CN109750009A - 一种草铵膦脱氢酶突变体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种草铵膦脱氢酶突变体及其应用，该草铵膦脱氢酶突变体由SEQ ID No.2所示氨基酸的第90位、第91位、第376位进行单突变或多突变获得；其中，第90位的赖氨酸突变为丝氨酸；第91位甘氨酸突变为丝氨酸或脯氨酸；第376位的丝氨酸突变为精氨酸。本发明利用定点饱和突变技术对SEQ ID No.1所示的草铵膦脱氢酶基因进行突变，发现第90位、第91位、第376位是影响酶活的关键位点，获得比酶活远高于母本草铵膦脱氢酶的突变体，其中，突变体lvPDH‑K90S‑G91P‑S376R的比酶活较母本草铵膦脱氢酶提升了8.4倍，具有工业应用前景。

Description

一种草铵膦脱氢酶突变体及其应用

技术领域

本发明涉及草铵膦生产技术领域，尤其涉及一种草铵膦脱氢酶突变体及其应用。

背景技术

草铵膦，也称草丁膦，英文名为：Phosphinothricin(简称PPT)，化学名为2-氨基-4-[羟基(甲基)膦酰基]-丁酸。草铵膦是一种内吸传导型除草剂，具有广谱杀草活性。除草剂用途广泛，国内外市场巨大，草铵膦为三大除草剂之一，近几年由于其作用机理和转基因技术，其市场份额有望进一步突破。

现在市场中的草铵膦主要为外消旋体。草铵膦有两种光学异构体：L-草铵膦和D-草铵膦。但只有L-草铵膦具有除草活性，是外消旋草铵膦的两倍，而且对人和动物的毒性较小，对环境影响小。但是，现在大规模生产的商品化草铵膦都是外消旋混合物的形式。外消旋草铵膦的使用，浪费巨大，而且对环境影响较为严重。为了减轻环保压力，减低生产成本，探索一条具有工业化应用前景的拆分外消旋草铵膦的生产路线具有重要的市场前景和社会意义。

现在制备L-草铵膦的方法总体主要分为化学法和生物酶法。

其中化学法主要包括化学立体合成法和手性拆分法。化学立体合成法需要用到昂贵的不对称合成试剂，主要是实验室研究规模，不利于大规模制备。化学手性拆分法也要消耗大量昂贵的手性拆分试剂，工艺较复杂，收率一般较低。

与化学法相比，生物酶法具有反应条件温和，立体选择性严格等优点。制备L-草铵膦生物酶法分为酶法不对称合成和酶法拆分。生物酶法拆分一般是通过化学合成外消旋D,L-草铵膦或其衍生物，再利用特定的酶选择性催化某一构型的反应，获得其中一个光学异构体，未反应的另一个异构体衍生物经过分离、消旋后，再进行酶催化反应，其理论产率可达100％。

酶法不对称合成理论转化率较高，主要涉及转氨酶与氨基酸脱氢酶。Schulz A(Stereospecific production of the herbicide phosphinothricin(glufosinate)bytransamination:isolation and characterization of a phosphinothricin-specifictransaminase from Escherichia coli[J].Applied and Environmental Microbiology,1990,56(1)：1-6)等利用从大肠杆菌中克隆的转氨酶，以2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸为底物，L-谷氨酸为氨基供体，制备L-草铵膦，转化率只有85％。

脱氢酶在酶法不对称合成手性氨基酸中有着重要的应用，其具有理论转化率高，原子利用率高等特点。草铵膦脱氢酶是一种具有工业应用潜力，能够不对称催化一步合成L-草铵膦的生物酶催化剂。该酶以2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸(PPO)为底物，无机铵根离子为氨基供体，在还原型辅酶(NADPH)存在的条件下，进行光学选择性还原胺化反应，获得L-草铵膦。

发明内容

本发明的目的在于针对现有草铵膦脱氢酶对2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸不对称还原活性不高和底物浓度低的问题，提供一种立体选择性草铵膦脱氢酶突变体以及利用该草铵膦脱氢酶突变体基因的重组菌及其粗酶液作为生物催化剂制备L-草铵膦的方法；该突变体具有高酶活的特点，可高效催化2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸不对称还原成L-草铵膦。

具体技术方案如下：

一种草铵膦脱氢酶突变体，所述草铵膦脱氢酶突变体由SEQ ID No.2所示氨基酸的第90位、第91位、第376位进行单突变或多突变获得；

其中，第90位的赖氨酸突变为丝氨酸；第91位甘氨酸突变为丝氨酸或脯氨酸；第376位的丝氨酸突变为精氨酸。

SEQ ID No.2所示氨基酸为母本草铵膦脱氢酶lvPDH，其核苷酸序列为SEQ IDNo.1所示。

进一步地，所述草铵膦脱氢酶突变体为下列之一：

(1)将SEQ ID No.2所示氨基酸第90位的赖氨酸突变为丝氨酸；

(2)将SEQ ID No.2所示氨基酸第91位甘氨酸突变为脯氨酸；

(3)将SEQ ID No.2所示氨基酸第376位的丝氨酸突变为精氨酸；

(4)将SEQ ID No.2所示氨基酸第90位的赖氨酸突变为丝氨酸，同时第91位甘氨酸突变为丝氨酸或脯氨酸；

(5)将SEQ ID No.2所示氨基酸第90位的赖氨酸突变为丝氨酸，第91位的甘氨酸突变为丝氨酸或脯氨酸，同时第376位的丝氨酸突变为精氨酸。

进一步地，将SEQ ID No.2所示氨基酸第90位的赖氨酸突变为丝氨酸，第91位的甘氨酸突变为脯氨酸，同时第376位的丝氨酸突变为精氨酸。

本发明还提供了所述草铵膦脱氢酶突变体的编码基因。

本发明还提供了所述草铵膦脱氢酶突变体的重组载体和基因工程菌。优选重组表达载体pETDuet-1；宿主细胞优选大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，通过蛋白诱导表达、细胞破碎获得粗酶液，催化特性均优于母本草铵膦脱氢酶。

进一步地，所述基因工程菌还包括葡萄糖脱氢酶基因。

进一步地，所述葡萄糖脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

本发明还提供了所述草铵膦脱氢酶突变体和葡萄糖脱氢酶共表达的重组载体和基因工程菌。

本发明还提供了所述的草铵膦脱氢酶突变体在不对称还原2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸制备L-草铵膦中的应用。

本发明还提供了一种不对称还原2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸制备L-草铵膦的方法，该方法包括：以2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸为底物，葡萄糖为辅助底物，在催化剂的作用下，进行反应，得到L-草铵膦；

所述催化剂为同时包含草铵膦脱氢酶突变体基因和葡萄糖脱氢酶基因的共表达基因工程菌、共表达基因工程菌的粗酶液或固定化的共表达工程菌；

或者，所述催化剂由催化剂I和催化剂II组成；

催化剂I为草铵膦脱氢酶突变体、所述的基因工程菌，或者工程菌的粗酶液、固定化的所述基因工程菌；

催化剂II为葡萄糖脱氢酶、包含葡萄糖脱氢酶基因的基因工程菌、工程菌的粗酶液或固定化的包含葡萄糖脱氢酶基因的基因工程菌；

所述草铵膦脱氢酶突变体如上所述；编码所述葡萄糖脱氢酶的基因的核苷酸序列为SEQ ID No.3所示。

进一步地，编码所述葡萄糖脱氢酶的基因的核苷酸序列为SEQ ID No.3所示；所述葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列为SEQ ID No.4所示。

进一步地，所述催化剂的制备方法为：

(1)对含草铵膦脱氢酶突变体基因的基因工程菌进行诱导培养，得到湿菌体I；

(2)对含葡萄糖脱氢酶基因的基因工程菌进行诱导培养，得到湿菌体II；

(3)将湿菌体I和湿菌体II混合，用磷酸盐缓冲液重悬后，超声破碎，得到作为催化剂的混合液。

具体地，所述湿菌体按如下方法制备：将含草铵膦脱氢酶突变体基因的重组基因工程菌接种到氨苄西林霉素的LB液体培养基中培养，以再将重组基因工程菌接种到新鲜的氨苄西林霉素的LB液体培养基中，培养后，再向培养液中加入IPTG，培养后，离心，获得含草铵膦脱氢酶的湿菌体；所述含葡萄糖脱氢酶基因的工程菌经诱导培养获得的湿菌体制备方法同含草铵膦脱氢酶基因的湿菌体。

进一步地，反应体系中，所述2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸的浓度为50～100g/L，葡萄糖的终浓度为75～150g/L；以破碎前的湿菌体总量计，催化剂用量为50～100g/L；所述湿菌体I与湿菌体II的质量比为3:1。

本发明所述草铵膦脱氢酶突变体的获取是采用定点饱和突变技术，使用该技术对SEQ ID No.1所示的草铵膦脱氢酶基因进行突变，将获得的突变质粒以热击方式转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞，对获得菌株进行接种、转接、诱导、菌体回收，利用粗酶液催化制备光学纯L-草铵膦。

具体方法如下：第一步将原始菌活化，获得了母本E.coli BL21(DE3)pETDuet-1-lvPDH，提取质粒pETDuet-1-lvPDH，并保存待用。第二步通过SWISS-MODEL与lvPDH比较，获得同源建模的模板蛋白晶体结构，利用Modeller 9.14同源建模，并进行分子对接，选择合适的突变位点，选点主要是活性通道附近获得活性口袋附件的氨基酸残基，设计突变的引物，以pETDuet-1-lvPDH为模板质粒，进行突变PCR，获得突变质粒，并转化，进行优势突变菌的筛选，将优势突变体送序检测并保存。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明利用定点饱和突变技术对SEQ ID No.1所示的草铵膦脱氢酶基因进行突变，发现第90位、第91位、第376位是影响酶活的关键位点，获得比酶活远高于母本草铵膦脱氢酶的突变体，其中，突变体lvPDH-K90S-G91P-S376R的比酶活较母本草铵膦脱氢酶提升了8.4倍，提高后的酶活高于目前报道的最高水平，具有很好的工业应用前景。

(2)本发明制备的草铵膦脱氢酶突变体，可以将200mM 2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸在很短时间内(120分钟)完全转化为L-草铵膦(底物转化率大于99％，产物ee值大于99％)，通过分离纯化、减压浓缩结晶，最终能够获得纯度为98％的L-草铵膦(ee值大于99％)。

附图说明

图1为利用草铵膦脱氢酶制备L-草铵膦的反应示意图。

图2为氨基酸脱氢酶突变体lvPDH-K90S-G91P-S376R和葡萄糖脱氢酶GDH共表达菌株的SDS-PAGE电泳图；

其中，M：标准蛋白分子量；泳道1：诱导后共表达菌株；泳道2：共表达菌株上清；泳道3：共表达菌株沉淀。

图3为实施例7中的反应进程图。

图4为实施例8中的固定化细胞反应批次情况。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。

实施例1草铵膦脱氢酶突变体文库的构建及筛选

将来源于白鳍豚的草铵膦脱氢酶基因(氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示)构建表达载体pETDuet-1-lvPDH，转化大肠杆菌，获得出发菌株E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-lvPDH。

草铵膦脱氢酶突变体文库的制备通过3轮定点饱和突变来实现，引物设计如表1。

第一轮，以载体pETDuet-1-lvPDH为模板，以表1中定点饱和突变引物K90-F和K90-R为引物，经饱和突变PCR，将SEQ ID No.2所示的草铵膦脱氢酶氨基酸序列的第90赖氨酸突变为其余19种氨基酸，并转化，涂平板，通过优势菌株筛选，获得草铵膦脱氢酶突变体lvPDH-K90S。

第二轮，以氨基酸序列SEQ ID No.3对应的突变体lvPDH-K90S为模板，以表1中定点饱和突变引物G91-F和G91-R为引物，经饱和突变PCR，转化，涂平板，通过优势菌株，筛选获得草铵膦脱氢酶突变体lvPDH-K90S-G91P。

第三轮，以突变体lvPDH-K90S-G91P为模板，以表1中定点饱和突变引物S376-F和S376-R为引物，经饱和突变PCR，转化，涂平板，通过优势菌株筛选，获得草铵膦脱氢酶突变体lvPDH-K90S-G91P-S376R，后期实验中其余优势单突变体lvPDH-G91P，lvPDH-S376R，分别以表1中定点突变引物G91P和S376R，以同样方法构建。

表1草铵膦脱氢酶定点突变引物设计

突变PCR体系(100μL)为：2倍Phanta Max缓冲液25μL，dNTPs 1μL，突变上下引物各1μL，模板1μL，Phanta Super-Fidelity DNA聚合酶0.5μL，补ddH₂O至50μL。

PCR条件为：95℃预变性5分钟，经25个循环：95℃15秒，56℃15秒，72℃6分钟，最后72℃终延伸10分钟。

PCR结果分别进行DNA琼脂糖凝胶电泳阳性验证，将PCR产物进行Dpn I酶消化模板，37℃，3小时，160转/分钟，65℃，1分钟灭活，将PCR产物热击转化，并将大肠杆菌E.coliBL21(DE3)活化，置于37℃、160转/分钟，培养1小时，涂布于含50μg/mL卡那霉素抗性的LB平板上，37℃倒置培养过夜。

对获得的突变体进行优势突变体的筛选，筛选条件如下：

10g DCW/L细胞(草铵膦脱氢酶突变体和葡萄糖脱氢酶菌体质量比3:1)，加入pH7.0的PBS(100mM)重悬细胞，在冰水混合物上破碎10min(超声破碎条件：功率400W，破1s，停1s)，获得粗酶液，30℃、150转/分钟条件下进行反应，反应结束，取样检测L-草铵膦浓度，筛选获得优势菌株。将获得优势菌株送杭州擎科生物技术有限公司测序，并保存。葡萄糖脱氢酶菌体制备同实施例2。

实施例2草铵膦脱氢酶母本、突变体和葡萄糖脱氢酶的诱导表达

葡萄糖脱氢酶基因gdh(核苷酸序列为SEQ ID No.3所示，氨基酸序列为SEQ IDNo.4所示)由全基因合成，获得来源为微小杆菌属(Exiguobacterium sibiricum)重组葡萄糖脱氢酶菌株E.coli BL21(DE3)/pET28b-GDH。

将实施例1出发菌株E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-lvPDH和草铵膦脱氢酶突变菌株以及重组葡萄糖脱氢酶菌株E.coli BL21(DE3)/pET28b-GDH分别接种到含有终浓度50μg/mL氨苄西林霉素和卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养9小时，以体积分数2％(v/v)接种到新鲜的含有终浓度50μg/mL氨苄西林霉素和卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、180转/分钟培养1.5小时，再向培养液中加入终浓度为0.1mM IPTG，28℃培养10小时后，4℃、8000转/分钟离心10分钟，获得相应的湿菌体细胞。以上获得的细胞产有相应的蛋白，可用于蛋白纯酶液的制备，也可用于粗酶液催化不对称合成L-PPT。

实施例3突变文库筛选

将实施例2诱导表达的突变株湿菌体及葡萄糖脱氢酶湿菌体以质量比3:1混合，按照菌体总量50g/L的量加入pH 7.5、100mM磷酸盐缓冲液中重悬，在冰水混合物上超声破碎10分钟，超声破碎条件：功率为400W，破碎1秒、暂停1秒，获得突变株粗酶液。同样条件下，用出发菌株替换突变菌株湿菌体制备出发株粗酶液。

将突变株粗酶液或出发株粗酶液作为催化剂，以2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸为底物，以葡萄糖为辅助底物，不添加外源性NADPH或NADP⁺，运用菌体内源型NADPH，建立起辅酶循环系统。反应体系选择为10mL，催化剂用量以破碎前湿菌体总浓度计50g/L，底物终浓度500mM，葡萄糖终浓度112.5g/L，30℃、150转/分钟反应1小时取样，反应液稀释10倍，-20℃过夜，12000转/分钟离心3分钟，取上清，过0.22μM微滤膜，作为液相样品，HPLC检测产物浓度，筛选优势突变体，实验结果示于表2。

2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸液相检测条件：色谱柱C18(4.6×250mm，Acchrom,China)柱，流动相乙腈：50mM磷酸二氢铵溶液(pH3.8，含10％四丁基氢氧化铵)体积比为12:88。流速为1mL/min，检测波长为232nm，进样量10μL，柱温30℃，2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸保留时间为：9.7分钟。

草铵膦液相检测条件：色谱柱C18(4.6×250mm，Acchrom,China)柱，流动相甲醇:0.05M乙酸铵(pH5.7)体积比为10:90，流速1.0mL/min，检测波长E_x＝＝340nm、E_m＝450nm，进样量10μL，柱温35℃。L-草铵膦、D-草铵膦、保留时间分别为：10.6分钟，12.6分钟。

表2 lvPDH及其突变体的催化性能和立体选择性

由表2可知，三个位点，90位、91位和376位的突变株都有不同程度的提高。其中，在单突变株中，催化性能最好的是lvPDH-G91P。在90位点的突变株中，lvPDH-K90S的催化性能提高最大。双突变株中，lvPDH-K90S-S376R的催化性能提高最大。在三个突变位点叠加后，lvPDH-K90S-G91P-S376R的催化性能最高。

实施例4草铵膦脱氢酶母本及其突变体的纯化

将实施例3获得的优势突变体(表2中lvPDH-K90S，lvPDH-G91P，lvPDH-S376R，lvPDH-K90S-G91P，lvPDH-K90S-G91P-S376R，)，根据实施例2所述方法获得草铵膦脱氢酶突变体湿菌体，分别用缓冲液A(含0.3M NaCl、30mM咪唑的pH 8.0、50mM磷酸钠缓冲液)悬浮，超声破碎20分钟(冰浴，功率400W，破碎1秒、暂停1秒)，4℃、12000转/分钟离心20min，取上清。

使用Ni亲和柱(1.6×10cm，Bio-Rad公司，美国)纯化突变体蛋白，具体操作如下：

①用5倍柱体积的结合缓冲液(含0.3M NaCl的pH 8.0、50mM磷酸钠缓冲液)平衡Ni柱，至基线稳定；②样品上样，流速1mL/min，上样量在25-40mg/mL蛋白，使目标蛋白吸附于Ni柱上；③用6倍柱体积的缓冲液A(含0.3M NaCl、30mM咪唑的pH 8.0、50mM磷酸钠缓冲液)冲洗杂蛋白，流速1mL/min，至基线稳定；④用缓冲液B(含0.3M NaCl、500mM咪唑的pH 8.0、50mM磷酸钠缓冲液)洗脱，流速1mL/min，收集目的蛋白。将目的蛋白置于pH 7.5、20mM磷酸盐缓冲液中透析过夜，获得纯化酶；⑤5倍柱体积的结合缓冲液(含0.3M NaCl的pH 8.0、50mM磷酸钠缓冲液)冲洗Ni柱直至基线稳定，用5倍柱体积含20％乙醇的超纯水保存Ni柱。

出发菌株E.coli BL21(DE3)/pETduet-1-lvPDH的草铵膦脱氢酶纯酶采用相同条件收集。

实施例5：母本草铵膦脱氢酶及其突变体酶比酶活的测定

酶活单位(U)定义为：在35℃、pH 7.4条件下，每分钟每生成1μmol的L-草铵膦所需的酶量定义为一个酶活单位，U。比酶活定义为每毫克酶蛋白所具有的活力单位数，U/mg。

酶活检测标准条件：100mM 2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸，10mM NADPH，适量酶液，30℃、pH 7.4，600转/分钟条件下反应10分钟，样品处理并进行HPLC检测分析。

蛋白浓度用BCA蛋白测定试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司，南京)测定。母本草铵膦脱氢酶及其突变体的比酶活如表3所示。

表3突变体的相对酶活和差向对应异构体选择性(ee)值

a：在标准条件下，lvPDH的初始酶活指定为100％。

构建的三个突变株ee值没有降低，酶活均有提高。其中，单突变中lvPDH-G91P突变株活力提高最大，为5.4倍。而叠加饱和突变lvPDH-K90S-G91P-S376R的活力最高，为8.4倍。

实施例6：氨基酸脱氢酶突变体lvPDH-K90S-G91P-S376R和葡萄糖脱氢酶GDH共表达菌株的构建

葡萄糖脱氢酶基因gdh通过双酶切连到pETDuet-1载体上，将该重组质粒导入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，获得重组葡萄糖脱氢酶菌株E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-lvPDH-K90S-G91P-S376R-GDH，接种到含有终浓度50μg/mL氨苄西林霉素的LB液体培养基中，37℃培养9小时，以体积分数2％(v/v)接种到新鲜的含有终浓度50μg/mL氨苄西林霉素的LB液体培养基中，37℃、180转/分钟培养1.5小时，再向培养液中加入终浓度为0.1mMIPTG，28℃培养10小时后，4℃、8000转/分钟离心10分钟，获得相应的湿菌体细胞。以上获得的细胞产有相应的蛋白，可用于蛋白纯酶液的制备，也可用于粗酶液催化不对称合成L-PPT。

实施例7：氨基酸脱氢酶突变体lvPDH-K90S-G91P-S376R和葡萄糖脱氢酶GDH共表达菌株全细胞不对称胺化还原2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸

根据实施例6的描述，通过发酵获得共表达菌株3g，并用40mL、pH7.4、磷酸缓冲液(100mM)重悬，在冰上破碎(超声破碎条件：功率400W，破1s，停5s)，取全部破碎混合液(即粗酶液)，加入终浓度200mM的2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸，终浓度300mM的葡萄糖构成反应体系，在35℃、磁力搅拌转速为300rpm下进行反应，流加氨水使反应液pH维持在7.4。

以实施例3所示液相方法检测反应过程中产物L-草铵膦的生成和ee值的变化，其反应进程如附图3所示。产物浓度随时间的推移而逐渐升高，120分钟内反应完成，底物转化率大于99％，产物ee值始终保持在99％以上。

实施例8：氨基酸脱氢酶突变体lvPDH-K90S-G91P-S376R和葡萄糖脱氢酶GDH共表达菌株细胞固定化

根据实施例6的描述，通过发酵获得共表达菌株100g，细胞加入2L的生理盐水水中充分溶解。将细胞菌悬液与2％质量体积比的海藻酸钠溶液从分混合，待混合均匀后，利用注射器滴入2％质量体积比CaCl₂溶液中，并在4℃中固化12h。利用蒸馏水将小球清洗三次，加入0.5％质量体积比的戊二醛，20min后用蒸馏水清洗三次，加入1％质量体积比的聚乙烯亚胺，搅拌混匀20min,再次利用蒸馏水清洗三次，得到固定化细胞。根据实施例6的描述，将3g细胞对应的固定化细胞用于催化反应。待反应完全后，抽滤，用水冲洗，再次进行下一批次反应。固定化细胞反应批次情况，如附图4所示。

实施例9：L-草铵膦的分离纯化

氢型001×7阳离子树脂的预处理：

(1)用去离子水洗柱，流速为1.0BV/h，洗2BV；

(2)用2M氢氧化钠水溶液洗柱，流速为0.5BV/h，洗2BV；

(3)用去离子水洗柱，流速为1.0BV/h，洗2BV；

(4)用2M盐酸水溶液洗柱，流速为0.5BV/h，洗2BV；

(5)用去离子水洗柱，流速为1.0BV/h，洗2BV。

将实施例8中反应液离心去除固定化细胞，上清液用盐酸调pH至2抽滤，滤液上样至已经预处理好的氢型001×7阳离子树脂，柱体积为120mL，离子交换柱柱高比15:1，上样流速为1.0BV/h，上样后用超纯水冲洗4BV，收集含有流出液。再用2mol/L氨水以0.5BV/h流速洗脱，收集含有L-草铵膦的洗脱液。将洗脱液在60℃，真空度0.075～0.085MPa下，减压浓缩结晶，得到纯度为98％的L-草铵膦。

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 一种草铵膦脱氢酶突变体及其应用

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1335

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

atgattgaga gtgtggacaa cttcctggcc cgcctgcagc agcgtgatcc aggccagccg 60

gagtttcacc aggcagtgga ggaagtttta cgcacgttat ggccgttctt ggaggcaaac 120

ccacactatt tgcaggccgg gatcttggaa cgtatggtag aacccgagcg tgcggtactt 180

tttcgcgttt cttgggtaga cgatcatggc aaggtacagg taaaccgtgg ctaccgcatt 240

cagatgaata gcgcaatcgg tccttacaaa ggcggtcttc gttttcaccc ttcggtcaac 300

ttgtccgtct tgaagttcct ggcgttcgag caagtcttca agaattcatt aacctccctg 360

ccaatgggtg gagggaaagg cggatctgac ttcgacccta aggggaaatc ggatgccgag 420

gtcatgcgtt tctgtcaggc atttatgtct gaactgtatc gtcacattgg tgcggactgt 480

gacgtcccgg caggcgacat tggggtaggt gcgcgcgaga ttggttatat gttcggacaa 540

tacaagcgcc tggcaaacca gttcaccagt gtactgacgg gaaaaggcat gacctatggc 600

ggcttccgcc ccgaggctac cggttatggt tgtgtatatt ttgcggagga aatgctgaag 660

cgccaagggc agcgtatcga tggtcgtcgc gtggcaatta gtggttccgg aaatgtcgca 720

cagtatgcag cacgcaaagt aatggactta ggcgggaagg tcatcagtct ttcggatagt 780

gaggggacgc tgtatgctga ggcagggctg accgatgcac agtgggaagc tgtgatgacg 840

ctgaagaatg ttaagcgcgg acgcatctct gaattagccg ggcaatttgg gttagaattt 900

cgtaaaggtc agacgccatg gagtctggca tgtgacattg ctttgccctg cgctacccaa 960

aacgaacttg atgtagagga tgcaaaagcc ttattggcaa atgggtgtat ttgcgtggcg 1020

gagggcgcca acatgccaac cactttagct gcggtagata tcttcttaga agccggaatt 1080

ttgtacgcgc ccggtaaagc gtcaaatgca ggaggggtcg ctgtgtcggg attggaaatg 1140

tctcaaaacg caatgcgctt actgtggact gccggcgagg tagactcgaa attacacggc 1200

attatgcaat ctattcatca tgcctgcgtc cactacggtg aagagggcga tggtcgtgta 1260

aattacgtta aaggcgccaa catcgccggg tttgttaagg tagctgatgc tatgctggct 1320

cagggcgtcg tttaa 1335

<210> 2

<211> 444

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

Met Ile Glu Ser Val Asp Asn Phe Leu Ala Arg Leu Gln Gln Arg Asp

1 5 10 15

Pro Gly Gln Pro Glu Phe His Gln Ala Val Glu Glu Val Leu Arg Thr

20 25 30

Leu Trp Pro Phe Leu Glu Ala Asn Pro His Tyr Leu Gln Ala Gly Ile

35 40 45

Leu Glu Arg Met Val Glu Pro Glu Arg Ala Val Leu Phe Arg Val Ser

50 55 60

Trp Val Asp Asp His Gly Lys Val Gln Val Asn Arg Gly Tyr Arg Ile

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Ala Ile Gly Pro Tyr Lys Gly Gly Leu Arg Phe His

85 90 95

Pro Ser Val Asn Leu Ser Val Leu Lys Phe Leu Ala Phe Glu Gln Val

100 105 110

Phe Lys Asn Ser Leu Thr Ser Leu Pro Met Gly Gly Gly Lys Gly Gly

115 120 125

Ser Asp Phe Asp Pro Lys Gly Lys Ser Asp Ala Glu Val Met Arg Phe

130 135 140

Cys Gln Ala Phe Met Ser Glu Leu Tyr Arg His Ile Gly Ala Asp Cys

145 150 155 160

Asp Val Pro Ala Gly Asp Ile Gly Val Gly Ala Arg Glu Ile Gly Tyr

165 170 175

Met Phe Gly Gln Tyr Lys Arg Leu Ala Asn Gln Phe Thr Ser Val Leu

180 185 190

Thr Gly Lys Gly Met Thr Tyr Gly Gly Phe Arg Pro Glu Ala Thr Gly

195 200 205

Tyr Gly Cys Val Tyr Phe Ala Glu Glu Met Leu Lys Arg Gln Gly Gln

210 215 220

Arg Ile Asp Gly Arg Arg Val Ala Ile Ser Gly Ser Gly Asn Val Ala

225 230 235 240

Gln Tyr Ala Ala Arg Lys Val Met Asp Leu Gly Gly Lys Val Ile Ser

245 250 255

Leu Ser Asp Ser Glu Gly Thr Leu Tyr Ala Glu Ala Gly Leu Thr Asp

260 265 270

Ala Gln Trp Glu Ala Val Met Thr Leu Lys Asn Val Lys Arg Gly Arg

275 280 285

Ile Ser Glu Leu Ala Gly Gln Phe Gly Leu Glu Phe Arg Lys Gly Gln

290 295 300

Thr Pro Trp Ser Leu Ala Cys Asp Ile Ala Leu Pro Cys Ala Thr Gln

305 310 315 320

Asn Glu Leu Asp Val Glu Asp Ala Lys Ala Leu Leu Ala Asn Gly Cys

325 330 335

Ile Cys Val Ala Glu Gly Ala Asn Met Pro Thr Thr Leu Ala Ala Val

340 345 350

Asp Ile Phe Leu Glu Ala Gly Ile Leu Tyr Ala Pro Gly Lys Ala Ser

355 360 365

Asn Ala Gly Gly Val Ala Val Ser Gly Leu Glu Met Ser Gln Asn Ala

370 375 380

Met Arg Leu Leu Trp Thr Ala Gly Glu Val Asp Ser Lys Leu His Gly

385 390 395 400

Ile Met Gln Ser Ile His His Ala Cys Val His Tyr Gly Glu Glu Gly

405 410 415

Asp Gly Arg Val Asn Tyr Val Lys Gly Ala Asn Ile Ala Gly Phe Val

420 425 430

Lys Val Ala Asp Ala Met Leu Ala Gln Gly Val Val

435 440

<210> 3

<211> 813

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

atgggttata attctctgaa aggcaaagtc gcgattgtta ctggtggtag catgggcatt 60

ggcgaagcga tcatccgtcg ctatgcagaa gaaggcatgc gcgttgttat caactatcgt 120

agccatccgg aggaagccaa aaagatcgcc gaagatatta aacaggcagg tggtgaagcc 180

ctgaccgtcc agggtgacgt ttctaaagag gaagacatga tcaacctggt gaaacagact 240

gttgatcact tcggtcagct ggacgtcttt gtgaacaacg ctggcgttga gatgccttct 300

ccgtcccacg aaatgtccct ggaagactgg cagaaagtga tcgatgttaa tctgacgggt 360

gcgttcctgg gcgctcgtga agctctgaaa tacttcgttg aacataacgt gaaaggcaac 420

attatcaata tgtctagcgt ccacgaaatc atcccgtggc ctactttcgt acattacgct 480

gcttctaagg gtggcgttaa actgatgacc cagactctgg ctatggaata tgcaccgaaa 540

ggtatccgca ttaacgctat cggtccaggc gcgatcaaca ctccaattaa tgcagaaaaa 600

ttcgaggatc cgaaacagcg tgcagacgtg gaaagcatga tcccgatggg caacatcggc 660

aagccagagg agatttccgc tgtcgcggca tggctggctt ctgacgaagc gtcttacgtt 720

accggcatca ccctgttcgc agatggtggc atgaccctgt acccgagctt tcaggctggc 780

cgtggtctcg agcaccacca ccaccaccac tga 813

<210> 4

<211> 270

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

Met Gly Tyr Asn Ser Leu Lys Gly Lys Val Ala Ile Val Thr Gly Gly

1 5 10 15

Ser Met Gly Ile Gly Glu Ala Ile Ile Arg Arg Tyr Ala Glu Glu Gly

20 25 30

Met Arg Val Val Ile Asn Tyr Arg Ser His Pro Glu Glu Ala Lys Lys

35 40 45

Ile Ala Glu Asp Ile Lys Gln Ala Gly Gly Glu Ala Leu Thr Val Gln

50 55 60

Gly Asp Val Ser Lys Glu Glu Asp Met Ile Asn Leu Val Lys Gln Thr

65 70 75 80

Val Asp His Phe Gly Gln Leu Asp Val Phe Val Asn Asn Ala Gly Val

85 90 95

Glu Met Pro Ser Pro Ser His Glu Met Ser Leu Glu Asp Trp Gln Lys

100 105 110

Val Ile Asp Val Asn Leu Thr Gly Ala Phe Leu Gly Ala Arg Glu Ala

115 120 125

Leu Lys Tyr Phe Val Glu His Asn Val Lys Gly Asn Ile Ile Asn Met

130 135 140

Ser Ser Val His Glu Ile Ile Pro Trp Pro Thr Phe Val His Tyr Ala

145 150 155 160

Ala Ser Lys Gly Gly Val Lys Leu Met Thr Gln Thr Leu Ala Met Glu

165 170 175

Tyr Ala Pro Lys Gly Ile Arg Ile Asn Ala Ile Gly Pro Gly Ala Ile

180 185 190

Asn Thr Pro Ile Asn Ala Glu Lys Phe Glu Asp Pro Lys Gln Arg Ala

195 200 205

Asp Val Glu Ser Met Ile Pro Met Gly Asn Ile Gly Lys Pro Glu Glu

210 215 220

Ile Ser Ala Val Ala Ala Trp Leu Ala Ser Asp Glu Ala Ser Tyr Val

225 230 235 240

Thr Gly Ile Thr Leu Phe Ala Asp Gly Gly Met Thr Leu Tyr Pro Ser

245 250 255

Phe Gln Ala Gly Arg Gly Leu Glu His His His His His His

260 265 270

<210> 5

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (16)..(17)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 5

gcaatcggtc cttacnnkgg cggtcttcgt tttc 34

<210> 6

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (18)..(19)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 6

gaaaacgaag accgccmnng taaggaccga ttgc 34

<210> 7

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(20)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 7

gcaatcggtc cttacaaann kggtcttcgt tttcaccc 38

<210> 8

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(20)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 8

gggtgaaaac gaagaccmnn tttgtaagga ccgattgc 38

<210> 9

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (16)..(17)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 9

ggaggggtcg ctgtgnnkgg attggaaatg tctc 34

<210> 10

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (18)..(19)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 10

gagacatttc caatccmnnc acagcgaccc ctcc 34

<210> 11

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 11

gcaatcggtc cttacaaacc aggtcttcgt tttcaccc 38

<210> 12

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 12

gggtgaaaac gaagacctgg tttgtaagga ccgattgc 38

<210> 13

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 13

ggaggggtcg ctgtgagggg attggaaatg tctc 34

<210> 14

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 14

gagacatttc caatcccctc acagcgaccc ctcc 34

Claims (10)

1.一种草铵膦脱氢酶突变体，其特征在于，所述草铵膦脱氢酶突变体由SEQ ID No.2所示氨基酸的第90位、第91位和第376位进行单突变或多突变获得；

其中，第90位的赖氨酸突变为丝氨酸；第91位甘氨酸突变为丝氨酸或脯氨酸；第376位的丝氨酸突变为精氨酸。

2.如权利要求1所述的草铵膦脱氢酶突变体，其特征在于，所述草铵膦脱氢酶突变体为下列之一：

(1)将SEQ ID No.2所示氨基酸第90位的赖氨酸突变为丝氨酸；

(2)将SEQ ID No.2所示氨基酸第91位甘氨酸突变为脯氨酸；

(3)将SEQ ID No.2所示氨基酸第376位的丝氨酸突变为精氨酸；

(4)将SEQ ID No.2所示氨基酸第90位的赖氨酸突变为丝氨酸，同时第91位甘氨酸突变为丝氨酸或脯氨酸；

(5)将SEQ ID No.2所示氨基酸第90位的赖氨酸突变为丝氨酸，第91位的甘氨酸突变为丝氨酸或脯氨酸，同时第376位的丝氨酸突变为精氨酸。

3.如权利要求1所述的草铵膦脱氢酶突变体，其特征在于，将SEQ ID No.2所示氨基酸第90位的赖氨酸突变为丝氨酸，第91位的甘氨酸突变为脯氨酸或丝氨酸，同时第376位的丝氨酸突变为精氨酸。

4.一种如权利要求1～3任一项所述草铵膦脱氢酶突变体的编码基因。

5.一种包含权利要求4所述编码基因的基因工程菌。

6.如权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，还包括葡萄糖脱氢酶基因。

7.如权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，所述葡萄糖脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

8.如权利要求1～3任一项所述的草铵膦脱氢酶突变体在不对称还原2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸制备L-草铵膦中的应用。

9.如权利要求5～7任一项所述的基因工程菌在不对称还原2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸制备L-草铵膦中的应用。

10.一种不对称还原2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸制备L-草铵膦的方法，包括：以2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸为底物，葡萄糖为辅助底物，在催化剂的作用下，进行反应，得到L-草铵膦；

其特征在于，

所述催化剂为同时包含草铵膦脱氢酶突变体基因和葡萄糖脱氢酶基因的共表达基因工程菌、共表达基因工程菌的粗酶液或固定化的共表达工程菌；

或者，所述催化剂由催化剂I和催化剂II组成；

催化剂I为草铵膦脱氢酶突变体、权利要求5～7任一项所述的基因工程菌，或者工程菌的粗酶液、固定化的所述基因工程菌；

催化剂II为葡萄糖脱氢酶、包含葡萄糖脱氢酶基因的基因工程菌、工程菌的粗酶液或固定化的包含葡萄糖脱氢酶基因的基因工程菌；

所述草铵膦脱氢酶突变体如权利要求1或2任一项所述；编码所述葡萄糖脱氢酶的基因的核苷酸序列为SEQ ID No.3所示。