CN105861529A - 一种精氨酸脱羧酶及其应用 - Google Patents

一种精氨酸脱羧酶及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种精氨酸脱羧酶及其应用，属于生物工程技术领域。本发明通过基因组数据库挖掘及同源序列比对等虚拟筛选手段，结合分子生物学手段从腐败希瓦氏菌中克隆获得精氨酸脱羧酶基因。采用分子生物学和过程优化等手段，提高精氨酸脱羧酶生产菌株产酶能力，通过优化催化体系，建立高效生物催化生产胍基丁胺的平台。发酵得到的粗酶液经纯化后进行转化，反应体系成分明确，有利于后续产物提取纯化。在37℃条件下，脱羧酶具有较高的活性，同时也有利于宿主细胞大肠杆菌的生长，在该温度下，反应速度得到极大的提高，转化周期需24h，胍基丁胺产量可达61‑71g/L，转化率达68‑82％。

Description

一种精氨酸脱羧酶及其应用
技术领域
本发明涉及一种精氨酸脱羧酶及其应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
胍基丁胺(Agmatine)又称为鲱精胺，分子式C5H14N4，一种内源性可乐定置换物质(clonidine displacing substance,CDS)，是咪唑啉受体的激动剂α2-肾上腺素能受体的非儿茶酚胺配体。它存在于生物体多种组织和细胞中,在生物体代谢中起到重要作用，具有多种生物学功能。在心血管系统，胍基丁胺能降低心率、平均动脉压、左室压、外周血管阻力指数等；在泌尿系统，胍基丁胺能增加肾小球过滤率和绝对近端冲吸收；在胃肠道，胍丁胺能增加胃酸和胃蛋白酶的分泌，使粘膜厚度变薄，恶化应激引起的粘膜病变等；在糖代谢条件中，胍丁胺能增加胰岛素的分泌，此外，近年的研究表明，胍基丁胺还能抑制多种细胞(包括血管平滑肌细胞、星型胶质细胞、内皮细胞、肝癌细胞和肾小管上皮细胞等)的增殖。
随着人们对胍基丁胺生理作用研究的深入，胍基丁胺显示了广阔的临床应用前景，特别是在神经系统中的应用前景尤其引入注意。此外，硫酸胍基丁胺也有多种药理学活性，是一种极具开发价值的戒毒类药物。在食品、化工、药物制备和临床等领域，国内外需求巨大，市场应用前景广阔。
胍基丁胺的生产方法主要有化学法和生物酶法。目前化学法主要用于制备硫酸胍基丁胺，以1,4-丁二胺为原料，对它进行单胺基保护，再使用1-硝基胍基-3,5-二甲基对另一个胺基进行硝胍化，后经还原、脱保护、成盐最终制得硫酸胍基丁胺。该路线步骤多、收率低、成本高、不适合大规模的工业化生产。生物酶法主要是使用精氨酸脱羧酶(Arginine decarboxylase，EC 4.1.1.19)，这是一种5'-磷酸吡哆醛(辅酶PLP)依赖型的脱羧酶。该酶可以L-精氨酸为底物，经脱羧基后生成胍基丁胺。目前精氨酸脱羧酶的来源在植物、动物和微生物体内广为分布。酶法生产胍基丁胺工艺简单，周期短，耗能低，专一性强，收率高，提取方便。
但是，在酶法生产胍基丁胺的过程中，如何获得低成本高效的酶源是关键问题。
发明内容
本发明提供了一种精氨酸脱羧酶及其应用，包括构建含有精氨酸脱羧酶的工程菌，并利用该工程菌生产精氨酸脱羧酶，所得精氨酸脱羧酶可进一步用于转化L-精氨酸生产胍基丁胺。
本发明的第一个目的是提供一种编码精氨酸脱羧酶的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的第二个目的是提供所述基因编码的精氨酸脱羧酶，所述精氨酸脱羧酶的氨基酸 序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的第三个目的是提供表达所述基因的重组菌株，其特征在于，表达核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的精氨酸脱羧酶基因；所述重组菌株是将SEQ ID NO.1所示的基因克隆到pET28a质粒上，然后将重组质粒转化到E.coliBL21(DE3)中进行表达。
本发明的第四个目的是提供一种应用所述精氨酸脱羧酶生产胍基丁胺的方法，所述方法以精氨酸脱羧酶作为催化剂转化L-精氨酸生产胍基丁胺。
在本发明的一种实施方式中，所述精氨酸脱羧酶氨基酸序列是SEQ ID NO.2所示的序列。
在本发明的一种实施方式中，所述精氨酸脱羧酶核苷酸序列是SEQ ID NO.1所示的序列。
在本发明的一种实施方式中，以精氨酸脱羧酶作为催化剂转化L-精氨酸生产胍基丁胺时，精氨酸脱羧酶的添加量为4.0-6.0×104U/L、底物精氨酸浓度为100-200g/L，转化温度为30-37℃，转化时间12-24h。
在本发明的一种实施方式中，以精氨酸脱羧酶作为催化剂转化L-精氨酸生产胍基丁胺时，还添加终浓度为20mmol/L硫酸镁和终浓度为60mmol/L 5-磷酸吡哆醛。
在本发明的一种实施方式中，以精氨酸脱羧酶作为催化剂转化L-精氨酸生产胍基丁胺时，投酶量为6.0×104U/L。
在本发明的一种实施方式中，所述转化是在摇床中进行，摇床转速为150-250rpm。
在本发明的一种实施方式中，所述精氨酸脱羧酶的制备过程包括以下步骤：(1)将编码SEQ ID NO.1序列的基因克隆到pET28a，然后将重组质粒转化到E.coliBL21(DE3)中得到基因工程菌；(2)诱导基因工程菌表达精氨酸脱羧酶，然后收集菌体；(3)将菌体洗涤后，破碎离心取上清液，经纯化后得纯酶液。
在本发明的一种实施方式中，所述诱导是将重组菌株培养至OD600为0.4-0.6，加入终浓度为0.05-0.15mmol/L的IPTG进行诱导，14-18h后收集菌体。
在本发明的一种实施方式中，所述诱导表达，是将重组菌株培养至OD600为0.6，加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG，在30℃下进行诱导，16h后收集菌体。
在本发明的一种实施方式中，所述纯化是将菌体破碎，收集上清液过膜并经过镍柱纯化，获得酶液。
本发明还要求保护所述精氨酸脱羧酶在食品、化工、化妆品，以及制备药物方面的应用。
在本发明中，1U精氨酸脱羧酶是指在最适催化条件(37℃、pH8.5)下，1min内催化1μmol精氨酸转化生成1μmol胍基丁胺所需的酶量
本发明的有益效果：
1、本发明是使用来源于腐败希瓦氏菌的精氨酸脱羧酶转化L-精氨酸生产胍基丁胺，该 酶在大肠杆菌内表达后，仍表现出很高的活力，可以满足工业化规模生产的需求。
2、添加纯酶进行转化，反应体系成分清晰，有利于后续产物提纯。在37℃，产量可达61.4g/L，整个转化过程的平均生产强度为2.6g/L/h，转化率达82.1％。
附图说明
图1是镁离子和辅酶PLP浓度对胍基丁胺产量的影响；A：辅酶PLP对胍基丁胺产量的影响；B，镁离子浓度对胍基丁胺产量的影响；
图2是投酶量对胍基丁胺产量的影响；
图3是L-精氨酸转化生产胍基丁胺的化学方程式；
图4是转化液质谱图；131.15处为胍基丁胺质谱峰；
图5是转化液高效液相色谱图。
具体实施方式
精氨酸脱羧酶酶活力的测定：
10mmol/L L-精氨酸，2.5mmol/L硫酸镁，0.6mmol/L 5-磷酸吡哆醛,0.05g/L纯酶，缓冲液50mmol/L Tris-HCl。pH 8.5，温度37℃。酶活定义：在37℃和pH 8.5的条件下，1min内降解1μmol L-精氨酸产生1μmol胍基丁胺的酶量为一个酶活力单位。
胍基丁胺产量检测：
取转化液10000rpm离心2min，收集上清液，并以硫酸胍基丁胺作为标准品，配制标准溶液。将适度稀释后的上清液和标准溶液分别与邻苯二甲醛(OPA)衍生，经0.22μm微孔滤膜过滤后，用高效液相色谱法测定胍基丁胺的含量。标准曲线在25-100mg/L之间呈现良好的线性关系，回归方程：y＝6.01×10-5x-0.02，R2＝0.9996。
高效液相色谱法测定L-瓜氨酸的含量：
色谱柱：ZORBAX SB-Aq；流动相：A：磷酸盐缓冲液(pH 5.3)，B：乙腈-甲醇-磷酸盐(体积比为5:3:1)，用0.22μm滤膜过滤，超声脱气；柱温：35℃；检测波长：激发波长330nm，发射波长465nm；进样量：12μl(样品8μl+OPA4μl)；流速:1mL/min。
实施例1：含精氨酸脱羧酶基因工程菌的构建
按以下方法构建含精氨酸脱羧酶的基因工程菌：
(1)通过分子生物学手段用序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的引物1：
5'-CGGAATTCATGAATGATTGGTCTATTGATGAT-3'和引物2:
5'-CCGCTCGAGTTAAGAAAAATCTTCTAAATAA-3'将来自于腐败希瓦氏菌的精氨酸脱羧酶基因(氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)进行PCR扩增：体系中加入rTaq酶，95℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2.0min，30个循环，最后72℃延伸10min；
(2)用限制性内切酶EcoR I和Xho I将目的基因和表达载体pET28a 37℃酶切4h；
(3)用T4连接酶分别将酶切并胶回收后的目的基因和质粒pET28a 16℃连接12h；
(4)将构建好的表达质粒导入E.coli BL21(DE3)，在含有卡纳霉素的LB平板中培养12h；
(5)将平板中长出的菌落进行PCR及酶切验证，将含有目的基因的质粒进行测序验证，选出目的基因完全正确的菌株，即为表达精氨酸脱羧酶基因工程菌。
实施例2：精氨酸脱亚胺酶的诱导表达
按以下方法诱导基因工程菌表达：
(1)将构建的基因工程菌接入LB斜面培养基培养12h；
(2)接一环斜面种子到LB培养基内，培养6h；
(3)将种子液接入LB发酵培养基内，培养至OD600为0.6，在16，25和37℃三个温度下诱导，分别加入终浓度为0.05,0.1,0.2和0.4mmol/L的IPTG，诱导4,8,10和16h后收集菌体，无菌生理盐水洗涤菌体。
实施例3：转化条件对胍基丁胺产量的影响
培养实施例1构建的基因工程菌，并诱导其表达精氨酸脱羧酶，然后收集基因工程菌菌体，并用无菌生理盐水洗涤菌体两次；
使用镍柱进行蛋白纯化，用Bradford试剂盒检测蛋白浓度；采用不同转化体系，用高效液相色谱法分别测定转化液中胍基丁胺的含量。
(1)转化体系为：纯酶5.0×104U/L、底物精氨酸浓度为140g/L，转化温度为37℃，转化时间24h；该转化条件下胍基丁胺的产量可达71.9g/L，整个转化过程的平均生产强度为3.0g/(L·h)，转化率达68.7％。
(2)转化体系为：纯酶6.0×104U/L、底物精氨酸浓度为100g/L，转化温度为37℃，转化时间24h，摇床转速200rpm；胍基丁胺的产量可达61.4g/L，整个转化过程的平均生产强度为2.6g/(L·h)，转化率达82.1％。
实施例4：镁离子浓度对胍基丁胺产量的影响
在转化温度为37℃、pH 8.5、湿菌体浓度为35g/L的条件下，转化反应1h，研究镁离子浓度(1-6mmol/L)对胍基丁胺产量的影响。结果如图1A所示，当镁离子浓度低于4mmol/L时，胍基丁胺的产量随着底物浓度的增加而增加；当底物浓度为4mmol/L时，胍基丁胺的产量达到最高，为3.3g/L，此时转化率为22.1％，生产强度为3.3g/(L·h)；当镁离子浓度超过4mmol/L时，胍基丁胺的产量反而降低。可能是因为：金属离子浓度过高，反应体系离子强度增大，改变了精氨酸脱羧酶的构象，对转化反应产生了不利影响。
实施例5：辅酶PLP与底物的比例对胍基丁胺产量的影响
在转化温度为37℃、pH8.5、底物浓度为20g/L的条件下，转化反应2h，研究辅酶PLP与底物比例对胍基丁胺产量的影响，结果如图1B所示。结果显示：当辅酶PLP与底物的摩尔比小于0.06时，胍基丁胺的产量随着二者摩尔比增加而增加；当辅酶PLP与底物的摩尔比为0.06时，胍基丁胺的产量达到最高，为6.7g/L，此时转化率为44.8％，生产强度为3.4g/(L·h)；当辅酶PLP与底物的摩尔比超过0.06时，胍基丁胺的产量反而降低。
实施例6：纯酶液添加量对胍基丁胺产量的影响
为验证纯酶液添加量对酶促脱羧生产胍基丁胺的影响，在底物浓度为100g/L，硫酸镁添加量20mmol/L,辅酶PLP添加量60mmol/L，转化温度为37℃，pH 8.5的条件下转化12h，以1.0-6.0×104U/L不同纯酶添加量参与反应，考察其对胍基丁胺产量的影响。结果如图2所示，在5.0×104U/L酶浓度以下，胍基丁胺的产量随酶浓度的增加而显著增加；当酶浓度达到5.0-6.0×104U/L之后，酶浓度增加对胍基丁胺产量增加的效果并不显著。说明在此时对酶而已，底物浓度已达到饱和，酶所有活性位点均被底物占据。当酶浓度为1.0×104U/L时，胍基丁胺的产量为39.1g/L，生产强度为1.6g/(L·h)，转化率52.1％；当酶浓度为6.0×104U/L时，胍基丁胺的产量为61.4g/L，生产强度为2.6g/(L·h)，转化率82.1％。另外，该过程中酶浓度提高6倍，胍基丁胺产量提高了1.6倍。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种编码精氨酸脱羧酶的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.表达权利要求1所述基因的重组菌株。
3.权利要求1所述基因编码的精氨酸脱羧酶，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.一种应用权利要求3所述精氨酸脱羧酶生产胍基丁胺的方法，其特征在于，作为催化剂转化L-精氨酸生产胍基丁胺。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述精氨酸脱羧酶的获得是将重组表达所述精氨酸脱羧酶的菌体破碎，收集上清液过膜并经过镍柱纯化，获得纯化后的酶液。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述精氨酸脱羧酶添加量4.0-6.0×104U/L，所述L-精氨酸浓度100-200g/L；在30-37℃、pH 8.0-9.0条件下，转化时间为12-24h。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，还添加终浓度为20mmol/L硫酸镁和终浓度为50-70mmol/L 5-磷酸吡哆醛。
8.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述精氨酸脱羧酶是诱导重组菌株表达获得的；所述重组菌株是将SEQ ID NO.1所示的基因克隆到pET28a质粒上，然后将重组质粒转化到E.coli BL21(DE3)得到的。
9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述诱导是将重组菌株培养至OD600为0.4-0.6，加入终浓度为0.05-0.15mmol/L的IPTG进行诱导，14-18h后收集菌体。
10.权利要求3所述精氨酸脱羧酶在食品、化工、药物制备等方面的应用。
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