CN109609474A

CN109609474A - 一种氨基酸脱氢酶突变体及其在合成l-草铵膦中的应用

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Publication number: CN109609474A
Application number: CN201811621667.8A
Authority: CN
Inventors: 薛亚平; 程峰; 李恒; 郑裕国; 徐建妙
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2018-12-28
Filing date: 2018-12-28
Publication date: 2019-04-12
Anticipated expiration: 2038-12-28
Also published as: WO2020133989A1; US20210071215A1; US11408016B2; CN109609474B

Abstract

本发明公开了一种氨基酸脱氢酶突变体及其在合成L‑草铵膦中的应用，所述氨基酸脱氢酶突变体是将SEQ ID No.2所示氨基酸第95位、108位、172位、303位进行单突变或多突变获得的。本发明制备的氨基酸脱氢酶突变体DyGDH‑F95I‑A108T‑R172P‑R303H的比酶活较母本醛酮还原酶提升了33倍，最大底物2‑羰基‑4‑(羟基甲基氧膦基)‑丁酸投料达到500mM，该氨基酸脱氢酶突变体更具工业应用前景。利用该氨基酸脱氢酶突变体生产L‑草铵膦，反应时间显著缩短，一般的过程需要20小时，而本发明的反应时间仅需要120分钟，这显示该氨基酸脱氢酶突变体具有很好的工业应用前景。

Description

一种氨基酸脱氢酶突变体及其在合成L-草铵膦中的应用

技术领域

本发明设计氨基酸脱氢酶突变体的构建DyGDH突变体的构建，开发氨基酸脱氢酶重组菌和酶在2-氨基-4-(羟基甲基氧膦基)-L-丁酸铵(俗称L-草铵膦)手性生物合成方面的应用。

背景技术

草铵膦是世界上第二大转基因作物耐受除草剂，由赫斯特公司(现归属拜耳公司)开发生产，属磷酸类除草剂，是谷氨酰胺合成酶抑制剂，非选择性(灭生性)触杀型除草剂。

草铵膦活性介于草甘膦和百草枯之间，具有高活性、低毒易降解、环境友好等优势；另外，它还可以用于筛选抗草铵膦的转基因作物，因此它应用十分广泛，普遍受到市场青睐，未来也将具有广阔的市场前景。

草铵膦由一对具有旋光性的对应异构体混合而成，可以拆分为左旋体(顺式构型D)和右旋体(反式构型L)，其中只有L-草铵膦具有杀虫活性，且在土壤中易分解，对环境的破坏力小。

氨基酸脱氢酶超家族是一类NAD(P)H依赖型的氧化还原酶，其家族成员多是多亚基聚合体，单个亚基分子量从40KDa-120KDa不等，每个亚基都具有两个结构域(底物结合结构域和辅酶结合结构域)。氨基酸脱氢酶的底物谱一般比较严格，且催化产物大多是L-构型的。

我们从蒙氏假单胞菌Pseudomonas monteiliiWP_060477601.1中克隆得到氨基酸脱氢酶基因，并在大肠杆菌(Escherichia coli)中实现该基因的异源过量表达，该酶能够催化2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸不对称胺化还原为L-草铵膦，但该酶对2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸的活力不够高，从而限制了其工业化应用。通过已报道的氨基酸脱氢酶晶体结构，利用分子模拟手段，确定该酶的空间结构和可能的与活性相关的氨基酸位点，通过定点突变技术提高了氨基酸脱氢酶对2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸的催化活力，将具有较强的工业应用价值。

发明内容

本发明目的是针对现有氨基酸脱氢酶对2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸不对称胺化还原活性不高及底物浓度低的问题，提供一种氨基酸脱氢酶突变体及利用该氨基酸脱氢酶突变体基因重组菌及其粗酶液作为生物催化剂，用于L-草铵膦手性生物合成，催化剂的活性提高了33倍，底物浓度提高了5倍。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种氨基酸脱氢酶突变体，所述氨基酸脱氢酶突变体是将SEQ IDNo.2所示氨基酸第95位、108位、172位、303位进行单突变或多突变获得的。SEQ ID No.2所示氨基酸为母本氨基酸脱氢酶DyGDH，其核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。

进一步，优选所述氨基酸脱氢酶突变体为下列之一：(1)将SEQ ID No.2所示氨基酸第95位苯丙氨酸突变为亮氨酸(DyGDH-F95L)或异亮氨酸(DyGDH-F95I)；(2)将SEQ IDNo.2所示氨基酸第95位苯丙氨酸突变为亮氨酸，同时将第108位丙氨酸突变为苏氨酸(DyGDH-F95L-A108T)、丝氨酸(DyGDH-F95L-A108S)或酪氨酸(DyGDH-F95L-A108Y)；(3)将SEQ ID No.2所示氨基酸第95位苯丙氨酸突变为异亮氨酸，且第172位精氨酸突变为脯氨酸(DyGDH-F95I–R172P)或缬氨酸(DyGDH-F95I–R172V)；(4)将SEQ ID No.2所示氨基酸第95位苯丙氨酸突变为异亮氨酸，同时第108丙氨酸突变为苏氨酸，且第172位精氨酸突变为脯氨酸(DyGDH-F95I–A108T-R172P)或缬氨酸(DyGDH-F95I-A108T-R172V)；(5)将SEQ ID No.2所示氨基酸第95位苯丙氨酸突变为异亮氨酸，同时第108位丙氨酸突变为酪氨酸，且第172位精氨酸突变为脯氨酸(DyGDH-F95I–A108Y-R172P)；(6)将SEQ ID No.2所示氨基酸第95位苯丙氨酸突变为异亮氨酸，同时第108位并按苏氨酸突变为苏氨酸，且第172位精氨酸突变为脯氨酸，第303位精氨酸突变为组氨酸(DyGDH-F95I–A108T-R172P-R303H)。

进一步，更所述氨基酸脱氢酶突变体是将SEQ ID No.2所示氨基酸第95位苯丙氨酸突变为异亮氨酸，同时第108位并按苏氨酸突变为苏氨酸，且第172位精氨酸突变为脯氨酸，第303位精氨酸突变为组氨酸(DyGDH-F95I-A108T-R172P-R303H)。

本发明还涉及氨基酸脱氢酶突变体的编码基因、重组载体及工程菌。优选重组表达载体pETDEut；宿主细胞优选大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，通过蛋白诱导表达、细胞破碎获得粗酶液，催化特性均优于母本氨基酸脱氢酶。

本发明还涉及氨基酸脱氢酶突变体编码基因在制备氨基酸脱氢酶中的应用，所述应用为：构建含所述氨基酸脱氢酶突变体基因的重组载体，将所述重组载体转化至宿主菌(优选大肠杆菌)，获得重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离得到含有重组氨基酸脱氢酶的菌体细胞，与野生型氨基酸脱氢酶相比，具有更高的催化活性。

本发明还提供一种所述氨基酸脱氢酶突变体在不对称胺化还原2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸制备L-草铵膦中的应用，具体所述的应用方法为：将含氨基酸脱氢酶突变体基因的重组基因工程菌经诱导获得的湿菌体和含葡萄糖脱氢酶基因的工程菌经诱导培养获得的湿菌体混合后用pH7.4、100mM的磷酸盐缓冲液重悬，经过超声破碎、离心后取上清液为催化剂，以2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸为底物，以葡萄糖为辅底物构成反应体系，在35℃、400-600转/分钟条件下进行反应，反应结束，反应液分离纯化，获得L-草铵膦；所述葡萄糖脱氢酶基因核苷酸序列为SEQ ID No.3(所示编码蛋白氨基酸序列为SEQ IDNo.4)。

进一步，所述反应体系中，2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸终浓度300-500mM(优选500mM)，葡萄糖终浓度450-750mM(优选750mM)，催化剂用量以破碎前湿菌体总量计为50-100g/L(优选75-80g/L)，含氨基酸脱氢酶突变体基因的重组基因工程菌经转接诱导培养获得的湿菌体和含葡萄糖脱氢酶基因的工程菌经诱导培养获得的湿菌体以质量比3:1混合。

进一步，所述含氨基酸脱氢酶突变体基因的重组基因工程菌湿菌体按如下方法制备：将含氨基酸脱氢酶突变体基因的重组基因工程菌接种到含终浓度50μg/mL氨苄霉素的LB液体培养基中，37℃培养8小时，以体积浓度2％的接种量接种到新鲜的含终浓度50μg/mL氨苄霉素的LB液体培养基中，37℃、180转/分钟培养1.5小时，再向培养液中加入终浓度为0.1mMIPTG，18℃培养20小时后，4℃、8000转/分钟离心10分钟，获得含氨基酸脱氢酶的湿菌体，

进一步，所述含葡萄糖脱氢酶基因的工程菌湿菌体按如下方法制备：将所述含葡萄糖脱氢酶基因的工程菌接种到含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养9小时，以体积浓度2％的接种量接种到新鲜的含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、180转/分钟培养1.5小时，再向培养液中加入终浓度为0.1mM IPTG，28℃培养10小时后，4℃、8000转/分钟离心10分钟，获得含葡萄糖脱氢酶的湿菌体。

进一步，所述超声破碎条件为：将含氨基酸脱氢酶突变体基因的重组基因工程菌经诱导培养获得的湿菌体和含葡萄糖脱氢酶基因的工程菌经诱导培养获得的湿菌体混合后用pH 7.4、100mM磷酸盐缓冲液重悬，在冰水混合物上超声破碎15分钟，超声破碎条件：功率为400W，破碎1秒、暂停5秒。

本发明氨基酸脱氢酶母本DyGDH及氨基酸脱氢酶突变体碱基序列全长均为1341bp，从第一个碱基起至第1341个碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。

本发明所述氨基酸脱氢酶突变体的获取是采用定点饱和突变技术，使用该技术对所述SEQ ID No.2氨基酸脱氢酶基因进行突变，将获得的突变质粒以热击方式转入E.coliBL21(DE3)感受态细胞，对获得菌株进行接种、转接、诱导菌体回收，利用粗酶液催化2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸制备L-草铵膦，具体方法如下：第一步将原始菌活化，获得了母本E.coli BL21(DE3)pETDEut-dygdh，提取质粒模板pETDEut-dygdh，并保存待用。第二步通过NCBI与DyGDH比较，获得同源建模的模板蛋白PDB编号，在PDB数据库中查找模板蛋白晶体结构，利用Modeller9.20同源建模，并进行分子对接，选择合适的突变位点，选点主要是催化位点附近和底物结合口袋附近的氨基酸残基，设计突变的引物，以pETDEut-dygdh为模板质粒，进行突变PCR，获得突变质粒，并转化，进行优势突变菌的筛选，将优势突变体测序检测并保存。

本发明氨基酸脱氢酶突变体和葡萄糖脱氢酶基因工程菌的接种、转接、诱导、菌体回收，培养基可为本领域任何可使菌体生长并产生本发明的培养基，优选LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，蒸馏水溶解，pH 7.0。培养方法和培养条件没有特殊的限制，培养方法和条件可以根据宿主类型和培养方法等因素的不同按本领域普通知识进行适当的选择。所述葡萄糖脱氢酶来源于Exiguobacteriumsibiricum，葡萄糖脱氢酶基因序列号(GenBank：No.KM817194.1)，所用载体pET-28b(+)，构建重组表达载体pET-28b(+)-esgdh。

与现有技术相比，本发明主要的有益效果主要体现在：

1.本发明制备的氨基酸脱氢酶突变体DyGDH-F95I-A108T-R172P-R303H的比酶活较母本醛酮还原酶提升了33倍，最大底物2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸投料达到500mM，该氨基酸脱氢酶突变体更具工业应用前景。

2.利用该氨基酸脱氢酶突变体生产L-草铵膦，反应时间显著缩短，一般的过程需要20小时，而本发明的反应时间仅需要120分钟，这显示该氨基酸脱氢酶突变体具有很好的工业应用前景。

附图说明：

图1是氨基酸脱氢酶突变体DyGDH-F95I-A108T-R172P-R303H与葡萄糖脱氢酶偶联催化2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸不对称胺化还原制备L-草铵膦的反应示意图。

图2是氨基酸脱氢酶定点饱和突变的核酸电泳图。M：标准核酸分子量；泳道1：pETDEut-dygdh；泳道2：pETDEut-dygdh-F95L；泳道3：pETDEut-dygdh-A108T；泳道4：pETDEut-dygdh-R172P；泳道5：pETDEut-dygdh-R303H；泳道6：pETDEut-dygdh-F95L-A108T；泳道7：pETDEut-dygdh-F95L-A108T-R172P；

泳道8：pETDEut-dygdh-F95L-A108T-R172P-R303H。

图3是氨基酸脱氢酶突变体粗酶液(A)和纯酶液(B)的SDS-PAGE图。M：标准蛋白分子量；泳道1：母本氨基酸脱氢酶；泳道2：pDyGDH-F95L；泳道3：pDyGDH-A108T；泳道4：pDyGDH-R172P；泳道5：pDyGDH-R303H；泳道6：pDyGDH-F95L-A108T；泳道7：

pDyGDH-F95L-A108T-R172P；泳道8：pDyGDH-F95L-A108T-R172P-R303H。

图4是利用氨基酸脱氢酶突变体pDyGDH-F95L-A108T-R172P-R303H

偶联EsGDH不对称胺化还原2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸制备L-草铵膦时间进程图。

具体实施方式：

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述。

实施例1：氨基酸脱氢酶突变体文库的构建及筛选

将从蒙氏假单胞菌Pseudomonas monteiliiWP_060477601.1中克隆得到的氨基酸脱氢酶基因(核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，氨基酸序列SEQ ID No.2所示)构建表达载体pETDEut-dygdh，转化大肠杆菌，获得出发菌株E.coli BL21(DE3)/pETDEut-dygdh。

氨基酸脱氢酶突变体文库的制备通过4轮定点饱和突变来实现，引物设计如表1，第一轮，以载体pETDEut-dygdh为模板，以表1中F95F和F95R为引物，经饱和突变PCR，将SEQID No.2所示氨基酸脱氢酶氨基酸序列的第95位苯丙氨酸突变为其余19种氨基酸，并转化，涂平板，通过优势菌株筛选获得氨基酸脱氢酶突变体pDyGDH-F95L。第二轮以突变体pDyGDH-F95L为模板，以表1中A108F和A108R为引物，经饱和突变PCR，转化，涂平板，通过优势菌株筛选获得氨基酸脱氢酶突变体pDyGDH-F95L-A108T。第三轮以突变体pDyGDH-F95L-A108T为模板，以表1中R172F和R172R为引物，经饱和突变PCR，转化，涂平板，通过优势菌株筛选获得氨基酸脱氢酶突变体pDyGDH-F95L-A108T-R172P。第四轮以突变体pDyGDH-F95L-A108T-R172P为模板，以表1中R303F和R303R为引物，经饱和突变PCR，转化，涂平板，通过优势菌株筛选获得氨基酸脱氢酶突变体pDyGDH-F95L-A108T-R172P-R303H，后期实验中其余优势单突变体pDyGDH-A108T，pDyGDH-R172P，pDYGDH-R303H均由同样方法构建。

突变PCR体系(100μL)为：2倍Phanta Max缓冲液25μL，dNTPs 1μL，突变上下引物各1μL，模板1μL，Phanta Super-Fidelity DNA聚合酶0.5μL，补ddH₂O至50μL。PCR条件为：95℃预变性5分钟，经30个循环：90℃30秒，62℃30秒，72℃7分钟，最后72℃终延伸5分钟。PCR结果分别进行DNA琼脂糖凝胶电泳阳性验证，将PCR产物进行DpnI酶消化模板，37℃，1小时，220转/分钟，65℃，1分钟灭活，将PCR产物热击转化，并将大肠杆菌E.coli BL21(DE3)活化，置于37℃、220转/分钟，培养1小时，涂布于含50μg/mL氨苄霉素抗性的LB平板上，37℃倒置培养过夜，对获得的突变体进行优势突变体的筛选，将获得优势菌株送杭州擎科生物技术有限公司进行测序确认，并保存。

表1氨基酸脱氢酶定点饱和突变引物设计

实施例2：氨基酸脱氢酶母本、突变体和葡萄糖脱氢酶的诱导表达

从Exiguobacteriumsibiricum中克隆得到的葡萄糖脱氢酶基因esgdh(核苷酸序列为SEQ IDNo.3所示，氨基酸序列为SEQ ID No.4所示)，并通过双酶切连到pET-28b(+)载体上，将该重组质粒导入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，获得重组葡萄糖脱氢酶菌株E.coliBL21(DE3)/pET28b-esgdh。

将实施例1出发菌株E.coli BL21(DE3)/pETDEut-dygdh和氨基酸脱氢酶突变菌株分别接种到含有含终浓度50μg/mL氨苄霉素的LB液体培养基中，37℃培养8小时，以体积浓度2％的接种量接种到新鲜的含终浓度50μg/mL氨苄霉素的LB液体培养基中，37℃、180转/分钟培养1.5小时，再向培养液中加入终浓度为0.1mM IPTG，18℃培养20小时后，4℃、8000转/分钟离心10分钟，获得相应的湿菌体。

将重组葡萄糖脱氢酶菌株E.coli BL21(DE3)/pET28b-esgdh接种到含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养9小时，以体积浓度2％的接种量接种到新鲜的含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、180转/分钟培养1.5小时，再向培养液中加入终浓度为0.1mM IPTG，28℃培养10小时后，4℃、8000转/分钟离心10分钟，获得含葡萄糖脱氢酶的湿菌体。

以上获得的细胞产有相应的蛋白，可用于蛋白纯酶液的制备，也可用于粗酶液催化不对称胺化还原2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸制备L-草铵膦。

实施例3：突变文库筛选

将实施例2诱导表达的突变株湿菌体及葡萄糖脱氢酶湿菌体以质量比3:1混合，按照菌体总量50g/L的量加入pH 7.4、100mM磷酸盐缓冲液中重悬，在冰水混合物上超声破碎15分钟，超声破碎条件：功率为400W，破碎1秒、暂停5秒，获得突变株粗酶液。同样条件下，用出发菌株E.coli BL21(DE3)/pET2Deut-dygdh替换突变菌株湿菌体制备出发株粗酶液。

将突变株粗酶液或出发株粗酶液作为催化剂，以2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸为底物，以葡萄糖为辅助底物，不添加外源性NADPH或NADP+，运用菌体内源型NADPH，建立起辅酶循环系统。反应体系选择为10mL，催化剂用量以破碎前湿菌体总浓度计50g/L，底物终浓度300mM，葡萄糖终浓度450mM，30℃、600转/分钟反应10min取样，取反应液100μL，加5μL盐酸终止反应，以超纯水补足至1mL，即反应液稀释10倍，稀释后的样品先经过衍生化处理，取200μl稀释后的反应液+400μL衍生化试剂(含15mM邻苯二甲醛、15mM N-乙酰-L-半胱氨酸的pH9.8的硼酸缓冲液)30℃衍生化5min，再加400μL超纯水补足至1mL，12000转/分钟离心1分钟，取上清，过0.22μM微滤膜，作为液相样品，HPLC检测2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸、L-草铵膦、D-草铵膦及dep值。以产物L-草铵膦和e.e.为指标，筛选优势突变体，实验结果示于表2。

2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸液相检测条件：色谱柱C18(4.6×250mm，Acchrom,China)柱，流动相乙腈：50mM磷酸二氢铵溶液(pH3.8，含10％四丁基氢氧化铵)体积比为12:88。流速为1mL/min，检测波长为232nm，进样量10μL，柱温30℃，2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸保留时间为：9.7分钟。

草铵膦液相检测条件：色谱柱C18(4.6×250mm，Acchrom,China)柱，流动相甲醇:0.05M乙酸铵(pH5.7)体积比为10:90，流速1.0mL/min，检测波长Ex＝＝340nm、Em＝450nm，进样量10μL，柱温35℃。L-草铵膦、D-草铵膦、保留时间分别为：10.6分钟，12.6分钟。

表2pDyGDH及其突变体的催化性能和立体选择性

实施例4：氨基酸脱氢酶母本及其突变体的纯化

将实施例3获得的优势突变体(表2中pDyGDH-F95I，pDyGDH-A108T，

pDyGDH-R172P，pDyGDH-R303H，pDyGDH-F95I-A108T，

pDyGDH-F95I-A108T-R172P，pDyGDH-F95I-A108T-R172P-R303H)，根据实施例2所述方法获得氨基酸脱氢酶突变体湿菌体，分别用缓冲液A(含0.3M NaCl、30mM咪唑的pH8.0、50mM磷酸钠缓冲液)悬浮，超声破碎20分钟(冰浴，功率400W，破碎1秒、暂停5秒)，4℃、12000转/分钟离心20min，取上清。使用Ni亲和柱(1.6×10cm，Bio-Rad公司，美国)纯化突变体蛋白，具体操作如下：①用5倍柱体积的结合缓冲液(含0.3M NaCl的pH 8.0、50mM磷酸钠缓冲液)平衡Ni柱，至基线稳定；②样品上样，流速1mL/min，上样量在25-40mg/mL蛋白，使目标蛋白吸附于Ni柱上；③用6倍柱体积的缓冲液A(含0.3M NaCl、30mM咪唑的pH 8.0、50mM磷酸钠缓冲液)冲洗杂蛋白，流速1mL/min，至基线稳定；④用缓冲液B(含0.3M NaCl、500mM咪唑的pH 8.0、50mM磷酸钠缓冲液)洗脱，流速1mL/min，收集目的蛋白。将目的蛋白置于pH7.5、20mM磷酸盐缓冲液中透析过夜，获得纯化酶；⑤5倍柱体积的结合缓冲液(含0.3M NaCl的pH 8.0、50mM磷酸钠缓冲液)冲洗Ni柱直至基线稳定，用5倍柱体积含20％乙醇的超纯水保存Ni柱。

出发菌株E.coli BL21(DE3)/pETDEut-pdygdh的氨基酸脱氢酶纯酶采用相同条件收集。

实施例5：母本氨基酸脱氢酶及其突变体酶比酶活测定

酶活单位(U)定义为：在35℃、pH 7.4条件下，每分钟每生成1μmol的L-草铵膦所需的酶量定义为一个酶活单位，U。比酶活定义为每毫克酶蛋白所具有的活力单位数，U/mg。

酶活检测标准条件：100mM 2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸，10mM NADPH，0.02ug/uL的酶液，30℃、pH 7.4，600转/分钟条件下反应10分钟，样品处理并进行HPLC检测分析。

蛋白浓度用BCA蛋白测定试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司，南京)测定。

母本氨基酸脱氢酶及其突变体酶比酶活如表3所示。

表3突变体的相对酶活和差向对应异构体选择性(de_p)值

a：在标准条件下，pDyGDH的初始酶活指定为100％

实施例6：母本氨基酸脱氢酶及其突变体动力学参数测定

考察氨基酸脱氢酶及其突变的动力学参数，以2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸作为底物，浓度设置为2-10mM(2、4、6、8、10mM)，外源性辅酶NADPH浓度设置为1-5mM(1、2、3、4、5mM)，加入100uL的纯酶液(参见实施例4)。

反应体系选择为500μL，实施例4收集的纯酶液以pH7.4、100mM磷酸盐缓冲液稀释10倍取100μL，加入底物和外源性辅酶NADPH，pH 7.4、100mM磷酸盐缓冲液为反应介质，35℃、600转/分钟反应10min取样，取反应液HPLC检测L-草铵膦浓度(参见实施例4)。

根据氨基酸脱氢酶催化反应机制遵循顺序强制反应机制，通过双倒数作图可计算得出v_max、K_m ^A、K_m ^B，结果如表4所示，通过比较k_cat和K_m，可以发现，pDyGDH对2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸和NADPH的Km值分别是3.45mM、0.11mM，除突变体pDyGDH-A08T有所提升，其余突变体均有一定的下降，对2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸和NADPH的亲和力有增加趋势。突变体pDyGDH-F95I-A108T-R172P-R303H对2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸的催化效率k_cat/K_m ^B达到363.1s^-1·mM^-1，较母本(k_cat/K_m ^B＝12.41s^-1·mM^-1)提高29.3倍，对辅酶NADPH的催化效率达到14382.3s^-1·mM^-1，较母本(k_cat/K_m ^A＝385.67s^-1·mM^-1)提高37.3倍。

表4母本pDyGDH及其突变体动力学参数比较

实施例7：氨基酸脱氢酶突变体pDyGDH-F95I-A108T-R172P-R303H不对称胺化还原2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸

根据实施例2的描述，通过发酵获得氨基酸脱氢酶突变体pDyGDH-F95I-A108T-R172P-R303H菌体3g和葡萄糖脱氢酶EsGDH菌体1g混合，并用40mL、pH 7.4、磷酸缓冲液(100mM)重悬，在冰上破碎(超声破碎条件：功率400W，破1s，停5s)，取全部破碎混合液(即粗酶液)，加入终浓度500mM的2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸，终浓度750mM的葡萄糖构成反应体系50ml，在35℃、磁力搅拌转速为300rpm下进行反应，流加氨水使反应液pH维持在7.4。以实施例3所示液相方法检测反应过程中产物L-草铵膦的生成和e.e.值的变化，反应进程曲线如图4所示。该图显示，产物浓度随时间的推移而逐渐升高，120分钟内反应完成，底物转化率大于99％，产物e.e.值始终保持在99.5％以上。

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 一种氨基酸脱氢酶突变体及其在合成L-草铵膦中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1355

<212> DNA

<213> 蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)

<400> 1

gagctcatga ttgaaagcgt cgactcattt ttagcacgct tacaacaacg cgatccaggt 60

caacctgagt ttcaccaagc cgtggaggaa gttctgcgca cgttgtggcc gtttctggaa 120

gccaacccgc gctatttgca aagcggtatc ctggaacgta tggtcgagcc agaacgtgct 180

gtcttgtttc gcgtaagctg ggtagacgac caagggaaag ttcaggtgaa ccgtggttat 240

cgtattcaaa tgagcagcgc gattggaccc tataagggag gtttgcgttt tcacccttcc 300

gtgaatctga gtgtactgaa attcttggcc tttgaacaag tttttaaaaa ttcgctgact 360

tcccttccta tgggaggggg taagggggga tctgattttg atccgaaggg taaatctgac 420

gcggaggtaa tgcgcttttg ccaggcgttt atgtcggagt tgtaccgcca cattggggcg 480

gactgcgacg tgccagcggg ggatattgga gtaggagccc gcgagattgg gtttatgttc 540

ggacaataca agcgtttggc aaatcaattc acatcggttt tgaccgggaa agggatgacg 600

tatgggggca gtttaattcg tcctgaagca acgggatacg gttgcgtata cttcgcggag 660

gaaatgctta aacgtcaagg ccttcgcgta gatggccgcc gcgttgctat cagcggctct 720

gggaacgtcg ctcagtatgc agcgcgcaaa gtgatggact tgggcggcaa agtcatctct 780

ctttccgatt cggaaggtac cttatatgca gagggtgggt tgaccgaagc acaatgggaa 840

gcggtgatgc aattgaaaaa cgtagcgcgc ggacgcattt cagagcttgc tgaagccttc 900

ggtctggaat tccgcaaggg ccagactccg tggagcttac catgtgacat tgcattgccg 960

tgtgcgacgc aaaatgagct gggtatcgaa gatgcgcgca cccttcttcg caatggttgt 1020

atttgcgtgg ctgagggagc taatatgccg acgacgttgg ccgcggtgga cctgttcatc 1080

gacgctggta tcctttatgc accgggaaag gcaagtaacg ctggcggtgt ggccgtttcg 1140

gggttagaga tgagtcaaaa cgcgatgcgt cttctttgga cagcgggcga agtcgatagc 1200

aagttgcata atattatgca gtccattcac catgcctgtg ttcactatgg tgaggaggct 1260

gacggaaaag tgaattacgt taaaggagct aacattgcgg gctttgttaa agtcgccgac 1320

gcaatgcttg cccagggagt agtctaagcg gccgc 1355

<210> 2

<211> 446

<212> PRT

<213> 蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)

<400> 2

Met Ile Glu Ser Val Asp Ser Phe Leu Ala Arg Leu Gln Gln Arg Asp

1 5 10 15

Pro Gly Gln Pro Glu Phe His Gln Ala Val Glu Glu Val Leu Arg Thr

20 25 30

Leu Trp Pro Phe Leu Glu Ala Asn Pro Arg Tyr Leu Gln Ser Gly Ile

35 40 45

Leu Glu Arg Met Val Glu Pro Glu Arg Ala Val Leu Phe Arg Val Ser

50 55 60

Trp Val Asp Asp Gln Gly Lys Val Gln Val Asn Arg Gly Tyr Arg Ile

65 70 75 80

Gln Met Ser Ser Ala Ile Gly Pro Tyr Lys Gly Gly Leu Arg Phe His

85 90 95

Pro Ser Val Asn Leu Ser Val Leu Lys Phe Leu Ala Phe Glu Gln Val

100 105 110

Phe Lys Asn Ser Leu Thr Ser Leu Pro Met Gly Gly Gly Lys Gly Gly

115 120 125

Ser Asp Phe Asp Pro Lys Gly Lys Ser Asp Ala Glu Val Met Arg Phe

130 135 140

Cys Gln Ala Phe Met Ser Glu Leu Tyr Arg His Ile Gly Ala Asp Cys

145 150 155 160

Asp Val Pro Ala Gly Asp Ile Gly Val Gly Ala Arg Glu Ile Gly Phe

165 170 175

Met Phe Gly Gln Tyr Lys Arg Leu Ala Asn Gln Phe Thr Ser Val Leu

180 185 190

Thr Gly Lys Gly Met Thr Tyr Gly Gly Ser Leu Ile Arg Pro Glu Ala

195 200 205

Thr Gly Tyr Gly Cys Val Tyr Phe Ala Glu Glu Met Leu Lys Arg Gln

210 215 220

Gly Leu Arg Val Asp Gly Arg Arg Val Ala Ile Ser Gly Ser Gly Asn

225 230 235 240

Val Ala Gln Tyr Ala Ala Arg Lys Val Met Asp Leu Gly Gly Lys Val

245 250 255

Ile Ser Leu Ser Asp Ser Glu Gly Thr Leu Tyr Ala Glu Gly Gly Leu

260 265 270

Thr Glu Ala Gln Trp Glu Ala Val Met Gln Leu Lys Asn Val Ala Arg

275 280 285

Gly Arg Ile Ser Glu Leu Ala Glu Ala Phe Gly Leu Glu Phe Arg Lys

290 295 300

Gly Gln Thr Pro Trp Ser Leu Pro Cys Asp Ile Ala Leu Pro Cys Ala

305 310 315 320

Thr Gln Asn Glu Leu Gly Ile Glu Asp Ala Arg Thr Leu Leu Arg Asn

325 330 335

Gly Cys Ile Cys Val Ala Glu Gly Ala Asn Met Pro Thr Thr Leu Ala

340 345 350

Ala Val Asp Leu Phe Ile Asp Ala Gly Ile Leu Tyr Ala Pro Gly Lys

355 360 365

Ala Ser Asn Ala Gly Gly Val Ala Val Ser Gly Leu Glu Met Ser Gln

370 375 380

Asn Ala Met Arg Leu Leu Trp Thr Ala Gly Glu Val Asp Ser Lys Leu

385 390 395 400

His Asn Ile Met Gln Ser Ile His His Ala Cys Val His Tyr Gly Glu

405 410 415

Glu Ala Asp Gly Lys Val Asn Tyr Val Lys Gly Ala Asn Ile Ala Gly

420 425 430

Phe Val Lys Val Ala Asp Ala Met Leu Ala Gln Gly Val Val

435 440 445

<210> 3

<211> 789

<212> DNA

<213> 微小杆菌(Exiguobacteriumsibiricum)

<400> 3

atgggttata attctctgaa aggcaaagtc gcgattgtta ctggtggtag catgggcatt 60

ggcgaagcga tcatccgtcg ctatgcagaa gaaggcatgc gcgttgttat caactatcgt 120

agccatccgg aggaagccaa aaagatcgcc gaagatatta aacaggcagg tggtgaagcc 180

ctgaccgtcc agggtgacgt ttctaaagag gaagacatga tcaacctggt gaaacagact 240

gttgatcact tcggtcagct ggacgtcttt gtgaacaacg ctggcgttga gatgccttct 300

ccgtcccacg aaatgtccct ggaagactgg cagaaagtga tcgatgttaa tctgacgggt 360

gcgttcctgg gcgctcgtga agctctgaaa tacttcgttg aacataacgt gaaaggcaac 420

attatcaata tgtctagcgt ccacgaaatc atcccgtggc ctactttcgt acattacgct 480

gcttctaagg gtggcgttaa actgatgacc cagactctgg ctatggaata tgcaccgaaa 540

ggtatccgca ttaacgctat cggtccaggc gcgatcaaca ctccaattaa tgcagaaaaa 600

ttcgaggatc cgaaacagcg tgcagacgtg gaaagcatga tcccgatggg caacatcggc 660

aagccagagg agatttccgc tgtcgcggca tggctggctt ctgacgaagc gtcttacgtt 720

accggcatca ccctgttcgc agatggtggc atgaccctgt acccgagctt tcaggctggc 780

cgtggttga 789

<210> 4

<211> 262

<212> PRT

<213> 微小杆菌(Exiguobacteriumsibiricum)

<400> 4

Met Gly Tyr Asn Ser Leu Lys Gly Lys Val Ala Ile Val Thr Gly Gly

1 5 10 15

Ser Met Gly Ile Gly Glu Ala Ile Ile Arg Arg Tyr Ala Glu Glu Gly

20 25 30

Met Arg Val Val Ile Asn Tyr Arg Ser His Pro Glu Glu Ala Lys Lys

35 40 45

Ile Ala Glu Asp Ile Lys Gln Ala Gly Gly Glu Ala Leu Thr Val Gln

50 55 60

Gly Asp Val Ser Lys Glu Glu Asp Met Ile Asn Leu Val Lys Gln Thr

65 70 75 80

Val Asp His Phe Gly Gln Leu Asp Val Phe Val Asn Asn Ala Gly Val

85 90 95

Glu Met Pro Ser Pro Ser His Glu Met Ser Leu Glu Asp Trp Gln Lys

100 105 110

Val Ile Asp Val Asn Leu Thr Gly Ala Phe Leu Gly Ala Arg Glu Ala

115 120 125

Leu Lys Tyr Phe Val Glu His Asn Val Lys Gly Asn Ile Ile Asn Met

130 135 140

Ser Ser Val His Glu Ile Ile Pro Trp Pro Thr Phe Val His Tyr Ala

145 150 155 160

Ala Ser Lys Gly Gly Val Lys Leu Met Thr Gln Thr Leu Ala Met Glu

165 170 175

Tyr Ala Pro Lys Gly Ile Arg Ile Asn Ala Ile Gly Pro Gly Ala Ile

180 185 190

Asn Thr Pro Ile Asn Ala Glu Lys Phe Glu Asp Pro Lys Gln Arg Ala

195 200 205

Asp Val Glu Ser Met Ile Pro Met Gly Asn Ile Gly Lys Pro Glu Glu

210 215 220

Ile Ser Ala Val Ala Ala Trp Leu Ala Ser Asp Glu Ala Ser Tyr Val

225 230 235 240

Thr Gly Ile Thr Leu Phe Ala Asp Gly Gly Met Thr Leu Tyr Pro Ser

245 250 255

Phe Gln Ala Gly Arg Gly

260

Claims

1.一种氨基酸脱氢酶突变体，其特征在于所述氨基酸脱氢酶突变体是将SEQ ID No.2所示氨基酸第95位、108位、172位、303位进行单突变或多突变获得的。

2.如权利要求1所述氨基酸脱氢酶突变体，其特征在于所述氨基酸脱氢酶突变体为下列之一：(1)将SEQ ID No.2所示氨基酸第95位苯丙氨酸突变为亮氨酸或异亮氨酸；(2)将SEQ ID No.2所示氨基酸第95位苯丙氨酸突变为亮氨酸，同时将第108位丙氨酸突变为苏氨酸、丝氨酸或酪氨酸；(3)将SEQ ID No.2所示氨基酸第95位苯丙氨酸突变为异亮氨酸，且第172位精氨酸突变为脯氨酸或缬氨酸；(4)将SEQ ID No.2所示氨基酸第95位苯丙氨酸突变为异亮氨酸，同时第108丙氨酸突变为苏氨酸，且第172位精氨酸突变为脯氨酸或缬氨酸；(5)将SEQ ID No.2所示氨基酸第95位苯丙氨酸突变为异亮氨酸，同时第108位丙氨酸突变为酪氨酸，且第172位精氨酸突变为脯氨酸；(6)将SEQ ID No.2所示氨基酸第95位苯丙氨酸突变为异亮氨酸，同时第108位并按苏氨酸突变为苏氨酸，且第172位精氨酸突变为脯氨酸，第303位精氨酸突变为组氨酸。

3.如权利要求1所述氨基酸脱氢酶突变体，其特征在于所述氨基酸脱氢酶突变体是将SEQ ID No.2所示氨基酸第95位的苯丙氨酸取代为异亮氨酸、第108位的丙氨酸取代为苏氨酸、第172位的精氨酸取代为脯氨酸、第303位的精氨酸取代为组氨酸。

4.一种权利要求1所述氨基酸脱氢酶突变体的编码基因。

5.一种含权利要求4所述编辑基因的工程菌。

6.一种权利要求1所述氨基酸脱氢酶突变体在不对称胺化还原2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸制备L-草铵膦中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述的应用为：将含氨基酸脱氢酶突变体基因的重组基因工程菌经诱导获得的湿菌体和含葡萄糖脱氢酶基因的工程菌经诱导培养获得的湿菌体混合后用pH7.4、100mM的磷酸盐缓冲液重悬，经过超声破碎、离心后取上清液为催化剂，以2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸为底物，以葡萄糖为辅底物构成反应体系，在35℃、400-600转/分钟条件下进行反应，反应结束，反应液分离纯化，获得L-草铵膦。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述反应体系中，2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸终浓度300-500mM，葡萄糖终浓度450-750mM，催化剂用量以破碎前湿菌体总量计为50-100g/L，含氨基酸脱氢酶突变体基因的重组基因工程菌经转接诱导培养获得的湿菌体和含葡萄糖脱氢酶基因的工程菌经诱导培养获得的湿菌体以质量比3:1混合。

9.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述含氨基酸脱氢酶突变体基因的重组基因工程菌湿菌体按如下方法制备：将含氨基酸脱氢酶突变体基因的重组基因工程菌接种到含终浓度50μg/mL氨苄霉素的LB液体培养基中，37℃培养8小时，以体积浓度2％的接种量接种到新鲜的含终浓度50μg/mL氨苄霉素的LB液体培养基中，37℃、180转/分钟培养1.5小时，再向培养液中加入终浓度为0.1mM IPTG，18℃培养20小时后，4℃、8000转/分钟离心10分钟，获得含氨基酸脱氢酶的湿菌体；所述含葡萄糖脱氢酶基因的工程菌湿菌体按如下方法制备：将所述含葡萄糖脱氢酶基因的工程菌接种到含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养9小时，以体积浓度2％的接种量接种到新鲜的含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、180转/分钟培养1.5小时，再向培养液中加入终浓度为0.1mM IPTG，28℃培养10小时后，4℃、8000转/分钟离心10分钟，获得含葡萄糖脱氢酶的湿菌体。

10.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述超声破碎条件为：将含氨基酸脱氢酶突变体基因的重组基因工程菌经诱导培养获得的湿菌体和含葡萄糖脱氢酶基因的工程菌经诱导培养获得的湿菌体混合后用pH 7.4、100mM磷酸盐缓冲液重悬，在冰水混合物上超声破碎15分钟，超声破碎条件：功率为400W，破碎1秒、暂停5秒。