CN109609475A

CN109609475A - 草铵膦脱氢酶突变体及其合成l-草铵膦的应用

Info

Publication number: CN109609475A
Application number: CN201811621710.0A
Authority: CN
Inventors: 薛亚平; 程峰; 李清华; 郑裕国; 徐建妙
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2018-12-28
Filing date: 2018-12-28
Publication date: 2019-04-12
Anticipated expiration: 2038-12-28
Also published as: CN109609475B; WO2020133990A1; US20220090029A1

Abstract

本发明公开了一种草铵膦脱氢酶突变体及其合成L‑草铵膦的应用，该方法以2‑羰基‑4‑(羟基甲基膦酰基)丁酸或其盐为底物，在无机氨基供体及还原型辅酶存在的条件下，利用草铵膦脱氢酶或含有草铵膦脱氢酶的细胞作为生物催化剂，进行还原胺化反应，获得L‑草铵膦。本发明方法原料转化率和收率高，产物易于分离提纯且手性纯度较高；与其他催化工艺相比，工艺相对简单，原料转化率高达100％。

Description

草铵膦脱氢酶突变体及其合成L-草铵膦的应用

(一)技术领域

本发明涉及生物化工领域，涉及一种手性纯L-草铵膦的生产方法；是一种利用来源于微生物的草铵膦脱氢酶突变体生产光学纯L-草铵膦的方法。

(二)技术背景

草铵膦(glufosinate-ammonium)是世界第二大转基因作物耐受除草剂，由赫斯特公司(几经合并后现归属拜耳公司)开发生产，化学名称为4-[羟基(甲基)膦酰基]-DL-高丙氨酸，又称草铵膦铵盐、Basta、Buster等，属膦酸类除草剂，是谷氨酰胺合成酶抑制剂，非选择性(灭生性)触杀型除草剂。

目前，世界上的三大除草剂品种是草甘膦、草铵膦和百草枯，相对于百草枯和草甘膦，草铵膦具有优异的除草性能及较小的药害副作用，随着抗草铵膦转基因作物的快速发展，草铵膦在未来一段时间内市场需求巨大，前景非常广阔。

草铵膦有两种光学异构体，分别为L-草铵膦和D-草铵膦。但只有L-型具有生理活性，且在土壤中易分解，对人类和动物的毒性较小，除草谱广，对环境的破坏力小。

草铵膦有D、L两种对映异构体，但只有L-构型具有植物毒性，且在土壤中易分解，对人类和动物的毒性小，对环境的破坏力小。目前，市场上销售的草铵膦一般都是外消旋混合物。如果草铵膦产品能以L-构型的光学纯异构体形式使用，可使草铵膦的使用量降低50％，这对于提高原子经济性、降低成本、减轻环境压力都具有十分重要的意义。目前报道的L-草铵膦的方法主要有化学合成法，包括消旋草铵膦的拆分、手性原料法、手性辅基法和不对称催化法，但存在D-草铵膦不易消旋再利用、合成步骤冗长，反应需要超低温，产物ee值较低，收率低，且手性拆分试剂价格昂贵等问题。相比之下，生物合成法具有立体选择性严格、反应条件温和及产物易分离纯化的优点，因此探索生物法生产L-草铵膦的可行性具有十分重要的产业价值和显著的社会效益。

生物法生产L-草铵膦以起始原料和途径进行分类，主要包括以下3大类：

1)以L-草铵膦的衍生物为底物，通过酶法直接水解获得，主要的优点转化率高，产物ee值较高，但需要昂贵且不易获得的手性原料作为前体(Organophosphorus analoguesand derivatives or the natural L-amino carboxylic acids andpeptides.I.Enzymatic synthesis or D-,DL-,andL-phosphinothricin and theircyclicanalogues[J].BμLlchemsocjpn,1988,61(10):3699-3704.)。例如生物法制备L-草铵膦最简单的方法就是利用蛋白酶直接水解双丙氨膦。双丙氨膦是一种天然的三肽化合物，在蛋白酶的催化下，双丙氨膦脱去2分子L-丙氨酸，生成L-草铵膦。

2)以外消旋草铵膦的前提为底物，通过酶的选择性拆分获得。主要优点为原料相对易得，催化剂活力高，但其理论收率只能达到50％，会造成原料的浪费。Natchev报道了一种采用α-胰凝乳蛋白酶拆分双丙氨膦乙酯制备L-草铵膦的方法，该法首先经过3步反应将外消旋的草铵膦合成双丙氨膦二乙酯，接着用碱性mesinterico肽酶将其C端脂基水解。再经α-胰凝乳蛋白酶催化水解肽键(ChemInrormAbstract:Total Synthesis and Enzyme-Substrate Interaction or D-,DL-,and L-Phosphinotricine,“Bialaphos”(Sr-1293)and Its Cyclic Analogues[J].ChemInrorm,1989,1(17):125-131.)。在该步反应中，α-胰凝乳蛋白酶能选择性水解L-双丙氨膦乙酯，生成L-草铵膦乙脂。最后利用磷酸二脂酶水解P端酯基得到L-草铵膦。

3)以α-酮酸-2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸为底物，通过酶的不对称合成获得，主要涉及的酶包括转氨酶与草铵膦脱氢酶。早在研究草铵膦在土壤微生物体内的代谢途径时就已经发现，L-草铵膦在转氨酶的作用下，发生转氨作用被分解成一种α-酮酸-2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸(简称PPO)。SchμLz A等(Stereospeciric production orthe herbicide phosphinothricin(glurosinate)by transamination:isolation andcharacterization or a phosphinothricin-speciric transaminase from Escherichiacoli[J].Applied&Environmental Microbiology,1990,56(1):1-6.)在上世纪90年代就利用从大肠杆菌中克隆的转氨酶，以2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸为底物，L-谷氨酸作为氨基供体，催化转氨反应生产L-草铵膦。该在转氨酶经固定化并安装至生物反应器，催化制备L-草铵膦，其产物浓度可达76.1g/L，最高产率为50g/(L·h)，L-草铵膦的ee值超过99.9％。但利用转氨酶制备L-草铵膦有两大缺陷，其一是原料PPO不能完全转化为L-PPT，转化率最高只有90％；其二是要使可逆反应向生成L-PPT的方向进行，需要4倍当量以上的L-谷氨酸作为氨基供体，过量的谷氨酸给L-草铵膦的分离带来了很大的麻烦。

在诸多草铵膦的酶法合成路线中，酮酸中间体的酮羰基是潜手性官能团，能够通过酶法合成途径构建手性中心，酮酸路线也因原料价廉易得且可以避免使用剧毒氰化物，而成为适宜L-草铵膦工业化开发生产的路线。

草铵膦脱氢酶(EC 1.4.1.-，AADH)是一类能将氨基酸可逆的脱氨生成对应酮酸的酶，其反应需要核苷类辅酶的参与(NAD(P)+)。根据其底物特异性，可分为草铵膦脱氢酶、亮氨酸脱氢酶、丙氨酸脱氢酶、缬氨酸脱氢酶等。因其表现出的优良催化效率与选择性，草铵膦脱氢酶被广泛的应用于天然与非天然α-氨基酸的合成。例如，Li等利用亮氨酸脱氢酶制备L-叔亮氨酸，0.6M的底物能够在5.5H被完全转化，且其产物的ee值高达99％(Stereoselective synthesis or L-tert-leucine by a newly cloned leucinedehydrogenase from Exiguobacteriumsibiicum[J].Journal or Molecular CatalysisB Enzymatic,2014,105(7):11-17.)。Hanson等人利用草铵膦脱氢酶制备L-6-羟基正亮氨酸，其最终产率为91～97％，ee值大于99％(Enzymatic synthesis or L-6-hydroxynorleucine.[J].Bioorganic&Medicinal Chemistry,1999,7(10):2247-2252.)。

我们克隆了Pseudomonas moorei WP_090325311.1中的草铵膦脱氢酶基因，并在大肠杆菌(Escherichia coli)中实现该基因的异源表达，该酶能够催化2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸不对称胺化还原为L-草铵膦。但该野生酶对2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸的活力不够高，从而限制了其工业化应用。通过已报道的草铵膦脱氢酶晶体结构，利用分子模拟手段，确定该酶的空间结构和可能的与活性相关的草铵膦位点，通过定点突变技术提高了草铵膦脱氢酶对2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸的催化活力，将具有较强的工业应用价值。

(三)发明内容

本发明针对现有草铵膦脱氢酶对2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸不对称胺化还原活性不高及底物浓度低的问题，提供一种草铵膦脱氢酶突变体及利用该草铵膦脱氢酶突变体基因重组菌及其粗酶液作为生物催化剂，用于L-草铵膦手性生物合成，催化剂的活性提高了近10倍，底物浓度提高了5倍。最终完全催化90g/L的2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸生产L-草铵膦仅仅需要40分钟(转氨酶通常需要40小时)，且ee值大于99％。该方法原料转化率高、收率高、产物易于分离提纯。

本发明采用的技术方案：

本发明提供了一种草铵膦脱氢酶突变体，所述突变体突变体是将SEQ ID NO：6所示氨基酸序列第107位、第188位、第239位、第357位进行单突变或多位点突变获得的。

进一步，所述突变体为下列之一：第107位精氨酸突变为亮氨酸(R107L)、第107位精氨酸突变为亮氨酸+第188位脯氨酸突变为苯丙氨酸(R107L–P188F)、第107位精氨酸突变为亮氨酸+第239位赖氨酸突变为甘氨酸(R107L-K239G)、第107位精氨酸突变为亮氨酸+第188位脯氨酸突变为苯丙氨酸+第239位赖氨酸突变为酪氨酸(R107L-P188F-K239Y)、第107位精氨酸突变为亮氨酸+第188位脯氨酸突变为苯丙氨酸+第239位赖氨酸突变为半胱氨酸(R107L-P188F-K239C)、第107位精氨酸突变为亮氨酸+第188位脯氨酸突变为苯丙氨酸+第239位赖氨酸突变为甘氨酸(R107L-P188F-K239G)、第107位精氨酸突变为亮氨酸+第188位脯氨酸突变为苯丙氨酸+第239位赖氨酸突变为甘氨酸+第357位甘氨酸突变为苯丙氨酸(R107L-P188F-K239G-G357F)，更优选突变体为R107L-P188F-K239G-G357F。

本发明还涉及一种所述草铵膦脱氢酶突变体的编码基因及工程菌。

本发明还提供一种所述草铵膦脱氢酶突变体在催化2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸合成L-草铵膦中的应用，所述的应用以含草铵膦脱氢酶突变体基因和葡萄糖脱氢酶基因的重组工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体超声破碎提取的粗酶液为催化剂，以2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸为底物，以葡萄糖为辅助底物，加入无机氨基供体，于pH值为7.5的缓冲液中构成转化体系，在35℃、600rpm条件下反应，反应完全，将反应液分离纯化，获得L-草铵膦。所述转化体系中，催化剂的用量以湿菌体重量计为20～100g/L，所述底物的初始浓度为10～500mM，葡萄糖添加量为12-600mM，无机氨基供体添加量为50mM-1.5M；所述无机氨基供体优选为(NH₄)₂SO₄。

本发明反应体系中，催化剂的使用形式为细胞破碎后的粗酶液，也可以为表达重组酶的工程菌静息细胞，还可以采用纯化后的纯酶，或者是经固定化后的酶。

本发明所述催化剂按如下方法制备：将含有葡萄糖脱氢酶和草铵膦脱氢酶E3的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-PPTGDH E3-GDH接种至含有50μg/mL氨苄霉素抗性的LB液体培养基，37℃，200rpm下培养12h，再以1％(v/v)接种量接种至新鲜的含有50μg/mL氨苄霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃，150rpm下培养至菌体OD600达0.6-0.8，加入终浓度为24μg/mL的IPTG，18℃下诱导培养16h后，4℃、8000rpm离心20min，弃去上清液，收集沉淀，用pH 7.5、20mM磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤两次，即获得湿菌体；将湿菌体加入pH 7.5、100mM的PBS中重悬细胞，在冰水混合物上超声破碎10min，超声破碎条件：功率为400W，破碎1s，暂停5s，获得粗酶液。

本发明所述葡萄糖脱氢酶来源于西伯利亚杆菌(ExiguobacteFiumsibiFicum)，NCBI登录号为KM817194.1(核苷酸序列为SEQ ID NO.10所示)，通过双酶切连到pET-28b(+)载体上，将该重组质粒导入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，获得重组葡萄糖脱氢酶菌株E.coliBL21(DE3)/pET28b-GDH。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明方法以2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸或其盐为底物，在无机氨基供体与辅酶存在时，通过草铵膦脱氢酶催化底物发生氨化还原反应直接制备手性纯的L-草铵膦，催化剂的活性提高了近10倍，底物浓度提高了5倍。最终完全催化90g/L的2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸生产L-草铵膦仅仅需要40分钟(转氨酶通常需要40小时)，且ee值大于99％。该方法原料转化率高、收率高、产物易于分离提纯且手性纯度较高。

(2)本发明方法与转氨酶等催化工艺相比，工艺相对简单，原料转化率高，转化率可达100％，且获得的产物易于从反应液中分离提纯。

(四)附图说明

图1为利用草铵膦脱氢酶催化2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸不对称胺化还原制备L-草铵膦的反应示意图。

图2为利用草铵膦脱氢酶与辅酶再生酶双酶耦联催化2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸不对称胺化还原制备L-草铵膦的反应示意图。

图3为四种野生菌株的的反应进程图，底物浓度为100mmol/L，反应时间为24h。

图4为粗酶液SDS-PAGE图，M：标准蛋白分子量，泳道1：草铵膦脱氢酶BL21(DE3)/pETDuet-1-PPTGDHE3粗酶液，泳道2：草铵膦脱氢酶E3-葡萄糖脱氢酶重组菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-PPTGDHE3-GDH粗酶液，泳道3：葡萄糖脱氢酶E.coliBL21(DE3)/pET28b-GDH粗酶液。

图5为E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-PPTGDHE3-F107L-P188F-K239G-G357F的反应进程图。

(五)具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明做进一步描述。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。

本发明中的实验方法如无特别说明均为常规方法，基因克隆操作具体可参见J.萨姆布鲁克等编的《分子克隆实验指南》。

上游基因工程操作所用试剂：本发明实施例中使用的一步克隆试剂盒均购自Vazyme，南京诺唯赞生物科技有限公司；质粒提取试剂盒、DNA回收纯化试剂盒购自Axygen杭州有限公司；E.coli BL21(DE3)、质粒等购自上海生工；DNA marker、FastPfu DNA聚合酶、低分子量标准蛋白、琼脂糖电泳试剂、引物合成与基因测序工作由杭州擎科梓熙生物技术有限公司完成。以上试剂使用方法参考商品说明书。

下游催化工艺所用试剂：2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸(简称PPO)，D,L-草铵膦、L-草铵膦标准品购自Sigma-Aldrich公司；NADPH购于邦泰生物工程(深圳)有限公司；其他常用试剂购自国药集团化学试剂有限公司。

实施例1表达载体和工程菌的构建

通过文献报道和基因序列同源性，在NCBI数据库中挑选了4株脱氢酶，分别来源于Pseudomonas、Pseudomonas extremaustralis、Pseudomonas moorei和Pseudomonassaudiphocaensis，NCBI登录号为WP_092488511.1、WP_010562566.1、WP_090325311.1或WP_037025837.1，并进行全基因合成，分别获得源自Pseudomonas的草铵膦脱氢酶E1(核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示)、源自Pseudomonasextremaustralis的草铵膦脱氢酶E2(核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列为SEQID NO.4所示)、源自Pseudomonas moorei的草铵膦脱氢酶E3(核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示，氨基酸序列为SEQ ID NO.6所示)和源自Pseudomonas saudiphocaensis的草铵膦脱氢酶E4(核苷酸序列为SEQ ID NO.7所示，氨基酸序列为SEQ ID NO.8所示)四种草铵膦脱氢酶。

根据SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7所示核苷酸序列设计引物，并分别在引物中引入了Sac I和NotI限制性酶切位点：

E1上游引物：5’-GAGCTCATGATCGAATCCGTGGAATCA-3’；

E1下游引物：5’-GCGGCCGCTTACACGATTCCCTGGGCA-3’；

E2上游引物：5’-GAGCTCATGATCGAATCTGTCGAAAGT-3’；

E2下游引物：5’-GCGGCCGCTTATACAATGCCCTGAGCAAG-3’；

E3上游引物：5’-GAGCTCATGATTGAGAGCGTCGAGTCT-3’；

E3下游引物：5’-GCGGCCGCTTAGACGACCCCCTGTGCC-3’；

E4上游引物：5’-GAGCTCATGATCGAAACTGTTGATGCC-3’；

E4下游引物：5’-GCGGCCGCTTAAACGACTCCTTGGGCAAG-3’。

以pETDuet-1质粒为表达载体，构建大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-PPTGDH：

表达质粒的构建：在上述引物的引发下，分别以Pseudomonas、Pseudomonasextremaustralis、Pseudomonas moorei和Pseudomonas saudiphocaensis基因组为模板，以利用高保真Pfu DNA聚合酶进行扩增，分别获草铵膦脱氢酶E1、E2、E3和E4的基因序列，测序后利用Sac I和NotI限制性内切酶(TaKaRa)对扩增片段进行处理，并利用T4DNA连接酶(TaKaRa)将该片段同用相同的限制性内切酶处理的载体pETDuet-1进行连接，构建表达载体pETDuet-1-PPTGDHE1、pETDuet-1-PPTGDHE2、pETDuet-1-PPTGDHE3、pETDuet-1-PPTGDHE4。

重组大肠杆菌的构建：首先将储藏于-80℃的大肠杆菌BL21(DE3)(Invitrogen)感受态细胞在0℃冰浴10min，然后在超净台内分别加入5μL的质粒pETDuet-1-PPTGDHE1、pETDuet-1-PPTGDHE2、pETDuet-1-PPTGDHE3、pETDuet-1-PPTGDHE4，0℃冰浴30min，42℃水浴中热击90s，0℃冰浴2min，加入600μL的LB培养基，在37℃、200rpm摇床培养1h；涂布于含有50μg/ml氨苄霉素抗性的LB平板，37℃下培养8-12h，随机挑取克隆抽提质粒进行测序鉴定，筛选获得含有表达重组质粒的重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pETDuet-1-PPTGDHE1、E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-PPTGDHE2、E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-PPTGDHE3、E.coliBL21(DE3)/pETDuet-1-PPTGDHE4。

所述感受态细胞的制备：从-80℃冰箱中获得甘油管保藏的E.coli BL21(DE3)菌株，在无抗LB平板上划线，37℃培养10h，获取单菌落；挑取LB平板的单菌落，接种至含5mL的LB培养基的试管中，37℃、180rpm培养9h；从试管中取200μL菌液，接种到50mL的LB培养基中，37℃、180rpm培养OD600至0.4-0.6；将菌液在冰上预冷，取菌液至灭菌的离心管中，冰上放置10min，4℃、5000rpm离心10min；将上清液倒出，注意防止染菌，用预冷的0.1mol/L的CaCl₂水溶液重悬沉淀细胞，并在冰上放置30min；4℃、5000rpm离心10min，弃上清，用预冷的含15％甘油的0.1mol/L的CaCl₂水溶液重悬沉淀细胞，取100μL重悬细胞分装至灭菌的1.5mL离心管中，保藏于-80℃冰箱，需要时取出。

实施例2：草铵膦脱氢酶、葡萄糖脱氢酶的诱导表达、SDS-PAGE分析

1、含草铵膦脱氢酶的湿菌体：分别将实施例1获得的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-PPTGDHE1、E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-PPTGDHE2、E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-PPTGDHE3、E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-PPTGDHE4，接种至含有50μg/mL氨苄霉素抗性的LB液体培养基，37℃，200rpm下培养12h，再以1％(v/v)接种量接种至新鲜的含有50μg/mL氨苄霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃，150rpm下培养至菌体OD600达0.6-0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，18℃下诱导培养16h后，4℃、8000rpm离心20min，弃去上清液，收集沉淀，用pH 7.5、20mM磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤两次，即获得含草铵膦脱氢酶的大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-PPTGDHE1、E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-PPTGDHE2、E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-PPTGDHE3、E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-PPTGDHE4的湿菌体。

2、含葡萄糖脱氢酶的湿菌体：将来源于西伯利亚杆菌(ExiguobacteFiumsibiFicum)的葡萄糖脱氢酶基因(NCBI登录号为KM817194.1)，通过双酶切连到pET-28b(+)载体上，将该重组质粒导入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，获得重组葡萄糖脱氢酶菌株E.coli BL21(DE3)/pET28b-esgdh。将重组葡萄糖脱氢酶菌株E.coli BL21(DE3)/pET28b-esgdh接种到含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养9小时，作为种子液，以体积浓度3.5％的接种量接入装有3L发酵培养基的5L的发酵罐培养。首先将5L的发酵罐拆卸下来进行清洗，清洗完成后在发酵罐加入少量的水，安装完成后将接种口打开，将其放在灭菌锅中121℃，20min空消一次。空消完成后，将配好的培养基加入其中，出气口进气口包扎密封好，安装密封好，接种口打开，并和配好的乳糖诱导剂一同放入灭菌锅中115℃、30min灭菌(乳糖不能121℃灭菌)。将灭好菌的发酵罐拧上接种口，并安装到操作系统上，通上冷凝水和空气(进气管要安装除菌膜)，出气口插到锥形瓶液面以下，待灭菌锅降到37℃时，将火圈套在接种口上，将培养好的种子液接入到发酵罐中。在37℃，500rpm培养3-4h左右，菌种密度OD为6-8达到要求，将发酵罐温度降至28℃后，加入终浓度为16g/L的乳糖作为诱导剂加入，然后再28℃，500rpm培养12h。将养好的菌8000rpm离心10min，用pH7.5、20mM磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤两次，获得含葡萄糖脱氢酶GDH的湿菌体；所述发酵培养基组成：胰蛋白胨45g、酵母提取物36g、氯化钠30g、磷酸二氢钾4.08g、丙三醇(甘油)45g、三水合磷酸氢二钾6.84g、硫酸铵15g、硫酸镁1.125g、消泡剂4g，加入3L的蒸馏水进行溶解。

LB培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L，溶剂为水，pH7.4。

LB平板：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L，18g/L琼脂，溶剂为水，pH7.4。

3、标准酶活检测体系：25g/L湿菌体超声波破碎、100mM底物PPO、10mM辅酶NADPH、250mM(NH₄)₂SO₄，反应介质为pH 7.5磷酸盐缓冲液，总体系为400μL。单位酶活的定义：在标准的反应条件下，每分钟生成1μmol L-草铵膦所需要的酶量为一个酶活单位U。

按照上述标准酶活检测体系配置反应溶液，于35℃金属浴振荡反应器内反应10min，加入40μL 5M NaOH终止反应后置于冰上保存。样品稀释一定倍数后利用柱前衍生化高效液相检测其底物，L-草铵膦的浓度，并计算酶活，结果见表1。

高效液相色谱(HPLC)检测底物浓度，分析方法为：色谱柱型号：QS-C18，5μm，4.6×250mm。流动相：将50mM磷酸二氢胺溶于800mL超纯水中，加入10mL四丁基氢氧化铵(10％)用水稀释并定容至1000mL，用磷酸调pH到3.8，与乙腈以88:12混合。检测波长为232nm，流速：1.0mL/min。柱温：40℃，2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸出峰时间为：9.7分钟。

产物的手性分析及浓度分析通过柱前衍生化高效液相色谱进行，具体的分析方法为：

(1)色谱条件：色谱柱型号：QS-C18，5μm，4.6×250mm。流动相：50mM乙酸铵溶液：甲醇＝10:1。荧光检测波长：λex＝340nm，λem＝455nm。流速：1mL/min。柱温：30℃，L-草铵膦出峰时间为8.5min，D-草铵膦出峰时间为10.2min。

(2)衍生化试剂：分别称取0.1g邻苯二甲醛与0.12g N-乙酰-L-半胱氨酸，用10mL乙醇助溶，再加入40mL 0.1moL/L硼酸缓冲液(pH 9.8)，振荡使其充分溶解，4℃冰箱保存备用(不超过4天)。

(3)衍生化反应与测定：取100μL样品加入400μL衍生化试剂，在振荡器上500rpm，30℃震荡5min，再加入400μL超纯水混匀，进样10μL进行HPLC分析。

表1酶活测定结果：

通过酶活的测定，E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-PPTGDHE1的酶活为106.16U/g、E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-PPTGDHE2的为101.32U/g、E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-PPTGDHE3的酶活为180.37U/g、E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-PPTGDHE4的酶活为103.67U/g，目前E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-PPTGDHE3的酶活最高。

实施例3草铵膦脱氢酶催化PPO制备L-草铵膦

粗酶液：分别将实施例2方法制备的含草铵膦脱氢酶的湿菌体、含葡萄糖脱氢酶的湿菌体加入pH 7.5、100mM的PBS中重悬细胞，在冰水混合物上超声破碎10min，超声破碎条件：功率为400W，破碎1s，暂停5s，获得粗酶液。

在30mL PBS缓冲液(100mM、pH 7.5)中加入草铵膦脱氢酶粗酶液(菌体量为25g/L缓冲液)，2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸(终浓度100mmol/L)，无机氨基供体(NH₄)₂SO₄(终浓度500mM)，葡萄糖(终浓度120mmol/L)，NADPH(终浓度1mmol/L)，GDH粗酶液(菌体量为50g/L缓冲液)构成反应体系。35℃水浴反应24h，用氨水自动调节pH维持7.5恒定不变，每隔一段时间取样，采用实施例2方法计算底物转化率，E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-PPTGDHE1转化率65.5％、E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-PPTGDHE2转化率61.7％、E.coliBL21(DE3)/pETDuet-1-PPTGDHE3转化率69.4％、E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-PPTGDHE4转化率63.3％，产物ee值达99％以上，反应进程见图3。

经过酶活及反应进程的测定，最终选择E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-PPTGDHE3(WP_090325311.1)作为改造菌株，进行下一步的实验。

实施例4含有葡萄糖脱氢酶和草铵膦脱氢酶E3的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-PPTGDHE3-GDH

1、采用一步克隆法将葡萄糖脱氢酶克隆到质粒pETDuet-1的第二个多克隆位点上：

带有同源序列的葡糖糖脱氢酶基因的获得：将线性化载体开头和末端的各15-20bp序列作为同源序列，以E.coli BL21(DE3)/pET28b-GDH为模板，设计引物1、引物2，并将同源臂分别添加到基因特异性正/反向扩增引物序列的5’端，以此对带有同源臂的葡萄糖脱氢酶进行扩增，利用高保真Pfu DNA聚合酶进行扩增，将消化模板后的PCR产物，用DNA回收纯化试剂盒对其进行纯化回收，并分别测出核酸浓度，得到带有同源序列的葡萄糖脱氢酶基因序列，SEQ ID NO.10所示。

引物1：

5’-GAGATATACATGGCAGATCTCATGGGTTATAATTCTCTGAAAGGCAAAGTCGC-3’；

引物2：

5’-GTGGCAGCAGCCTAGGTTAATTAATCAACCACGGCCAGCCTGAAAGCTC-3’。

单片段同源重组反应：

最适克隆载体使用量＝{0.02*克隆载体碱基对数}ng(0.03pmol)

最适插入片段使用量＝{0.04*插入片段碱基对数}ng(0.06pmol)

反应体系：

组分	重组反应	阴性对照-1	阴性对照-2	阳性对照
					线性化载体	XμL	XμL	0μL	1μL
N个插入片段	Y<sub>1</sub>+Y<sub>2</sub>...+Y<sub>n</sub>μL	0μL	Y<sub>1</sub>+Y<sub>2</sub>...+Y<sub>n</sub>μL	1μL
					2*CLonExpressMIX	5μL	0μL	0μL	5μL
ddH<sub>2</sub>O	to 10μL	to 10μL	to 10μL	to 10μL

注：X表示加入线性化载体的量，Y表示插入片段的量。

将配置好的反应体系使用移液器轻轻吸打混匀，短暂离心后将反应液收集到管底。反应体系放在50℃的水浴中，静置5min，然后立即放在冰上冷却。将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)中(42℃，90s)，涂布于含有50μg/mL氨苄霉素抗性的LB平板，37℃下培养12-16h，随机挑取克隆抽提质粒进行测序鉴定，筛选获得含有葡萄糖脱氢酶和草铵膦脱氢酶E3的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-PPTGDHE3-GDH。同时进行蛋白质电泳验证，将湿菌体用pH 7.5、20mM磷酸盐缓冲液(PBS)悬浮，加入2x SDS-loading Buffer，沸水浴10min，进行SDS-PAGE分析。SDS-PAGE设置参数：电压120mV，电泳时间70min。鉴定结果如图4所示，从图中可以看出第二泳道的E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-PPTGDHE3-GDH表达蛋白在SDS-PAGE中的跑胶位置与目的蛋白分子量大小一致，同时与第一泳道E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-PPTGDHE3的表达蛋白和第三泳道的E.coli BL21(DE3)/pET28b-GDH的表达蛋白的位置一致，说明重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pETDuet-1-PPTGDHE3-GDH成功表达，蛋白胶图见附图4。

2、含草铵膦脱氢酶E3-葡萄糖脱氢酶的湿菌体及粗酶液的制备：将含有葡萄糖脱氢酶和草铵膦脱氢酶E3的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-PPTGDH E3-GDH接种至含有50μg/mL氨苄霉素抗性的LB液体培养基，37℃，200rpm下培养12h，再以1％(v/v)接种量接种至新鲜的含有50μg/mL氨苄霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃，150rpm下培养至菌体OD600达0.6-0.8，加入终浓度为24μg/mL的IPTG，18℃下诱导培养16h后，4℃、8000rpm离心20min，弃去上清液，收集沉淀，用pH 7.5、20mM磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤两次，即获得湿菌体。

将重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-PPTGDHE3-GDH湿菌体加入pH7.5、100mM的PBS中重悬细胞，在冰水混合物上超声破碎10min，超声破碎条件：功率为400W，破碎1s，暂停5s，获得粗酶液。

实施例5：草铵膦脱氢酶基因突变文库的建立

1、定点饱和突变

以实施例2构建的E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-PPTGDHE3-GDH为出发菌株。

氨基酸脱氢酶突变体文库的制备通过4轮定点饱和突变来实现，引物设计如表2，第一轮，以载体pETDuet-1-PPTGDHE3-GDH为模板，以表2中107F和107R为引物，经饱和突变PCR，将SEQ ID NO.6所示草铵膦脱氢酶E3氨基酸序列的第107位精氨酸突变为其余12种氨基酸，并转化，涂平板，通过优势菌株筛选获得草铵膦脱氢酶突变体pETDuet-1-PPTGDH E3-GDH-R107L。第二轮以突变体pETDuet-1-PPTGDH E3-GDH-R107L为模板，以表2中188F和188R为引物，经饱和突变PCR，转化，涂平板，通过优势菌株筛选获得草铵膦脱氢酶突变体pETDuet-1-PPTGDHE3-GDH-R107L-P188F。第三轮以突变体pETDuet-1-PPTGDHE3-GDH-R107L-P188F为模板，以表2中239F和239R为引物，经饱和突变PCF，转化，涂平板，通过优势菌株筛选获得氨基酸脱氢酶突变体pETDuet-1-PPTGDHE3-GDH-R107L-P188F-L239G。第四轮以突变体pETDuet-1-PPTGDHE3-GDH-R107L-P188F-L239G为模板，以表2中357F和357R为引物，经饱和突变PCR，转化，涂平板，通过优势菌株筛选获得草铵膦脱氢酶突变体pETDuet-1-PPTGDH E3-GDH-R107L-P188F-L239G-G357F。

突变PCR体系(100μL)为：2*Phanta Max缓冲液25μL，dNTPs 1μL，突变上下引物各1μL，模板1μL，Pfu DNA聚合酶0.5μL，补ddH₂O至50μL。PCR条件为：95℃预变性3min，经30个循环：95℃15s，60℃15s，72℃7min20s，最后72℃终延伸10min。PCR结果分别进行DNA琼脂糖凝胶电泳阳性验证，将PCR产物进行DpnI酶消化模板，37℃，1小时，200转/分钟，65℃，1分钟灭活，将PCR产物热击转化，并将大肠杆菌E.coliBL21(DE3)活化，置于37℃、200转/分钟，培养1小时，涂布于含50μg/mL氨苄霉素抗性的LB平板上，37℃倒置培养过夜，对获得的突变体进行优势突变体的筛选，将获得优势菌株送杭州擎科生物技术有限公司进行测序确认，并保存。

表2草铵膦脱氢酶定点饱和突变引物设计

实施例6：基因突变文库高通量筛选

一、草铵膦脱氢酶高通量筛选方法的建立

配制50mL工作液：邻苯二甲醛0.013g，N乙酰-L-半胱氨酸0.032g，用pH＝9.8硼酸缓冲液溶解定容到50mL，作为高通量工作液。用pH＝9.8硼酸缓冲液配置1mM外消旋草铵膦溶液50μL与50μL工作液震荡反应30s，再加入100μL ddH₂O。

二、高通量筛选

将实施例5获得的突变体文库转入大肠杆菌E.coLi BL21(DE3)的感受态细胞中，转化条件：将PCR产物加入到感受态细胞中，冰浴30min，热击温度42℃，热击90秒，在含有50μg/mL氨苄霉素的LB抗性平板上挑取单克隆，用灭菌的牙签挑取单菌落到灭好菌的96深孔板中，每孔有1mL含有50μg/mL氨苄抗性的LB培养基，在37℃、200rpm摇床上培养8h后，每孔吸取500μL的菌液，转移到另一每孔有500μL的含有氨苄和终浓度为24μg/mL IPTG诱导剂的LB培养基的96深孔板中，然后放在18℃、200rpm的摇床上培养16h后，离心，收取菌体于96孔板底。获得4576个含有突变体基因的重组大肠杆菌湿菌体，即突变体湿菌。

1、初筛：

配置反应液：终浓度10mM底物PPO(2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸)，50mM的无机氨基供体(NH₄)₂SO₄和12mM的葡萄糖，以pH7.5的磷酸缓冲液为反应介质构成反应液。96深孔板每孔加入500μL的反应液，同时用移液枪反复吹打，将96孔板收集的菌体重悬，然后将96深孔板放入35℃、200rpm的摇床上反应4小时后，离心取上清，测荧光值，λex＝340nm，λem＝455nm，筛选荧光值高于原始菌株的菌株。

2、复筛：

将初筛获得的菌株的粗酶液作为催化剂，以2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸为底物，以葡萄糖为辅助底物，不添加外源性NADPH或NADP+，运用菌体内源型NADPH，建立起辅酶循环系统。反应体系选择为10mL，催化剂用量以破碎前湿菌体总浓度计50g/L，底物终浓度300mM，葡萄糖终浓度450mM，无机氨基供体(NH₄)₂SO₄终浓度1M，30℃、600转/分钟反应10min取样，取反应液100μL，加5μL盐酸终止反应，以超纯水补足至1mL，即反应液稀释10倍，稀释后的样品先经过衍生化处理，取200μL稀释后的反应液加400μL衍生化试剂30℃衍生化5min，再加400μL超纯水补足至1mL，12000转/分钟离心1分钟，取上清，过0.22μM微滤膜，作为液相样品，HPLC检测2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸、L-草铵膦、D-草铵膦及ee值。以产物L-草铵膦和ee值为指标，筛选优势突变体，实验结果示于表3。

表3 PPTGDH及其突变体的催化性能和立体选择性

通过表3可以看出PPTGDH-R107L、PPTGDH-R107L–P188F、PPTGDH-R107L-K239G、PPTGDH-R107L-P188F-K239Y、PPTGDH-R107L-P188F-K239C、PPTGDH-R107L-P188F-K239G、PPTGDH-R107L-P188F-K239G-G357F突变株的L-草铵膦生成量明显高于原始菌株。

实施例7原始草铵膦脱氢酶及其突变体动力学参数测定

1.目的蛋白的纯化：将实施例6获得的优势突变体(PPTGDH-R107L、PPTGDH-R107L–P188F、PPTGDH-R107L-K239G、PPTGDH-R107L-P188F-K239Y、PPTGDH-R107L-P188F-K239C、PPTGDH-R107L-P188F-K239G、PPTGDH-R107L-P188F-K239G-G357F)以及PPT-GDHE3原始菌株，根据实施例2所述方法获得草铵膦脱氢酶突变体湿菌体，分别用缓冲液A(含0.3M NaCl、30mM咪唑的pH 8.0、50mM磷酸钠缓冲液)悬浮，超声破碎20分钟(冰浴，功率400W，破碎1秒、暂停5秒)，4℃、12000转/分钟离心20min，取上清。使用Ni亲和柱(1.6×10cm，Bio-Rad公司，美国)纯化突变体蛋白，具体操作如下：①用5倍柱体积的结合缓冲液(含0.3M NaCl的pH8.0、50mM磷酸钠缓冲液)平衡Ni柱，至基线稳定；②样品上样，流速1mL/min，上样量在25-40mg/mL蛋白，使目标蛋白吸附于Ni柱上；③用6倍柱体积的缓冲液A(含0.3M NaCl、30mM咪唑的pH 8.0、50mM磷酸钠缓冲液)冲洗杂蛋白，流速1mL/min，至基线稳定；④用缓冲液B(含0.3M NaCl、500mM咪唑的pH 8.0、50mM磷酸钠缓冲液)洗脱，流速1mL/min，收集目的蛋白。将目的蛋白置于pH 7.5、20mM磷酸盐缓冲液中透析过夜，获得草铵膦脱氢酶纯化酶；⑤5倍柱体积的结合缓冲液(含0.3M NaCl的pH 8.0、50mM磷酸钠缓冲液)冲洗Ni柱直至基线稳定，用5倍柱体积含20％乙醇的超纯水保存Ni柱。

2.考察草铵膦脱氢酶及其突变的动力学参数：以2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸作为底物，浓度设置为2-10mM(2、4、6、8、10mM)，外源性辅酶NADPH浓度设置为1-5mM(1、2、3、4、5mM)，无机氨基供体(NH₄)₂SO₄终浓度为10-50mM，分别加入一定量的草铵膦脱氢酶E3原始菌株PPTGDH以及突变体PPTGDH-R107L、PPTGDH-R107L–P188F、PPTGDH-R107L-K239G、PPTGDH-R107L-P188F-K239Y、PPTGDH-R107L-P188F-K239C、PPTGDH-R107L-P188F-K239G、PPTGDH-R107L-P188F-K239G-G357F纯酶液。

反应体系选择为500μL，收集的纯酶液用pH 7.5、100mM磷酸盐缓冲液稀释10倍取100μL，加入底物和外源性辅酶NADPH和无机氨基供体(NH₄)₂SO₄，pH 7.5、100mM磷酸盐缓冲液为反应介质，35℃、600转/分钟反应10min取样，取反应液HPLC检测L-草铵膦浓度。

根据草铵膦脱氢酶催化反应机制遵循顺序强制反应机制，通过双倒数作图可计算得出v_max、K_m ^A、K_m ^B，结果如表4所示，通过比较k_cat和K_m，可以发现，除突变体PPTGDH-G357F、PPTGDH-R107L-P188F有所提升，其余突变体均有一定的下降，对2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸和NADPH的亲和力有增加趋势。

表4原始菌株PPTGDH及其突变体动力学参数比较

从表4可以看出，突变体PPTGDH-F107L-P188F-K239G-G357F(氨基酸序列为SEQ IDNO.9所示)对2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸的催化效率kcat/Km达到337.73s^-1·mM^-1，较原始菌株(kcat/Km＝15.22s^-1·mM^-1)提高22.19倍，对辅酶NADPH的催化效率达到13703s^-1·mM^-1，较原始菌株(kcat/Km＝395.91s^-1·mM^-1)提高34.61倍。

实施例8：草铵膦脱氢酶突变体E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-PPTGDHE3-GDH-F107L-P188F-K239G-G357F不对称胺化还原2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸。

根据实施例4的方法，通过发酵获得氨基酸脱氢酶突变体菌体E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-PPTGDHE3-GDH-F107L-P188F-K239G-G357F 0.75g，加入终浓度500mM的2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸，终浓度750mM的葡萄糖，终浓度1.5M的无机氨基供体(NH₄)₂SO₄构成反应体系30ml，在35℃、磁力搅拌转速为500rpm下进行反应1h，流加氨水使反应液pH维持在7.5。通过液相方法检测反应过程中产物L-草铵膦的生成和ee值的变化，反应进程曲线如图5所示。该图显示，产物浓度随时间的推移而逐渐升高，40分钟内反应完成，底物转化率大于99％，产物ee值始终保持在99.5％以上。

由以上实验结果可知，本发明得到的含有草铵膦基因的重组大肠杆菌具有较强的催化能力，可以利用4-(甲基羟基磷酰基)-2-羰基-丁酸为底物，进行生物转化反应制备高光学纯的农药——L-草铵膦。

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 草铵膦脱氢酶突变体及其合成L-草铵膦的应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1338

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

atgatcgaat ccgtggaatc attcttagct cgcctgaaga agcgcgatcc cgaccaacca 60

gaatttcatc aagctgtcga ggaagtgctt cgtagcctgt ggcctttttt agaggccaac 120

ccgcactatc tggcatcggg gattttagaa cgcatttgcg aaccggaacg cgcaattact 180

tttcgcgttt catgggtaga cgatcatggc aaggtgcaag ttaatcgtgg gtttcgcatc 240

caaatgaata gcgcaatcgg accatacaaa gggggacttc gttttcatcc ttctgtaaat 300

ttaggggtac tgaaattttt ggcgttcgag cagacgttca agaattcact gacgtctctt 360

ccgatgggtg gcggtaaagg cgggagcgac tttgatccga aaggcaagtc cgacgcagaa 420

gtgatgcgtt tttgccaggc ttttatgtcc gagctgtatc gccatattgg agctgacgtg 480

gatgtcccgg ccggtgatat tggcgttggc gcacgcgaga ttggattttt atttggccaa 540

tataagcgtc tgtctaacca gtttacatcc gtgctgacag gaaaaggtat gacgtacggc 600

ggctctctta tccgccctga agctacgggc ttcggttgtg tgtactttgc agaggagatg 660

cttaaacgcg atgggcaacg tgtagagggt aagcgcgtgg ctgtcagtgg gagcgggaac 720

gtagcccaat acgccgcacg caaggtgatg gaccttggag ggaaagtgat tagtctttcc 780

gacagtgagg ggaccttgta tgctgaaagc ggtttgaccg aggaacaatg gtcagcgctg 840

ttagagctta agaatgtgca acgcgggcgt atttcggaac ttgcaggccg ctacggactt 900

gaatttcgcg ctggcaaaac tccgtgggag cttgcttgtg acatcgcttt gccttgcgcg 960

acacagaatg agcttgacgc cgaagcggct cgcacgttgt tacgtaatgg atgtatttgt 1020

gttgcagaag gtgctaacat gccaacgact ttagaggctg ttgacatttt tatcgaagcg 1080

gggatccttt tcgccccagg caaagctagt aacgctgggg gtgtagcggt ctctgggttg 1140

gaaatgtctc agaatgccat gcgcttattg tggaccgcag gtgaggtcga ctctaagtta 1200

cacaatatca tgcaaagtat ccatcacgca tgtgtacact acggggaaga gaatggccgc 1260

atcaactacg tgaaaggcgc gaatatcgcg ggattcgtaa aggtcgcaga cgctatgctt 1320

gcccagggaa tcgtgtaa 1338

<210> 2

<211> 445

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

Met Ile Glu Ser Val Glu Ser Phe Leu Ala Arg Leu Lys Lys Arg Asp

1 5 10 15

Pro Asp Gln Pro Glu Phe His Gln Ala Val Glu Glu Val Leu Arg Ser

20 25 30

Leu Trp Pro Phe Leu Glu Ala Asn Pro His Tyr Leu Ala Ser Gly Ile

35 40 45

Leu Glu Arg Ile Cys Glu Pro Glu Arg Ala Ile Thr Phe Arg Val Ser

50 55 60

Trp Val Asp Asp His Gly Lys Val Gln Val Asn Arg Gly Phe Arg Ile

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Ala Ile Gly Pro Tyr Lys Gly Gly Leu Arg Phe His

85 90 95

Pro Ser Val Asn Leu Gly Val Leu Lys Phe Leu Ala Phe Glu Gln Thr

100 105 110

Phe Lys Asn Ser Leu Thr Ser Leu Pro Met Gly Gly Gly Lys Gly Gly

115 120 125

Ser Asp Phe Asp Pro Lys Gly Lys Ser Asp Ala Glu Val Met Arg Phe

130 135 140

Cys Gln Ala Phe Met Ser Glu Leu Tyr Arg His Ile Gly Ala Asp Val

145 150 155 160

Asp Val Pro Ala Gly Asp Ile Gly Val Gly Ala Arg Glu Ile Gly Phe

165 170 175

Leu Phe Gly Gln Tyr Lys Arg Leu Ser Asn Gln Phe Thr Ser Val Leu

180 185 190

Thr Gly Lys Gly Met Thr Tyr Gly Gly Ser Leu Ile Arg Pro Glu Ala

195 200 205

Thr Gly Phe Gly Cys Val Tyr Phe Ala Glu Glu Met Leu Lys Arg Asp

210 215 220

Gly Gln Arg Val Glu Gly Lys Arg Val Ala Val Ser Gly Ser Gly Asn

225 230 235 240

Val Ala Gln Tyr Ala Ala Arg Lys Val Met Asp Leu Gly Gly Lys Val

245 250 255

Ile Ser Leu Ser Asp Ser Glu Gly Thr Leu Tyr Ala Glu Ser Gly Leu

260 265 270

Thr Glu Glu Gln Trp Ser Ala Leu Leu Glu Leu Lys Asn Val Gln Arg

275 280 285

Gly Arg Ile Ser Glu Leu Ala Gly Arg Tyr Gly Leu Glu Phe Arg Ala

290 295 300

Gly Lys Thr Pro Trp Glu Leu Ala Cys Asp Ile Ala Leu Pro Cys Ala

305 310 315 320

Thr Gln Asn Glu Leu Asp Ala Glu Ala Ala Arg Thr Leu Leu Arg Asn

325 330 335

Gly Cys Ile Cys Val Ala Glu Gly Ala Asn Met Pro Thr Thr Leu Glu

340 345 350

Ala Val Asp Ile Phe Ile Glu Ala Gly Ile Leu Phe Ala Pro Gly Lys

355 360 365

Ala Ser Asn Ala Gly Gly Val Ala Val Ser Gly Leu Glu Met Ser Gln

370 375 380

Asn Ala Met Arg Leu Leu Trp Thr Ala Gly Glu Val Asp Ser Lys Leu

385 390 395 400

His Asn Ile Met Gln Ser Ile His His Ala Cys Val His Tyr Gly Glu

405 410 415

Glu Asn Gly Arg Ile Asn Tyr Val Lys Gly Ala Asn Ile Ala Gly Phe

420 425 430

Val Lys Val Ala Asp Ala Met Leu Ala Gln Gly Ile Val

435 440 445

<210> 3

<211> 1338

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 3

atgatcgaat ctgtcgaaag tttcctggcg cgtttgaaga agcgtgaccc agatcaaccc 60

gagtttcatc aggctgtgga agaagtttta cgcagcttat ggccctttct tgaagcaaat 120

cctcactatt taacatcggg tatcctggaa cgtatctgtg agccagagcg cgctatcatt 180

ttccgcgtca gttgggttga tgaccacggg aaggtgcaag tgaaccgcgg tttccgtatc 240

caaatgaact cggctatcgg tccttacaaa ggaggcttgc gctttcatcc ctcagtaaac 300

ctgggtgtat taaaatttct tgctttcgaa cagacattta aaaattccct gacctccttg 360

ccgatgggtg ggggcaaggg aggtagcgat tttgacccaa aaggaaaatc tgacgcggaa 420

gtaatgcgtt tttgtcaagc atttatgagc gagctttacc gccatattgg cgcggatgtg 480

gacgtcccag cgggcgatat tggcgtcggt gcccgcgaaa tcgggttcct gtttggccag 540

tataaacgcc tttcaaacca gtttacctca gtgttgactg ggaagggtat gacttatggt 600

ggaagtttga ttcgtccaga ggctacgggt ttcgggtgcg tctattttgc cgaggagatg 660

ctgaagcgcg atgatcaacg tgtggagggt aagcgcgtgg caatcagtgg gtccggcaat 720

gtcgcccagt acgcagcgcg taaggtaatg gaccttgggg gaaaagtaat ctcgcttagc 780

gatagtgagg ggacgttata cgccgagtca ggtttaactg aagctcaatg gtcggcactg 840

ctggagctga agaatgtaca acgtggacgt attagtgaac tggcacagcg ctttggtctg 900

gaatttcgca aagggaaaac gccatgggag ttagcgtgtg acatcgcctt accgtgcgcc 960

acacagaatg agttagacgc ccaagcagct cgcacgcttt tgcacaatgg atgtatctgc 1020

gtcgctgagg gggccaatat gcctaccacc ttggaagcag tagatatctt tattgaagct 1080

ggcatcctgt tcgcccccgg taaggcttcc aatgcaggtg gcgtagcggt ctctggttta 1140

gagatgtcac agaacgctat gcgcttgctt tggacggctg gcgaagtaga cagcaagttg 1200

cacaacatta tgcagtcgat ccaccatgcg tgcgtccact acggggaaga aaatgggcgc 1260

gtgaactatg tgaaaggtgc taacattgct ggtttcgtga aggtagctga cgcgatgctt 1320

gctcagggca ttgtataa 1338

<210> 4

<211> 445

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 4

Met Ile Glu Ser Val Glu Ser Phe Leu Ala Arg Leu Lys Lys Arg Asp

1 5 10 15

Pro Asp Gln Pro Glu Phe His Gln Ala Val Glu Glu Val Leu Arg Ser

20 25 30

Leu Trp Pro Phe Leu Glu Ala Asn Pro His Tyr Leu Thr Ser Gly Ile

35 40 45

Leu Glu Arg Ile Cys Glu Pro Glu Arg Ala Ile Ile Phe Arg Val Ser

50 55 60

Trp Val Asp Asp His Gly Lys Val Gln Val Asn Arg Gly Phe Arg Ile

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Ala Ile Gly Pro Tyr Lys Gly Gly Leu Arg Phe His

85 90 95

Pro Ser Val Asn Leu Gly Val Leu Lys Phe Leu Ala Phe Glu Gln Thr

100 105 110

Phe Lys Asn Ser Leu Thr Ser Leu Pro Met Gly Gly Gly Lys Gly Gly

115 120 125

Ser Asp Phe Asp Pro Lys Gly Lys Ser Asp Ala Glu Val Met Arg Phe

130 135 140

Cys Gln Ala Phe Met Ser Glu Leu Tyr Arg His Ile Gly Ala Asp Val

145 150 155 160

Asp Val Pro Ala Gly Asp Ile Gly Val Gly Ala Arg Glu Ile Gly Phe

165 170 175

Leu Phe Gly Gln Tyr Lys Arg Leu Ser Asn Gln Phe Thr Ser Val Leu

180 185 190

Thr Gly Lys Gly Met Thr Tyr Gly Gly Ser Leu Ile Arg Pro Glu Ala

195 200 205

Thr Gly Phe Gly Cys Val Tyr Phe Ala Glu Glu Met Leu Lys Arg Asp

210 215 220

Asp Gln Arg Val Glu Gly Lys Arg Val Ala Ile Ser Gly Ser Gly Asn

225 230 235 240

Val Ala Gln Tyr Ala Ala Arg Lys Val Met Asp Leu Gly Gly Lys Val

245 250 255

Ile Ser Leu Ser Asp Ser Glu Gly Thr Leu Tyr Ala Glu Ser Gly Leu

260 265 270

Thr Glu Ala Gln Trp Ser Ala Leu Leu Glu Leu Lys Asn Val Gln Arg

275 280 285

Gly Arg Ile Ser Glu Leu Ala Gln Arg Phe Gly Leu Glu Phe Arg Lys

290 295 300

Gly Lys Thr Pro Trp Glu Leu Ala Cys Asp Ile Ala Leu Pro Cys Ala

305 310 315 320

Thr Gln Asn Glu Leu Asp Ala Gln Ala Ala Arg Thr Leu Leu His Asn

325 330 335

Gly Cys Ile Cys Val Ala Glu Gly Ala Asn Met Pro Thr Thr Leu Glu

340 345 350

Ala Val Asp Ile Phe Ile Glu Ala Gly Ile Leu Phe Ala Pro Gly Lys

355 360 365

Ala Ser Asn Ala Gly Gly Val Ala Val Ser Gly Leu Glu Met Ser Gln

370 375 380

Asn Ala Met Arg Leu Leu Trp Thr Ala Gly Glu Val Asp Ser Lys Leu

385 390 395 400

His Asn Ile Met Gln Ser Ile His His Ala Cys Val His Tyr Gly Glu

405 410 415

Glu Asn Gly Arg Val Asn Tyr Val Lys Gly Ala Asn Ile Ala Gly Phe

420 425 430

Val Lys Val Ala Asp Ala Met Leu Ala Gln Gly Ile Val

435 440 445

<210> 5

<211> 1338

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 5

atgattgaga gcgtcgagtc tttcttggcc cgccttaaaa agcgcgaccc tgaccagccg 60

gagtttcatc aggcagttga ggaagtctta cgctcattat ggccgttcct ggaagctaac 120

ccccgttatt tgactagcgg cattcttgaa cgtatttgcg agccggaacg tgccatcgtt 180

ttccgtgtga gctgggtaga cgaccaagga aaggtgcaag tgaaccgtgg cttccgcatc 240

cagatgaact cagctatcgg cccatataaa ggcgggttgc gttttcatcc aagcgttaat 300

ttgggtgtct taaaattctt agcgttcgag caaacattta aaaacagctt aacatcgtta 360

cccatgggtg gaggaaaggg tggtagtgac ttcgacccaa aggggaagag cgatgcggaa 420

gtcatgcgtt tctgccaggc attcatgtca gagctttacc gtcacatcgg ggcggacgtc 480

gatgtgccag cgggagatat tggcgtgggt gcgcgcgaga ttggattttt attcggtcag 540

tataagcgtc tgtctaacca gttcacctcg gtacttacgg gtaagggacc gtcatatggc 600

ggcagtttga ttcgcccaga agctaccgga tttggttgtg tttattttgc cgaagaaatg 660

cttaagcgcc gtggagaaac cgtggaaggc aagcgtgttg ccattagtgg ctctgggaac 720

gtagcgcagt atgcggcccg caaggtgatg gatcttggcg gaaaagtcat ttctttatca 780

gacagcgagg gcacattata ctgcgaatcc ggtttgactg aagctcaatg gcaagcagtg 840

ttggaactga agaatgtaca acgtggccgt atttcagaat tagccggacg ctttggtctt 900

gaatttttag cgggccaacg cccctggggt ttatcttgcg atatcgccct tccttgcgcg 960

acgcagaacg agcttgacgc cgaagctgcg cgtgctttac ttcgtaatgg atgcacgtgc 1020

gtcgctgaag gggcgaacat gccgacaacc cttgaggcgg ttgatctgtt tatcgaagcg 1080

ggtattctgt tcgctccagg taaagcctcg aatgctggcg gggttgcagt gtcgggttta 1140

gagatgtcgc aaaacgcaat gcgtttattg tggacagggg gcgaggttga ctcaaaattg 1200

catgctatca tgcagagcat ccatcatgct tgcgtacatt acggtgaaga gaacggtcag 1260

gtaaactacg taaagggggc gaatattgct ggattcgtga aggttgctga tgcaatgctg 1320

gcacaggggg tcgtctaa 1338

<210> 6

<211> 445

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 6

Met Ile Glu Ser Val Glu Ser Phe Leu Ala Arg Leu Lys Lys Arg Asp

1 5 10 15

Pro Asp Gln Pro Glu Phe His Gln Ala Val Glu Glu Val Leu Arg Ser

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Leu Trp Pro Phe Leu Glu Ala Asn Pro Arg Tyr Leu Thr Ser Gly Ile

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Leu Glu Arg Ile Cys Glu Pro Glu Arg Ala Ile Val Phe Arg Val Ser

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Trp Val Asp Asp Gln Gly Lys Val Gln Val Asn Arg Gly Phe Arg Ile

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Ala Ile Gly Pro Tyr Lys Gly Gly Leu Arg Phe His

85 90 95

Pro Ser Val Asn Leu Gly Val Leu Lys Phe Leu Ala Phe Glu Gln Thr

100 105 110

Phe Lys Asn Ser Leu Thr Ser Leu Pro Met Gly Gly Gly Lys Gly Gly

115 120 125

Ser Asp Phe Asp Pro Lys Gly Lys Ser Asp Ala Glu Val Met Arg Phe

130 135 140

Cys Gln Ala Phe Met Ser Glu Leu Tyr Arg His Ile Gly Ala Asp Val

145 150 155 160

Asp Val Pro Ala Gly Asp Ile Gly Val Gly Ala Arg Glu Ile Gly Phe

165 170 175

Leu Phe Gly Gln Tyr Lys Arg Leu Ser Asn Gln Phe Thr Ser Val Leu

180 185 190

Thr Gly Lys Gly Pro Ser Tyr Gly Gly Ser Leu Ile Arg Pro Glu Ala

195 200 205

Thr Gly Phe Gly Cys Val Tyr Phe Ala Glu Glu Met Leu Lys Arg Arg

210 215 220

Gly Glu Thr Val Glu Gly Lys Arg Val Ala Ile Ser Gly Ser Gly Asn

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Val Ala Gln Tyr Ala Ala Arg Lys Val Met Asp Leu Gly Gly Lys Val

245 250 255

Ile Ser Leu Ser Asp Ser Glu Gly Thr Leu Tyr Cys Glu Ser Gly Leu

260 265 270

Thr Glu Ala Gln Trp Gln Ala Val Leu Glu Leu Lys Asn Val Gln Arg

275 280 285

Gly Arg Ile Ser Glu Leu Ala Gly Arg Phe Gly Leu Glu Phe Leu Ala

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Gly Gln Arg Pro Trp Gly Leu Ser Cys Asp Ile Ala Leu Pro Cys Ala

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Thr Gln Asn Glu Leu Asp Ala Glu Ala Ala Arg Ala Leu Leu Arg Asn

325 330 335

Gly Cys Thr Cys Val Ala Glu Gly Ala Asn Met Pro Thr Thr Leu Glu

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Ala Val Asp Leu Phe Ile Glu Ala Gly Ile Leu Phe Ala Pro Gly Lys

355 360 365

Ala Ser Asn Ala Gly Gly Val Ala Val Ser Gly Leu Glu Met Ser Gln

370 375 380

Asn Ala Met Arg Leu Leu Trp Thr Gly Gly Glu Val Asp Ser Lys Leu

385 390 395 400

His Ala Ile Met Gln Ser Ile His His Ala Cys Val His Tyr Gly Glu

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Glu Asn Gly Gln Val Asn Tyr Val Lys Gly Ala Asn Ile Ala Gly Phe

420 425 430

Val Lys Val Ala Asp Ala Met Leu Ala Gln Gly Val Val

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<210> 7

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<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

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ttccgtgttc cgtgggtgga tgatcagggc cgtgtacaag taaatcgtgg ttaccgcatc 240

cagatgaatt cagccatcgg accgtataaa ggaggcctgc gtttccatcc atcagtaaac 300

gtcggggtgt tgaaatttct ggcttttgag caagtcttca agaactccct tacctctttg 360

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cttgcccaag gagtcgttta a 1341

<210> 8

<211> 446

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 8

Met Ile Glu Thr Val Asp Ala Phe Leu Ala Arg Leu Arg Gln Arg Asp

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Pro His Gln Pro Glu Phe His Gln Ala Val Glu Glu Val Val Arg Ser

20 25 30

Leu Trp Pro Phe Leu Glu Ala Asn Pro Arg Tyr Met Gln Ala Gly Ile

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Ile Glu Arg Met Val Glu Pro Glu Arg Ala Ile Met Phe Arg Val Pro

50 55 60

Trp Val Asp Asp Gln Gly Arg Val Gln Val Asn Arg Gly Tyr Arg Ile

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Ala Ile Gly Pro Tyr Lys Gly Gly Leu Arg Phe His

85 90 95

Pro Ser Val Asn Val Gly Val Leu Lys Phe Leu Ala Phe Glu Gln Val

100 105 110

Phe Lys Asn Ser Leu Thr Ser Leu Pro Met Gly Gly Gly Lys Gly Gly

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Ser Asp Phe Asn Pro Lys Gly Lys Ser Asp Asn Glu Val Met Arg Phe

130 135 140

Cys Gln Ser Phe Met Ser Glu Leu Tyr Arg His Ile Gly Ala Asp Leu

145 150 155 160

Asp Val Pro Ala Gly Asp Ile Gly Val Gly Gly Arg Glu Ile Gly Phe

165 170 175

Leu Phe Gly Gln Tyr Lys Arg Leu Ser Asn Gln Phe Thr Ser Val Leu

180 185 190

Thr Gly Lys Gly Leu Ala Tyr Gly Gly Ser Leu Ile Arg Pro Glu Ala

195 200 205

Thr Gly Tyr Gly Cys Val Tyr Phe Ala Gln Glu Met Leu Lys Ser Thr

210 215 220

Arg Ser Ser Phe Glu Gly Lys Arg Val Ser Ile Ser Gly Ser Gly Asn

225 230 235 240

Val Ala Gln Tyr Ala Ala Gln Lys Val Ile Glu Leu Gly Gly Leu Val

245 250 255

Val Ser Val Ser Asp Ser Gly Gly Thr Leu His Phe Pro Asp Gly Met

260 265 270

Thr Glu Glu Gln Trp Glu Tyr Leu Met Asp Leu Lys Asn Val Arg Arg

275 280 285

Gly Arg Leu Glu Glu Met Gly Ala His Phe Gly Val Thr Tyr Met Pro

290 295 300

Asp Gln Arg Pro Trp Ser Leu Pro Cys Asp Ile Ala Leu Pro Cys Ala

305 310 315 320

Thr Gln Asn Glu Leu Asp Gly Asp Asp Ala Arg Thr Leu Leu Lys Asn

325 330 335

Gly Cys Phe Cys Val Ala Glu Gly Ala Asn Met Pro Ser Thr Leu Glu

340 345 350

Ala Val Asp Leu Phe Leu Glu Ala Gly Ile Leu Tyr Ala Pro Gly Lys

355 360 365

Ala Ser Asn Ala Gly Gly Val Ala Cys Ser Gly Leu Glu Met Ser Gln

370 375 380

Asn Ser Met Arg Leu His Trp Thr Ala Gly Glu Val Asp Thr Lys Leu

385 390 395 400

His Ser Ile Met Gln Ser Ile His His Ala Cys Val Ala Tyr Gly Glu

405 410 415

Glu Glu Asp Gly Arg Ile Asn Tyr Val Lys Gly Ala Asn Ile Ala Gly

420 425 430

Phe Val Lys Val Ala Asp Ala Met Leu Ala Gln Gly Val Val

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<210> 9

<211> 445

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 9

Met Ile Glu Ser Val Glu Ser Phe Leu Ala Phe Leu Lys Lys Phe Asp

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Pro Asp Gln Pro Glu Phe His Gln Ala Val Glu Glu Val Leu Phe Ser

20 25 30

Leu Trp Pro Phe Leu Glu Ala Asn Pro Phe Tyr Leu Thr Ser Gly Ile

35 40 45

Leu Glu Phe Ile Cys Glu Pro Glu Phe Ala Ile Val Phe Phe Val Ser

50 55 60

Trp Val Asp Asp Gln Gly Lys Val Gln Val Asn Phe Gly Phe Phe Ile

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Ala Ile Gly Pro Tyr Lys Gly Gly Leu Phe Phe His

85 90 95

Pro Ser Val Asn Leu Gly Val Leu Lys Phe Leu Ala Phe Glu Gln Thr

100 105 110

Phe Lys Asn Ser Leu Thr Ser Leu Pro Met Gly Gly Gly Lys Gly Gly

115 120 125

Ser Asp Phe Asp Pro Lys Gly Lys Ser Asp Ala Glu Val Met Phe Phe

130 135 140

Cys Gln Ala Phe Met Ser Glu Leu Tyr Phe His Ile Gly Ala Asp Val

145 150 155 160

Asp Val Pro Ala Gly Asp Ile Gly Val Gly Ala Phe Glu Ile Gly Phe

165 170 175

Leu Phe Gly Gln Tyr Lys Phe Leu Ser Asn Gln Phe Thr Ser Val Leu

180 185 190

Thr Gly Lys Gly Pro Ser Tyr Gly Gly Ser Leu Ile Phe Pro Glu Ala

195 200 205

Thr Gly Phe Gly Cys Val Tyr Phe Ala Glu Glu Met Leu Lys Phe Phe

210 215 220

Gly Glu Thr Val Glu Gly Lys Phe Val Ala Ile Ser Gly Ser Gly Asn

225 230 235 240

Val Ala Gln Tyr Ala Ala Phe Lys Val Met Asp Leu Gly Gly Lys Val

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Gly Phe Ile Ser Glu Leu Ala Gly Phe Phe Gly Leu Glu Phe Leu Ala

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Gly Cys Thr Cys Val Ala Glu Gly Ala Asn Met Pro Thr Thr Leu Glu

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Glu Asn Gly Gln Val Asn Tyr Val Lys Gly Ala Asn Ile Ala Gly Phe

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Val Lys Val Ala Asp Ala Met Leu Ala Gln Gly Val Val

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<210> 10

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<212> DNA

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gcgttcctgg gcgctcgtga agctctgaaa tacttcgttg aacataacgt gaaaggcaac 420

attatcaata tgtctagcgt ccacgaaatc atcccgtggc ctactttcgt acattacgct 480

gcttctaagg gtggcgttaa actgatgacc cagactctgg ctatggaata tgcaccgaaa 540

ggtatccgca ttaacgctat cggtccaggc gcgatcaaca ctccaattaa tgcagaaaaa 600

ttcgaggatc cgaaacagcg tgcagacgtg gaaagcatga tcccgatggg caacatcggc 660

aagccagagg agatttccgc tgtcgcggca tggctggctt ctgacgaagc gtcttacgtt 720

accggcatca ccctgttcgc agatggtggc atgaccctgt acccgagctt tcaggctggc 780

cgtggttga 789

Claims

1.一种来源于Pseudomonas moorei的草铵膦脱氢酶突变体，其特征在于所述突变体是将SEQ ID NO：6所示氨基酸序列第107位、第188位、第239位、第357位进行单突变或多位点突变获得的。

2.如权利要求1所述草铵膦脱氢酶突变体，其特征在于所述突变体为下列之一：第107位精氨酸突变为亮氨酸、第107位精氨酸突变为亮氨酸+第188位脯氨酸突变为苯丙氨酸、第107位精氨酸突变为亮氨酸+第239位赖氨酸突变为甘氨酸、第107位精氨酸突变为亮氨酸+第188位脯氨酸突变为苯丙氨酸+第239位赖氨酸突变为酪氨酸、第107位精氨酸突变为亮氨酸+第188位脯氨酸突变为苯丙氨酸+第239位赖氨酸突变为半胱氨酸、第107位精氨酸突变为亮氨酸+第188位脯氨酸突变为苯丙氨酸+第239位赖氨酸突变为甘氨酸、第107位精氨酸突变为亮氨酸+第188位脯氨酸突变为苯丙氨酸+第239位赖氨酸突变为甘氨酸+第357位甘氨酸突变为苯丙氨酸。

3.如权利要求1所述草铵膦脱氢酶突变体，其特征在于所述突变体为第107位的精氨酸取代为亮氨酸、第188位的脯氨酸取代为苯丙氨酸、第239位的亮氨酸取代为甘氨酸、第357位的甘氨酸取代为苯丙氨酸。

4.一种权利要求1所述草铵膦脱氢酶突变体的编码基因。

5.一种权利要求4所述含草铵膦脱氢酶突变体的编码基因的工程菌。

6.一种权利要求1所述草铵膦脱氢酶突变体在催化2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸合成L-草铵膦中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述的应用以含草铵膦脱氢酶突变体基因和葡萄糖脱氢酶基因的重组工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体超声破碎提取的粗酶液为催化剂，以2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸为底物，以葡萄糖为辅助底物，加入无机氨基供体，于pH值为7.5的缓冲液中构成转化体系，在35℃、600rpm条件下反应，反应完全，将反应液分离纯化，获得L-草铵膦。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述转化体系中，催化剂的用量以湿菌体重量计为20～100g/L，所述底物的初始浓度为10～500mM，葡萄糖添加量为12-600mM，无机氨基供体添加量为50mM-1.5M。

9.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述催化剂按如下方法制备：将含有葡萄糖脱氢酶和草铵膦脱氢酶E3的重组工程菌接种至含有50μg/mL氨苄霉素抗性的LB液体培养基，37℃，200rpm下培养12h，再以体积浓度1％接种量接种至新鲜的含有50μg/mL氨苄霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃，150rpm下培养至菌体OD600达0.6-0.8，加入终浓度为24μg/mL的IPTG，18℃下诱导培养16h后，4℃、8000rpm离心20min，弃去上清液，收集沉淀，用pH 7.5、20mM磷酸盐缓冲液洗涤两次，即获得湿菌体；将湿菌体加入pH 7.5、100mM的PBS中重悬细胞，在冰水混合物上超声破碎10min，超声破碎条件：功率为400W，破碎1s，暂停5s，获得粗酶液。