CN110257448A

CN110257448A - 一种利用菌体全细胞催化精氨酸转化为胍基丁胺的方法

Info

Publication number: CN110257448A
Application number: CN201910596812.XA
Authority: CN
Inventors: 袁建国; 张言慧; 高先岭
Original assignee: Shandong National Biotechnology Research Institute; Shandong Guoli Biological Science And Technology Co Ltd
Current assignee: Shandong National Biotechnology Research Institute; Shandong Guoli Biological Science And Technology Co Ltd
Priority date: 2019-07-02
Filing date: 2019-07-02
Publication date: 2019-09-20
Anticipated expiration: 2039-07-02
Also published as: CN110257448B

Abstract

本发明涉及一种利用菌体全细胞催化精氨酸转化为胍基丁胺的方法，属于生物工程技术领域。所述方法包括：全细胞精氨酸脱羧酶浓缩液的制备，全细胞精氨酸脱羧酶浓缩液与初始转化液混合、转化，结晶、重结晶。本发明方法通过发酵诱导过程中碳源、氮源及溶氧的控制，所得精氨酸脱羧酶基因工程菌菌体全细胞浓缩液对精氨酸催化转化效率高；且浓缩液中无副产物，便于对转化所得胍基丁胺结晶纯化。另外一方面，所述菌体全细胞浓缩液，发酵周期短，短时间内可大量获得，有利于胍基丁胺的大量制备。转化液中胍基丁胺产物浓度为200～300g/L，转化率在92％～99％，胍基丁胺产品纯度可以达到97～100％，产品收率可以达到90～100％。

Description

一种利用菌体全细胞催化精氨酸转化为胍基丁胺的方法

技术领域

本发明涉及一种利用菌体全细胞催化精氨酸转化为胍基丁胺的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

胍基丁胺作为一种重要的生物胺，具有很大的生理功能和医药价值。目前我国胍基丁胺的制备主要来自化学的方法，化学法合成胍基丁胺步骤繁琐、效率低、成本高、污染重、不符合绿色环保的要求。利用生物法合成胍基丁胺因具有反应速率快、操作简便、无污染等优点，受到了人们的关注。

胍基丁胺是由精氨酸脱羧酶催化底物精氨酸脱羧产生的(见图1)。血液中胍基丁胺的浓度为0.2～0.4ng/ml，胍基丁胺在体内几乎分布于所有的器官，在亚细胞水平上，通过免疫细胞化学的方法证实，胍基丁胺存在于胞浆中距内质网和线粒体很近的大密度核心囊泡中。迄今为止已发现胍基丁胺对中枢神经系统具有多种生物学功能：可作为一种抗抑郁的药物；能增强阿片类药物的镇痛效果；减缓耐药性的发生和改善急性吗啡停药综合征。此外，胍基丁胺还能促进记忆的巩固，抑制肝癌细胞的增殖，抑制细胞内多胺的合成，促进多胺的降解，降低细胞内多胺的水平。总之，胍基丁胺具有降血压、抗抑郁、消炎、镇痛、抑制细胞增生等多种生理功能，在食品、医药等领域应用广泛，国内外需求巨大，市场前景广阔。

中国发明专利申请(CN 105062943A)公开了一种利用高产精氨酸脱羧酶的重组菌生产胍基丁胺的方法(发明人为江南大学的刘立明等人)，将来源于大肠杆菌编码精氨酸脱羧酶的speA基因过量表达于工程菌中，获得了一株含精氨酸脱羧酶的重组菌株，该酶在大肠杆菌内诱导表达后，可以催化精氨酸转化为胍基丁胺。但是其胍基丁胺产量仅有14.3g/L，不够理想。该申请的后续申请(中国发明专利CN 105861529A)为了将产量提高，将细胞进行了破碎，但其产物浓度也仅有61～71g/L，转化率仅有68％～82％。中国发明专利申请CN104911223A公开了一种胍基丁胺硫酸盐的生物制备方法，虽然其产量可以达到200g/L，但是其将细胞进行了破碎，这无疑给后续的纯化提取增加了负担。因此，有必要提供一种产量高且便于纯化的制备胍基丁胺的方法。

发明内容

针对背景技术中所述问题，本发明主要目的是提供了一种利用菌体全细胞催化精氨酸转化为胍基丁胺的方法，该方法催化转化效率高，且步骤简单，所得胍基丁胺产品纯度高。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明第一个方面，提供一种利用菌体全细胞催化精氨酸转化为胍基丁胺的方法，所述方法包括：全细胞精氨酸脱羧酶浓缩液的制备，全细胞精氨酸脱羧酶浓缩液与精氨酸底物溶液混合、转化，结晶、重结晶；

全细胞精氨酸脱羧酶浓缩液的制备方法为：

将精氨酸脱羧酶基因工程菌种子液接种于发酵培养基中进行发酵诱导培养，待发酵至溶氧开始回升时流加甘油，在发酵2～6h开始流加氨水，控制搅拌转速为150～500rpm，通气量为1～2vvm，控制发酵液溶氧量为15％～20％，发酵液pH值控制在6.5～7.5，发酵24～30h，过40～50nm滤膜、洗涤，得浓缩液；

精氨酸底物溶液包括以下成分及其含量：精氨酸15～150g/L，磷酸吡哆醛0.05～5g/L，硫酸镁1～10g/L。

本发明将精氨酸的初始浓度控制在15～150g/L，由于反应时会产生大量的二氧化碳气泡，会使转化液随气泡从排气口溢出，所以初始精氨酸浓度不宜过高。

进一步地，精氨酸脱羧酶基因工程菌是以大肠杆菌K12为宿主，以pET28A为载体，表达adiA基因；所述adiA基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQID NO.2所示。

进一步地，将含全细胞精氨酸脱羧酶的发酵液进行浓缩与洗涤，并将洗涤过的浓缩液加入转化液中反应；

所用发酵液与转化液的体积比为0.1～1：1。

进一步地，转化液pH值为4.0～6.0，20～40℃条件下转化6～8h。

进一步地，转化过程中每隔30～60min补加精氨酸，补加精氨酸用量为15～150g/L。

进一步地，结晶方法为：将转化液经滤膜过滤后，取上清液，浓缩，降温至4～15℃，滴加乙醇；搅拌2～3h，抽滤，烘干，即得。

进一步地，乙醇滴加量为浓缩液体积的50％～60％，优选的，乙醇滴加量为浓缩体积的55％。

进一步地，重结晶方法为：将初次结晶样品室温下溶于水中，然后降温，温度降至4～15℃，滴加乙醇，搅拌，抽滤，烘干，即得。

进一步地，搅拌速度为80～120rpm。

本发明第二个方面，提供以上所述方法制备得到的胍基丁胺。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的方法从根本上解决了化学合成制备成本高、收率低、环境隐患大等问题。本发明方法通过发酵诱导过程中碳源、氮源的控制，所得精氨酸脱羧酶基因工程菌菌体全细胞浓缩液对精氨酸催化转化效率高；且转化液无副产物产生，便于对转化所得胍基丁胺结晶纯化。另外一方面，所述菌体全细胞浓缩液，发酵周期短，短时间内可大量获得，有利于胍基丁胺的大量制备。

在催化精氨酸转化胍基丁胺反应过程中，将精氨酸、磷酸吡哆醛和硫酸镁按特定比例混合，控制精氨酸的初始浓度，并随着反应的进行不断补加精氨酸，有效保证了胍基丁胺的产量和得率。转化液中胍基丁胺产物浓度可以达到200～300g/L，转化率在92％～99％。

本发明所用结晶方法可以使母液上清中的胍基丁胺浓度接近为零，即转化浓缩液中的胍基丁胺回收率接近100％。最终胍基丁胺产品纯度可以达到97％～100％，产品收率可以达到90％～100％。

本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。

附图说明

图1：精氨酸脱羧酶催化底物精氨酸脱羧基生产胍基丁胺的反应式

图2：硫酸胍基丁胺标准品液相检测图谱

图3：精氨酸标准品液相检测图谱

图4：硫酸胍基丁胺与精氨酸混合标品液相检测图谱

图5：实施例1中乙醇与转化浓缩液比例对结晶效果的影响

图6：实施例2中胍基丁胺精氨酸浓度过程变化曲线

图7：胍基丁胺生产技术路线

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。

使用高效液相色谱仪测定转化液中的胍基丁胺浓度，色谱柱为C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；检测波长为210nm；流动相为0.03mol/L的NaH₂PO₄，用磷酸调节pH至3.0；柱温为25℃；进样量为20μL；分析时间为20min。

实施例1：胍基丁胺结晶条件的优化

由于现有的科研资料还未发现胍基丁胺结晶方面的相关资料，所以本发明考察了多种有机溶剂对胍基丁胺结晶的影响，包括甲醇、乙醇等。虽然这些有机溶剂均在一定程度上有利于胍基丁胺的结晶，但是考虑到胍基丁胺在应用中安全性方面的因素，本发明重点考察了乙醇对胍基丁胺结晶的影响。因为低温有利于胍基丁胺的析出，所以实验过程中控制温度为4～15℃，转化清液中胍基丁胺的浓度为200～300g/L，并真空浓缩至原有体积的1/2。最终结果显示向浓缩液中添加55％比例的乙醇更有利于胍基丁胺的回收(见图5)，而乙醇的添加比例低于或高于55％,母液上清中均残留有大量的胍基丁胺，此部分胍基丁胺没有结晶析出。而乙醇添加比例为55％时母液上清中胍基丁胺的残留量在1g/L以下，即从这一指标考察产品回收率接近100％。

另外，考察了低速搅拌(80～120rpm)，中速搅拌(200～300rpm)及高速搅拌(500～800rpm)对晶体与晶核形成的影响，同样的实验过程中温度控制在4～15℃，转化清液中胍基丁胺浓度为200～300g/L，并真空浓缩至原有体积的1/2，乙醇添加比例为55％，经过观察，三种搅拌速度结晶实验中，低速搅拌状态下的养晶过程，浓缩液短时间内(20min)即出现明显的浑浊，即已有晶体与晶核析出。而中速与高速搅拌需要更长的时间形成晶体，甚至没有晶体与晶核生成。

实施例2：利用菌体全细胞催化精氨酸转化为胍基丁胺的方法

所述方法包括以下步骤：

(1)全细胞精氨酸脱羧酶浓缩液的制备

a.精氨酸脱羧酶基因工程菌的构建

所述基因工程菌以大肠杆菌K12为宿主，以pET28A为载体，以adiA为目的基因，所述adiA基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，采用常规分子克隆技术构建即可。

b.精氨酸脱羧酶基因工程菌中试发酵培养

s₁.取所述工程菌甘油管接种于培养皿平板上活化菌种，培养时间24h；将培养皿平板保存于4℃冰箱；用接种环在无菌条件下挖取一环平板种子接种于种子培养基中(50mL/500mL锥形瓶)。培养基组成为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，pH自然，在121℃，0.1Mpa压力下灭菌20min。然后将接种后的种子摇瓶在37℃、180rpm的恒温气浴摇床中培养16h得到一级种子培养液。将摇瓶种子液接种于20L种子罐中，发酵罐装料量10L，接种量3％。培养基组成为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 12g/L，磷酸二氢钾5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0，在121℃，0.1Mpa压力下灭菌20min。通气量为1vvm，培养约8h后，种子进入对数生长后期，得到二级种子液，可以将其接种于中试规模的发酵罐。

s_2.采用200L发酵罐进行培养，初始装液量为100L。

将步骤s₁.培养得到的二级种子液按3％的接种量接入到发酵培养基中，温度控制在37℃，搅拌转速为100～500rpm，通气量为1vvm，发酵时间5h OD₆₀₀增长至16.2时，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG，30℃下诱导培养至放罐。

发酵培养基为：蛋白胨12g/L，酵母粉5g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 15g/L，K₂HPO₄·3H₂O13g/L，磷酸二氢钾5g/L，氯化钠1g/L，硫酸镁0.5g/L，pH7.0，在121℃，0.1Mpa压力下灭菌20min。

发酵周期进行至大约4.6h时溶氧开始回升，此时开始流加浓度为50％的甘油，整个发酵过程共流加发酵液体积的26.51％，最大流加速率为23.12mL/(L·h)。从发酵周期2h开始流加浓度为28％的氨水，氨水既做氮源又用来调节pH，整个发酵过程共流加氨水3.5％。开始时加入一定量的甘油以使发酵罐初始碳源浓度为7g/L。发酵过程中pH控制在7.0。

发酵24h结束后，采用50nm陶瓷膜收集含精氨酸脱羧酶的全细胞菌体，并用去离子水洗涤三遍，即得全细胞精氨酸脱羧酶浓缩液，4℃保藏备用。

(2)催化转化

将步骤(1)所得的含有精氨酸脱羧酶的发酵液按照与转化液体积比1:1的比例进行转化实验。首先按照步骤(1)所述的方法进行浓缩洗涤，然后加入底物精氨酸、辅酶及硫酸镁，控制温度在37℃，用20％稀硫酸溶液调节pH至6.0。每隔一小时补加一次精氨酸，转化时间约8h。最后补加的精氨酸浓度约为247.89g/L，检测硫酸胍基丁胺浓度为318.97g/L，转化率为98.2％。

所述转化液中各成分的初始浓度分别为：精氨酸100g/L，磷酸吡哆醛1g/L，硫酸镁4g/L。

将转化液过50nm陶瓷膜过滤，收集上清液用于后续的浓缩结晶，分离所得全细胞酶液可以用于下次继续转化精氨酸生成胍基丁胺。

(3)结晶、重结晶

结晶：取步骤(2)收集所得上清液200mL，用旋转蒸发仪浓缩至100mL，降温至10℃。开始滴加乙醇，逐渐有晶体析出，待乙醇滴加总量为浓缩液体积的55％时停止滴加乙醇，100rpm继续搅拌3小时后进行抽滤。上清检测胍基丁胺含量为0，然后将胍基丁胺固体放于37℃真空烘干，得到固体62.2g，计算晶体收率为97.5％。

重结晶：称取初次结晶样品60.00g，加水99mL，常温溶解，此时总体积为130mL，即此时的样品浓度为461.5g/L。然后降温，当温度降至10℃时，逐滴加入乙醇71mL，100rpm搅拌170分钟后，开始抽滤以得到晶体，将晶体进行烘干，称量晶体重量为57g。重结晶收率达95％，检测晶体纯度为98.12％。

实施例3：利用菌体全细胞催化精氨酸转化为胍基丁胺的方法

所述方法包括以下步骤：

(1)全细胞精氨酸脱羧酶浓缩液的制备

a.精氨酸脱羧酶基因工程菌的构建

b.精氨酸脱羧酶基因工程菌中试发酵培养

s_2.采用200L发酵罐进行培养，初始装液量为100L。

将步骤s₁.培养得到的二级种子液按3％的接种量接入到发酵培养基中，温度控制在37℃，搅拌转速为150～400rpm，通气量为1.2vvm，发酵时间6h OD₆₀₀增长至15.6时，加入终浓度为0.3mmol/L的IPTG，30℃下诱导培养至放罐。

发酵周期进行至大约5h时溶氧开始回升，此时开始流加浓度为60％甘油，整个发酵过程共流加发酵液体积的15.2％，最大流加速率为19.6mL/(L·h)。从发酵周期2h开始流加浓度为14％的氨水，氨水既做氮源又用来调节pH，整个发酵过程共流加氨水为发酵培养基体积的5.2％。发酵过程中pH控制在6.5。甘油刚开始时加入1000mL以使发酵罐初始碳源浓度为6g/L。

发酵27h结束后，采用50nm陶瓷膜收集含精氨酸脱羧酶的全细胞菌体，并用去离子水洗涤三遍，即得全细胞精氨酸脱羧酶浓缩液，4℃保藏备用。

(2)催化转化

将步骤(1)所得的含有精氨酸脱羧酶的发酵液按照与转化液体积比0.7:1的比例进行转化实验。首先按照步骤(1)所述的方法进行浓缩洗涤，然后加入底物精氨酸、辅酶及硫酸镁，控制温度在35℃，用20％稀硫酸溶液调节pH至5.5。每隔一小时补加一次精氨酸，转化时间约7h。最后补加的精氨酸浓度约为200.12g/L，检测硫酸胍基丁胺浓度为254.36g/L，转化率为97％。

所述转化液中各成分的初始浓度为：精氨酸30g/L，磷酸吡哆醛0.05g/L，硫酸镁1g/L。

将转化液过50nm陶瓷膜过滤，收集上清液用于后续浓缩结晶，分离所得全细胞酶液可以用于下次继续转化精氨酸生成胍基丁胺。

(3)结晶、重结晶

结晶：取步骤(2)收集所得上清液1000mL，用旋转蒸发仪浓缩至500mL，降温至4℃。开始滴加乙醇，逐渐出现分层现象，待乙醇滴加总量为浓缩液体积的50％时停止滴加乙醇，80rpm继续搅拌3小时后进行抽滤，上清检测胍基丁胺含量为0.12g/L。然后将胍基丁胺固体放于37℃真空烘干，得到固体239.58g，计算晶体收率为92.76％。

重结晶：称取初次结晶样品200g，加水400mL，常温溶解，然后降温，当温度降为4℃时，逐滴加乙醇105mL，搅拌养晶后开始抽滤，将抽滤所得晶体进行真空烘干，即得成品硫酸胍基丁胺186.24g，计算晶体收率为93.12％。检测晶体纯度为98.25％。

实施例4：利用菌体全细胞催化精氨酸转化为胍基丁胺的方法

所述方法包括以下步骤：

(1)全细胞精氨酸脱羧酶浓缩液的制备

a.精氨酸脱羧酶基因工程菌的构建

b.精氨酸脱羧酶基因工程菌中试发酵培养

s_2.采用200L发酵罐进行培养，初始装液量为110L。

将步骤s₁.培养得到的二级种子液按3％的接种量接入到发酵培养基中，温度控制在37℃，搅拌转速为500rpm，通气量为1.5vvm，发酵时间为8h时OD₆₀₀增长至16.3，加入终浓度为0.6mmol/L的IPTG，30℃下诱导培养至放罐。

发酵周期进行至大约5.2h时溶氧开始回升，此时开始流加浓度为40％的甘油，整个发酵过程共流加发酵液体积的27.2％，最大流加速率为24.6mL/(L·h)。从发酵周期2h开始流加浓度为28％的氨水，氨水既做氮源又用来调节pH，整个发酵过程共流加氨水为发酵培养基体积的2.1％。发酵过程中pH控制在7.5。甘油刚开始时加入1925mL以使发酵罐初始碳源浓度为7g/L。

发酵30h结束后，采用50nm陶瓷膜收集含精氨酸脱羧酶的全细胞菌体，并用去离子水洗涤三遍，即得全细胞精氨酸脱羧酶浓缩液，4℃保藏备用。

(2)催化转化

将步骤(1)所得的含有精氨酸脱羧酶的发酵液按照与转化液体积比0.7:1的比例进行转化实验。首先按照步骤(1)所述的方法进行浓缩洗涤，然后加入底物精氨酸、辅酶及硫酸镁，控制温度在20℃，用20％稀硫酸溶液调节pH至4.5开始反应。每隔一小时补加一次精氨酸，转化时间约6h。最后补加的精氨酸浓度约为215.67g/L，检测硫酸胍基丁胺浓度为271.29g/L，转化率为96％。

所述转化液中各成分的初始浓度为：精氨酸60g/L，磷酸吡哆醛0.1g/L，硫酸镁2g/L。

将转化液过50nm陶瓷膜过滤，收集上清液用于后续结晶，分离所得全细胞酶液可以用于下次继续转化精氨酸生成胍基丁胺。

(3)结晶、重结晶

结晶：取步骤(2)收集所得上清液1000mL，用旋转蒸发仪浓缩至500mL，降温至15℃。开始滴加乙醇，逐渐出现分层现象，待乙醇滴加总量为浓缩液体积的60％时停止滴加乙醇，待晶体开始析出后于120rpm继续搅拌3小时后进行抽滤，上清检测胍基丁胺含量为1.6g/L。然后将胍基丁胺固体放于37℃真空烘干，得到固体244.16g，计算晶体收率为90％。

重结晶：称取初次结晶样品200g，加水400mL，常温溶解，然后降温，当温度降为15℃时，逐滴加乙醇95mL，养晶160min后开始抽滤，将抽滤所得晶体进行真空烘干，即得成品硫酸胍基丁胺184g，计算晶体收率为92％。检测晶体纯度为98.9％。

给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本专利公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。

序列表

<110> 山东国力生物科技有限公司山东国力生物技术研究院

<120> 一种利用菌体全细胞催化精氨酸转化为胍基丁胺的方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2268

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

atgaaagtat taattgttga aagcgagttt ctccatcaag acacctgggt cggtaacgcc 60

gttgagcgtc tggcagatgc tttaagccag caaaatgtta ccgtgattaa atccacctcc 120

tttgatgatg gttttgccat tctctcttca aacgaagcca ttgactgcct gatgttcagc 180

tatcaaatgg aacatccgga cgaacatcaa aacgtcagac aattgatcgg taagcttcat 240

gagcgccaac aaaacgtgcc ggtcttcctg ttgggcgatc gggaaaaagc cctcgccgca 300

atggatcgcg acctgctgga gcttgtcgat gaattcgcct ggattctgga agataccgcc 360

gactttatcg ccggacgcgc cgttgccgcg atgacccgct accgccagca gctgttgccg 420

ccactgttca gcgcgctgat gaaatatagt gacatccatg aatattcctg ggcagcgcca 480

ggccaccagg gcggcgttgg ttttaccaaa acacccgccg gacgtttcta ccatgactac 540

tatggtgaaa atctgttccg caccgacatg ggcatcgaac gaacttccct cggttctttg 600

cttgaccata ctggcgcatt tggcgaaagc gaaaaatatg ccgcacgcgt atttggtgcc 660

gatcgctcct ggtcggtagt cgtcggtact tccggctcta accgcaccat catgcaggct 720

tgcatgaccg ataacgatgt cgtggtcgtt gaccgtaact gccataaatc catcgaacaa 780

ggtttgatgc tgacaggcgc gaaaccggtc tatatggtgc caagccgcaa ccgctacggc 840

attatcgggc caatctatcc gcaggaaatg caacctgaaa ccttgcagaa gaaaatcagt 900

gaaagcccgc tgaccaaaga caaagccggg caaaaaccgt cttactgcgt ggtgaccaac 960

tgcacctatg acggcgtgtg ttataacgct aaagaagcgc aggatctgct ggaaaaaacc 1020

tccgatcgtc tgcactttga cgaagcctgg tacggctatg cacgtttcaa cccgatctat 1080

gccgatcact atgccatgcg cggcgaacct ggcgatcaca acggtcctac cgttttcgcc 1140

acccactcca cccacaaact gctgaatgcg ctgtcacagg cttcttatat tcatgtacgt 1200

gaaggtcgtg gggcgattaa cttctcccgc ttcaaccagg cctacatgat gcatgccacc 1260

acctccccgc tgtatgccat ctgcgcatcc aacgacgtgg cggtgtcgat gatggacggc 1320

aacagcggcc tgtcactgac acaggaagtg attgacgaag cggttgattt ccgtcaggcg 1380

atggcgcggc tatataaaga gttcaccgct gacggtagct ggttcttcaa accgtggaac 1440

aaagaagtcg tcaccgaccc acaaaccggc aaaacctatg actttgctga cgcaccaacc 1500

aaactgctga ccaccgttca ggactgctgg gtaatgcatc cgggcgaaag ctggcacggc 1560

ttcaaagata ttccggataa ctggagtatg ctcgacccga ttaaaatcag catccttgct 1620

ccgggaatgg gtgaagatgg tgaactggaa gaaaccggtg ttccggcggc gctggtcact 1680

gcctggcttg gtcgccacgg cattgtacct acccgcacca ctgacttcca aattatgttc 1740

ctgttctcta tgggcgtaac ccgtgggaaa tggggaactc tggttaacac cctttgctcc 1800

ttcaaacgcc actatgacgc caacacaccg ctggcgcagg tgatgccgga acttgttgaa 1860

caatatcctg acacttacgc gaacatgggg attcacgatc tgggtgacac catgtttgcc 1920

tggctgaaag aaaacaaccc tggcgcacgg ttgaacgaag cctattccgg cctgccggtg 1980

gcggaagtca ccccgcgtga agcgtacaac gcgattgtcg acaacaatgt cgaactggta 2040

tccattgaaa atctgccagg acgcatcgcg gcaaactcag ttatcccgta tccgccagga 2100

atcccgatgc tgctgtctgg tgaaaacttc ggcgataaaa acagtccgca agtaagttat 2160

ttacgctcgc tgcaatcctg ggaccaccat ttccctggat ttgaacacga aactgaaggg 2220

actgaaatta ttgacggtat ttaccacgtt atgtgcgtga aagcgtaa 2268

<210> 2

<211> 755

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 2

Met Lys Val Leu Ile Val Glu Ser Glu Phe Leu His Gln Asp Thr Trp

1 5 10 15

Val Gly Asn Ala Val Glu Arg Leu Ala Asp Ala Leu Ser Gln Gln Asn

20 25 30

Val Thr Val Ile Lys Ser Thr Ser Phe Asp Asp Gly Phe Ala Ile Leu

35 40 45

Ser Ser Asn Glu Ala Ile Asp Cys Leu Met Phe Ser Tyr Gln Met Glu

50 55 60

His Pro Asp Glu His Gln Asn Val Arg Gln Leu Ile Gly Lys Leu His

65 70 75 80

Glu Arg Gln Gln Asn Val Pro Val Phe Leu Leu Gly Asp Arg Glu Lys

85 90 95

Ala Leu Ala Ala Met Asp Arg Asp Leu Leu Glu Leu Val Asp Glu Phe

100 105 110

Ala Trp Ile Leu Glu Asp Thr Ala Asp Phe Ile Ala Gly Arg Ala Val

115 120 125

Ala Ala Met Thr Arg Tyr Arg Gln Gln Leu Leu Pro Pro Leu Phe Ser

130 135 140

Ala Leu Met Lys Tyr Ser Asp Ile His Glu Tyr Ser Trp Ala Ala Pro

145 150 155 160

Gly His Gln Gly Gly Val Gly Phe Thr Lys Thr Pro Ala Gly Arg Phe

165 170 175

Tyr His Asp Tyr Tyr Gly Glu Asn Leu Phe Arg Thr Asp Met Gly Ile

180 185 190

Glu Arg Thr Ser Leu Gly Ser Leu Leu Asp His Thr Gly Ala Phe Gly

195 200 205

Glu Ser Glu Lys Tyr Ala Ala Arg Val Phe Gly Ala Asp Arg Ser Trp

210 215 220

Ser Val Val Val Gly Thr Ser Gly Ser Asn Arg Thr Ile Met Gln Ala

225 230 235 240

Cys Met Thr Asp Asn Asp Val Val Val Val Asp Arg Asn Cys His Lys

245 250 255

Ser Ile Glu Gln Gly Leu Met Leu Thr Gly Ala Lys Pro Val Tyr Met

260 265 270

Val Pro Ser Arg Asn Arg Tyr Gly Ile Ile Gly Pro Ile Tyr Pro Gln

275 280 285

Glu Met Gln Pro Glu Thr Leu Gln Lys Lys Ile Ser Glu Ser Pro Leu

290 295 300

Thr Lys Asp Lys Ala Gly Gln Lys Pro Ser Tyr Cys Val Val Thr Asn

305 310 315 320

Cys Thr Tyr Asp Gly Val Cys Tyr Asn Ala Lys Glu Ala Gln Asp Leu

325 330 335

Leu Glu Lys Thr Ser Asp Arg Leu His Phe Asp Glu Ala Trp Tyr Gly

340 345 350

Tyr Ala Arg Phe Asn Pro Ile Tyr Ala Asp His Tyr Ala Met Arg Gly

355 360 365

Glu Pro Gly Asp His Asn Gly Pro Thr Val Phe Ala Thr His Ser Thr

370 375 380

His Lys Leu Leu Asn Ala Leu Ser Gln Ala Ser Tyr Ile His Val Arg

385 390 395 400

Glu Gly Arg Gly Ala Ile Asn Phe Ser Arg Phe Asn Gln Ala Tyr Met

405 410 415

Met His Ala Thr Thr Ser Pro Leu Tyr Ala Ile Cys Ala Ser Asn Asp

420 425 430

Val Ala Val Ser Met Met Asp Gly Asn Ser Gly Leu Ser Leu Thr Gln

435 440 445

Glu Val Ile Asp Glu Ala Val Asp Phe Arg Gln Ala Met Ala Arg Leu

450 455 460

Tyr Lys Glu Phe Thr Ala Asp Gly Ser Trp Phe Phe Lys Pro Trp Asn

465 470 475 480

Lys Glu Val Val Thr Asp Pro Gln Thr Gly Lys Thr Tyr Asp Phe Ala

485 490 495

Asp Ala Pro Thr Lys Leu Leu Thr Thr Val Gln Asp Cys Trp Val Met

500 505 510

His Pro Gly Glu Ser Trp His Gly Phe Lys Asp Ile Pro Asp Asn Trp

515 520 525

Ser Met Leu Asp Pro Ile Lys Ile Ser Ile Leu Ala Pro Gly Met Gly

530 535 540

Glu Asp Gly Glu Leu Glu Glu Thr Gly Val Pro Ala Ala Leu Val Thr

545 550 555 560

Ala Trp Leu Gly Arg His Gly Ile Val Pro Thr Arg Thr Thr Asp Phe

565 570 575

Gln Ile Met Phe Leu Phe Ser Met Gly Val Thr Arg Gly Lys Trp Gly

580 585 590

Thr Leu Val Asn Thr Leu Cys Ser Phe Lys Arg His Tyr Asp Ala Asn

595 600 605

Thr Pro Leu Ala Gln Val Met Pro Glu Leu Val Glu Gln Tyr Pro Asp

610 615 620

Thr Tyr Ala Asn Met Gly Ile His Asp Leu Gly Asp Thr Met Phe Ala

625 630 635 640

Trp Leu Lys Glu Asn Asn Pro Gly Ala Arg Leu Asn Glu Ala Tyr Ser

645 650 655

Gly Leu Pro Val Ala Glu Val Thr Pro Arg Glu Ala Tyr Asn Ala Ile

660 665 670

Val Asp Asn Asn Val Glu Leu Val Ser Ile Glu Asn Leu Pro Gly Arg

675 680 685

Ile Ala Ala Asn Ser Val Ile Pro Tyr Pro Pro Gly Ile Pro Met Leu

690 695 700

Leu Ser Gly Glu Asn Phe Gly Asp Lys Asn Ser Pro Gln Val Ser Tyr

705 710 715 720

Leu Arg Ser Leu Gln Ser Trp Asp His His Phe Pro Gly Phe Glu His

725 730 735

Glu Thr Glu Gly Thr Glu Ile Ile Asp Gly Ile Tyr His Val Met Cys

740 745 750

Val Lys Ala

755

Claims

1.一种利用菌体全细胞催化精氨酸转化为胍基丁胺的方法，其特征在于，所述方法包括：全细胞精氨酸脱羧酶浓缩液的制备，全细胞精氨酸脱羧酶浓缩液与初始转化液混合、转化，结晶、重结晶；

全细胞精氨酸脱羧酶浓缩液的制备方法为：

将精氨酸脱羧酶基因工程菌种子液接种于发酵培养基中进行发酵诱导培养，待发酵至溶氧开始回升时流加甘油，在发酵2～6h开始流加氨水，控制搅拌转速为100～500rpm，通气量为1～2vvm，控制发酵液溶氧为15～20％，发酵液pH值控制在6.5～7.5，发酵24～30h，过40～50nm滤膜、洗涤，得浓缩液；

转化液中各成分的初始浓度为：精氨酸15～150g/L，磷酸吡哆醛0.05～5g/L，硫酸镁1～10g/L。

2.如权利要求1所述方法，其特征在于，精氨酸脱酸酶基因工程菌是以大肠杆菌K12为宿主，以pET28A为载体，表达adiA基因；所述adiA基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.如权利要求1所述方法，其特征在于，含有精氨酸脱羧酶的发酵液按照与转化液体积比0.1～1：1的比例进行转化实验。

4.如权利要求1所述方法，其特征在于，转化溶液pH值为4.5～6.5，20～40℃条件下转化6～8h。

5.如权利要求1所述方法，其特征在于，转化过程中每隔30～60min补加精氨酸，补加精氨酸的用量为15～150g/L。

6.如权利要求1所述方法，其特征在于，结晶方法为：将转化液经滤膜过滤后，取上清液，浓缩，降温至10～15℃，滴加乙醇；搅拌2～3h，抽滤，烘干，即得。

7.如权利要求5所述方法，其特征在于，乙醇滴加量为浓缩液体积的50～60％，优选的，乙醇滴加量为浓缩体积的55％。

8.如权利要求1所述方法，其特征在于，重结晶方法为：将初次结晶样品室温下溶于水中，然后降温，温度降至10～15℃，滴加乙醇，搅拌，抽滤，即得。

9.如权利要求6或8所述方法，其特征在于，搅拌速度为80～120rpm。

10.权利要求1～9任一项所述方法制备得到的胍基丁胺。