CN103421734B

CN103421734B - 一种重组酪氨酸脱羧酶的可溶性高表达的方法及该酶的应用

Info

Publication number: CN103421734B
Application number: CN201310367673.6A
Authority: CN
Inventors: 倪晔; 章凯
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2013-08-22
Filing date: 2013-08-22
Publication date: 2016-12-28
Anticipated expiration: 2033-08-22
Also published as: CN103421734A

Abstract

一种重组酪氨酸脱羧酶的可溶性高表达的方法及该酶的应用，属于酶工程技术领域。本发明公开了一株重组表达短乳杆菌酪氨酸脱羧酶TDC的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET24‑TDC，该基因工程菌的构建方法，高表达可溶性TDC的方法，及该酶的应用。将TDC编码基因连接表达载体并转入大肠杆菌表达宿主，通过在发酵培养基中添加葡萄糖显著提高了重组TDC（rTDC）的可溶性表达，蛋白产量达到224 mg/L发酵液。采用Ni柱纯化C端带有His‑Tag的rTDC，回收率90%。rTDC对于底物L‑酪氨酸的比酶活为133.5 U/mg。本发明的重组表达可溶性rTDC的方法具有表达水平高、纯化简单、回收率高、成本低等优点，可用于制备酪胺、多巴胺以及帕金森病的治疗研究。

Description

一种重组酪氨酸脱羧酶的可溶性高表达的方法及该酶的应用

技术领域

一种重组酪氨酸脱羧酶的可溶性高表达的方法及该酶的应用，属于酶工程技术领域。本发明具体涉及短乳杆菌酪氨酸脱羧酶（TDC）基因的克隆、其基因工程菌的构建、重组TDC的高水平可溶性表达方法及该酶的应用。

背景技术

酪氨酸脱羧酶（TDC）是一种磷酸吡哆醛（PLP）依赖型的脱羧酶，可催化酪氨酸脱羧生成酪胺。TDC普遍存在于微生物及植物体内，根据目前的研究，微生物来源TDC的比酶活比植物来源的TDC高几个数量级。同时，一些TDC具有多巴脱羧酶（DDC）活性，可将多巴脱羧生成多巴胺，因此TDC的研究对帕金森病的治疗具有参考价值。

酪胺是许多神经激素的医药前体，如章鱼胺、大麦芽碱、辛弗林、肾上腺素、红景天苷等。目前酪胺的制备以化学合成法为主，但是存在能耗高、污染大、转化率低、回收率困难等问题。而生物法制备酪胺则由于TDC的来源有限而受到限制。

多巴胺对帕金森病有显著的治疗效果。刘军等通过对帕金森病模型大鼠的研究发现，通过补充外源性的DDC保持脱羧酶活性，将内源性和外源性的L-多巴转化为多巴胺，对于改善帕金森病患者的症状、延缓和减低患者的症状波动具有积极的意义。目前的报道显示，短乳杆菌来源的TDC的DDC活性要比昆虫、动物的DDC高出1个数量级或以上。

目前国内外对于TDC的研究发现，野生菌的产酶能力低下，且纯化步骤比较复杂，回收率普遍较低。Borresen等报道的粪链球菌来源的TDC纯化后比活力115 U/mg，回收率3.4%；Moreno-Arribas等报道的短乳杆菌来源的TDC纯化后比活力1058 U/mg，是目前酶活力最高的TDC，但回收率也只有24%。有关TDC重组表达的文献十分有限，几乎都没有提到重组表达后的表达量问题。从彭静叶对大红景天TDC的研究来看，重组表达后绝大多数都以包涵体的形式存在，通过包涵体复性实验，虽然恢复了部分活性，但步骤复杂，酶活回收率极低。范恩宇对谷氨酸脱羧酶（GAD）进行研究时发现：一段1881 bp的GAD基因在异源表达时全部以包涵体的形式存在，对其进行发酵条件优化也未得到任何结果；该GAD基因与短乳杆菌的TDC基因的氨基酸序列同源性在99%以上。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组酪氨酸脱羧酶的可溶性高表达的方法及该酶的应用，解决如下技术问题：

1、大肠杆菌重组表达短乳杆菌来源的TDC编码基因。

2、解决rTDC在大肠杆菌中异源重组表达时大量包涵体的问题，实现其高水平可溶性表达。

3、建立rTDC的纯化方法并提高其回收率。

4、rTDC用于制备酪胺和多巴胺。

5、rTDC作为外源性添加研究其对帕金森病的治疗效果。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

1．本发明的技术方案之一是：提供一株重组表达短乳杆菌酪氨酸脱羧酶TDC的基因工程菌E. coli BL21 (DE3)/pET24-TDC，该基因工程菌携带TDC基因的重组表达载体pET24-TDC，所述的TDC基因核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。

2、本发明的技术方案之二是：所述的重组表达短乳杆菌TDC的基因工程菌E. coliBL21 (DE3)/pET24-TDC的构建方法，包括如下步骤：

（1）提取短乳杆菌（Lactobacillus brevis）CGMCC 1.2028（见WORD附件CGMCC网页保藏说明）全基因组；

（2）引物设计：PCR扩增的引物设计参照GenBank中编码TDC的基因序列（EU195891.1），

上游引物：5’-ctagctagca tggaaaaaag taatcgctca c-3’，如SEQ ID No. 2所示，在5’端加上Nhe I酶切位点；

下游引物：5’-ccgctcgaga acattttcct tttgattaac-3’，如SEQ ID No. 3所示，在5’端加上Xho I酶切位点；

引物中未设计TDC基因末端的终止密码子，以便在重组TDC的C端融合6*His-Tag；

（3）使用步骤（2）的引物，通过PCR扩增步骤（1）中短乳杆菌全基因组的TDC基因，连接pMD18-T克隆载体，重组质粒为pMD18-TDC，克隆宿主为大肠杆菌JM109；

（4）将步骤（3）的TDC重组质粒进行双酶切，获得的TDC片段插入到pET-24a质粒中，得到重组质粒pET24-TDC，其克隆宿主为大肠杆菌JM109；

（5）将步骤（4）得到的重组质粒pET24-TDC转入大肠杆菌BL21 (DE3)，筛选阳性重组子，获得重组表达TDC的基因工程菌E. coli BL21 (DE3)/pET24-TDC。

3、本发明的技术方案之三是：重组表达短乳杆菌TDC的基因工程菌E. coli BL21(DE3)/pET24-TDC的培养和诱导方法，将该基因工程菌按体积比1%～10%接种LBG或TBG培养基中，当OD达到0.5时加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），在15 ~ 37℃条件下诱导2 ~10 h，得发酵液备用；

LBG培养基为含0.2%～2%葡萄糖的LB培养基；

TBG培养基为含0.2%～2%葡萄糖的TB培养基。

4、本发明的技术方案之四是：优化发酵培养基组成，提高rTDC的可溶性表达，并优化rTDC的诱导条件。

（1）基因工程菌的摇瓶实验发酵培养基为LBG/Kan（含0.2%－2%葡萄糖的LB培养基，卡那霉素Kan浓度为50 mg/L）培养基，在OD达到0.5左右时加入IPTG，在15 ~ 37℃条件下诱导，得发酵液备用。

（2）基因工程菌的3L发酵罐实验，发酵培养基为TBG/Kan（含1%葡萄糖的TB培养基，Kan浓度为50 mg/L）培养基，OD达到1.0 ~ 4.0时加入IPTG，在15~ 37℃条件下诱导，得发酵液备用。

5、本发明的技术方案之五是：重组表达短乳杆菌TDC的基因工程菌E. coli BL21(DE3)/pET24-TDC的重组TDC蛋白纯化方法，将技术方案之三或四所得的发酵液离心，用缓冲液A将沉淀重悬，超声或高压匀浆破碎全细胞，离心获得的上清液为TDC粗酶液，用Ni柱进行亲和层析，获得TDC纯酶，并用凝胶柱层析去除咪唑；步骤为：

（1）将诱导后的基因工程菌发酵液离心，获取全细胞并用缓冲液A（Tris-HCl 25mM，pH 7.4，咪唑20 mM，氯化钠300 mM）重悬，用超声破碎仪或高压匀浆机破碎，再次离心并保留上清液。

（2）用缓冲液A（Tris-HCl 25 mM，pH 7.4，咪唑20 mM，氯化钠300 mM）平衡Ni柱，然后将重组菌破碎后的上清液上样，上样后用缓冲液B（Tris-HCl 25 mM，pH 7.4，咪唑280mM，氯化钠300 mM）进行洗脱，获取rTDC酶液。

（3）用缓冲液C（Tris-HCl 25 mM，pH 7.4，氯化钠150 mM）平衡凝胶柱，将Ni柱纯化得到的rTDC酶液上样，上样后继续用缓冲液C洗脱，获取rTDC纯酶液。

6、本发明的技术方案之六是：用技术方案五所得的诱导后的基因工程菌全细胞或TDC酶液进行酪胺、多巴胺的制备；或用技术方案五所得的TDC纯酶进行治疗帕金森病的应用研究。

测定rTDC的酶学性质及对L-酪氨酸的动力学参数，测定rTDC对L-多巴及其他芳香族氨基酸的脱羧活性，用于rTDC催化制备酪胺、多巴胺等。以下均使用凝胶柱纯化后的TDC纯酶液。

（1）底物的消耗量及产物的生成量用高效液相色谱（HPLC）法检测，用于计算rTDC的酶活力。蛋白质浓度用Bradford法测定。

（2）pH 3.5 ~ 9.0的缓冲液，L-酪氨酸5.5 mM，磷酸吡哆醛0.2 mM，反应温度40℃，反应10 min，考察不同pH对rTDC活性的影响。

（3）将rTDC在pH 2 ~ 10条件下4℃放置7 d，分别在经过1、2、4、7 d后，用最适反应条件测定残余酶活力。

（4）在0.2 M醋酸钠缓冲液中，pH 5.0，磷酸吡哆醛0.2 mM，L-酪氨酸5.5 mM，4 ~60℃下反应10 min，考察在不同温度下rTDC的催化活性。

将rTDC在4 ~ 60℃下放置3 h，分别在经过1、2、3 h后，用最适的反应条件测定残余酶活力。

（5）醋酸钠缓冲液0.2 M，pH 5.0，L-酪氨酸5.5 mM，不同磷酸吡哆醛浓度，40℃下反应10 min，测定rTDC的活性。

（6）在醋酸钠0.2 M、pH 5.0、磷酸吡哆醛0.2 mM的缓冲液中，分别加入不同浓度的L-酪氨酸，40℃下反应10 min，测定酶活力，按Lineweaver-Burk双倒数法作图，算出K _m和V _max。

（7）在醋酸钠0.2 M、pH 5.0、磷酸吡哆醛0.2 mM的缓冲液中，分别添加5.5 mM的L-多巴、L-色氨酸、L-苯丙氨酸，40℃条件下反应10 min，测定rTDC的脱羧活性。

7、本发明的技术方案之七是：用TDC纯酶作为外源性的补充，研究其对帕金森病的治疗效果。

制备帕金森病模型大鼠，进行rTDC注射，对比实验组与对照组用阿扑吗啡诱发的旋转实验结果。

（1）大鼠用水合氯醛腹腔内麻醉后，进行单侧纹状体定点注射（6-羟基多巴胺3 μL）。1周后进行阿扑吗啡行为学检测，计算大鼠平均每分钟身体旋转360度的次数，达到6rpm或以上者为合格的帕金森病模型。每周测1次，连续4周，获取稳定的大鼠模型。

（2）取合格的帕金森病模型大鼠，用水合氯醛腹腔内麻醉后，进行肌肉注射。实验组注射含有rTDC的缓冲液C 50 μL，对照组注射缓冲液C 50 μL。每天注射1次，1周后进行阿扑吗啡诱发的旋转实验。

本发明的有益效果：本发明的重组表达可溶性rTDC的方法具有表达水平高、纯化简单、回收率高、成本低等优点，可用于制备酪胺、多巴胺以及帕金森病的治疗研究。

附图说明

以下结合附图说明本发明的特征和有益效果。应理解，下列附图仅用于说明本发明的具体实施方案而不用于限定本发明的范围。

图1 PCR扩增的TDC基因的琼脂糖凝胶电泳图。M：DNA Marker；1：PCR扩增的TDC基因。

图2 表达质粒pET24-TDC的构建示意图。

图3重组表达rTDC的SDS-PAGE电泳图。M：蛋白Marker；1：IPTG诱导后破碎液上清；2：未诱导（对照组）；3：IPTG诱导后破碎液沉淀。

图4 发酵培养基优化后rTDC的表达情况。M：蛋白 Marker；1~6：分别代表诱导1~6小时后的可溶性蛋白部分。

图5 rTDC的Ni柱纯化层析图谱。

图6 rTDC的Ni柱纯化结果。M：蛋白Marker；1：纯化前的粗酶液；2：纯化后的酶液。

具体实施方式

下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

1．实验菌株与载体：

（1）短乳杆菌（Lactobacillus brevis）CGMCC 1.2028，见中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)保藏网页：

http://www.cgmcc.net/index.php/Contents/show/id/9613

（2）大肠杆菌JM109

（3）大肠杆菌BL21 (DE3)

（4）pMD18-T载体

（5）pET-24a载体

2、主要培养基及溶液：

（1）LB培养基：胰蛋白胨1%，酵母膏0.5%，氯化钠1%，121℃灭菌20 min，（固体培养基中加2%的琼脂条）。

（2）LBG培养基：胰蛋白胨1%，酵母膏0.5%，氯化钠1%，葡萄糖1%，115℃灭菌20 min，（固体培养基中加2%的琼脂条）。

（3）SOC培养基：胰蛋白胨2%，酵母膏0.5%，氯化钾2.5 mM，氯化钠10 mM，115℃灭菌20 min，使用时添加氯化镁10 mM、葡萄糖20 mM。

（4）TBG培养基：胰蛋白胨12 g，酵母膏24 g，甘油5 g，配成800 mL溶液，115℃灭菌20 min；磷酸二氢钾2.31 g，磷酸氢二钾12.54 g，配成100 mL溶液，115℃灭菌20 min；葡萄糖10 g，配成100 mL溶液，115℃灭菌20 min；使用时将3种溶液混合成1 L。

（5）酶活力测定反应液：醋酸钠0.2 M，pH 5.0，L-酪氨酸5.5 mM，磷酸吡哆醛0.2mM。

（6）缓冲液A（细胞破碎缓冲液及Ni柱平衡液）：Tris-HCl 25 mM，pH 7.4，氯化钠300 mM，咪唑20 mM，膜滤（0.22 µm）并超声脱气。

（7）缓冲液B（Ni柱洗脱液）：Tris-HCl 25 mM，pH 7.4，氯化钠300 mM，咪唑280 mM，膜滤（0.22 µm）并超声脱气。

（8）缓冲液C（凝胶柱平衡液及洗脱液）：Tris-HCl 25 mM，pH 7.4，氯化钠150 mM，膜滤（0.22 µm）并超声脱气。

（9）液相色谱流动相：甲醇-水-乙酸（体积比10︰90︰0.01），膜滤（0.22 µm）并超声脱气。

（10）抗生素母液：氨苄青霉素 (Amp) 100 mg/mL；卡那霉素 (Kan) 50 mg/mL[YN1]

2、酶活力定义及测定方法：

（1）TDC的酶活力定义为：40℃条件下，1 min转化1 µmol酪氨酸的酶量为1U。

（2）酶活力测定：将10 μL酶液加到990 μL酶活力测定反应液中反应10 min，然后在100℃金属浴中放置10 min终止反应。反应液冷却后，先12000 rpm离心5 min并膜滤（0.22 μm），再用高效液相色谱（HPLC）进行检测。液相色谱仪为Shimadzu 20A，色谱柱为DIKMA的Diamonsil C18柱。进样前样品可以做适当稀释，进样体积为10 μL，流动相流速1mL/min，紫外检测波长220 nm，柱箱温度30℃。制作底物浓度标准曲线时，配制0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/L的底物标准溶液，用HPLC检测并计算各浓度对应的底物峰面积，绘制底物浓度标曲。

3、蛋白质浓度测定方法：

用Bradford法蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，其中包括5 mg/mL的牛血清白蛋白（BSA）、Bradford试剂和1 × PBS。

实施例1：短乳杆菌酪氨酸脱羧酶TDC基因克隆及初步表达

本发明使用的TDC基因来源于短乳杆菌Lactobacillus brevis CGMCC 1.2028，引物设计参照GenBank中编码TDC的基因序列（EU195891.1），基因长度为1881 bp，编码626个氨基酸。上游引物如SEQ ID No. 2所示，在5’端加上Nhe I酶切位点；下游引物如SEQ IDNo. 3所示，在5’端加上Xho I酶切位点。通过PCR扩增获取TDC基因片段，反应体系如下：

PCR反应程序：先94℃变性10 min，然后94℃变性1 min，57℃退火45 s，72℃延伸2min，反应30个循环后，再72℃延伸10 min，最后冷却至4℃。PCR后，用5 µL 产物进行琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖浓度为1%（每100 mL琼脂糖凝胶中添加7 µL 的GoodView核酸染料），电压90 V，时间30 min。结果如图1所示，获得的目的片段长度约为1800 bp，与预期的结果相近。

得到的PCR产物用PCR产物纯化试剂盒（上海生工生物工程技术服务有限公司）进行回收，并与pMD18-T载体进行连接。TDC与pMD18-T载体连接的反应体系如下：

以上反应液在16℃下反应8 h后用热转化法转入大肠杆菌JM109感受态细胞中。

所有感受态的制备都使用CaCl₂法。热转化时，先将感受态细胞冰浴，用预冷的枪头加入连接液并混匀，于冰浴中静置30 min后，42℃金属浴中热激90 s，冰浴2 min，最后加入890 µL SOC培养基，37℃、150 rpm培养1.5 h，吸取100 µL培养液涂布 LB/Amp平板，37℃过夜培养。次日挑取部分单菌落进行菌落PCR验证，反应体系如下：

PCR反应程序：先94℃变性10 min，然后94℃变性1 min，57℃退火45 s，72℃延伸2min，反应30个循环后，再72℃延伸10 min，最后冷却至4℃。

将验证成功的重组菌接种到LB/Amp液体培养基中，37℃、180 rpm培养12 h后，用质粒DNA小量抽提试剂盒（上海生工生物工程技术服务有限公司）提取重组质粒，重组质粒命名为pMD18-TDC，送出测序。测序结果显示，PCR获得的短乳杆菌TDC基因与引物设计的原始序列长度一致，编码626个氨基酸，序列同源性为99%。

构建TDC的表达质粒时，先要培养pMD18-TDC、pET-24a的宿主菌至可以提取质粒的阶段，然后分别提取质粒。将克隆载体pMD18-TDC用Nhe I和Xho I进行双酶切，割胶回收TDC基因片段，再与同样用Nhe I和Xho I双酶切并割胶回收的pET-24a进行连接；另外，双酶切的优点是不用考虑质粒自环现象的发生和连接时的方向性错误，目的基因和载体只会以一个方向进行连接。将双酶切后的TDC与pET-24a进行连接，连接液转化大肠杆菌JM109感受态细胞，涂布LB/Kan平板，37℃培养至菌落长出，挑取单菌落进行重组子的PCR鉴定。

重组载体pMD18-TDC的双酶切反应体系如下：

表达载体pET-24a的双酶切反应体系如下：

将上述两种反应液于37℃反应6 h，割胶回收目的片段并连接，连接反应体系如下：

TDC基因与表达载体的连接在16℃下进行，12h后转化大肠杆菌JM109感受态细胞，菌落PCR鉴定阳性的重组子并保存菌株。PCR验证的反应体系如下：

PCR反应程序：先94℃变性10 min，然后94℃变性1 min，52℃退火45 s，72℃延伸2min，反应30个循环后，再72℃延伸10 min，最后冷却至4℃。

阳性的大肠杆菌JM109重组菌株经37℃，180 rpm摇瓶培养12 h后，提取质粒，重组质粒命名为pET24-TDC，进行双酶切验证及目的基因的测序。双酶切验证的反应体系如下：

经PCR验证、双酶切验证和测序后，将阳性的重组子转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞并验证，获得阳性重组菌E. coli BL21 (DE3)/pET24-TDC，可以用来进行rTDC的诱导表达。

整个TDC表达质粒的构建过程如图2所示。

将验证后的重组菌转接到LB/Kan液体培养基中，12 h后，以2%的接种量接种新鲜的LB/Kan培养基。对其产酶条件进行优化，包括IPTG浓度、诱导温度和诱导时间。优化后确定的最适条件为：OD₆₀₀达到0.5时进行诱导，IPTG浓度0.2 mM，30℃诱导4 h。测得酶活力为2.6 U/mL发酵液，rTDC产量20 mg/L。rTDC的表达情况如图3所示，多数rTDC都以包涵体的形式存在，rTDC的分子量约为70 kDa，与预测的分子量70.5 kDa大小相近。

实施例2：TDC重组菌的发酵培养基及发酵产酶条件的优化

将该TDC重组菌在装有30 mL LB/Kan培养基的250 mL摇瓶培养12 h，以2%的接种量接种到LBG/Kan培养基中进行rTDC的诱导表达。图4为该重组菌诱导6 h内的rTDC表达情况。可见，随着诱导时间的延长，生物量和rTDC的产量都呈现增长趋势，且蛋白的表达量与优化前相比有大量增加。图4的发酵条件为：转接后OD₆₀₀达到0.5时开始诱导，IPTG浓度0.4mM，诱导温度25℃，180 rpm。

经发酵培养基优化后，rTDC诱导表达的前6h内，几乎没有包涵体形成。而6h后，菌体开始自溶，并带有包涵体产生。

优化IPTG浓度：转接后的重组菌在37℃下培养，当OD₆₀₀达到0.5时添加不同浓度的IPTG进行诱导，诱导温度30℃，诱导时间4 h，结果如下表所示。

结果显示，当IPTG浓度为0.2 mM时，发酵液的酶活力最高。

优化诱导温度及时间：转接后的重组菌在37℃下培养，当OD₆₀₀达到0.5时，加入IPTG 0.2 mM，分别在20、25、30℃下诱导，考察8 h内的产酶情况，结果如下表所示。

结果显示，rTDC的最佳诱导温度为25℃，诱导时间6 h，发酵液的酶活力达到26 U/mL，rTDC产量为194 mg/L发酵液。

TDC重组菌的放大实验在3L搅拌式发酵罐中进行，发酵条件参考摇瓶优化的结果并在此基础上优化IPTG诱导时的菌浓。发酵条件为：TBG/Kan培养基，装液量1 L，初始温度37℃，接种量2%。当OD₆₀₀接近0.6时开始降温至25℃，OD600达到0.6左右时加入终浓度为0.2mM的IPTG进行诱导，6 h后发酵液的酶活力达到30 U/mL，rTDC产量为224 mg/L发酵液。

实施例3：重组酪氨酸脱羧酶的纯化及酶学性质测定

所有纯化操作都在4℃或接近4℃的低温条件下进行。

将诱导后的重组菌发酵液8000 rpm离心10 min收集菌体。用缓冲液A将沉淀洗涤2次后重悬，超声或高压匀浆破碎菌体，再次离心，得到的上清液为rTDC粗酶液。

先用缓冲液A平衡Ni柱，流速2 mL/min，时间10 min，然后以2 mL/min的流速上样，上样完毕后用缓冲液A继续冲洗至基线后更换缓冲液B洗脱rTDC，洗脱液流速为2 mL/min，洗脱过程如图5所示。经Ni柱纯化后rTDC的纯度及rTDC单亚基的大小如图6所示。

凝胶柱层析的主要作用是测定天然状态下的蛋白质分子量、除盐及进一步提高rTDC酶液的纯度，有利于减小酶学性质测定时的误差。先将Ni柱纯化得到的蛋白在4℃下进行超滤浓缩，至蛋白浓度为10 mg/mL左右。凝胶柱层析采用GE公司的Superdex 200预装柱（10 × 300 mm，24 mL）。先用缓冲液C平衡凝胶柱，流速0.5 mL/min，经过1.5个柱体积后上样，上样量0.5 mL，上样后用缓冲液C以同样的流速进行洗脱，收集目的峰并记录洗脱体积。rTDC的分子量及亚单位由凝胶层析时记录的洗脱体积和SDS-PAGE显示的单亚基大小确定。本发明确定了短乳杆菌来源的rTDC是同源二聚体，天然状态下的分子量为140 kDa。

rTDC的纯化结果如下表所示。

rTDC的最适反应pH：pH 3.5 ~ 9.0（pH 3.5 ~ 6.0，0.2 M醋酸钠缓冲液；pH 6.0 ~8.0，0.2 M磷酸钠缓冲液；pH 8.0 ~ 9.0，0.2 M Tris-HCl缓冲液）的缓冲液， L-酪氨酸5.5mM，磷酸吡哆醛0.2 mM，反应温度40℃，反应10 min，考察不同pH对rTDC活性的影响。测得rTDC的最适反应pH为5.0。

rTDC的pH稳定性：将rTDC在pH 2 ~ 10条件下4℃放置7 d，分别在经过1、2、4、7 d后，用最适的反应条件测定残余酶活力。结果显示rTDC在pH 7.4条件下最为稳定，可以在存放1周后保留90%以上的活性。在pH 5.0的条件下也相对稳定，1 d后活性保留90%以上。

rTDC的最适反应温度：在0.2 M醋酸钠缓冲液中，pH 5.0，磷酸吡哆醛0.2 mM，L-酪氨酸5.5 mM，4 ~ 80℃下反应10 min，考察在不同温度下rTDC的催化活性。测得rTDC的最适反应温度为50℃，40℃下活性为50℃的80%左右。

rTDC的热稳定性：将rTDC在4 ~ 60℃下放置3 h，分别在经过1、2、3 h后，用最适的反应条件测定残余酶活力。结果显示rTDC在50℃下并不稳定，1 h后残余活性在20%以下，相对的，40℃保温1 h后rTDC的残余活性在90%左右。

辅酶PLP对rTDC酶活力的影响：醋酸钠缓冲液0.2 M，pH 5.0，L-酪氨酸5.5 mM，反应温度40℃，PLP浓度分别为0、0.0005、0.001、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.3的条件下，反应10 min，测定rTDC的活性。测得反应中最适的PLP浓度为0.2 mM。

综上，rTDC在高温下表现出较高的活性及较差的稳定性，应该是由于高温下分子运动比较剧烈所造成的。确定rTDC的测活条件为：醋酸钠0.2 M，pH 5.0，L-酪氨酸5.5 mM，磷酸吡哆醛0.2 mM，反应温度40℃，时间10 min，100℃金属浴灭活，灭活时间10 min。确定rTDC的保存条件为：缓冲液C，4℃。

rTDC对L-酪氨酸的动力学：在醋酸钠0.2 M、pH 5.0、磷酸吡哆醛0.2 mM的缓冲液中，分别加入终浓度为0.28、0.55、1.1、2.2、3.3、4.4、5.5、8.3 mM的L-酪氨酸（浓度高时需加热溶解，溶解后降温至反应温度，确定其不会析出），40℃条件下反应10 min，测定酶活力，按Lineweaver-Burk双倒数法作图，算出K _m和V _max。测得rTDC对于L-酪氨酸的动力学参数为：K _m = 0.59 mM，V _max = 147.1 µM min^-1 mg^-1，k _cat = 343.1 s^-1，k _cat/K _m = 583.3mM^-1 s^-1。

rTDC的底物特异性：在醋酸钠0.2 M、pH 5.0、磷酸吡哆醛0.2 mM的缓冲液中，分别添加5.5 mM的L-多巴、L-色氨酸、L-苯丙氨酸，40℃条件下反应10 min，测定rTDC的脱羧活性。结果显示，相对L-酪氨酸（133.5 U/mg），rTDC对于L-多巴的活性为43.9%（58.6 U/mg）。

实施例4：重组酪氨酸脱羧酶的应用

通过实施例3的结果证实，rTDC具有L-酪氨酸、L-多巴脱羧活性，可以用于生物催化法制备酪胺、多巴胺；同时也可以作为外源性的添加，进行帕金森病治疗的研究。

酪胺的制备实验：在装有2 L醋酸钠缓冲液（醋酸钠0.2 M，pH 5.0，磷酸吡哆醛0.2mM）的3 L搅拌式反应器中，先加入L-酪氨酸2 g，添加rTDC酶液1 mL（2.5 mg/mL；rTDC比活力133.5 U/mg）。反应开始后每5 min添加L-酪氨酸2 g、rTDC酶液1 mL。1 h后取反应液1mL，100℃金属浴加热10 min灭活，12000 rpm离心5 min并膜滤（0.22 μm），用高效液相色谱法进行检测。结果显示底物可以达到完全转化，产物酪胺的纯度在98%以上。

多巴胺的制备实验：在装有2L醋酸钠缓冲液（醋酸钠0.2 M，pH 5.0，磷酸吡哆醛0.2 mM）的3 L搅拌式反应器中，先加入L-多巴2 g，添加rTDC酶液2 mL（2.5 mg/mL；rTDC比活力133.5 U/mg）。反应开始后每5 min添加L-多巴2 g、rTDC酶液2 mL。1 h后取反应液1mL，100℃金属浴加热10 min灭活，12000 rpm离心5 min并膜滤（0.22 μm），用高效液相色谱法进行检测。结果显示底物可以达到完全转化，产物多巴胺的纯度在98%以上。

帕金森病的治疗实验：大鼠用10%水合氯醛腹腔内麻醉后，进行单侧纹状体定点注射（坐标：[YN4] 嘴侧1.6 mm、正中线左侧2.5 mm、大脑表面复侧4.5 mm），注射6-羟基多巴胺3 μL（6-羟基多巴胺溶液浓度为5 mg/mL，用双蒸去离子水配制，水中含0.02%抗坏血酸）。1周后进行阿扑吗啡行为学检测，计算大鼠平均每分钟身体旋转360度的次数，达到6 rpm或以上者为合格的帕金森病模型。每周测1次，连续4周，获取稳定的大鼠模型。取合格的帕金森病模型大鼠共20只，随机分为实验组（10只）和对照组（10只）。采用10%水合氯醛腹腔内麻醉，进行左后腿肌肉注射。实验组注射含有rTDC的缓冲液C 50 μL（rTDC浓度2 mg/mL），对照组注射缓冲液C 50 μL。每天注射1次，1周后进行阿扑吗啡诱发的旋转实验。实验结果表明，注射rTDC后，模型大鼠的旋转行为较治疗前有明显改善，由平均9.2 rpm减少至2.6 rpm，表明了外源性的rTDC可以起到治疗帕金森病的作用。

<210> SEQ ID NO: 1

<211> 1878

<212> DNA

<213> 酪氨酸脱羧酶

atggaaaaaa gtaatcgctc acttaaagat ttagatttaa atgcattatt tattggggat 60

aaggccgaaa atggacagtt gtataaagat ctgcttaata aattagtgga tgaacattta 120

ggatggcgta agaactacat accttcagat ccaaatatga ttggtccaga agatcaaaac 180

tctccagcgt ttaaaaagac tgttgggcat atgaagacag tcttagatca attgtcagaa 240

cggattcgaa cagagtctgt tccatggcat tcggctggtc gttattgggg tcacatgaat 300

tcagagaccc taatgcctgc tctattggcg tataactatg ctatgttatg gaatggtaat 360

aacgtggctt atgaatcttc accagcaacg tcgcaaatgg aagaagaagt tggccaagaa 420

tttgcccgat taatgggtta tgactatggc tggggccaca ttgtcgcaga tggttccttg 480

gctaatcttg agggactctg gtatgcgcga aatattaaat cactcccgtt tgccatgaaa 540

gaagttaatc cagaattagt tgccggtaag tccgattggg agcttcttaa tatgccgact 600

aaagaaatta tggatctttt ggagaatgcg ggttctcaga tcgatgaagt caagaagcgt 660

tcagctcgaa gtggtaagaa tctacaacgc cttgggaaat ggctagtacc acaaacgaag 720

cattattctt ggatgaaggc cgctgatatc attggtattg gtttggatca agttgttcct 780

gttccaattg atagtaatta tcggatggat attcaagcct tagaaagtat tattcgtaaa 840

tatgcggctg aaaagacacc aatactaggc gtggttggtg tggccggatc aactgaagaa 900

ggtgccgttg atggcattga taagattgtc gctttacgtc aaaagctgca aaaggaagga 960

atttacttct atctacacgt agatgctgca tatggtggat atgctcgggc attgttcttg1020

gacgaggacg atcagtttat tccatacaaa aatttacaaa aagtacatgc ggaaaatcat1080

gtcttcacgg aagataaaga atacatcaaa ccagaagtct atgcggcata taaagctttc1140

gatcaagcag agtccattac aattgatccc cataagatgg gatatgtacc atactcggct1200

gggggcattg tcattcaaga tattcggatg cgtgacacga tttcctattt tgcaacatat1260

gtatttgaga agggtgccga tattccggca ttgctaggtg cttatattct ggagggctcc1320

aaagcgggtg ccactgctgc atctgtttgg gcagcacacc acacattgcc attgaacgtg1380

acaggatatg ggaagttgga aggtgcctca attgaagggg ctcaccgtta ctatgatttc1440

ttgaagaatt taaagtttga agtggctggt aaacggattt cagttcatcc gttaatctca1500

cctgacttca atatggttga ctatgtttta aaagaagatg gcaatgatga cttaattgaa1560

atgaatcgat tgaatcatgc cttctatgaa caagcatctt atgttaaagg gtccttgtat1620

ggtaaagaat atatcgtatc acatacggac tttgctatcc cagattatgg tgatagtcca1680

ttggcatttg ttgaaagtct aggctttagc gaagttgaat ggcgacatgc cggaaaggtt1740

acaatcattc gcgcttcggt tatgacgccg tatatgaatc aacgagaaaa ctttgactac1800

tttgcaccac gaatcaaaaa agcaattcaa gcagaccttg aaaaagtcta tgcttcggtt1860

aatcaaaagg aaaatgtt 1878

<210> SEQ ID NO: 2

<211> 31

<212> DNA

<213> 上游引物

5’-ctagctagca tggaaaaaag taatcgctca c-3’

<210> SEQ ID NO: 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 下游引物

5’-ccgctcgaga acattttcct tttgattaac-3’

Claims

1.一种重组表达短乳杆菌TDC的基因工程菌E. coli BL21 (DE3)/pET24-TDC的培养和诱导方法，其特征在于，优化发酵培养基组成，提高rTDC的可溶性表达，并优化rTDC的诱导条件，TDC基因核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，

（1）基因工程菌E. coli BL21 (DE3)/pET24-TDC的摇瓶实验，发酵培养基为LBG/Kan培养基：LBG培养基为含0.2% ~ 2%葡萄糖的LB培养基，含卡那霉素Kan浓度为50 mg/L，在OD达到0.5时加入IPTG，在15 ~ 37℃条件下诱导，得发酵液备用；

（2）基因工程菌E. coli BL21 (DE3)/pET24-TDC的3L发酵罐实验，发酵培养基为TBG/Kan培养基：TBG培养基为含1%葡萄糖的TB培养基，含卡那霉素Kan浓度为50 mg/L，OD达到1.0 ~ 4.0时加入IPTG，在15~ 37℃条件下诱导，得发酵液备用。