羧酶的生产方法对精氨酸脱羧酶的产业化应用有重要的实践意义。

发明内容

本发明的主要目的是实现高活性重组精氨酸脱羧酶的高密度发酵培养。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明目的之一，提供一种精氨酸脱羧酶基因工程菌，所述基因工程菌以E.coliK12为宿主，以pET28A为载体，重组表达adiA基因；所述adiA基因核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

本发明目的之二，提供以上所述精氨酸脱羧酶基因工程菌的高密度发酵培养方法，所述方法包括：种子液培养；将种子液接种到发酵培养基中，发酵诱导培养；补加碳源、氮源；控制溶氧量等。

碳源为甘油或葡萄糖，氮源为氨水、蛋白胨或酵母粉；优选的，碳源为甘油；氮源为氨水。

本发明目的之三，提供利用以上所述方法得到的重组精氨酸脱羧酶。

本发明目的之四，提供以上所述方法得到的重组精氨酸脱羧酶在制备胍基丁胺中的应用。

在发酵工业中，工程菌往往由于表达载体、表达宿主、表达条件等，使菌体高密度生长和重组蛋白的高水平表达受限，从而致使工程菌无法真正适用于工业化生产中。本发明以核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的adiA基因为目的基因，以E.coliK12为宿主，以pET28A为载体，利用基因工程手段，构建得到的工程菌性能稳定，可分泌高活性重组精氨酸脱羧酶，并且该工程菌可应用于规模化高密度发酵生产。

本发明所述工程菌的发酵培养方法，通过对发酵培养基的筛选及诱导培养条件的优化，通过控制甘油、氨水的补加时间、补加速率及用量控制碳源与氮源的供应，通过调整搅拌转速、通气量控制氧的供应，从而实现菌体高密度生长和目的蛋白酶大量表达。本发明方法在短时间内(24～30h)不仅实现了工程菌高密度培养，菌体湿重可以达到100g/L以上，而且得到高催化活性的发酵液，所得重组精氨酸脱羧酶酶活可以达到5000U/mL以上，大大增加了单位发酵液的细胞酶量。本发明方法有利于降低发酵成本，使得生物反应体系得到高效利用，提高生物质资源的利用率。

附图说明

图1：精氨酸脱羧酶催化反应示意图

图2：实施例2中不同培养基组成对酶活的影响

图3：实施例2中装液量对菌体生长和酶活的影响

图4：实施例2中接种量对酶活的影响

图5：实施例2中诱导温度对菌体生长和酶活的影响

图6：实施例2中诱导时间对菌体生长和酶活的影响

图7：实施例2中诱导剂浓度对菌体生长和酶活的影响

图8：实施例2中30℃诱导培养酶活液相检测图谱

图9：实施例4中中试发酵甘油、氨水流加速率曲线图谱

图10：实施例4中中试发酵菌体生长及比生长速率曲线图谱

图11：实施例4中中试发酵酶活变化曲线

图12：实施例4中中试发酵过程控制参数变化曲线

图13：精氨酸脱羧酶发酵技术路线

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。

针对背景技术中所涉及的问题，本发明第一个方面，提供一种精氨酸脱羧酶基因工程菌，所述基因工程菌以E.coliK12为宿主，以pET28A为载体，表达adiA基因；所述adiA基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述adiA基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明构建所得基因工程菌可应用于中试发酵中，分泌高活性精氨酸脱羧酶。

本发明第二个方面，提供一种以上所述精氨酸脱羧酶基因工程菌的发酵培养方法，所述方法包括：种子液培养；将种子液接种到发酵培养基中，发酵诱导培养；补加碳源、氮源；控制溶氧量；碳源为甘油或葡萄糖，氮源为氨水、蛋白胨或酵母粉；优选的，碳源为甘油；氮源为氨水。

进一步地，所述发酵培养基由以下成分及配比组成：甘油5～52g/L，蛋白胨8～45g/L，酵母粉2～36g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 6～50g/L，K₂HPO₄·3H₂O 3～46g/L，磷酸二氢钾3～35g/L，氯化钠0.5～18g/L，硫酸镁0.5～15g/L，余量为水。本发明通过对不同营养成分的筛选，所得上述发酵培养基效果最佳。

进一步地，发酵诱导培养过程中，诱导剂为IPTG或乳糖；优选的，诱导剂为IPTG，IPTG诱导浓度为0.3～0.6mmol/L，诱导时间为5～8h。在该诱导条件下，所得重组酶活力最好。

进一步地，在发酵过程中，待发酵至溶氧开始回升时流加甘油，所用甘油浓度为40～60％，流加速率为0.2～30mL/(L·h)，流加甘油总量为发酵培养基体积的10～30％。

进一步地，在发酵2～6h开始流加氨水，所用氨水浓度为10～30％，流加速率为0.1～5mL/(L·h)，流加氨水总量为发酵培养基体积的1～8％。

进一步地，搅拌转速为150～500rpm，通气量为1～2vvm，控制发酵液溶氧量为15～20％。

进一步地，发酵过程中pH值控制在6.5～7.5。

在发酵过程中产生的副产物，如乙酸等往往会对菌体生长和产物生成有不利影响，影响发酵结果。而合理掌控发酵过程中菌体的比生长速率(μ)和产物的比生产速率(Q_P)尤为关键。

由式(1)可知，菌体的比生长速率与生长限制性底物有关。

式中S是生长限制性底物，μ_m是最大比生长速率，Ks是半饱和常数，X为菌体细胞质量，dX/dt为菌体细胞的瞬时增量。

由式(2)可知，产物的比生产速率与菌体的比生长速率有关，进一步分析可得产物的比生产速率与生长限制性底物有关。

本发明工程菌发酵过程中，生长限制性底物包括碳源、氮源及氧。因此，通过控制限制性底物的补加时间、补加速率及用量控制碳源与氮源的供应，通过调整搅拌转速，通气量控制氧的供应，从而实现菌体高密度生长和目标蛋白酶大量表达。通过筛选，本发明以甘油作为氮源，氨水作为碳源效果最佳。

进一步地，

式中，CH_mO_l为碳源，此处为CH₂O；CH_pO_nN_q为菌体，此处可取CH_1.898O_0.627N_0.152；CH_rO_sN_t为蛋白产物，此处为CH_1.679O_0.345N_0.275；a、b、c、d均为化学计量系数；y_X是量纲为1的菌体得率，y_P是量纲为1的产物的率，它们与碳源的菌体得率Y_X/S，碳源的产物得率Y_P/S有如下关系

式中，α₁为碳源含碳量，α₂为菌体含碳量，α₃为产物含碳量。

又因为对于生长限制性底物氧而言，菌体的耗氧速率(Oxygen uptake rate,OUR)：

式中，F_in为进气流量，mol；V为发酵液体；

为排气中的氧及二氧化碳的浓度，通过在线尾气分析仪测定；t_in为进气的温度，℃；h为进气的相对湿度。

鉴于作为菌体生长和产物生成的限制性底物碳源、氮源及氧存在上述关系，经多次实验后分析计算，本发明底物的补加时间为发酵培养底料里的生长限制性底物耗尽即溶氧的突然回升为判断点，此时碳源或氮源耗尽，并开始流加碳源或氮源，并调控流加速率使得溶氧控制在15～20％；碳源甘油流加量控制在发酵培养基体积的10～30％，氮源氨水流加量控制在发酵培养基体积的1～8％，而碳氮比是通过控制pH实现的，维持在6.5～7.5之间。最终使得菌体细胞在短时间内实现高密度生长(发酵24h菌体湿重即达到100g/L以上)，并且精氨酸脱羧酶得到高效表达(酶活可以达到5000U/mL以上)。

本发明第三个方面，利用上述方法得到的重组精氨酸脱羧酶。

本发明第四个方面，提供以上所述方法得到的重组精氨酸脱羧酶在制备胍基丁胺中的应用。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。

本发明中，精氨酸脱羧酶的酶活测定方法为：在0.2mol/L的磷酸二氢钾缓冲溶液中进行，酶活检测体系为：4mL 0.2mol/L的KH₂PO₄缓冲液，200μL L-Arg母液，200μL磷酸吡哆醛母液，200μL硫酸镁母液，将上述4.6mL反应体系在37℃水浴锅中预热15min或以上，然后加入适量的全细胞催化液反应5min；。反应结束后，用冷水迅速降温，并且离心取上清，用液相检测上清中的胍基丁胺含量计算出酶活。

实施例1工程菌的构建

表达E.coliMG1655菌株来源的精氨酸脱羧酶，基因工程菌中精氨酸脱羧酶基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。基因工程菌的构建方法如下：

由于E.coliMG1655的adiA基因中没有内含子，采用细菌基因组提取试剂盒提取该菌基因组。并根据目的基因的核苷酸序列设计引物。并在正向引物与反向引物中分别加入限制性酶切位点SacI和BamHI。

正向引物F：5’-CGAGCTCGAATGCGAAAGTGCGTGTATTG-3’，如SEQ ID NO.3核苷酸序列所示；

反向引物R：5’-CGGGATCCCGTACTTTCATAATTAACAAC-3’，如SEQ ID NO.4核苷酸序列所示。

PCR反应体系和条件如下：

PCR扩增体系：

PCR扩增条件：

(1)预变性：95℃3min；

(2)变性：95℃20s；退火：55℃20s；延伸：72℃20s；循环30次；

(3)延伸：72℃10min；

(4)4℃保存。

用限制性内切酶SacI和BamHI将质粒载体pET28A和目的基因酶切6h；

用T4DNA连接酶将酶切的目的基因和质粒载体pET28A于16℃条件下过夜连接。

将构建好的重组质粒转化入感受态E.coli K12细胞中，并将其涂布于含有50μg/mL硫酸卡那霉素的LB平板培养基上过夜培养。挑取单菌落验证重组质粒中目的基因核苷酸序列的正确性，从而获得正确构建的基因工程菌株。

实施例2：发酵培养基及发酵条件的优化

(1)发酵培养基的优化

通过筛选，确定发酵培养基的组成为：

甘油5～52g/L，蛋白胨8～45g/L，酵母粉2～36g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 6～50g/L，K₂HPO₄·3H₂O 3～46g/L，磷酸二氢钾3～35g/L，氯化钠0.5～18g/L，硫酸镁0.5～15g/L，余量为水。

采用十一因素二水平L₁₂(2¹¹)正交试验方法对大肠杆菌发酵培养基进行进一步优化实验，并以单位发酵液的酶活为响应值，确定了最优的培养基组成为：甘油7g/L，蛋白胨15g/L，酵母粉5g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 18g/L，K₂HPO₄·3H₂O 13g/L，磷酸二氢钾5g/L，氯化钠1g/L，硫酸镁1g/L。

为了验证本培养基的优越性，本发明特别对比了该菌在六种不同的发酵培养基下产生精氨酸脱羧酶的酶活差异，实验时种子培养基相同，均为蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L。发酵培养基组成见下表1(单位g/L)：

表1

经过检测得到各组培养基发酵培养条件下得到的精氨酸脱羧酶酶活大小(见图2)，可见并非营养元素越多越有利于重组蛋白的表达，因为培养基中的一些成分会限制酶活的发挥，比如氯化铵、柠檬酸等。从结果中可以看出本培养基有利于精氨酸脱羧酶的表达。

(2)发酵条件的优化

本发明利用单因素实验方法考察了摇瓶培养条件下25mL/500mL，50mL/500mL，75mL/500mL，100mL/500mL四种不同的装液量对菌体生长和酶活大小的影响，实验过程中控制发酵温度为37℃，pH为7.0，转速180rpm，发酵周期24h。实验结果见图3，经过实验，发现50mL/500mL装液量条件下酶活最高，菌体生长也较好，为最佳装液量，25mL/500mL条件下虽然菌体生长较好，但是酶活不高，这是因为溶氧对精氨酸脱羧酶酶活的发挥产生了影响。

本发明利用单因素实验方法考察了1％、2％、3％、4％、5％五种不同的接种量对酶活大小的影响，发酵培养条件同上，实验结果见图4，可以看出3％的接种量条件下酶活最高。

本发明利用单因素实验方法考察了25℃、30℃、33℃、37℃四种不同的诱导培养温度，发酵周期的3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h七种不同的诱导时间及0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L、0.5mmol/L、0.6mmol/L、0.7mmol/L七种不同的诱导剂浓度下菌体生长和精氨酸脱羧酶酶活的差异，实验结果见图5、图6、图7，可以看出诱导培养温度控制在30℃，诱导时间为转种后6h，诱导剂浓度为0.5mmol/L，更有利于菌体生物量的增加与酶活的提高，这主要是因为重组蛋白的生成速率与酶蛋白空间结构的形成存在关系，低温放缓了蛋白质的生成速率，但是却维持了酶蛋白正确的空间结构，但是过低的温度却不利于生物量的积累，所以诱导培养温度控制在30℃；而诱导剂对菌体细胞有毒害作用，过早的诱导及过高的浓度均不利于生物量的积累与酶蛋白的表达，而诱导时间太晚会造成只长菌体而不表达蛋白的结果，同理诱导剂浓度过低也不利于酶蛋白的生成。

实施例3：种子液的培养

(1)小试培养

取甘油管接种于培养皿平板上活化菌种，培养时间24h；将培养皿平板保存于4℃冰箱；用接种环在无菌条件下挖取一环平板种子接种于种子培养基中(50mL/500mL锥形瓶)。培养基组成为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，pH自然，在121℃，0.1Mpa压力下灭菌20min。然后将接种后的种子摇瓶在37℃、180rpm的恒温气浴摇床中培养16h得到小试发酵的种子培养液。

(2)中试培养

取甘油管接种于培养皿平板上活化菌种，培养时间24h；将培养皿平板保存于4℃冰箱；用接种环在无菌条件下挖取一环平板种子接种于种子培养基中(50mL/500mL锥形瓶)。培养基组成为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，pH自然，在121℃，0.1Mpa压力下灭菌20min。然后将接种后的种子摇瓶在37℃、180rpm的恒温气浴摇床中培养16h得到一级种子培养液。将摇瓶种子液接种于20L种子罐中，发酵罐装料量10L，接种量3％。培养基组成为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，Na₂HPO₄·12H₂O12g/L，磷酸二氢钾5g/L，NaCl 10g/L，pH7.0，在121℃，0.1Mpa压力下灭菌20min。通气量为1vvm，培养约8h后，种子进入对数生长后期，得到二级种子液，可以将其接种于中试规模的发酵罐。

实施例4：精氨酸脱羧酶基因工程菌的发酵培养方法

(1)小试发酵

采用15L发酵罐进行了精氨酸脱羧酶高密度细胞培养小试发酵工艺的研究，装液量为7.5L。

将实施例2小试培养得到的种子液按3％的接种量接入到发酵培养基中，温度控制在37℃，搅拌转速为200rpm，通气量为1.5vvm，发酵至OD₆₀₀为14.2时，发酵时间6.5h加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG，开始在30℃下诱导。

所用发酵培养基为：甘油7g/L，蛋白胨15g/L，酵母粉5g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 18g/L，K₂HPO₄·3H₂O 13g/L，磷酸二氢钾5g/L，氯化钠1g/L，硫酸镁1g/L，余量为水。

发酵周期进行至4.5h时溶氧开始回升，此时开始流加浓度为50％的甘油，整个发酵过程共流加50％甘油26.56％，最高流加速率为12.5mL/(L·h)。从发酵周期6h开始流加浓度为28％氨水，氨水既做氮源又用来调节pH，整个发酵过程共流加氨水2％，氨水流加的最高速率为3.5mL/(L·h)。甘油刚开始时加入52mL以使发酵罐初始碳源浓度为3.5g/L，通气量调节至1.2vvm，并提高搅拌转速将溶氧控制在20％，随着菌体的生长，菌体的耗氧速率逐渐增加，需要逐渐提升碳源流加速度。氨水根据碳源的消耗速率自动流加，发酵过程中pH值控制在6.5。

发酵24h结束后，菌体OD₆₀₀最后为95.4。采用50nm陶瓷膜收集含精氨酸脱羧酶的全细胞菌体，并用去离子水洗涤三遍，所得菌体湿重为125g/L，精氨酸脱羧酶的酶活为5216U/mL。

(2)中试发酵

采用200L发酵罐进行培养，装液量为100L。

将实施例2中试培养得到的二级种子液按3％的接种量接入到发酵培养基中，温度控制在37℃，搅拌转速为300rpm，通气量为1vvm，发酵至OD₆₀₀为15.65时，发酵时间6h加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG，开始在30℃下诱导。

发酵培养基为：蛋白胨12g/L，酵母粉5g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 15g/L，K₂HPO₄·3H₂O13g/L，磷酸二氢钾5g/L，氯化钠1g/L，硫酸镁0.5g/L，pH7.0，在121℃，0.1Mpa压力下灭菌20min。

发酵周期进行至大约4.5h时溶氧开始回升，此时开始流加浓度为50％甘油，整个发酵过程共流加21.8％，最大流加速率为19.2mL/(L·h)。从发酵周期2h开始流加浓度为28％的氨水，氨水既做氮源又用来调节pH，整个发酵过程共流加氨水4.1％。甘油刚开始时加入1400mL以使发酵罐初始碳源浓度为7g/L。发酵过程中pH控制在7.0。甘油、氨水流加曲线图如图9所示，菌体生长及比生长速率曲线如图10所示，发酵酶活变化曲线图如图11所示，发酵过程控制参数变化曲线如图12所示。

发酵29h结束后，菌体OD₆₀₀最后为104.7。采用50nm陶瓷膜收集含精氨酸脱羧酶的全细胞菌体，并用去离子水洗涤三遍，所得菌体湿重为152g/L，精氨酸脱羧酶的酶活5632U/mL。

实施例5：精氨酸脱羧酶基因工程菌的发酵培养方法

(1)小试发酵

采用15L发酵罐进行了精氨酸脱羧酶高密度细胞培养小试发酵工艺的研究，装液量为8.0L。

将实施例2小试培养得到的种子液按3％的接种量接入到发酵培养基中，温度控制在37℃，搅拌转速为150rpm，通气量为1vvm，发酵至OD₆₀₀为13.8时，发酵时间8h加入终浓度为0.3mmol/L的IPTG，开始在30℃下诱导。

所用发酵培养基为甘油5g/L，蛋白胨8g/L，酵母粉2g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 6g/L，K₂HPO₄·3H₂O 3g/L，磷酸二氢钾3g/L，氯化钠0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，余量为水。

发酵周期进行至4.8h时溶氧开始回升，此时开始流加浓度为60％的甘油，整个发酵过程共流加23.1％，最大流加速率为22.5mL/(L·h)。从发酵周期6h开始流加浓度为28％氨水，氨水既做氮源又用来调节pH，整个发酵过程共流加氨水2.3％，氨水最高流加的速率2.5mL/(L·h)。甘油刚开始时加入95mL以使发酵罐初始碳源浓度为7.0g/L，发酵时间5.3h流加甘油时由于速度过快，使得溶氧跌零，此时停止流加甘油，通气量调节至1.2vvm，5min后溶氧开始回升，并控制在20％，重新开始流加碳源。发酵过程中pH值控制在6.5。

发酵25h结束后，菌体OD₆₀₀最后为106。采用50nm陶瓷膜收集含精氨酸脱羧酶的全细胞菌体，并用去离子水洗涤三遍，所得菌体湿重为141g/L，精氨酸脱羧酶的酶活4927U/mL。

(2)中试发酵

采用200L发酵罐进行培养，装液量为100L。

将实施例2中试培养得到的二级种子液按3％的接种量接入到发酵培养基中，温度控制在37℃，搅拌转速为150rpm，通气量为1.2vvm，发酵至OD₆₀₀为15.4时，发酵时间6h加入终浓度为0.3mmol/L的IPTG，开始在30℃下诱导。

发酵周期进行至大约4.5h时溶氧开始回升，此时开始流加浓度为60％甘油，整个发酵过程共流加60％甘油为发酵培养基体积的15％，最高流加速率为13.8mL/(L·h)。从发酵周期2h开始流加浓度为14％的氨水，氨水既做氮源又用来调节pH，整个发酵过程共流加氨水为发酵培养基体积的6.5％。发酵过程中pH控制在6.5。

甘油刚开始时加入1400mL以使发酵罐初始碳源浓度为7g/L。

发酵28h结束后，菌体OD₆₀₀最后为102.1。采用50nm陶瓷膜收集含精氨酸脱羧酶的全细胞菌体，并用去离子水洗涤三遍，所得菌体湿重为138g/L，精氨酸脱羧酶的酶活5319U/mL。

实施例6：精氨酸脱羧酶基因工程菌的发酵培养方法

(1)小试发酵

采用15L发酵罐进行了精氨酸脱羧酶高密度细胞培养小试发酵工艺的研究，装液量为7L。

将实施例2小试培养得到的种子液按3％的接种量接入到发酵培养基中，温度控制在37℃，搅拌转速为500rpm，通气量为2vvm，发酵至OD₆₀₀为14.8时，发酵时间5h加入终浓度为0.6mmol/L的IPTG，开始在30℃下诱导。

所用发酵培养基为甘油52g/L，蛋白胨45g/L，酵母粉36g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 50g/L，K₂HPO₄·3H₂O 46g/L，磷酸二氢钾35g/L，氯化钠18g/L，硫酸镁15g/L，余量为水。

发酵周期进行至4.6h时溶氧开始回升，此时开始流加浓度为40％的甘油，整个发酵过程共流加40％甘油为发酵培养基体积的29.1％，最大流加速率为28.5mL/(L·h)。从发酵周期6h开始流加浓度为14％的氨水，氨水既做氮源又用来调节pH，整个发酵过程共流加氨水为发酵培养基体积的3.9％，氨水流加的速率最高为3.21mL/(L·h)。甘油刚开始时加入50mL以使发酵罐初始碳源浓度为3.5g/L，发酵时间6.2h流加甘油时由于甘油流加速度过慢，使得溶氧处于高位，菌体耗氧速率减弱，此时将甘油流加速度调快，3min后溶氧开始下降，并控制在15％。发酵过程中pH值控制在7.5。

发酵26h结束后，菌体OD₆₀₀最后为97.3。采用50nm陶瓷膜收集含精氨酸脱羧酶的全细胞菌体，并用去离子水洗涤三遍，所得菌体湿重为127.2g/L，精氨酸脱羧酶的酶活5721U/mL。

(2)中试发酵

采用200L发酵罐进行培养，装液量为110L。

将实施例2中试培养得到的二级种子液按3％的接种量接入到发酵培养基中，温度控制在37℃，搅拌转速为500rpm，通气量为1.5vvm，发酵至OD₆₀₀为16.4时，发酵时间7h加入终浓度为0.6mmol/L的IPTG，开始在30℃下诱导。

发酵周期进行至大约4.5h时溶氧开始回升，此时开始流加浓度为40％甘油，整个发酵过程共流加40％甘油为发酵培养基体积的21％，流加速率最大为18.3mL/(L·h)。从发酵周期2.5h开始流加浓度为28％的氨水，氨水既做氮源又用来调节pH，整个发酵过程共流加氨水为发酵培养基体积的6％。发酵过程中pH控制在7.5。甘油刚开始时加入2060mL以使发酵罐初始碳源浓度为7g/L。

发酵27h结束后，菌体OD₆₀₀最后为112.5。采用50nm陶瓷膜收集含精氨酸脱羧酶的全细胞菌体，并用去离子水洗涤三遍，所得菌体湿重为168.3g/L，精氨酸脱羧酶的酶活5361U/mL。

实施例7：精氨酸脱羧酶基因工程菌的发酵培养方法

(1)小试发酵

发酵周期进行至4.6h时溶氧开始回升，此时开始流加浓度为40％的甘油，整个发酵过程共流加40％甘油为发酵培养基体积的10％，最大流加速率为0.2mL/(L·h)。从发酵周期6h开始流加浓度为14％的氨水，氨水既做氮源又用来调节pH，整个发酵过程共流加氨水为发酵培养基体积的1％，氨水流加的速率最高为0.1mL/(L·h)。甘油刚开始时加入50mL以使发酵罐初始碳源浓度为3.5g/L，发酵时间6.2h流加甘油时由于甘油流加速度过慢，使得溶氧处于高位，菌体耗氧速率减弱，此时将甘油流加速度调快，3min后溶氧开始下降，并控制在15％。发酵过程中pH值控制在7.5。

发酵26h结束后，菌体OD₆₀₀最后为95.8。采用50nm陶瓷膜收集含精氨酸脱羧酶的全细胞菌体，并用去离子水洗涤三遍，所得菌体湿重为123.2g/L，精氨酸脱羧酶的酶活5683U/mL。

(2)中试发酵

采用200L发酵罐进行培养，装液量为110L。

发酵周期进行至大约4.5h时溶氧开始回升，此时开始流加浓度为40％甘油，整个发酵过程共流加40％甘油为发酵培养基体积的30％，流加速率最大为30mL/(L·h)。从发酵周期2.5h开始流加浓度为28％的氨水，流加速率为5mL/(L·h)。氨水既做氮源又用来调节pH，整个发酵过程共流加氨水为发酵培养基体积的8％。发酵过程中pH控制在7.5。甘油刚开始时加入2060mL以使发酵罐初始碳源浓度为7g/L。

发酵27h结束后，菌体OD₆₀₀最后为108.2。采用50nm陶瓷膜收集含精氨酸脱羧酶的全细胞菌体，并用去离子水洗涤三遍，所得菌体湿重为159.6g/L，精氨酸脱羧酶的酶活5286U/mL。

给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。

序列表

<110> 山东国力生物科技有限公司山东国力生物技术研究院

<120> 一种精氨酸脱羧酶基因工程菌及其高密度发酵培养方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2268

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

atgaaagtat taattgttga aagcgagttt ctccatcaag acacctgggt cggtaacgcc 60

gttgagcgtc tggcagatgc tttaagccag caaaatgtta ccgtgattaa atccacctcc 120

tttgatgatg gttttgccat tctctcttca aacgaagcca ttgactgcct gatgttcagc 180

tatcaaatgg aacatccgga cgaacatcaa aacgtcagac aattgatcgg taagcttcat 240

gagcgccaac aaaacgtgcc ggtcttcctg ttgggcgatc gggaaaaagc cctcgccgca 300

atggatcgcg acctgctgga gcttgtcgat gaattcgcct ggattctgga agataccgcc 360

gactttatcg ccggacgcgc cgttgccgcg atgacccgct accgccagca gctgttgccg 420

ccactgttca gcgcgctgat gaaatatagt gacatccatg aatattcctg ggcagcgcca 480

ggccaccagg gcggcgttgg ttttaccaaa acacccgccg gacgtttcta ccatgactac 540

tatggtgaaa atctgttccg caccgacatg ggcatcgaac gaacttccct cggttctttg 600

cttgaccata ctggcgcatt tggcgaaagc gaaaaatatg ccgcacgcgt atttggtgcc 660

gatcgctcct ggtcggtagt cgtcggtact tccggctcta accgcaccat catgcaggct 720

tgcatgaccg ataacgatgt cgtggtcgtt gaccgtaact gccataaatc catcgaacaa 780

ggtttgatgc tgacaggcgc gaaaccggtc tatatggtgc caagccgcaa ccgctacggc 840

attatcgggc caatctatcc gcaggaaatg caacctgaaa ccttgcagaa gaaaatcagt 900

gaaagcccgc tgaccaaaga caaagccggg caaaaaccgt cttactgcgt ggtgaccaac 960

tgcacctatg acggcgtgtg ttataacgct aaagaagcgc aggatctgct ggaaaaaacc 1020

tccgatcgtc tgcactttga cgaagcctgg tacggctatg cacgtttcaa cccgatctat 1080

gccgatcact atgccatgcg cggcgaacct ggcgatcaca acggtcctac cgttttcgcc 1140

acccactcca cccacaaact gctgaatgcg ctgtcacagg cttcttatat tcatgtacgt 1200

gaaggtcgtg gggcgattaa cttctcccgc ttcaaccagg cctacatgat gcatgccacc 1260

acctccccgc tgtatgccat ctgcgcatcc aacgacgtgg cggtgtcgat gatggacggc 1320

aacagcggcc tgtcactgac acaggaagtg attgacgaag cggttgattt ccgtcaggcg 1380

atggcgcggc tatataaaga gttcaccgct gacggtagct ggttcttcaa accgtggaac 1440

aaagaagtcg tcaccgaccc acaaaccggc aaaacctatg actttgctga cgcaccaacc 1500

aaactgctga ccaccgttca ggactgctgg gtaatgcatc cgggcgaaag ctggcacggc 1560

ttcaaagata ttccggataa ctggagtatg ctcgacccga ttaaaatcag catccttgct 1620

ccgggaatgg gtgaagatgg tgaactggaa gaaaccggtg ttccggcggc gctggtcact 1680

gcctggcttg gtcgccacgg cattgtacct acccgcacca ctgacttcca aattatgttc 1740

ctgttctcta tgggcgtaac ccgtgggaaa tggggaactc tggttaacac cctttgctcc 1800

ttcaaacgcc actatgacgc caacacaccg ctggcgcagg tgatgccgga acttgttgaa 1860

caatatcctg acacttacgc gaacatgggg attcacgatc tgggtgacac catgtttgcc 1920

tggctgaaag aaaacaaccc tggcgcacgg ttgaacgaag cctattccgg cctgccggtg 1980

gcggaagtca ccccgcgtga agcgtacaac gcgattgtcg acaacaatgt cgaactggta 2040

tccattgaaa atctgccagg acgcatcgcg gcaaactcag ttatcccgta tccgccagga 2100

atcccgatgc tgctgtctgg tgaaaacttc ggcgataaaa acagtccgca agtaagttat 2160

ttacgctcgc tgcaatcctg ggaccaccat ttccctggat ttgaacacga aactgaaggg 2220

actgaaatta ttgacggtat ttaccacgtt atgtgcgtga aagcgtaa 2268

<210> 2

<211> 755

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 2

Met Lys Val Leu Ile Val Glu Ser Glu Phe Leu His Gln Asp Thr Trp

1 5 10 15

Val Gly Asn Ala Val Glu Arg Leu Ala Asp Ala Leu Ser Gln Gln Asn

20 25 30

Val Thr Val Ile Lys Ser Thr Ser Phe Asp Asp Gly Phe Ala Ile Leu

35 40 45

Ser Ser Asn Glu Ala Ile Asp Cys Leu Met Phe Ser Tyr Gln Met Glu

50 55 60

His Pro Asp Glu His Gln Asn Val Arg Gln Leu Ile Gly Lys Leu His

65 70 75 80

Glu Arg Gln Gln Asn Val Pro Val Phe Leu Leu Gly Asp Arg Glu Lys

85 90 95

Ala Leu Ala Ala Met Asp Arg Asp Leu Leu Glu Leu Val Asp Glu Phe

100 105 110

Ala Trp Ile Leu Glu Asp Thr Ala Asp Phe Ile Ala Gly Arg Ala Val

115 120 125

Ala Ala Met Thr Arg Tyr Arg Gln Gln Leu Leu Pro Pro Leu Phe Ser

130 135 140

Ala Leu Met Lys Tyr Ser Asp Ile His Glu Tyr Ser Trp Ala Ala Pro

145 150 155 160

Gly His Gln Gly Gly Val Gly Phe Thr Lys Thr Pro Ala Gly Arg Phe

165 170 175

Tyr His Asp Tyr Tyr Gly Glu Asn Leu Phe Arg Thr Asp Met Gly Ile

180 185 190

Glu Arg Thr Ser Leu Gly Ser Leu Leu Asp His Thr Gly Ala Phe Gly

195 200 205

Glu Ser Glu Lys Tyr Ala Ala Arg Val Phe Gly Ala Asp Arg Ser Trp

210 215 220

Ser Val Val Val Gly Thr Ser Gly Ser Asn Arg Thr Ile Met Gln Ala

225 230 235 240

Cys Met Thr Asp Asn Asp Val Val Val Val Asp Arg Asn Cys His Lys

245 250 255

Ser Ile Glu Gln Gly Leu Met Leu Thr Gly Ala Lys Pro Val Tyr Met

260 265 270

Val Pro Ser Arg Asn Arg Tyr Gly Ile Ile Gly Pro Ile Tyr Pro Gln

275 280 285

Glu Met Gln Pro Glu Thr Leu Gln Lys Lys Ile Ser Glu Ser Pro Leu

290 295 300

Thr Lys Asp Lys Ala Gly Gln Lys Pro Ser Tyr Cys Val Val Thr Asn

305 310 315 320

Cys Thr Tyr Asp Gly Val Cys Tyr Asn Ala Lys Glu Ala Gln Asp Leu

325 330 335

Leu Glu Lys Thr Ser Asp Arg Leu His Phe Asp Glu Ala Trp Tyr Gly

340 345 350

Tyr Ala Arg Phe Asn Pro Ile Tyr Ala Asp His Tyr Ala Met Arg Gly

355 360 365

Glu Pro Gly Asp His Asn Gly Pro Thr Val Phe Ala Thr His Ser Thr

370 375 380

His Lys Leu Leu Asn Ala Leu Ser Gln Ala Ser Tyr Ile His Val Arg

385 390 395 400

Glu Gly Arg Gly Ala Ile Asn Phe Ser Arg Phe Asn Gln Ala Tyr Met

405 410 415

Met His Ala Thr Thr Ser Pro Leu Tyr Ala Ile Cys Ala Ser Asn Asp

420 425 430

Val Ala Val Ser Met Met Asp Gly Asn Ser Gly Leu Ser Leu Thr Gln

435 440 445

Glu Val Ile Asp Glu Ala Val Asp Phe Arg Gln Ala Met Ala Arg Leu

450 455 460

Tyr Lys Glu Phe Thr Ala Asp Gly Ser Trp Phe Phe Lys Pro Trp Asn

465 470 475 480

Lys Glu Val Val Thr Asp Pro Gln Thr Gly Lys Thr Tyr Asp Phe Ala

485 490 495

Asp Ala Pro Thr Lys Leu Leu Thr Thr Val Gln Asp Cys Trp Val Met

500 505 510

His Pro Gly Glu Ser Trp His Gly Phe Lys Asp Ile Pro Asp Asn Trp

515 520 525

Ser Met Leu Asp Pro Ile Lys Ile Ser Ile Leu Ala Pro Gly Met Gly

530 535 540

Glu Asp Gly Glu Leu Glu Glu Thr Gly Val Pro Ala Ala Leu Val Thr

545 550 555 560

Ala Trp Leu Gly Arg His Gly Ile Val Pro Thr Arg Thr Thr Asp Phe

565 570 575

Gln Ile Met Phe Leu Phe Ser Met Gly Val Thr Arg Gly Lys Trp Gly

580 585 590

Thr Leu Val Asn Thr Leu Cys Ser Phe Lys Arg His Tyr Asp Ala Asn

595 600 605

Thr Pro Leu Ala Gln Val Met Pro Glu Leu Val Glu Gln Tyr Pro Asp

610 615 620

Thr Tyr Ala Asn Met Gly Ile His Asp Leu Gly Asp Thr Met Phe Ala

625 630 635 640

Trp Leu Lys Glu Asn Asn Pro Gly Ala Arg Leu Asn Glu Ala Tyr Ser

645 650 655

Gly Leu Pro Val Ala Glu Val Thr Pro Arg Glu Ala Tyr Asn Ala Ile

660 665 670

Val Asp Asn Asn Val Glu Leu Val Ser Ile Glu Asn Leu Pro Gly Arg

675 680 685

Ile Ala Ala Asn Ser Val Ile Pro Tyr Pro Pro Gly Ile Pro Met Leu

690 695 700

Leu Ser Gly Glu Asn Phe Gly Asp Lys Asn Ser Pro Gln Val Ser Tyr

705 710 715 720

Leu Arg Ser Leu Gln Ser Trp Asp His His Phe Pro Gly Phe Glu His

725 730 735

Glu Thr Glu Gly Thr Glu Ile Ile Asp Gly Ile Tyr His Val Met Cys

740 745 750

Val Lys Ala

755

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

cgagctcgaa tgcgaaagtg cgtgtattg 29

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

cgggatcccg tactttcata attaacaac 29

Claims

1.一种精氨酸脱羧酶基因工程菌的高密度发酵培养方法，其特征在于，所述基因工程菌以E.ColiK12为宿主，以pET28A为载体，表达adiA基因；所述adiA基因核苷酸序列如SEQID NO.1所示；培养方法包括：种子液培养；将种子液接种到发酵培养基中，发酵诱导培养；补加碳源、氮源；控制溶氧量；碳源为甘油；氮源为氨水；

所述发酵培养基由以下成分及配比组成：甘油5～52g/L，蛋白胨8～45g/L，酵母粉2～36g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 6～50g/L，K₂HPO₄·3H₂O 3～46g/L，磷酸二氢钾3～35g/L，氯化钠0.5～18g/L，硫酸镁0.5～15g/L，余量为水；

所述发酵诱导培养过程中，诱导剂为IPTG；

待发酵至溶氧开始回升时流加甘油，所用甘油浓度为40～60％，流加速率为0.2～30mL/(L·h)，流加甘油总量为发酵培养基体积的10～30％；在发酵2～6h开始流加氨水，所用氨水浓度为14～28％，流加速率为0.1～5mL/(L·h)，流加氨水总量为发酵培养基体积的1～8％；

所述发酵诱导培养过程中，诱导剂为IPTG，IPTG诱导浓度为0.3～0.6mmol/L，诱导时间为接种后5～8h；

搅拌转速为150～500rpm，通气量为1～2vvm，控制发酵液溶氧量为15～20％；

发酵过程中pH值控制在6.5～7.5。