CN113897382B

CN113897382B - 辅酶自足型大肠杆菌及其构建方法与应用

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Publication number: CN113897382B
Application number: CN202111022022.4A
Authority: CN
Inventors: 薛亚平; 邹树平; 姜镇涛; 徐建妙; 程峰; 郑裕国
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2021-09-01
Filing date: 2021-09-01
Publication date: 2023-10-20
Anticipated expiration: 2041-09-01
Also published as: CN113897382A; US20230084966A1

Abstract

本发明提供了辅酶自足型大肠杆菌及其构建方法，以及其在L‑草铵膦合成中的应用。本发明在大肠杆菌中表达NADH激酶和辅酶合成途径的关键酶，并敲除了分解辅酶的酶，在细胞培养过程中，通过联合代谢中间物的添加，使胞内NADP(H)浓度提高至少50％，谷氨酸脱氢酶催化活力提高2倍。在不对称还原胺化2‑羰基‑4‑(羟基甲基氧膦基)‑丁酸的过程中，NADH激酶继续将胞内NAD(H)转化为NADP(H)，减缓了NADP(H)半衰期过短导致的谷氨酸脱氢酶活力下降，使不对称还原胺化反应进程缩短至少5h，显著提高了该反应的时空产率。

Description

辅酶自足型大肠杆菌及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及一种利用基因工程技术和发酵工程技术构建的辅酶自足型大肠杆菌、构建方法及其在催化合成草铵膦中的应用。

背景技术

草铵膦（glufosinate-ammonium）是世界第二大转基因作物耐受除草剂，由赫斯特公司（几经合并后现归属拜耳公司）开发生产，化学名称为4-[羟基（甲基）膦酰基]-DL-高丙氨酸，又称草铵膦铵盐、Basta、Buster等，属膦酸类除草剂，是谷氨酰胺合成酶抑制剂，非选择性（灭生性）触杀型除草剂。

目前，世界上的三大除草剂品种是草甘膦、草铵膦和百草枯，相对于百草枯和草甘膦，草铵膦具有优异的除草性能及较小的药害副作用，随着抗草铵膦转基因作物的快速发展，草铵膦在未来一段时间内市场需求巨大，前景非常广阔。

草铵膦有两种光学异构体，分别为L-草铵膦和D-草铵膦。但只有L-型具有生理活性，且在土壤中易分解，对人类和动物的毒性较小，除草谱广，对环境的破坏力小。

目前，市场上销售的草铵膦一般都是外消旋混合物。如果草铵膦产品能以L-构型的光学纯异构体形式使用，可使草铵膦的使用量降低50％，这对于提高原子经济性、降低成本、减轻环境压力都具有十分重要的意义。目前报道的L-草铵膦的方法主要有化学合成法，包括消旋草铵膦的拆分、手性原料法、手性辅基法和不对称催化法，但存在D-草铵膦不易消旋再利用、合成步骤冗长，反应需要超低温，产物ee值较低，收率低，且手性拆分试剂价格昂贵等问题。相比之下，生物合成法具有立体选择性严格、反应条件温和及产物易分离纯化的优点，因此探索生物法生产L-草铵膦的可行性具有十分重要的产业价值和显著的社会效益。

以D,L-草铵膦为原料，其中的D-草铵膦经D-氨基酸氧化酶催化得到L-草铵膦前体2-羰基-4-[羟基（甲基）膦酰基]丁酸（PPO），再经氨基酸脱氢酶或转氨酶催化得到L-草铵膦，该方法不仅解决了消旋化的问题，也节约了成本。

NAD（H）和NADP（H）是一种关键性的辅酶，在所有生物中发挥重要的作用并且分工明确，很多氧化还原过程需要NAD（H）和NADP（H）的参与，例如氨基酸脱氢酶催化的PPO不对称还原胺化反应需要NADPH提供还原力。但细胞内源性NAD（P）（H）的不足通常成为制约这类辅酶依赖型氧化还原酶催化效率的限制因素。因此调节胞内NAD（H）和NADP（H）的浓度是至关重要的。

大肠杆菌能够自身合成NAD(P)辅酶，包括以L-天冬氨酸为起始底物的从头合成途径和以烟酸为底物的补救途径，该代谢途径中的每一步都有多种酶参与调控。其中，较为关键的包括：由nadE基因编码的NAD合成酶，由nadD基因编码的烟酸腺苷酸转移酶，以及由pncB基因编码的烟酸磷酸核糖转移酶等，胞内NAD(P)的合成量主要通过这些酶进行控制。此外，存在辅酶分解途径，主要包括mazG、mudC、nadR等基因调控的辅因子分解代谢。

此外调节胞内NAD（H）和NADP（H）浓度的一种关键酶是NAD（H）激酶，可催化NAD（H）以ATP或无机多聚磷酸[poly（P）]作为磷酰基供体进行磷酸化反应，生成NADP（H）NADH激酶（EC2 .7 .1 .23；NADK）只能专一性的结合NAD+，使其磷酸化生成NADP+，这是NADP+生物合成途径的最后一步。根据磷酰基受体的不同，NADH激酶被分为poly（P）/ATP-NADH激酶和ATP-NADH激酶。不同于NADH激酶的专一性，NADH激酶（EC2.7.1.86； NADHK）不仅可以催化NAD+，还可以催化NADH发生磷酸化形成NADPH，但是优先利用NADH作为底物。

由于L-天冬氨酸、喹啉酸、烟酸、烟酰胺等都是辅酶合成途径中的前体或中间物，因此在解除关键基因调控的限速步骤后，通过添加这些化合物可以进一步提高胞内辅酶的浓度。

在前期工作中，申请人构建了包含草铵膦脱氢酶和葡萄糖脱氢酶的大肠杆菌工程菌株，该菌株能够在NADPH存在下催化2-羰基-4-（羟基甲基氧膦基）-丁酸不对称胺化还原为L-草铵膦，并通过葡萄糖脱氢酶实现辅酶再生，但细胞内源性NADP（H）浓度过低限制了谷氨酸脱氢酶的催化效率，限制了其工业化应用。

发明内容

本发明的目的是构建辅酶自足型大肠杆菌并利用该工程菌高效催化合成草铵膦，以解决目前大肠杆菌内源性辅酶浓度不足的问题。

本发明采用的技术方案是：

一种辅酶自足型大肠杆菌，由如下方法构建获得：

（1）构建表达载体，将NADH激酶基因、葡萄糖脱氢酶基因、谷氨酸脱氢酶基因以及NADP辅酶合成途径的基因转化至大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中，筛选正确的转化子，得到谷氨酸脱氢酶-葡萄糖脱氢酶-NADH激酶共表达基因工程菌；所述NADH激酶基因序列如SEQ IDNo.1~5之一所示，所述葡萄糖脱氢酶基因序列如SEQ ID No.6所示，所述谷氨酸脱氢酶基因序列如SEQ ID NO.7所示，所述NADP辅酶合成途径的基因序列如SEQ ID No.8~10之一所示；

（2）敲除共表达基因工程菌基因组中mazG、mudC、nadR中的任意一种或多种的组合，得到所述辅酶自足型大肠杆菌。所述重组大肠杆菌同时表达了外源谷氨酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶、NADH激酶和辅酶合成途径的酶，并在宿主大肠杆菌的基础上敲除了辅酶分解基因。

优选的，步骤（1）中所述NADH激酶基因序列如SEQ ID No.3所示，所述NADP辅酶合成途径的基因序列如SEQ ID No.8所示。

优选的，步骤（2）中敲除mazG和nadR基因。

所述NADH激酶分别来自于Corynebacterium glutamicum（CgNadK）（登录号NC_003450.3）、Escherichia coli（EcNadK）（登录号NC_000913.3）、Methanocaldococcus jannaschii（MjNadK）（登录号NC_000009.12）、Entamoeba histolytica（EhNadK）（登录号NW_001914860.1）、Saccharomyces cerevisiae（ScNadK）（登录号NC_001148.4）。

所述辅酶合成途径的酶包括大肠杆菌内源性的NAD合成酶（nadE）、烟酸腺苷酸转移酶（nadD）、烟酸磷酸核糖转移酶（pncB）。

所述敲除基因nadR的NCBI accession No为ACT46046.1，mazG的NCBI accessionNo为ACT44443.1，nudC的NCBI accession No为ACT45665.1。

本发明还涉及构建所述辅酶自足型大肠杆菌的方法，所述方法包括：

（2）敲除共表达基因工程菌基因组中mazG、mudC、nadR中的任意一种或多种的组合，得到所述辅酶自足型大肠杆菌。

优选的，步骤（1）中所述NADH激酶基因序列如SEQ ID No.3所示，所述NADP辅酶合成途径的基因序列如SEQ ID No.8所示；步骤（2）中敲除mazG和nadR基因。

可将重组大肠杆菌接种至含有5~40mg/L辅酶合成前体的培养基中提高胞内辅酶浓度。所述辅酶合成前体为下列之一：L-天冬氨酸、喹啉酸、烟酸、烟酰胺。

本发明还涉及所述辅酶自足型大肠杆菌在微生物发酵制备L-草铵膦中的应用。

具体的，所述应用为：以所述辅酶自足型大肠杆菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体超声破碎提取的酶液为催化剂，以2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸为底物，加入硫酸铵和葡萄糖，以pH值为7.5的缓冲液为反应介质构成反应体系，在35℃~40℃、500~600rpm条件下反应，反应结束后反应液分离纯化，获得L-草铵膦。

所述反应体系中，催化剂用量以湿菌体总重量计为10～50g/L，底物的初始浓度为10～500mM，葡萄糖添加量为12~750mM，硫酸铵添加量为50mM~1.5M。

优选的，所述反应体系中，催化剂用量以湿菌体总重量计为15g/L，底物的初始浓度为200mM，葡萄糖添加量为250mM，硫酸铵添加量为300mM。

本发明的有益效果主要体现在：本发明在大肠杆菌中表达NADH激酶和辅酶合成途径的基因，并敲除辅酶分解基因，在细胞培养过程中，通过联合代谢中间物的添加，以及NADH激酶将胞内NAD（H）转化为NADP（H），使胞内NADP（H）浓度提高至少50%，谷氨酸脱氢酶催化活力提高2倍。在不对称还原胺化2-羰基-4-（羟基甲基氧膦基）-丁酸的过程中，NADH激酶继续将胞内NAD（H）转化为NADP（H），减缓了NADP（H）半衰期过短导致的谷氨酸脱氢酶活力下降，使不对称还原胺化反应进程缩短至少5h，显著提高了该反应的时空产率。

附图说明

图1为NAD（H）激酶催化合成NADP（H）及为谷氨酸脱氢酶偶联葡萄糖脱氢酶实现辅酶再生高效催化2-羰基-4-（羟基甲基氧膦基）-丁酸合成L-草铵膦的反应式。

图2为5种NAD（H）激酶、谷氨酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶共表达菌株的粗酶液SDS-PAGE蛋白电泳图。M：标准蛋白分子量；泳道1：E.coli BL21（DE3）MN/ pETDuet-1-PPTGDHE3-GDH/ pCDFDuet-1-EhNadK粗酶液上清；泳道2：E.coli BL21（DE3）MN/ pETDuet-1-PPTGDHE3-GDH/ pCDFDuet-1-EhNadK粗酶液沉淀；泳道3：E.coli BL21（DE3）MN/ pETDuet-1-PPTGDHE3-GDH/ pCDFDuet-1-ScNadK粗酶液上清；泳道4：E.coli BL21（DE3）MN/pETDuet-1-PPTGDHE3-GDH/ pCDFDuet-1-ScNadK粗酶液沉淀；泳道5：E.coli BL21（DE3）MN/pETDuet-1-PPTGDHE3-GDH/ pCDFDuet-1-EcNadK粗酶液上清；泳道6：E.coli BL21（DE3）MN/pETDuet-1-PPTGDHE3-GDH/ pCDFDuet-1-EcNadK粗酶液沉淀；泳道7：E.coli BL21（DE3）MN/pETDuet-1-PPTGDHE3-GDH/ pCDFDuet-1-MjNadK粗酶液上清；泳道8：E.coli BL21（DE3）MN/pETDuet-1-PPTGDHE3-GDH/ pCDFDuet-1-MjNadK粗酶液沉淀；泳道9：E.coli BL21（DE3）MN/pETDuet-1-PPTGDHE3-GDH/ pCDFDuet-1-CgNadK粗酶液上清；泳道10：E.coli BL21（DE3）MN/ pETDuet-1-PPTGDHE3-GDH/ pCDFDuet-1-CgNadK粗酶液沉淀。

图3为nadD、nadE、pncB与谷氨酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶共表达菌株的粗酶液SDS-PAGE蛋白电泳图。M：标准蛋白分子量；泳道1：E.coli BL21（DE3）MN/ pETDuet-1-PPTGDHE3-GDH/ pCDFDuet-1-nadD粗酶液；泳道2：E.coli BL21（DE3）MN/ pETDuet-1-PPTGDHE3-GDH/pCDFDuet-1-nadE粗酶液；泳道3：E.coli BL21（DE3）MN/ pETDuet-1-PPTGDHE3-GDH/pCDFDuet-1-pncB粗酶液；

图4为大肠杆菌BL21（DE3）表达EhNadK、ScNadK、MjNadK、EcNadK、CgNadK后辅酶NADP（H）变化情况。

图5为大肠杆菌BL21（DE3）表达nadD、nadE、pncB后辅酶NADP（H）变化情况。

图6为菌株E.coli BL21（DE3）MN/ pETDuet-1-PPTGDHE3-GDH/ pCDFDuet-1-EhNadK、E.coliBL21（DE3）MN/ pETDuet-1-PPTGDHE3-GDH/ pCDFDuet-1-ScNadK、E.coliBL21（DE3）MN/ pETDuet-1-PPTGDHE3-GDH/ pCDFDuet-1-EcNadK、E.coliBL21（DE3）MN/ pETDuet-1-PPTGDHE3-GDH/ pCDFDuet-1-MjNadK、E.coliBL21（DE3）MN/ pETDuet-1-PPTGDHE3-GDH/ pCDFDuet-1-CgNadK细胞内辅酶NADP（H）变化情况。

图7为菌株E.coli BL21（DE3）MN/ pETDuet-1-PPTGDHE3-GDH/ pCDFDuet-1-pncB、E.coliBL21（DE3）MN/ pETDuet-1-PPTGDHE3-GDH/ pCDFDuet-1-nadE细胞内辅酶NADP（H）变化情况。

图8为菌株E.coli BL21（DE3）MN/ pETDuet-1-PPTGDHE3-GDH/ pCDFDuet-1-EhNadK、E.coli BL21（DE3）MN/pETDuet-1-PPTGDHE3-GDH/ pCDFDuet-1-ScNadK、E.coliBL21（DE3）MN/pETDuet-1-PPTGDHE3-GDH/ pCDFDuet-1-EcNadK、E.coli BL21（DE3）MN/pETDuet-1-PPTGDHE3-GDH/ pCDFDuet-1-MjNadK、E.coli BL21（DE3）MN/pETDuet-1-PPTGDHE3-GDH/ pCDFDuet-1-CgNadK全细胞比活力结果图。

图9为菌株E.coli BL21（DE3）MN/ pETDuet-1-PPTGDHE3-GDH/ pCDFDuet-1-pncB、E.coliBL21（DE3）MN/ pETDuet-1-PPTGDHE3-GDH/ pCDFDuet-1-nadEqu全细胞比活力结果图。

图10为培养基中添加不同浓度喹啉酸、L-天冬氨酸、烟酸、烟酰胺、腺嘌呤、ATP后发酵所得细胞的催化活力变化情况。

图11为出发菌株和MjNadK/nadE/PPTGDH/GDH共表达大肠杆菌不同菌体浓度下催化2-羰基-4-（羟基甲基氧膦基）-丁酸的反应进程。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

本发明中的实验方法如无特别说明均为常规方法，基因克隆操作具体可参见J.萨姆布鲁克等编的《分子克隆实验指南》。

上游基因工程操作所用试剂：实施例中使用的一步克隆试剂盒均购自Vazyme，南京诺唯赞生物科技有限公司；质粒提取试剂盒、DNA回收纯化试剂盒购自Axygen杭州有限公司；E.coli BL21（DE3）MN、质粒等购自上海生工；DNA marker、FastPfu DNA聚合酶、低分子量标准蛋白、琼脂糖电泳试剂、引物合成与基因测序工作由杭州擎科梓熙生物技术有限公司完成。以上试剂使用方法参考商品说明书。

下游催化工艺所用试剂：2-羰基-4-（羟基甲基膦酰基）丁酸（简称PPO），D,L-草铵膦、L-草铵膦（L-PPT）标准品购自Sigma-Aldrich公司；其他常用试剂购自国药集团化学试剂有限公司。

实施例1：辅酶分解基因的敲除

将Escherichia coliBL21(DE3)上的mudC、mazG和nadR进行单或双敲除，其中，本发明所用基因敲除的质粒为pCasRed与pCRISPR-gDNA(sgRNA)与同源臂(donor)一起导入Escherichia coliBL21(DE3)上，Cas9/sgRNA诱发宿主在目标基因位点发生双链断裂，重组酶Red将donor整合到目标基因上，实现基因的敲除，并测序验证。mudCsgRNA、mudCdonor、mazGsgRNA、mazGdonor、nadRsgRNA、nadRdonor分别如序列表SEQ ID NO 16~SEQ ID NO 21所示。不同敲除组合获得的菌株胞内辅酶浓度变化情况见表1。

表1：基因敲除后辅酶变化情况

由表1可见，E. coliBL21(DE3)∆mazG∆nadR效果最佳，命名为E. coliBL21(DE3)MN。

实施例2：包含NADH激酶的大肠杆菌的构建

本实施例中，通过文献报道并在NCBI数据库中挑选了5条NADH激酶序列，分别来源于Corynebacterium glutamicum（CgNadK）（登录号NC_003450.3）、Escherichia coli（EcNadK）（登录号NC_000913.3）、Methanocaldococcus jannaschii（MjNadK）（登录号NC_000009.12）、Entamoeba histolytica（EhNadK）（登录号NW_001914860.1）、Saccharomycescerevisiae（ScNadK）（登录号NC_001148.4），并进行密码子优化后全基因合成，核苷酸序列分别为SEQ ID NO.1~NO.5所示。

采用一步克隆法将MjNadK、EcNadK、CgNadK、EhNadK、ScNadK分别克隆至质粒pCDFDuet-1的第一个多克隆位点上：

设计载体线性化引物1、引物2，以线性化载体的开头和末端各10~15bp为同源序列，根据SEQ ID NO.1~NO.5设计带有同源序列的引物3~引物12，以合成的MjNadK、EcNadK、CgNadK、EhNadK、ScNadK为模板，将同源臂添加至基因特异性正/反向扩增引物的5’端，以此对带有同源臂的MjNadK、EcNadK、CgNadK、EhNadK、ScNadK基因利用高保真PfuDNA聚合酶进行扩增，将消化模板后的PCR产物用DNA回收纯化试剂盒进行纯化回收，并分别测出核酸浓度，得到带有同源序列的MjNadK、EcNadK、CgNadK、EhNadK、ScNadK基因序列。

引物1：5’-GATCCGAATTCGAGCTCGG-3’；

引物2：5’-CTGGCTGTGGTGATGATGGTG-3’；

引物3：

5’- accatcatcaccacagccagATGGTCATCATGGAAGGGTTTAA-3’；

引物4：

5’- gccgagctcgaattcggatcTTTAATACCAAGACAGCGACTTAACTT-3’；

引物5：

5’- accatcatcaccacagccagATGAACAACCACTTCAAGTGCATT-3’；

引物6：

5’- gccgagctcgaattcggatcAAATAATTTTTTGGACCAGCCTAAC-3’；

引物7：

5’- accatcatcaccacagccagATGACAGCACCTACCAACGCA-3’；

引物8：

5’- gccgagctcgaattcggatcCCCTGCGCTGCGCGGGTC-3’；

引物9：

5’- accatcatcaccacagccagATGACCACATTACAGATTGATCATATTC-3’；

引物10：

5’- gccgagctcgaattcggatcTTCAAAGAAATCCTTTGTGACTTTATTAAT-3’；

引物11：

5’- accatcatcaccacagccagATGTTCGTCCGTGTAAAACTTAAT-3’；

引物12：

5’- gccgagctcgaattcggatcATCATTATCGGTTTGACGCTTC-3’；

单片段同源重组反应：

最适克隆载体使用量＝{0.02*克隆载体碱基对数}ng（0.03pmol）

最适插入片段使用量＝{0.04*插入片段碱基对数}ng（0.06pmol）

反应体系：

注：X表示加入线性化载体的量，Y表示插入片段的量。

将配置好的反应体系使用移液器轻轻吸打混匀，短暂离心后将反应液收集到管底，反应体系放在37℃的水浴中，静置30min，然后立即放在冰上冷却。将5种不同体系分别转化至E.coli BL21（DE3）MNMN中（42℃，90s），涂布于含有50 μ g/mL链霉素抗性的LB平板，37℃下培养12-16h，随机挑取单克隆抽提质粒进行测序鉴定，分别筛选获得含有MjNadK、EcNadK、CgNadK、EhNadK、ScNadK的重组大肠杆菌E.coli BL21（DE3）MN/pCDFDuet-1-MjNadK、E.coli BL21（DE3）MN/pCDFDuet-1-EcNadK、E.coli BL21（DE3）MN/pCDFDuet-1-CgNadK、E.coli BL21（DE3）MN/pCDFDuet-1- EhNadK、E.coli BL21（DE3）MN/pCDFDuet-1-ScNadK。

实施例3：辅酶合成途径基因的表达

本实施例中，通过在KEGG数据库中查找大肠杆菌E.coli BL21（DE3）的辅酶合成代谢途径，并获得了nadE（NAD合成酶基因）、nadD（烟酸腺苷酸转移酶基因）、pncB（烟酸磷酸核糖转移酶基因），核苷酸序列分别为SEQ ID NO.8~NO.10所示。

采用一步克隆法将nadE、nadD、pncB分别克隆至质粒pCDFDuet-1的第二个多克隆位点上：

设计载体线性化引物13、引物14，以线性化载体的开头和末端各10~15bp为同源序列，根据SEQ ID NO.8~NO.10设计带有同源序列的引物15~引物20，以大肠杆菌E.coli BL21（DE3）MN基因组为模板，将同源臂添加至基因特异性正/反向扩增引物的5’端，以此对带有同源臂的nadE、nadD、pncB基因利用高保真PfuDNA聚合酶进行扩增，将消化模板后的PCR产物用DNA回收纯化试剂盒进行纯化回收，并分别测出核酸浓度，得到带有同源序列的nadE、 nadD、pncB基因序列和扩增的线性化载体pCDFDuet-1。

引物13：

5’-gcagatctcaattggatatcggc-3’；

引物14：

5’-catatgtatatctccttcttatacttaac-3’；

引物15：

5’-gaaggagatatacatatgATGACATTGCAACAACAA-3’；

引物16：

5’-tccaattgagatctgcTTACTTTTTCCAGA-3’；

引物17：

5’-gaaggagatatacatatgATGAAATCTTTACAGGC-3’；

引物18：

5’-tccaattgagatctgcTCAGCGATACAAG-3’；

引物19：

5’-gaaggagatatacatatgATGACACAATTCGCTTCT-3’；

引物20：

5’-tccaattgagatctgcTTAACTGGCTTTTTTAATATGCG-3’；

按实施例2所述方法将nadE、nadD、pncB基因分别连接至pCDFDuet-1中，将3种不同体系分别转化至大肠杆菌BL21(DE3) MN中（42℃，90s），涂布于含有50 μ g/mL链霉素抗性的LB平板，37℃下培养12-16h，随机挑取单克隆抽提质粒进行测序鉴定，分别筛选获得含有nadE、nadD、pncB的重组大肠杆菌E.coli BL21（DE3）MN/pCDFDuet-1-nadE、E.coli BL21（DE3）MN/pCDFDuet-1-nadD、E.coli BL21（DE3）MN/pCDFDuet-1-pncB。

实施例4：共表达大肠杆菌的构建

本实验室前期工作中已构建包含谷氨酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶的重组大肠杆菌E.coli BL21（DE3）/pETDuet-1-PPTGDHE3-GDH（专利公开号CN109609475A）。将E.coliBL21（DE3）/pETDuet-1-PPTGDHE3-GDH、E.coli BL21（DE3）MN/pCDFDuet-1-MjNadK、E.coli BL21（DE3）MN/pCDFDuet-1-EcNadK、E.coli BL21（DE3）MN/pCDFDuet-1-CgNadK、E.coli BL21（DE3）MN/pCDFDuet-1- EhNadK、E.coli BL21（DE3）MN/pCDFDuet-1-ScNadK、E.coli BL21（DE3）MN/pCDFDuet-1-nadE、E.coli BL21（DE3）MN/pCDFDuet-1-nadD、E.coli BL21（DE3）MN/pCDFDuet-1-pncB分别接种至LB液体培养基中，培养12h后抽提质粒，分别获得质粒pETDuet-1-PPTGDHE3-GDH、pCDFDuet-1-MjNadK、pCDFDuet-1- EcNadK、pCDFDuet-1-CgNadK、pCDFDuet-1- EhNadK、pCDFDuet-1-ScNadK、pCDFDuet-1-nadEpCDFDuet-1-nadD、pCDFDuet-1-pncB，测出核酸浓度，取200ng pETDuet-1-PPTGDHE3-GDH，分别与200ng的pCDFDuet-1-MjNadK、pCDFDuet-1-EcNadK、pCDFDuet-1-CgNadK、pCDFDuet-1- EhNadK、pCDFDuet-1-ScNadK、pCDFDuet-1-nadEpCDFDuet-1-nadD、pCDFDuet-1-pncB混合均匀，将8种混合质粒分别转化至E.coli BL21（DE3）MN中（42℃，90s），涂布于含有50 μ g/mL链霉素和50μg/mL氨苄青霉素的LB平板，37℃下培养12~16h，随机挑取单克隆抽提质粒进行测序鉴定，分别筛选获得含有PPTGDHE3/GDH/MjNadK、PPTGDHE3/GDH/ EcNadK、PPTGDHE3/GDH/CgNadK、PPTGDHE3/GDH/EhNadK、PPTGDHE3/GDH/ScNadK、PPTGDHE3/GDH/nadE、PPTGDHE3/GDH/nadD、PPTGDHE3/GDH/pncB的重组大肠杆菌E.coli BL21（DE3）MN/ pETDuet-1-PPTGDHE3-GDH/ pCDFDuet-1-MjNadK、E.coli BL21（DE3）MN/ pETDuet-1-PPTGDHE3-GDH/pCDFDuet-1-EcNadK、E.coli BL21（DE3）MN/ pETDuet-1-PPTGDHE3-GDH/ pCDFDuet-1-CgNadK、E.coli BL21（DE3）MN/ pETDuet-1-PPTGDHE3-GDH/ pCDFDuet-1-EhNadK、E.coliBL21（DE3）MN/ pETDuet-1-PPTGDHE3-GDH/ pCDFDuet-1-ScNadK、E.coli BL21（DE3）MN/pETDuet-1-PPTGDHE3-GDH /pCDFDuet-1-nadE、E.coli BL21（DE3）MN/ pETDuet-1-PPTGDHE3-GDH /pCDFDuet-1-nadD、E.coli BL21（DE3）MN/ pETDuet-1-PPTGDHE3-GDH /pCDFDuet-1-pncB。

实施例5：重组大肠杆菌的诱导表达

（1）含NADH激酶的大肠杆菌湿细胞的获得：分别将实施例2获得的5种重组大肠杆菌接种至含有50 μ g/mL链霉素抗性的LB液体培养基，37℃，200rpm下培养12h，再以1％（v/v）接种量接种至新鲜的含有50 μ g/mL链霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃，150rpm下培养至菌体OD600达0.6-0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，24℃下诱导培养16h后，4℃、8000rpm离心10min，弃去上清液，收集沉淀，用pH 7.5、20mM磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤两次，即获得含MjNadK、EcNadK、CgNadK、EhNadK、ScNadK的重组菌株E.coli BL21（DE3）MN/pCDFDuet-1-MjNadK、E.coli BL21（DE3）MN/pCDFDuet-1-EcNadK、E.coli BL21（DE3）MN/pCDFDuet-1-CgNadK、E.coli BL21（DE3）MN/pCDFDuet-1- EhNadK、E.coli BL21（DE3）MN/pCDFDuet-1-ScNadK的湿菌体。

（2）含辅酶合成途径酶的大肠杆菌湿细胞的获得：分别将实施例3获得的3种重组大肠杆菌接种至含有50 μ g/mL链霉素抗性的LB液体培养基，37℃，200rpm下培养12h，再以1％（v/v）接种量接种至新鲜的含有50 μ g/mL链霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃，150rpm下培养至菌体OD600达0.6-0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，24℃下诱导培养16h后，4℃、8000rpm离心10min，弃去上清液，收集沉淀，用pH 7.5、20mM磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤两次，即获得含NAD合成酶、烟酸腺苷酸转移酶、烟酸磷酸核糖转移酶的重组菌株E.coli BL21（DE3）MN/pCDFDuet-1-nadD、E.coli BL21（DE3）MN/pCDFDuet-1-nadE、E.coli BL21（DE3）MN/pCDFDuet-1-pncB的湿菌体。

（3）共表达大肠杆菌湿细胞的获得：分别将实施例4获得的5种重组大肠杆菌接种至含有50 μ g/mL链霉素和50μg/mL氨苄青霉素抗性的LB液体培养基，37℃，200rpm下培养12h，再以1％（v/v）接种量接种至新鲜的含有50 μ g/mL链霉素和50μg/mL氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃，150rpm下培养至菌体OD600达0.6~0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，24℃下诱导培养16h后，4℃、8000rpm离心10min，弃去上清液，收集沉淀，用pH 7.5、20mM磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤两次，即获得重组菌株E.coli BL21（DE3）MN/ pETDuet-1-PPTGDHE3-GDH/ pCDFDuet-1-MjNadK、E.coli BL21（DE3）MN/ pETDuet-1-PPTGDHE3-GDH/pCDFDuet-1-EcNadK、E.coli BL21（DE3）MN/ pETDuet-1-PPTGDHE3-GDH/ pCDFDuet-1-CgNadK、E.coli BL21（DE3）MN/ pETDuet-1-PPTGDHE3-GDH/ pCDFDuet-1-EhNadK、E.coliBL21（DE3）MN/ pETDuet-1-PPTGDHE3-GDH/ pCDFDuet-1-ScNadK、E.coli BL21（DE3）MN/pETDuet-1-PPTGDHE3-GDH /pCDFDuet-1-nadE、E.coli BL21（DE3）MN/ pETDuet-1-PPTGDHE3-GDH /pCDFDuet-1-nadD、E.coli BL21（DE3）MN/ pETDuet-1-PPTGDHE3-GDH /pCDFDuet-1-pncB的湿菌体，蛋白表达情况如图2和图3所示。

实施例6：胞内辅酶NADP（H）浓度的测定

利用EnzyChromTM NADP/NADPH Assay Kit进行辅酶测定。发酵液稀释至OD600为0.5左右，取1mL稀释后的发酵液，12000rpm离心1min，弃上清并用PBS缓冲液洗涤并再次离心弃上清，加入100μL NADP提取液（NADPH提取液），60℃保温5min，用于提取NADP（NADPH），随后加入20μL Assay Buffer和100μL相反的提取液用于中和，14000rpm离心5min，上清用于测定；96孔酶标板中加入40μL样品，80μL反应液，立即测定OD565，28℃保温30min后再次测定0D565，利用OD565前后差值与相应的标准曲线计算辅酶浓度。

其中反应液配方为：60μL Assay Buffer，1μL Enzyme Mix，10μL Glucose，14μLMTT。

含有不同来源NADH激酶的重组大肠杆菌E.coli BL21（DE3）MN/pCDFDuet-1-MjNadK、E.coli BL21（DE3）MN/pCDFDuet-1- EcNadK、E.coli BL21（DE3）MN/pCDFDuet-1-CgNadK、E.coli BL21（DE3）MN/pCDFDuet-1- EhNadK、E.coliBL21（DE3）MN/pCDFDuet-1-ScNadK中NADP（H）的浓度测定结果示于图4。从图4可以看出，表达MjNadK、EcNadK、CgNadK的细胞内NADP（H）提高了14.2%~71.4%，而表达EhNadK、ScNadK的细胞NADP（H）无提高，优选的NAD激酶为MjNadK。

含有不同辅酶合成途径酶的重组大肠杆菌E.coli BL21（DE3）MN/pCDFDuet-1-nadD、E.coli BL21（DE3）MN/pCDFDuet-1-nadE、E.coli BL21（DE3）MN/pCDFDuet-1-pncB中NADP（H）的浓度测定结果示于图5。从图5可以看出，表达nadE、pncB后胞内NADP(H)分别提高了114.5%、70.3%，而表达nadD后NADP（H）无提高，优选的辅酶合成途径酶为nadE。

含有不同NADH激酶与谷氨酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶共表达大肠杆菌中NADP（H）的浓度测定结果示于图6。从图6可以看出，MjNadK、EcNadK、CgNadK共表达菌株内NADP（H）提高了16.7%~77.2%，EhNadK、ScNadK共表达菌株内NADP（H）无提高。

含有不同辅酶合成途径酶与谷氨酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶共表达大肠杆菌中NADP（H）的浓度测定结果示于图7。从图7可以看出，把nadE基因共表达后，与对照相比辅酶含量增加了41%。

实施例7：MjNadK/nadE/PPTGDH/GDH共表达菌株的构建

以pCDFDuet-1-MjNadK为载体，利用引物13、14进行线性化，以大肠杆菌E.coliBL21(DE3)基因组为模板，利用引物15、16进行扩增，按实施例3所述重组载体构建方法，构建重组载体pCDFDuet-1-MjNadK-nadE。

按实施例4所述方法，将pETDuet-1-PPTGDH3-GDH和pCDFDuet-1-MjNadK-nadE共转化至大肠杆菌E. coliBL21(DE3) MN中，筛选阳性克隆，获得MjNadK/nadE/PPTGDH/GDH共表达菌株。

按实施例5所述方法获得MjNadK/nadE/PPTGDH3/GDH共表达大肠杆菌湿细胞。

按实施例6所述方法对MjNadK/nadE/PPTGDH3/GDH共表达大肠杆菌中的辅酶进行检测，结果如下表所示：

结果可见，与E.coli BL21（DE3）MN/pETDuet-1-PPTGDH-GDH相比，MjNadK/nadE/PPTGDH3/GDH共表达大肠杆菌胞内辅酶浓度提高83.1%。

实施例8：重组大肠杆菌活力测定

取实施例5和实施例7所得湿细胞，用100mM 磷酸钾缓冲液（pH7.5）重悬成100g/L菌悬液；分别配置2-羰基-4-（羟基甲基氧膦基）-丁酸400mM、葡萄糖500mM、硫酸铵600mM，反应体系为：

2-羰基-4-（羟基甲基氧膦基）-丁酸250μL；

葡萄糖250μL；

硫酸铵250μL；

菌悬液100μL；

磷酸钾缓冲液（pH7.5）150μL。

35℃、600rpm反应10min，取样100μL，用5μL 6M HCl终止反应，稀释100倍后用高效液相色谱检测2-羰基-4-（羟基甲基氧膦基）-丁酸减少量与L-草铵膦生成量。

色谱条件为：

2-羰基-4-（羟基甲基氧膦基）-丁酸检测方法：

色谱柱型号：QS-C18，5μm，4.6×250mm。流动相：将5.75g磷酸二氢胺溶于800mL超纯水中，加入1g四丁基氢氧化铵用水稀释并定容至1000mL，用磷酸调pH到3.8，与乙腈以体积比88:12混合。检测波长为232nm，流速：1.0mL/min。柱温：40℃，2-羰基-4-（羟基甲基氧膦基）-丁酸出峰时间为：9.7分钟。

草铵膦通过柱前衍生化高效液相色谱进行检测，具体方法为：

色谱条件：色谱柱型号：QS-C18，5 μ m，4.6×250mm。流动相：50mM乙酸铵溶液：甲醇＝10:1。荧光检测波长：λ ex＝340nm，λ em＝455nm。流速：1mL/min。柱温：30℃， L-草铵膦出峰时间为8.5min，D-草铵膦出峰时间为10.2min。

衍生化试剂：分别称取0.1g邻苯二甲醛与0.12g N-乙酰-L-半胱氨酸，用10mL乙醇助溶，再加入40mL 0.1moL/L硼酸缓冲液（pH9.8），振荡使其充分溶解，4℃冰箱保存备用。

衍生化反应与测定：取200μL样品加入400μL衍生化试剂，在振荡器上500rpm，30℃震荡5min，再加入400μL超纯水混匀，进样10μL进行HPLC分析。

利用2-羰基-4-（羟基甲基氧膦基）-丁酸和草铵膦标准品绘制浓度-峰面积标准曲线，利用标准曲线计算样品浓度，根据产物生成量计算细胞活力。其中活力单位定义：1分钟内催化生成1μmol L-草铵膦所需要的湿细胞量定义为1U。比活力定义：每克湿细胞具有的活力单位数。

实施例4中获得的NADH激酶、谷氨酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶共表达大肠杆菌比活力示于图8。如图8所示，导入不同NADH激酶后，细胞比活力提高25.6%~83.1%。

实施例4中获得的辅酶合成途径酶、谷氨酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶共表达大肠杆菌比活力示于图9。如图9所示，与对照相比，导入nadE后，比活力提高12.5%。

实施例7中获得的MjNadK/nadE/PPTGDH/GDH共表达大肠杆菌比活力如下表所示。

可见，与E.coli BL21（DE3）MN/pETDuet-1-PPTGDH-GDH相比，MjNadK/nadE/PPTGDH3/GDH共表达大肠杆菌比活力提高144.8%。

实施例9：辅酶自足型重组大肠杆菌湿菌体的制备

将实施例7所得重组大肠杆菌单菌落接种至含有50 μ g/mL氨苄青霉素和链霉素抗性的LB液体培养基，37℃，200rpm下培养12h，再以1％(v/v)接种量接种至新鲜的含有50μ g/mL氨苄青霉和链霉素素抗性的发酵培养基中，其中发酵培养基含有0~40mg/L的L-天冬氨酸、喹啉酸、烟酸、烟酰胺、腺嘌呤、ATP中的一种，于37℃，150rpm下培养至菌体OD600达0.6-0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，24℃下诱导培养16h后，4℃、8000rpm离心10min，弃去上清液，收集沉淀，用pH 7.5、20mM磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤两次，即获得湿菌体。

发酵培养基组成如下：蛋白胨 24 g/L，酵母粉 16 g/L，NaCl 5 g/L，NaSO₄2 g/L，(NH₄)₂SO₄2.5 g/L，NH₄Cl 0.5 g/L，一水合柠檬酸 1 g/L，K₂HPO₄·3H₂O 19.12 g/L，NaH₂PO4·2H₂O 3.6 g/L，MgSO₄·7H₂O 2 g/L，氨基酸或吡啶化合物 20mg/L，甘油 8 g/L，tracemetal solution 1mL/L，消泡剂1mL/L，溶剂为水；其中trace metal solution组成如下：FeSO₄·7H₂O 10 g/L，CaCl₂2 g/L，ZnSO₄·7H₂O 2.2 g/L，MnSO₄·4H₂O 0.5 g/L，CuSO₄·5H₂O 1 g/L，(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 0.1 g/L，NaB₄O₇·10H₂O 0.02 g/L，溶剂为水。

按实施例6所述方法，对培养所得湿菌体的胞内辅酶浓度进行测定，添加L-天冬氨酸、喹啉酸、烟酸、烟酰胺后辅酶浓度均有提高，其中喹啉酸最适添加量为20mg/L，辅酶浓度提高23.8%；L-天冬氨酸最适添加量为20mg/L，辅酶浓度提高52.3%；烟酸最适添加量为30mg/L，辅酶浓度提高27.6%；烟酰胺最适添加量为10mg/L，辅酶浓度提高14.3%；而腺嘌呤和ATP在不同添加浓度下均没有导致辅酶浓度的提高，两者在高浓度下反而导致辅酶浓度的下降。

按实施例8所述方法，对培养所得湿菌体的比活力进行测定，如图10所示，喹啉酸添加量20mg/L时活力提高33.4%；L-天冬氨酸添加量20mg/L时活力提高41.7%；烟酸添加量30mg/L时活力提高43.9%；烟酰胺添加量10mg/L时活力提高26.5%，而腺嘌呤和ATP的添加没有导致活力提高。

优选的，辅酶合成前体添加物为L-天冬氨酸20mg/L。

实施例10：MjNadK/nadE/PPTGDH/GDH共表达大肠杆菌催化合成L-草铵膦

根据实施例9所述的方法，通过发酵获得包含MjNadK/nadE/PPTGDH/GDH的重组大肠杆菌湿菌体，利用容积为1L的机械搅拌式反应器进行催化合成L-草铵膦，具体反应体系为：

湿细胞分别取15g/L、20g/L、25g/L；

2-羰基-4-（羟基甲基氧膦基）-丁酸200mM；

葡萄糖250mM；

硫酸铵300mM；

蒸馏水定容至300mL；

通过自动补加15%氨水控制pH在7.5，通过夹套加热和冷却水控制温度在35℃，转速设定为500rpm。

反应进程示于图11，作为对照的大肠杆菌E.coli BL21(DE3)-pETDuet-1-PPTGDH3/GDH在25g/L时需要10h实现底物完全转化，而MjNadK/nadE/PPTGDH/GDH共表达大肠杆菌在相同条件下仅需4h，并且菌体用量降低至15g/L后仍仅需5h实现完全反应。

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 辅酶自足型大肠杆菌及其构建方法与应用

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 960

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 1

atgacagcac ctaccaacgc aggggagctg cgtcgcgtcc ttctggtgcc acatactggt 60

cgttcttcga atatcgaatc cgcgatcctg gcagcgaaat tattagacga tgcggggatt 120

gatgtccgtg tccttattaa tgatgccgac gaccctattg ctgaacactc tgtattgggc 180

cgctttaccc acgttcgtca cgccgcagac gcggcagatg gagctgaact tgtccttgtt 240

ttggggggag acggcacctt cttgcgtgct gctgatatgg ctcacgcggt tgatctgccg 300

gttctgggaa tcaatttagg tcatgtgggc ttcctggcgg aatgggaaag tgatagtctg 360

gaggaagcat tgaagcgtgt gattgaccgt gactaccgca tcgaagatcg catgacactt 420

acagttgttg tcctggacgg gggtggtgaa gagattggac gtggctgggc acttaacgaa 480

gtgagcatcg aaaacctgaa tcgccgcggc gttttggatg caacgttgga ggtagacgct 540

cgtccagtag catccttcgg gtgcgacggg gtcttaatct ctactcccac aggctcgaca 600

gcttacgcct ttagcgctgg gggcccagtc ctgtggcctg aactggacgc gattttggtc 660

gtgcctaata acgcccatgc gttgtttacg aagcccttgg tcgtgtcgcc gaagagtaca 720

gtcgctgtcg aaagtaactc cgatactagc gcagctatgg cagtaatgga cggtttccgc 780

cccattccga tgccccctgg gagtcgcgta gaagtcactc gtggggaacg tccagtccgc 840

tgggtacgtc ttgactcctc acccttcact gatcgtttgg tcagcaaact tcgcttacct 900

gtgacgggct ggcgtggccc gcaaaagcag gcagaaaata aagacccgcg cagcgcaggg 960

<210> 2

<211> 876

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 2

atgaacaacc acttcaagtg cattggtatt gtcgggcacc ctcgccatcc tacggctctt 60

acaacacacg aaatgttata tcgctggttg tgtaccaagg gctacgaagt cattgttgaa 120

cagcagattg cacatgaact gcaacttaaa aatgtcaaga ctggaacctt agctgaaatt 180

ggacaactgg cagatttggc ggtcgtcgta gggggggacg gaaatatgtt gggtgctgcc 240

cgcactttgg cacgctatga tattaaggta atcgggatta accgtggtaa ccttggattc 300

ctgactgatc tggacccaga caacgcacag cagcaacttg ctgatgtgct ggaaggacac 360

tatatttccg agaagcgttt ccttctggag gcgcaagtat gccagcaaga ctgccagaaa 420

cgtatttcaa cggccattaa tgaagtagtt ctgcaccctg ggaaagtagc acatatgatc 480

gagttcgagg tgtacatcga cgagatcttc gcattctcgc agcgttcgga cggtttaatc 540

atcagtacac caactggctc aaccgcgtat tccttatcgg ccggtggccc gattttgact 600

ccgtcattgg atgctattac tctggtgccc atgtttcccc atacattatc tgcccgtcca 660

ttagtaatta acagttcatc aacaatccgt ctgcgcttct ctcaccgccg taatgacctg 720

gagatttcct gcgactctca aatcgcactg cctatccaag agggtgaaga tgttcttatt 780

cgtcgttgcg attaccactt aaatcttatt catccgaaag actattccta ctttaacaca 840

cttagtacga agttaggctg gtccaaaaaa ttattt 876

<210> 3

<211> 1722

<212> DNA

<213> Methanocaldococcus jannaschii

<400> 3

atggtcatca tggaagggtt taaaatcgct atgaaggtga ttgacgaaat cgataaaaag 60

attaagccat taattgggtg ggaaaaggcc gatgaagtcg ttaaaattgg ggctgacggt 120

actcctacaa aacgcattga tgtaattgca gaaaacatgg cgattaacat cttggagaaa 180

ttctctggtg gtatcttaat ttctgaagaa atcggattga aagtggtagg agatgaatta 240

gagtatatct ttattcttga tcctatcgac ggtacgtata acgcattgaa atcaattccc 300

atctattcta ccagcatcgc cgtcgcgaag atcaagggtg aagataaaaa gttaattcgt 360

gagaatatca acaatattga ttggatcaaa tcttttatcg ccaataaata tactattaat 420

gacctttatg ttggcatcgt aaagaatctg gctactggcg acctttacta tgcaattaag 480

ggcgaaggct ccttcttaga gaaagacggg gaaaaaatta agattgaaac taagaatatt 540

aaagacttaa aggaggcgtc ggttggtttg tttgtatatg gcttgagtaa tgatttattg 600

gaattcctta aagaacgtaa agtccgccgt gttcgtttgt ttggttcaat ggcattagag 660

atgtgttacg tggtatcggg ggcgcttgac gcatatatta acgtaaatga gaacagtcgt 720

ctttgtgata tcgcgggtgc gtatgtaatt tgtcgcgaag ggaacgcaat cgtaaccaat 780

aagaacggaa aaccgttaaa tatgaaattg cacctgatgg aacgtacttc actgatcgtc 840

agcaacaaat accttcataa aaaacttatt gctctttttg gaaaccgttg gatcattaag 900

ccagtcaaat ttggaatcgt ggtccgcgag gataaggagg aggcaattaa ccttgccatc 960

gaaatttgta agtacttgaa agataaaaac atcccattct gcgtggaaga tttcctgcgc 1020

gaacgcgttg ggggtgataa attcgatatc agtgccattt cacacattat tgccatcggg 1080

ggagacggaa ctattttacg tgctagtcgc cttgtgaatg gtgagacaat tccaattatt 1140

gcagttaaca tggggaaagt cggttttctt gccgagtttt gcaaggatga ggtcttcgaa 1200

atcattgata aggtgattta cggggagtac gaaattgaaa aacgctcgaa gttatcctgc 1260

aagattatca aggacaaccg tgttatcaaa acaccatccg ccttgaacga aatggtggtt 1320

atcactaaga acccagcgaa gatcctggaa ttcgatgtct acgtgaacga cacgcttgta 1380

gagaacgtgc gcgctgacgg tatcatcgta agcacgccta ctggatcgac agcctattct 1440

ttgtccgcgg gagggccaat cgttgaacca aatgtagatt gcttcattat ctcgcctatt 1500

tgtccattta aactgtcaag ccgtccgctt gttatttcag cgtcgaatcg cattaagtta 1560

aagcttaagc tggaaaaacc cgctctttta gtcatcgacg ggagcgtaga gtacgaaatt 1620

aacaaagatg atgaactgat ctttgagaaa tccgatagtt acgcatactt cgtgaagggc 1680

caatcgtttt acaacaagtt aagtcgctgt cttggtatta aa 1722

<210> 4

<211> 783

<212> DNA

<213> Entamoeba histolytica

<400> 4

atgaccacat tacagattga tcatattcgt gctaaattcc atattgacga ctacaaccaa 60

aaggctcctg acgtggcccg ccagtttgaa cgtattcatg atgaagtcaa tccaaacgtc 120

gtcatgacgt tcgggggaga tggcaccttc ctgaaagcct ttcacgaaaa ttatcatctt 180

caacttccct accttggaat taattgtggg aacgtgggtt atctgatcaa cccaatccaa 240

gaagttatgg acagcatcga gcaaaacaag ccccttaaat gctactctta tccttgcctg 300

aaggttgatg cctcaaacgg gagcacgcag ctgtcgaccc aacttgcatt caacgacgct 360

tggattgaac gccttaacgg acaatgctgc tggttcgagg tcatcatcaa cggggttgta 420

cgtatcccaa aattgtgttg tgacggaatt gtggtatgta cccctgccgg cagcacgggc 480

tactccaagt ccattggcgt catgccaatt cctccaaatg cgaacatgat cgggtttgtt 540

cctaataacg cgagctaccc tttgggcatt cgccccttat atctgccgtt agacacagag 600

gtaattgtta aaaatatcca gccaaaccgt cgtaaaacac gcggatttta tgatggggtc 660

gagctgaacg aaatcactga attgaagatc aaggctatcg agaacggctg ccgcgttatc 720

tacgctcatg aggagaacct gaacaaaacc tacattaata aagtcacaaa ggatttcttt 780

gaa 783

<210> 5

<211> 1242

<212> DNA

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 5

atgttcgtcc gtgtaaaact taataagcca gttaaatggt atcgctttta ttccacgctt 60

gattcacatt cgctgaaatt acagagtggg tctaaattcg ttaagattaa acctgtcaac 120

aacctgcgct ctagtagttc agcggatttc gtcagtcctc ccaactccaa attacagtcc 180

ttgatctggc agaatccttt acagaatgtg tatattacca agaagccgtg gactccatca 240

actcgcgagg ctatggtgga gttcattact caccttcacg agtcctaccc cgaggtaaac 300

gttattgtcc agcctgacgt tgccgaagaa atcagtcaag actttaaatc tcctctggag 360

aacgacccta atcgcccgca tattctgtat acgggtcccg aacaggacat cgtcaatcgc 420

actgacttgt tggtgacgtt agggggtgac gggactatcc tgcacggggt ctccatgttt 480

ggtaatacgc aagtgcctcc cgttcttgca ttcgcgcttg gaacccttgg gttcttgtcc 540

ccctttgatt ttaaagagca taagaaagtt tttcaagagg ttatctcttc gcgtgcaaag 600

tgtctgcatc gtacccgttt ggaatgtcat cttaagaaaa aagattcgaa ttccagtatt 660

gtaacccacg ccatgaatga tattttctta caccgcggca attcacccca tttaaccaat 720

ctggacatct ttattgatgg agagtttttg actcgcacca cggctgacgg tgtcgcttta 780

gcaacgccca ctggatctac agcgtactca ttatctgctg gcggcagcat tgttagccca 840

ctggtccctg ctatcctgat gactccgatc tgccctcata gtctgtcttt tcgccccttg 900

attttgcccc actcaagcca tatccgcatc aaaatcggat caaaacttaa ccagaaacct 960

gtcaactccg tagtaaagtt atcggtggat gggattccac agcaggacct tgacgttgga 1020

gacgaaattt atgtcatcaa tgaggtgggc acaatttata ttgatgggac tcaattgcca 1080

actacccgta agacagaaaa cgattttaat aattcaaaga aaccaaaacg tagtggtatt 1140

tattgtgtgg ctaagacaga gaacgattgg atccgcggga tcaatgagtt gttaggattt 1200

aactcatcct ttcgcttaac gaagcgtcaa accgataatg at 1242

<210> 6

<211> 789

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 6

atgggttata attctctgaa aggcaaagtc gcgattgtta ctggtggtag catgggcatt 60

ggcgaagcga tcatccgtcg ctatgcagaa gaaggcatgc gcgttgttat caactatcgt 120

agccatccgg aggaagccaa aaagatcgcc gaagatatta aacaggcagg tggtgaagcc 180

ctgaccgtcc agggtgacgt ttctaaagag gaagacatga tcaacctggt gaaacagact 240

gttgatcact tcggtcagct ggacgtcttt gtgaacaacg ctggcgttga gatgccttct 300

ccgtcccacg aaatgtccct ggaagactgg cagaaagtga tcgatgttaa tctgacgggt 360

gcgttcctgg gcgctcgtga agctctgaaa tacttcgttg aacataacgt gaaaggcaac 420

attatcaata tgtctagcgt ccacgaaatc atcccgtggc ctactttcgt acattacgct 480

gcttctaagg gtggcgttaa actgatgacc cagactctgg ctatggaata tgcaccgaaa 540

ggtatccgca ttaacgctat cggtccaggc gcgatcaaca ctccaattaa tgcagaaaaa 600

ttcgaggatc cgaaacagcg tgcagacgtg gaaagcatga tcccgatggg caacatcggc 660

aagccagagg agatttccgc tgtcgcggca tggctggctt ctgacgaagc gtcttacgtt 720

accggcatca ccctgttcgc agatggtggc atgaccctgt acccgagctt tcaggctggc 780

cgtggttga 789

<210> 7

<211> 1338

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 7

atgattgaga gcgtcgagtc tttcttggcc cgccttaaaa agcgcgaccc tgaccagccg 60

gagtttcatc aggcagttga ggaagtctta cgctcattat ggccgttcct ggaagctaac 120

ccccgttatt tgactagcgg cattcttgaa cgtatttgcg agccggaacg tgccatcgtt 180

ttccgtgtga gctgggtaga cgaccaagga aaggtgcaag tgaaccgtgg cttccgcatc 240

cagatgaact cagctatcgg cccatataaa ggcgggttgc gttttcatcc aagcgttaat 300

ttgggtgtct taaaattctt agcgttcgag caaacattta aaaacagctt aacatcgtta 360

cccatgggtg gaggaaaggg tggtagtgac ttcgacccaa aggggaagag cgatgcggaa 420

gtcatgcgtt tctgccaggc attcatgtca gagctttacc gtcacatcgg ggcggacgtc 480

gatgtgccag cgggagatat tggcgtgggt gcgcgcgaga ttggattttt attcggtcag 540

tataagcgtc tgtctaacca gttcacctcg gtacttacgg gtaagggacc gtcatatggc 600

ggcagtttga ttcgcccaga agctaccgga tttggttgtg tttattttgc cgaagaaatg 660

cttaagcgcc gtggagaaac cgtggaaggc aagcgtgttg ccattagtgg ctctgggaac 720

gtagcgcagt atgcggcccg caaggtgatg gatcttggcg gaaaagtcat ttctttatca 780

gacagcgagg gcacattata ctgcgaatcc ggtttgactg aagctcaatg gcaagcagtg 840

ttggaactga agaatgtaca acgtggccgt atttcagaat tagccggacg ctttggtctt 900

gaatttttag cgggccaacg cccctggggt ttatcttgcg atatcgccct tccttgcgcg 960

acgcagaacg agcttgacgc cgaagctgcg cgtgctttac ttcgtaatgg atgcacgtgc 1020

gtcgctgaag gggcgaacat gccgacaacc cttgaggcgg ttgatctgtt tatcgaagcg 1080

ggtattctgt tcgctccagg taaagcctcg aatgctggcg gggttgcagt gtcgggttta 1140

gagatgtcgc aaaacgcaat gcgtttattg tggacagggg gcgaggttga ctcaaaattg 1200

catgctatca tgcagagcat ccatcatgct tgcgtacatt acggtgaaga gaacggtcag 1260

gtaaactacg taaagggggc gaatattgct ggattcgtga aggttgctga tgcaatgctg 1320

gcacaggggg tcgtctaa 1338

<210> 8

<211> 828

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 8

atgacattgc aacaacaaat aataaaggcg ctgggcgcaa aaccgcagat taatgccgaa 60

gaggaaattc gtcgtagtgt cgattttctg aaaagctacc tgcgaactta tccgttcatt 120

aaatcactgg tgctcgggat cagcggcggt caggactcca cgcttgccgg aaagctgtgc 180

cagatggcga ttaatgagct gcgccaggaa accggcaacg aatcactgca atttattgcc 240

gtacgcctgc cctatggtgt tcaggccgac gaacaagatt gccaggatgc cattgccttt 300

attcaaccgg atcgcgtatt aaccgttaat atcaagggcg cggtattggc tagcgagcag 360

gcattgcggg aagcaggcat tgaactgagc gattttgtcc gtggcaatga aaaagcgcgt 420

gagcggatga aagcacaata tagcattgcg ggtatgacca gcggtgtcgt ggtgggcacc 480

gatcatgcag cagaagccat taccggattc ttcactaaat atggtgacgg cggtacggat 540

attaatccgc tgtatcgtct caacaaacgt cagggtaaac agttactggc ggcattaggt 600

tgcccggaac acctttataa gaaagcgcca acggccgatc tggaagatga tcgcccttct 660

ctgccagatg aagtggcact cggcgtgacc tatgacaata tcgacgacta tctggaaggg 720

aaaaacgtac ctcaacaggt cgccagaaca atagagaact ggtatctgaa aaccgaacat 780

aaacgccgtc cgccaattac cgttttcgat gatttctgga aaaagtaa 828

<210> 9

<211> 642

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 9

atgaaatctt tacaggctct gtttggcggc acctttgatc cggtgcacta tggtcatcta 60

aaacccgtgg aaacgctggc gaatttgatt ggtctgacgc gggtcacaat catccctaat 120

aatgttcctc cgcatcgtcc ccagccggaa gcgaacagcg tgcagcgtaa acacatgctt 180

gaactggcga ttgccgacaa gccattattt actcttgatg aacgcgagct aaagcgcaat 240

gccccctctt acactgcgca aacactgaaa gagtggcggc aggaacaagg accggacgtg 300

ccgctggcgt ttattattgg tcaggattca ttgctgacct ttccgacctg gtacgaatac 360

gaaacgatac tcgacaatgc acatttgatc gtctgtcggc gtccaggtta cccacttgaa 420

atggcgcaac cgcaatacca gcaatggctg gaagatcatt tgacacataa cccggaagat 480

cttcaccttc agcctgccgg taaaatttat ctggctgaaa cgccgtggtt taacatctcg 540

gcgaccatca tccgcgaacg tttgcaaaac ggtgaatcgt gtgaggattt attgccggaa 600

ccggtattga cttacattaa ccaacaaggc ttgtatcgct ga 642

<210> 10

<211> 1203

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 10

atgacacaat tcgcttctcc tgttctgcac tcgttgctgg atacagatgc ttataagttg 60

catatgcagc aagccgtgtt tcatcattat tacgatgtgc atgtcgcggc ggagtttcgt 120

tgccgaggtg acgatctgct gggtatttat gccgatgcta ttcgtgaaca gattcaggcg 180

atgcagcacc tgcgcctgca ggatgatgaa tatcagtggc tttctgccct gcctttcttt 240

aaggccgact atcttaactg gttacgcgag ttccgcttta acccggaaca agtcaccgtg 300

tccaacgata atggcaagct ggatattcgt ttaagcggcc cgtggcgtga agtcatcctc 360

tgggaagttc ctttgctggc ggttatcagt gaaatggtac atcgctatcg ctcaccgcag 420

gccgacgttg cgcaagccct cgacacgctg gaaagcaaat tagtcgactt ctcggcgtta 480

accgccggtc ttgatatgtc gcgcttccat ctgatggatt ttggcacccg tcgccgtttt 540

tctcgcgaag tacaagaaac catcgttaag cgtctgcaac aggaatcctg gtttgtgggc 600

accagcaact acgatctggc gcgtcggctt tccctcacgc cgatgggaac acaggcacac 660

gaatggttcc aggcacatca gcaaatcagc ccggatctag ccaacagcca gcgagctgca 720

cttgctgcct ggctggaaga gtatcccgac caacttggca ttgcattaac cgactgcatc 780

actatggatg ctttcctgcg tgatttcggt gtcgagttcg ctagtcggta tcaaggcctg 840

cgtcatgact ctggcgaccc ggttgaatgg ggtgaaaaag ccattgcaca ttatgaaaag 900

ctgggaattg atccacagag taaaacgctg gttttctctg acaatctgga tttacgcaaa 960

gcggttgagc tataccgcca cttctcttcc cgcgtgcaat taagttttgg tattgggact 1020

cgcctgacct gcgatatccc ccaggtaaaa cccctgaata ttgtgattaa gttggtagag 1080

tgtaacggta aaccggtggc gaaactttct gacagccctg gcaaaactat ctgccacgat 1140

aaagcgtttg ttcgggcgct gcgcaaagcg ttcgaccttc cgcatattaa aaaagccagt 1200

taa 1203

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 11

acaaaaatta tggttgccga 20

<210> 12

<211> 120

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 12

cagtgagaaa tgtaaaaacc atgttaaaca tgccagtgat gcaaaggtag tgcaagagct 60

tgatacactg accgcctgac gcactaagga acagccaaaa tgaccgaact taaaaacgat 120

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 13

atccggaaaa cggctgcccg 20

<210> 14

<211> 120

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 14

tcacttctat tctggtcaca ggtttccacc tgacagaccc gcaattttca ggacaattca 60

gggaattacg cggtcaagcg ccatttgtgt cattttttaa atgacaagcg cttgatttgc 120

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 15

gggctgcacg ctacagcagg 20

<210> 16

<211> 120

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 16

aaaactctcc gacgcgctta gcgtgttcga cgacttataa tgaggaatac ggagggagat 60

ccgcgatgaa acggctcaaa ggcgaggtat aaaataagtt ttttgatgag ttgaaaacct 120

Claims

1.一种辅酶自足型大肠杆菌，由如下方法构建获得：

（1）构建表达载体，将NADH激酶基因、葡萄糖脱氢酶基因、草铵膦脱氢酶基因以及NADP辅酶合成途径的基因转化至大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中，筛选正确的转化子，得到草铵膦脱氢酶-葡萄糖脱氢酶-NADH激酶共表达基因工程菌；所述NADH激酶基因序列如SEQ IDNo.3所示，所述葡萄糖脱氢酶基因序列如SEQ ID No.6所示，所述草铵膦脱氢酶基因序列如SEQ ID NO.7所示，所述NADP辅酶合成途径的基因序列如SEQ ID No.8所示；

（2）敲除共表达基因工程菌基因组中mazG和nadR基因，得到所述辅酶自足型大肠杆菌。

2.构建权利要求1所述辅酶自足型大肠杆菌的方法，所述方法包括：

3.权利要求1所述辅酶自足型大肠杆菌在制备L-草铵膦中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述应用为：以所述辅酶自足型大肠杆菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体超声破碎提取的酶液为催化剂，以2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸为底物，加入硫酸铵和葡萄糖，以pH值为7.5的缓冲液为反应介质构成反应体系，在35℃~40℃、500~600rpm条件下反应，反应结束后反应液分离纯化，获得L-草铵膦。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述反应体系中，催化剂用量以湿菌体总重量计为10～50g/L，底物的初始浓度为10～500mM，葡萄糖添加量为12~750mM，硫酸铵添加量为50mM~1.5M。

6.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述反应体系中，催化剂用量以湿菌体总重量计为15g/L，底物的初始浓度为200mM，葡萄糖添加量为250mM，硫酸铵添加量为300mM。