CN103966185A

CN103966185A - 高效合成s-腺苷同型半胱氨酸的双酶体系及其应用方法

Info

Publication number: CN103966185A
Application number: CN201410207959.2A
Authority: CN
Inventors: 邵蔚蓝; 钱国军; 王洪成
Original assignee: NANJING XIANYI GENE TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: NANJING XIANYI GENE TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2014-05-18
Filing date: 2014-05-18
Publication date: 2014-08-06

Abstract

本发明涉及生物工程领域；具体涉及分子生物技术、基因工程、酶工程、制药工程等技术领域；更具体涉及极耐热性重组酶的高效表达和酶学定性，以及应用这些酶在高温的反应条件下高效生产S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）的方法。SAH是一类有效的镇静剂和抗病毒因子。本发明的要点包括：（1）发现海栖热袍菌S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的最适反应条件和最高催化活性，为SAH的酶法生产获得活性和稳定性俱佳的酶种；（2）将SAH合成反应与辅酶再生反应相偶联，建立高效生产SAH的双酶系统与技术；（3）用重组海栖热袍菌乳酸脱氢酶作辅酶再生反应催化剂，实现主体产物的高产低消耗；（4）根据海栖热袍菌S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的性质建立高效生产SAH的独特的工艺条件。

Description

高效合成 S- 腺苷同型半胱氨酸的双酶体系及其应用方法

技术领域

本发明涉及生物工程领域；具体涉及分子生物技术、基因工程、酶工程、制药工程等技术领域；更具体涉及极耐热性重组酶的高效表达和酶学定性，以及应用这些酶在高温下高效生产S-腺苷同型半胱氨酸的方法。

背景技术

S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)是一种氨基酸衍生物，在生物体内与抗病性相关，是对相关病理障碍进行早期诊断的重要指标。外源SAH有镇静剂作用，是有效的安眠药和抗惊厥药物，同时也是1种抗病毒因子。随着SAH在医学领域的广泛研究与应用，其高效生产制备技术也备受关注。

SAH可通过化学方法进行合成，但化学合成方法存在生产条件苛刻，污染环境等缺陷。S-腺苷同型半胱氨酸水解酶（SAHase）能够催化腺苷和同型半胱氨酸的合成反应，有效地产生SAH；通过酶法制备SAH可提高生产的可操作性和简化产物的下游加工过程。但是，已报道的SAHase的活性和稳定性都不能满足生产的要求。

极端嗜热微生物产生的一类热稳定性酶的高温酶，在酶的生产和应用过程中克服了中温酶（20℃-65℃）及低温酶（2℃-20℃）易于失活的难题，从而极大地降低酶的应用成本，提高生产效率。同时，高温酶基因在常温菌细胞内重组表达后，可通过热处理的方式使宿主细胞的蛋白变性，重组酶得到快速分离纯化。用高温酶在较高的温度下进行生物合成或加工，还有助于提高底物或产物的溶解性，从而加快反应速度、提高产物提取效率。此前，国际上发表过1篇关于海栖热袍菌SAHase的研究论文（Lozada-Ramirez et al. 2013, Appl Biochem Biotechnol 170(3): 639-653）。该文作者没有发现该酶需要辅酶参与催化反应，所报道的SAHase最高活性只有2.45 U/mg，最适反应条件为75℃，pH 6.5；pH 7.0时酶的活性下降约50%，pH 8.0时活性很低，并且在其设定的反应条件下该酶的稳定性极差。

SAHase是一种NAD依赖型酶，在反应过程中需要要消耗大量NAD。由于辅酶的价格高稳定性差，并且，随着辅酶由底物型态转化为产物型态，反应方向逐渐逆转，表观反应速度逐渐停止。因此，辅酶依赖型酶的实际应用，除了必须有合适的酶和反应工艺以外，还需要有效地解决辅酶再生问题。通过双酶的偶联反应，人们有望建立辅酶循环再生体系，达到降低成本和维持快速反应的目的。本实验室研究了海栖热袍菌来源的乳酸脱氢酶的酶学性质，发现该酶具有极高的稳定性，在宽广的温度和pH值范围内保持较高活性，在NAD再生中具有很大的应用潜力。

发明内容

发明的目的：

为了解决现有SAH制备方法中酶的活性低，稳定性差，NAD消耗快，过程复杂等问题，本发明研制1种用于合成SAH的高活性的高温酶，并利用极耐热性乳酸脱氢酶进行NAD再生，建立高效生产SAH的双酶体系。

技术关键：

从海栖热袍菌中克隆出编码S-腺苷同型半胱氨酸水解酶和乳酸脱氢酶的基因并将其分别插入具有自主知识产权的热激表达载体pHsh质粒（美国专利US 7,807,460 B2），在大肠杆菌中进行超量表达产生极耐热性S-腺苷同型半胱氨酸水解酶和乳酸脱氢酶；对这两种酶分别进行纯化和酶学性质分析，发现它们具有很强的活性和匹配性；随后，运用S-腺苷同型半胱氨酸水解酶和乳酸脱氢酶建立一个高效的SAH的双酶合成方法。

技术方案：

(1) 从海栖热袍菌中克隆出编码S-腺苷同型半胱氨酸水解酶和催化NAD再生反应的酶如乳酸脱氢酶的编码基因并将其分别插入热激载体pHsh构建表达质粒pHsh-sahase，和pHsh-ldh。

(2) 对表达质粒中的目标基因的序列进行优化，使目标酶在大肠杆菌细胞中实现超量表达；将优化后的基因表达质粒导入大肠杆菌，通过热激诱导进行表达。

(3) 对重组的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶和催化NAD再生反应的酶如乳酸脱氢酶等进行分离纯化（图1）。

(4) 对分离纯化后的各种酶分别进行酶学性质的鉴定，（图2、3）。

(5) 建立用S-腺苷同型半胱氨酸水解酶制备SAH的单酶合成系统及反应条件。

(6) 以海栖热袍菌来源的极耐热性的酶如乳酸脱氢酶等构建高效的辅酶再生系统，与S-腺苷同型半胱氨酸水解酶联用（图4），提高SAH的合成速度并延长反应周期（图5）。

本发明可取得的有益效果：

本发明的关键有益效果包括：

（1）首次发现海栖热袍菌S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的最适反应依赖于NAD的浓度、揭示的最高活性比过去报道的活性提高15倍，为SAH的酶法生产获得活性和稳定性俱佳的酶种；

（2）以pHsh为表达载体使极耐热性S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的产量达到最高水平，为SAH的酶法生产获得可靠的酶源；

（3）为S-腺苷同型半胱氨酸水解酶配置NAD再生系统，并应用海栖热袍菌来源的极耐热性酶建立高效的辅酶循环系统，使SAH的产量得到大幅度提高；

（4）发现并证明海栖热袍菌产生的乳酸脱氢酶在NAD再生反应中是高活性高效率的优选酶种。

（5）确立了独特的高产SAH的工艺条件：pH ≥8.0、温度≥80℃、底物腺苷浓度≥20毫摩尔、NAD浓度≥1毫摩尔。

附图说明

图1. 重组的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶和乳酸脱氢酶的表达效果图。

图2. 重组的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶酶学性质。

图3. 重组的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶和乳酸脱氢酶酶在最优生产条件下的稳定性。

图4. 双酶法制备S-腺苷同型半胱氨酸过程示意图。

图5. 双酶法制备S-腺苷同型半胱氨酸。

具体实施方式：

本发明中所用术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面的方法结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。应理解实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

本发明所用材料与常规技术包括：

(1) 菌株及质粒：海栖热袍杆菌Thermotoga maritima MSB8购自美国菌种保存中心，编号为ATCC43589；质粒pHsh由仙奕生物科技 (南京) 有限公司 (Shine E Biotech, Nanjing, China) 提供。

(2) 培养基及培养条件：E. coli培养在LB培养基中，转化子的选择用含有氨苄青霉素 (100 μg/mL) 的LB培养基，重组酶最高产量测定用含有氨苄青霉素 (100 μg/mL) 的TB培养基。电转化用SOC培养基。

(3) 其他常规DNA操作方法：实验中所使用的T4 DNA连接酶购自NEB公司，PrimeSTAR^® HS DNA聚合酶、PrimeSTAR^® max DNA聚合酶、DNA分子量Marker等常规试剂均购自大连Takara生物公司，DNA片段割胶回收中所用QG、PE试剂购自Qiagen公司。PCR反应和DNA片段连接反应均按照相应说明书要求操作。基因序列的测定由上海美吉生物公司完成。

实例 1. 海栖热袍菌来源的 SAHase 和 LDH 的克隆表达和纯化

(1) 极耐热性SAHase和LDH基因的克隆

海栖热袍菌基因组的提取、PCR扩增、DNA的分离、纯化、酶切、连接、大肠杆菌的转化等基因操作按《分子克隆手册》第三版上的标准方法进行。

(2) 极耐热性SAHase和LDH基因在大肠杆菌中的超量表达

分别以重组质粒pHsh-sahase和pHsh-ldh转化E. coli BL21中，在30℃培养，挑取单菌落接入含0.1 mg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，于30℃震荡培养至OD₆₀₀ 达到0.6-1.0，将试管移入42℃水浴摇床诱导基因表达，继续培养2-6 h，用超声波破碎细胞，离心去除细胞碎片。

(3) 极耐热性SAHase和LDH重组酶的纯化

重组SAHase的纯化：按上述方法进行大体积培养细胞并进行诱导表达，将离心收集的细胞用咪唑邻苯二甲酸氢钾缓冲液 (pH 8.0) 重悬，经高压细胞破碎仪破碎细胞，13 000 g离心15 min，取上清液于80℃热处理1 h后，13 000 g离心15 min，离心上清液过镍离子柱 (亲和层析)，经100 mM 咪唑，0.2 M 氯化钠，和20 mM Tris–HCl缓冲液(pH 7.9)洗脱，所获得的重组酶达到电泳纯。

重组LDH的纯化：将离心收集的细胞用咪唑邻苯二甲酸氢钾缓冲液(pH 8.0)重悬，经高压细胞破碎仪破碎细胞，13 000 g离心15 min，取上清于80℃热处理1 h后，13 000 g离心15 min，离心上清液经过阴离子交换层析，重组酶达到电泳纯。

实例 2. 酶活性测定

(1) S-腺苷同型半胱氨酸水解酶活性的测定

以腺苷和同型半胱氨酸为底物，采用HPLC法测定反应体系中SAH的生成量。1 mL反应液中含有1 mM的腺苷，2 mM的同型半胱氨酸，1 mM的NAD，50 mM的Tris-HCl (pH 8.0)。加入适量酶液，于85 ℃反应20 min后，迅速移至冰浴中终止反应。用HPLC在260 nm 处检测SAH的生成量。SAHase酶活单位定义：每分钟生成SAH 1 μmol所需要的酶量定义为一个活性单位。用SAH作标准曲线。

(2) 乳酸脱氢酶酶活性测定

LDH活性测定采用分光光度法，以丙酮酸钠和NADH为底物，测定反应体系中NADH的下降量。反应体系为200 μL，内含1 mM的丙酮酸钠，1 mM的NADH，适量稀释后酶液，50 mM的Tris-HCl (pH 8.0)。空白对照中不加酶，补加等体积的缓冲液，85℃反应5 min后，冰浴中迅速终止反应，用分光光度计在340 nm处测定其吸收值，计算相对于空白对照的下降值。LDH酶活单位定义：每分钟氧化NADH 1 μmol所需要的酶量定义为一个活性单位。用NADH作标准曲线。

实例 3. 酶法制备 SAH

(1) 单酶反应系统生产SAH的最适条件

反应体系为10 ml，内含20 mM的腺苷，40 mM的同型半胱氨酸，1 mM NAD，0.5 mg纯化后SAHase，50 mM的Tris-HCl。反应条件为85℃，pH 8.0，12 h。

(2) 双酶反应系统生产S-腺苷同型半胱氨酸的最适条件

反应体系为10 ml，内含20 mM的腺苷，40 mM的同型半胱氨酸，40 mM的丙酮酸钠，1 mM NAD，0.5 mg纯化后SAHase酶液，0-2 mg纯化后LDH，50 mM的Tris-HCl。反应条件为85℃，pH 8.0，12 h。

实例 4. 极耐热性 S- 腺苷同型半胱氨酸水解酶的克隆表达

(1) 根据极耐热性S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(GenBank: AF013268.1)基因序列设计一对引物：5’-CATGCCATGGCTAACACAGGTGAAATGAAGA-3’，5’-CCGCTCGAGCTGCCAAC TTCTCAGATA-3’。以海栖热袍菌基因组DNA为模板，用上述引物对S-腺苷同型半胱氨酸水解酶基因进行PCR扩增。

(2) 用Nco I和Xho I处理PCR产物，并将它与Nco І和Xho I双酶切的载体pHsh大片段混合并连接。

(3) 通过电转化导入E. coli BL21(DE3)后，涂布到含0.1 mg/ml氨苄青霉素的LB平板上，于30℃培养。

(4) 从LB平板上挑选单菌落，分别接种到4 ml含0.1 mg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，30℃培养过夜后，按照标准的方法提取质粒。

(5) 质粒寄送到上海美吉生物公司进行序列测定，并将质粒命名为pHsh-sahase，并用作后续研究的起始材料和实验对照。

(6) 将重组质粒pHsh-sahase转入E. coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL，涂布于含0.1 mg/ml的氨苄青霉素的LB固体培养基上，30℃过夜培养。

(7) 挑取重组单菌落接种于含0.1 mg/ml的氨苄青霉素的LB培养液中，30℃振荡培养至OD₆₀₀达0.8~1.0时，转入42℃水浴摇床中使其瞬间升温至42℃进行诱导，200 rpm继续培养5 h后，以12 000 rpm离心1 min收集菌体。

(8) 用邻苯二甲酸氢钾-咪唑缓冲液(50 mM，pH 8.0)洗涤细胞两次，并用500 µl的缓冲液重悬细胞，超声波破碎，5秒/次，共10次。

(9) 超声破碎后以12 000 rpm，4℃离心1 min去除未破碎细胞及细胞碎片，取上清用于SAHase酶活测定。同样收集1 ml菌液离心弃上清，以1 ×样品缓冲液重悬菌体，煮沸后进行蛋白电泳（12.5%分离胶）分析。

实例 5. 重组 S- 腺苷同型半胱氨酸水解酶酶的分离纯化

(1) 将重组质粒pHsh-sahase转入宿主菌株E. coli BL21(DE3)，挑取单菌落接种于10 ml含0.1 mg/ml的氨苄青霉素的LB培养液中（10 ml/50 ml三角瓶），30℃振荡培养过夜。

(2) 按1%的接种量转接入700 ml含0.1 mg/ml的氨苄青霉素的LB培养液中（700 ml/3 L三角瓶），30℃振荡培养至OD₆₀₀达0.8~1.0时，转入42℃水浴摇床200 rpm培养5 h，以5 000 g，离心10 min收集细胞。用灭菌的去离子水洗涤细胞三次，彻底除去残留的培养基溶液菌，按照1：2（湿重：体积）的比例重悬于适量的邻苯二甲酸氢钾-咪唑（50 mM，pH 8.0）缓冲液中。

(3) 用高压破碎法破碎细胞后，以20 000 g离心30 min去除破碎细胞和细胞碎片，上清即为胞内粗酶液。

(4) 将粗酶液置于三角瓶中，在80℃下热处理1 h变性大部分杂蛋白进行部分纯化，热处理过程中不时的摇动三角瓶以保证受热的充分。热处理后，10 000 g，4℃下离心，30 min取得部分纯化的上清。

(5) 上清利用His-tag亲和层析纯化S-腺苷同型半胱氨酸水解酶。具体过程如下：

a 取1 ml填料装柱；

b 先用3倍柱体积的无菌水洗涤柱子；

c 再用5倍柱体积的1×Charge buffer漂洗柱子；

d 再用3倍柱体积的1×Binding buffer漂洗柱子；

e 把部分纯化的SAHase上清液加入柱子中；

f 用10倍柱体积的1×Binding buffer漂洗柱子；

g 用6倍柱体积的1×Wash buffer漂洗柱子；

h 用6倍柱体积的1×Elute buffer 洗脱柱子上结合的蛋白；

i 用4倍体积的1×Strip buffer洗柱子；

j 用10倍无菌水冲洗柱子，然后用20%酒精充满柱填料，4℃下保存填料。

收集的洗脱液经SDS-PAGE胶验证后，合并其中较纯的洗脱液，并置于冰上用缓冲液透析。

实施例 6. 重组 S- 腺苷同型半胱氨酸水解酶酶学性质的测定

(1) NAD浓度对合成活性影响的测定：反应在50 mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液中进行，内含20 mM的腺苷，40 mM同型半胱氨酸，适量稀释后SAHase酶液，1-20 mM NAD，于85℃反应20 min。用HPLC检测不同NAD浓度下，SAH的生成量。

(2) 最适反应pH的测定：不同的pH（6.5~10.0）的50 mM phosphate-Tris-Gly缓冲液，于85℃分别测定酶活，反应体系为1 ml：1 mM 腺苷， 2 mM 同型半胱氨酸， 1 mM NAD，然后添加适量稀释的SAHase酶液，于85℃下反应20 min。以最高酶活力为100%，计算相对活性。

(3) 最适反应温度的测定：酶反应在50 mM pH 8.0的Tris-HCl缓冲液中进行，缓冲液pH在85℃下校正。在60～100℃范围内，每隔5℃，分别测定酶活，反应体系为1 ml：1 mM 腺苷，2 mM 同型半胱氨酸，1 mM NAD，然后添加适量稀释的酶液，反应时间为20 min。以最高酶活力为100%，计算相对酶活。

(4) 稳定性的测定：取适量纯化酶液（6.4 μg/ml）在85℃下pH 8.0环境保温20、90、210、330、450、570、720 min，在不同的时间取样测定酶活，以未保温（4℃保存）的酶活力为100%，计算相对酶活，确定酶在最适反应条件下的稳定性。

实施例 7. 酶法制备 S- 腺苷同型半胱氨酸

S-腺苷同型半胱氨酸含量的分析在Agilent 1260 Infinity HPLC高压液相色谱仪上，用Agilent TC-C18 柱 (4.6 mm × 250 mm，5 μm)分析。色谱条件：柱温：25℃；流动相：86%的甲醇；流速：0.8 ml/min；紫外可见吸收检测器：260nm。

具体方法是：在10 ml 50 mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液中添加20 mM 腺苷, 40 mM 同型半胱氨酸, 1 mM NAD，然后添加0.5 mg的纯酶，于85℃下反应12 h。

实施例 8. 用乳酸脱氢酶作为辅酶再生系统生产 S- 腺苷同型半胱氨酸

具体方法是：在10 ml 50mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液中添加20 mM腺苷, 40 mM同型半胱氨酸，40mM丙酮酸钠，1 mM NAD，然后添加0.5 mg的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶和适量乳酸脱氢酶，于85℃下反应12 h。

实施例 9. 用 NADH 氧化酶作为辅酶再生系统生产 S- 腺苷同型半胱氨酸

具体方法是：在10 ml 50mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液中添加20 mM腺苷, 40 mM同型半胱氨酸， 1 mM NAD，然后添加0.5 mg的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶和适量NADH氧化酶，于85℃下反应12 h。

实施例 10. 用醇脱氢酶作为辅酶再生系统生产 S- 腺苷同型半胱氨酸

具体方法是：在10 ml 50mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液中添加20 mM腺苷, 40 mM同型半胱氨酸，40 mM 乙醛，1 mM NAD，然后添加0.5 mg的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶和适量醇脱氢酶，于85℃下反应12 h。

实施例 11. 用葡萄糖脱氢酶作为辅酶再生系统生产 S- 腺苷同型半胱氨酸

具体方法是：在10 ml 50 mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液中添加20 mM腺苷, 40 mM同型半胱氨酸，40 mM D-葡萄糖酸-1,5-内酯，1 mM NAD，然后添加0.5 mg的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶和适量葡萄糖脱氢酶，于85℃下反应12 h。

Claims

1.一种由海栖热袍菌S-腺苷同型半胱氨酸水解酶与催化NAD再生反应的酶共同组成的高效合成S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）的双酶系统，以及应用双酶系统高效合成SAH的方法；技术方案包括以下主要步骤：(1)从海栖热袍菌中克隆出编码S-腺苷同型半胱氨酸水解酶等目标基因，并将其插入大肠杆菌表达载体构建基因表达质粒；(2)对表达质粒中的目标基因的序列进行优化，提高其表达水平；(3)用表达质粒转化大肠杆菌获得重组细胞，细胞培养过程中诱导基因表达后，收集并裂解重组细胞，对细胞提取液进行热处理后离心，得到重组酶；(4)在高温条件下，用海栖热袍菌S-腺苷同型半胱氨酸水解酶与介导辅酶再生的酶进行联合反应，进行SAH的高效合成。

2.如权利要求1 所述的大肠杆菌表达载体，其特征在于用热激诱导型载体pHsh表达海栖热袍菌S-腺苷同型半胱氨酸水解酶基因。

3.如权利要求1 所述的介导辅酶再生的酶，其特征在于其编码基因来源于极端高温微生物，产生的酶属于极耐热性酶。

4.如权利要求3 所述的介导NAD再生的极耐热性酶，其特征是由海栖热袍菌的基因编码的乳酸脱氢酶。

5.如权利要求1 所述的SAH高效合成，其特征在于根据S-腺苷同型半胱氨酸水解酶酶学性质设定的极端反应条件：pH 》8.0、温度》80℃、底物腺苷浓度》20毫摩尔、NAD浓度》1毫摩尔。