CN102834515B - 新的水解酶蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明的课题在于：提供用于将2乙烯基环丙烷1,1二甲酸二烷基酯通过酶水解，有效制得可用作丙型肝炎治疗药合成中间体的(1S,2S)1烷氧基羰基2乙烯基环丙烷甲酸的新的水解酶。根据本发明，可提供包含如序列号2~5的任一项所示氨基酸序列，具有以高于包含如序列号1所示氨基酸序列的蛋白质的选择性，催化由2乙烯基环丙烷1,1二甲酸二乙酯向(1S,2S)1乙氧基羰基2乙烯基环丙烷甲酸的反应的活性的水解酶蛋白。

Description

新的水解酶蛋白
技术领域
本发明涉及可用于(1S,2S)-1-烷氧基羰基-2-乙烯基环丙烷甲酸的制备的新的水解酶蛋白及其用途。
背景技术
(1S,2S)-1-烷氧基羰基-2-乙烯基环丙烷甲酸为对正在作为丙型肝炎治疗药开发的各种HCV NS3蛋白酶抑制剂等的制备有用的中间体。在非专利文献1中记载有将2-乙烯基环丙烷-1,1-二甲酸二甲酯通过酶水解，制得(1S,2S)-1-甲氧基羰基-2-乙烯基环丙烷甲酸的方法，但酶的光学选择性不足，制得的(1S,2S)-1-甲氧基羰基-2-乙烯基环丙烷甲酸的光学纯度为90% e.e.，不适合作为药品中间体的工业制备方法。
另外，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) ATCC23857的基因组序列众所周知，源于该枯草芽孢杆菌ATCC23857株的对硝基苄基酯酶(以下有时称为“PNBE23857”)的氨基酸序列登记于GenBank登录号ZP_03593235中。
先前技术文献
非专利文献
非专利文献1：C. Fliche等, Synth. Commun. 24(20), 2873-2876 (1994)。
发明内容
发明所要解决的课题
本发明所要解决的课题在于，提供用于将2-乙烯基环丙烷-1,1-二甲酸二烷基酯通过酶水解，有效制得可用作丙型肝炎治疗药制备用中间体的(1S,2S)-1-烷氧基羰基-2-乙烯基环丙烷甲酸的新的水解酶蛋白。
解决课题的手段
本发明人为解决上述课题而深入研究的结果发现：源于枯草芽孢杆菌的对硝基苄基水解酶蛋白可以良好的选择性水解2-乙烯基环丙烷-1,1-二甲酸二乙酯，有效制得(1S,2S)-1-乙氧基羰基-2-乙烯基环丙烷甲酸。另外，当根据已知的源于枯草芽孢杆菌的对硝基苄基水解酶蛋白的DNA序列信息，克隆近亲的枯草芽孢杆菌所具有的对硝基苄基水解酶基因，确认该基因所编码的对硝基苄基水解酶蛋白的活性时，成功获得以高于已知的对硝基苄基水解酶蛋白的选择性催化上述水解反应的新的同源物。此外，当根据对硝基苄基水解酶蛋白的已知的立体结构信息，进行上述新的同源物的同源建模(homology modeling)，进行相对于底物结合部位附近的氨基酸残基的诱变试验时，成功制备以更高的选择性催化上述水解反应的水解酶蛋白。本发明基于上述见解完成。
即，根据本发明，提供以下发明。
[1] 水解酶蛋白，所述水解酶蛋白由如序列号2~5的任一项所示氨基酸序列组成，具有以高于由如序列号1所示氨基酸序列组成的蛋白质的选择性催化如式(1)所示反应的活性：
。
[2] 水解酶蛋白，所述水解酶蛋白由在如序列号1~5的任一项所示氨基酸序列中氨基酸编号70号、106号、107号、108号、219号、270号、271号、272号、273号、274号、275号、276号和313号氨基酸中1个以上被侧链体积小于野生型氨基酸的氨基酸所取代的氨基酸序列组成，具有以高于由如序列号1所示氨基酸序列组成的蛋白质的选择性催化如式(1)所示反应的活性：
。
[3] 水解酶蛋白，所述水解酶蛋白由在如序列号1~5的任一项所示氨基酸序列中氨基酸编号188号、190号、193号、215号、216号、217号、314号、358号、362号和363号氨基酸中1个以上被侧链体积大于野生型氨基酸的氨基酸所取代的氨基酸序列组成，具有以高于由如序列号1所示氨基酸序列组成的蛋白质的选择性催化如式(1)所示反应的活性：
。
[4] 水解酶蛋白，所述水解酶蛋白由在如序列号1~5的任一项所示氨基酸序列中氨基酸编号70号、106号、107号、108号、219号、270号、271号、272号、273号、274号、275号、276号和313号氨基酸中1个以上被侧链体积小于野生型氨基酸的氨基酸所取代，且氨基酸编号188号、190号、193号、215号、216号、217号、314号、358号、362号和363号氨基酸中1个以上被侧链体积大于野生型氨基酸的氨基酸所取代的氨基酸序列组成，具有以高于由如序列号1所示氨基酸序列组成的蛋白质的选择性催化如式(1)所示反应的活性：
。
[5] [2]或[4]中记载的水解酶蛋白，其中，在如序列号1~5的任一项所示氨基酸序列中，至少氨基酸编号70号、270号、273号和313号氨基酸中1个以上氨基酸被取代。
[6] [5]中记载的水解酶蛋白，其中，在如序列号1~5的任一项所示氨基酸序列中，至少氨基酸编号70号的亮氨酸被天冬氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸或甘氨酸中的任一氨基酸所取代。
[7] [5]或[6]中记载的水解酶蛋白，其中，在如序列号3或4所示氨基酸序列中，氨基酸编号270号的亮氨酸被丝氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或丙氨酸中的任一氨基酸所取代。
[8] [5]或[6]中记载的水解酶蛋白，其中，在如序列号1、2或5的任一项所示氨基酸序列中，氨基酸编号270号的异亮氨酸被丝氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或丙氨酸中的任一氨基酸所取代。
[9] [5]~[8]的任一项中记载的水解酶蛋白，其中，在如序列号1~5的任一项所示氨基酸序列中，氨基酸编号273号的亮氨酸被精氨酸或组氨酸中的任一氨基酸所取代。
[10] [5]~[9]的任一项中记载的水解酶蛋白，其中，在如序列号1~5的任一项所示氨基酸序列中，氨基酸编号313号的亮氨酸被甲硫氨酸、丙氨酸或脯氨酸中的任一氨基酸所取代。
[11] 水解酶蛋白，所述水解酶蛋白由在如序列号4所示的氨基酸序列中氨基酸编号70号的亮氨酸被天冬氨酸所取代，270号的亮氨酸被谷氨酰胺、谷氨酸或丙氨酸中的任一氨基酸所取代，第273号的亮氨酸被精氨酸所取代，且第313号的亮氨酸被甲硫氨酸所取代的氨基酸序列组成，具有以高于由如序列号1所示氨基酸序列组成的蛋白质的选择性催化如式(1)所示反应的活性：
。
[12] 水解酶蛋白，所述水解酶蛋白由与[1]~[11]的水解酶蛋白的氨基酸序列具有90%以上同源性的氨基酸序列，或相对于[1]~[11]的水解酶蛋白的氨基酸序列具有1~数个氨基酸的取代、缺失和/或添加的氨基酸序列组成，具有以高于由如序列号1所示氨基酸序列组成的蛋白质的选择性催化如式(1)所示反应的活性：
。
[13] DNA，所述DNA编码[1]~[12]的任一项中记载的水解酶蛋白。
[14] [13]中记载的DNA，所述DNA由以下碱基序列组成：
(a) 序列号7~10中记载的碱基序列；
(b) 碱基序列，其为可与由序列号7~10中记载的碱基序列组成的DNA在严格条件下杂交的DNA，编码以下水解酶蛋白，所述水解酶蛋白具有以高于由如序列号1所示氨基酸序列组成的蛋白质的选择性催化如式(1)所示反应的活性；或
(c) 碱基序列，其为在序列号7~10中记载的碱基序列中具有1~数个碱基的取代、缺失和/或添加的碱基序列，编码以下水解酶蛋白，所述水解酶蛋白具有以高于由如序列号1所示氨基酸序列组成的蛋白质的选择性催化如式(1)所示反应的活性；
。
[15] (1S,2S)-1-烷氧基羰基-2-乙烯基环丙烷甲酸的制备方法，所述制备方法包括使[1]~[12]的任一项中记载的水解酶蛋白作用于2-乙烯基环丙烷-1,1-二甲酸二烷基酯来制备(1S,2S)-1-烷氧基羰基-2-乙烯基环丙烷甲酸的工序。
发明的效果
本发明的水解酶蛋白具有可在水解2-乙烯基环丙烷-1,1-二甲酸二烷基酯制备1-烷氧基羰基-2-乙烯基环丙烷甲酸时优先生成(1S,2S)-1-烷氧基羰基-2-乙烯基环丙烷甲酸的高选择性。即，根据本发明的水解酶蛋白，可凭借工业上可实际应用的方法，与现有方法相比有效率地制备可用作丙型肝炎治疗药制备用中间体的(1S,2S)-1-烷氧基羰基-2-乙烯基环丙烷甲酸。利用本发明的水解酶蛋白的(1S,2S)-1-烷氧基羰基-2-乙烯基环丙烷甲酸的制备方法可用于丙型肝炎治疗药及其中间体的制备。通过本发明的制备方法制备的化合物可用作制备丙型肝炎治疗药的原料或中间体。
实施发明的最佳方式
以下对本发明的实施方式进行详细说明。
(1) 本发明的水解酶蛋白
本发明的水解酶蛋白的特征在于：由如序列号2~5的任一项所示氨基酸序列或对其进行变异的氨基酸序列组成，具有以高于由如序列号1所示氨基酸序列组成的蛋白质的选择性催化如式(1)所示反应的活性。在这里，序列号1为源于枯草芽孢杆菌 ATCC23857株的对硝基苄基酯酶(PNBE23857，GenBank登录号ZP_03593235)的氨基酸序列
需说明的是，式(1)中的Et表示乙基。
在本发明中，选择性为光学选择性，指通过优先生成某种异构体来生成具有光学活性的化合物的性质。具体而言，指水解2-乙烯基环丙烷-1,1-二甲酸二烷基酯优先生成(1S,2S)-1-烷氧基羰基-2-乙烯基环丙烷甲酸的性质。
作为用于水解2-乙烯基环丙烷-1,1-二甲酸二烷基酯有效率地制得(1S,2S)-1-烷氧基羰基-2-乙烯基环丙烷甲酸的水解酶蛋白所需的选择性，可列举出以下几点。
<1R2S/1S2S比>
首先，2-乙烯基环丙烷-1,1-二甲酸二烷基酯中存在(2R)体和(2S)体的2种立体异构体，但只要不是发生2位立体反转的特殊条件，基本上仅(2S)体可成为作为目标的(1S,2S)-1-烷氧基羰基-2-乙烯基环丙烷甲酸的原料。
在水解(2S)-2-乙烯基环丙烷-1,1-二甲酸二烷基酯时，水解酶蛋白需要具有在键合于1位前手性碳的二个烷氧基羰基中仅优先水解pro-R烷氧基羰基，优先生成(1S,2S)-1-烷氧基羰基-2-乙烯基环丙烷甲酸的选择性。需说明的是，pro-R为区别存在于CX2YZ上的2个X 的标记方法，概要如下所示。对于C上的各取代基，依据CIP规则确定优先顺序。此时，假设2个 X 中一方的优先顺序高于另一方。与Y、Z的优先顺序关系不发生变化。基于假设的优先顺序，根据RS标记法确定中心碳的手性为 R或S 。在R体的情况下，将此时优先的X作为pro-R，在S体的情况下作为pro-S。
本选择性可以通过水解生成的1-烷氧基羰基-2-乙烯基环丙烷甲酸的(1S,2S)体与(1R,2S)体的比例为指标进行比较，与(1S,2S)体的生成量相比，(1R,2S)体的生成量比例越低，(1S,2S)-1-烷氧基羰基-2-乙烯基环丙烷甲酸的收率越是提高，有利于工业化。
<1S2S体光学纯度(% e.e.)>
其次，当以外消旋体的2-乙烯基环丙烷-1,1-二甲酸二烷基酯为底物时，通过水解酶蛋白水解(2R)体，可生成(1S,2R)体和(1R,2R)体，但就相当于目标(1S,2S)体的对映体的(1R,2R)体而言，优选将其生成量抑制到极低。即，水解酶蛋白需要具有：在键合于(2R)-2-乙烯基环丙烷-1,1-二甲酸二烷基酯1位前手性碳的二个烷氧基羰基中仅优先水解pro-R烷氧基羰基，优先生成(1S,2R)-1-烷氧基羰基-2-乙烯基环丙烷甲酸的选择性，和/或与(2R)-2-乙烯基环丙烷-1,1-二甲酸二烷基酯相比优先水解(2S)-2-乙烯基环丙烷-1,1-二甲酸二烷基酯的选择性。任一种选择性均可通过由水解生成的1-烷氧基羰基-2-乙烯基环丙烷甲酸的(1S,2S)体相对于(1R,2R)体的对映体过剩率(% e.e.)来进行比较，(1S,2S)体的对映体过剩率越高，对之后的制备工序或所制备的药品的生理活性产生不良影响的可能性越低，有利于工业化。
<1S2R/1S2S比>
另外，如上所述，水解酶蛋白在键合于(2R)-2-乙烯基环丙烷-1,1-二甲酸二烷基酯1位前手性碳的两个烷氧基羰基中可水解pro-R烷氧基羰基，生成相当于目标(1S,2S)体的非对映异构体的(1S,2R)-1-烷氧基羰基-2-乙烯基环丙烷甲酸，但为减轻对之后制备工序的影响，优选极力降低该(1S,2R)体的混入。
本选择性可通过所生成的1-烷氧基羰基-2-乙烯基环丙烷甲酸的(1S,2S)体生成量与(1S,2R)体生成量的比例来进行比较，相对于(1S,2S)体生成量的(1S,2R)体生成量低者对之后的制备工序或所制备的药品的生理活性产生不良影响的可能性低，有利于工业化。
因此，本发明中的选择性以1-烷氧基羰基-2-乙烯基环丙烷甲酸中的“1R2S/1S2S比”、“1S2S体光学纯度(% e.e.)”或“1S2R/1S2S比”为指标。
即，本发明的“以高于由如序列号1所示氨基酸序列组成的蛋白质的选择性催化如式(1)所示反应的活性”可以作为生成物的1-乙氧基羰基-2-乙烯基环丙烷羧酸中的“1R2S/1S2S比”、“1S2S体光学纯度(% e.e.)”或“1S2R/1S2S比”为指标确定。
作为本发明的水解酶蛋白的优选实施方式，可列举出以下物质。
(a) 由在如序列号1~5的任一项所示氨基酸序列中氨基酸编号70号、106号、107号、108号、219号、270号、271号、272号、273号、274号、275号、276号和313号氨基酸中1个以上被侧链体积小于野生型氨基酸的氨基酸所取代的氨基酸序列组成，具有上述以高于由如序列号1所示氨基酸序列组成的蛋白质的选择性催化如式(1)所示反应的活性的水解酶蛋白。
(b) 由在如序列号1~5的任一项所示氨基酸序列中氨基酸编号188号、190号、193号、215号、216号、217号、314号、358号、362号和363号氨基酸中1个以上被侧链体积大于野生型氨基酸的氨基酸所取代的氨基酸序列组成，具有上述以高于由如序列号1所示氨基酸序列组成的蛋白质的选择性催化如式(1)所示反应的活性的水解酶蛋白。
(c) 由在如序列号1~5的任一项所示氨基酸序列中氨基酸编号70号、106号、107号、108号、219号、270号、271号、272号、273号、274号、275号、276号和313号氨基酸中1个以上被侧链体积小于野生型氨基酸的氨基酸所取代，且氨基酸编号188号、190号、193号、215号、216号、217号、314号、358号、362号和363号氨基酸中1个以上被侧链体积大于野生型氨基酸的氨基酸所取代的氨基酸序列组成，具有上述以高于由如序列号1所示氨基酸序列组成的蛋白质的选择性催化如式(1)所示反应的活性的水解酶蛋白。
(d) 水解酶蛋白，其为上述(a)或(c)的水解酶蛋白，由至少氨基酸编号70号、270号、273号和313号氨基酸中1个以上氨基酸被取代的氨基酸序列组成，具有上述以高于由如序列号1所示氨基酸序列组成的蛋白质的选择性催化如式(1)所示反应的活性。
在本发明中，特别优选(d)的水解酶蛋白。
“侧链体积小于野生型氨基酸的氨基酸”或“侧链体积大于野生型氨基酸的氨基酸”中的“体积”，具体而言可以在J.Theoret.Biol.，1968，21,170的表3中作为体积性(Bulkiness)示出的数值为指标。各氨基酸的体积性值具体而言如下所示
Ala (丙氨酸)：11.50
Arg (精氨酸)：14.28
Asp (天冬氨酸)：11.68
Asn (天冬酰胺)：12.82
Cys (半胱氨酸)：13.46
Glu (谷氨酸)：13.57
Gln (谷氨酰胺)：14.45
Gly (甘氨酸)：3.40
His (组氨酸)：13.69
Leu (亮氨酸)：21.40
Ile (异亮氨酸)：21.40
Lys (赖氨酸)：15.71
Met (甲硫氨酸)：16.25
Phe (苯丙氨酸)：19.80
Pro (脯氨酸)：17.43
Ser (丝氨酸)：9.47
Thr (苏氨酸)：15.77
Trp (色氨酸)：21.67
Tyr (酪氨酸)：18.03
Val (缬氨酸)：21.57。
即，“被侧链体积小于野生型氨基酸的氨基酸所取代”指被上述体积性值小于野生型氨基酸的氨基酸所取代，“被侧链体积大于野生型氨基酸的氨基酸所取代”指被上述体积性值大于野生型氨基酸的氨基酸所取代。
特别是作为本发明的水解酶蛋白，优选在如序列号1~5的任一项所示氨基酸序列中氨基酸编号70号、270号、273号或313号的亮氨酸或异亮氨酸中1个以上被上述体积性值小于它们的氨基酸所取代。
作为这样的水解酶蛋白，可列举出以下物质。
(e) 水解酶蛋白，其为上述(d)的水解酶蛋白，在如序列号1~5的任一项所示氨基酸序列中至少氨基酸编号70号的亮氨酸被天冬氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸或甘氨酸中的任一氨基酸所取代。
(f) 水解酶蛋白，其为上述(d)或(e)的水解酶蛋白，在如序列号3或4所示氨基酸序列中氨基酸编号270号的亮氨酸被丝氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或丙氨酸中的任一氨基酸所取代。
(g) 水解酶蛋白，其为上述(d)或(e)的水解酶蛋白，在如序列号1、2或5的任一项所示氨基酸序列中氨基酸编号270号的异亮氨酸被丝氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或丙氨酸中的任一氨基酸所取代。
(h) 水解酶蛋白，其为上述(d)~(g)的任一水解酶蛋白，在如序列号1~5的任一项所示氨基酸序列中氨基酸编号273号的亮氨酸被精氨酸或组氨酸中的任一氨基酸所取代。
(i) 水解酶蛋白，其为上述(d)~(h)的任一水解酶蛋白，在如序列号1~5的任一项所示氨基酸序列中氨基酸编号313号的亮氨酸被甲硫氨酸、丙氨酸或脯氨酸中的任一氨基酸所取代。
在本发明中，特别优选以下水解酶蛋白，所述水解酶蛋白由在如序列号4所示氨基酸序列中氨基酸编号70号的亮氨酸被天冬氨酸所取代，270号的亮氨酸被谷氨酰胺、谷氨酸或丙氨酸中的任一氨基酸所取代，第273号的亮氨酸被精氨酸所取代，且第313号的亮氨酸被甲硫氨酸所取代的氨基酸序列组成，具有上述以高于由如序列号1所示氨基酸序列组成的蛋白质的选择性催化如式(1)所示反应的活性。
作为本发明的水解酶蛋白，进一步包括以下水解酶蛋白，所述水解酶蛋白由与上述本发明的水解酶蛋白的氨基酸序列具有90%以上同源性的氨基酸序列，或相对于上述本发明的水解酶蛋白的氨基酸序列具有1~数个氨基酸的取代、缺失和/或添加的氨基酸序列组成，具有以高于由如序列号1所示氨基酸序列组成的蛋白质的选择性催化如式(1)所示反应的活性。
在本发明中，“与上述本发明的水解酶蛋白的氨基酸序列具有90%以上同源性的氨基酸序列”中的“90%以上同源性”指与本发明的水解酶蛋白的氨基酸序列的同源性或同一性为90%以上、优选93%以上、进一步优选95%以上、特别优选98%以上。
在本发明中，“1~数个氨基酸的取代、缺失和/或添加”中的“1或数个”指例如1~40个左右，优选指1~20个左右，更优选指1~10个左右，进一步优选指1~5个左右。
本发明的水解酶蛋白的来源无特殊限定，可为源自微生物等的天然的酶或基因重组蛋白质。
作为天然的酶，可优选由枯草芽孢杆菌取得。即，本发明的水解酶蛋白例如可由枯草芽孢杆菌NBRC3026、枯草芽孢杆菌 NBRC3108、枯草芽孢杆菌 NBRC3027和枯草芽孢杆菌NBRC3013等菌株通过通常的酶提取、纯化方法获得。作为提取方法，具体而言可列举出例如利用碎片化、匀浆化、声波处理、渗透压休克法、冻融法等细胞破碎的提取，表面活性剂提取等，或它们的组合等处理操作。另外，作为纯化方法，具体而言可列举出例如利用硫酸铵或硫酸钠等的盐析、离心分离、透析、超滤法、吸附色谱法、离子交换色谱法、疏水性色谱法、反相色谱法、凝胶过滤法、凝胶渗透色谱法、亲和色谱法、电泳法、酶谱法等或它们的组合等处理操作。
另外，可依据公知的方法克隆本发明的水解酶蛋白的基因，导入适当的宿主中表达，从而以基因重组蛋白质的形式获得本发明的水解酶蛋白。例如，可根据编码本发明水解酶蛋白的基因的碱基序列信息基设计对本发明水解酶蛋白的基因具有特异性的探针或引物，使用该探针或引物，由枯草芽孢杆菌NBRC3026、枯草芽孢杆菌NBRC3108、枯草芽孢杆菌NBRC3027和枯草芽孢杆菌 NBRC3013等的DNA文库(例如基因组DNA文库或cDNA文库等)分离或扩增编码本发明水解酶蛋白的DNA，通过基因重组技术将其插入载体后导入宿主细胞中，使之在其中表达，从而获得本发明的水解酶蛋白。
(2) 本发明的DNA
根据本发明，可提供编码上述本发明的水解酶蛋白的DNA。
作为本发明的DNA的具体实例，可列举出由以下碱基序列组成的DNA。
(a) 序列号7~10中记载的碱基序列；
(b) 碱基序列，其为可与由序列号7~10中记载的碱基序列组成的DNA在严格条件下杂交的DNA，编码以下水解酶蛋白，所述水解酶蛋白具有以高于由如序列号1所示氨基酸序列组成的蛋白质的选择性催化如式(1)所示反应的活性；或
(c) 碱基序列，其为在序列号7~10中记载的碱基序列中具有1~数个碱基的取代、缺失和/或添加的碱基序列，编码以下水解酶蛋白，所述水解酶蛋白具有以高于由如序列号1所示氨基酸序列组成的蛋白质的选择性催化如式(1)所示反应的活性；
。
编码本发明的水解酶蛋白的DNA为由枯草芽孢杆菌 NBRC3026、枯草芽孢杆菌NBRC3108、枯草芽孢杆菌NBRC3027和枯草芽孢杆菌NBRC3013克隆的DNA或对该DNA导入变异的DNA。另外，由于根据本发明确定了其碱基序列，所以也可根据该碱基序列进行合成。此外，也可通过以根据该碱基序列制备的寡聚核苷酸为探针的杂交，或通过以根据上述序列制备的寡聚核苷酸为引物的PCR，由枯草芽孢杆菌等微生物的DNA文库(例如基因组DNA文库或cDNA文库等)进行分离。另外，本发明的水解酶蛋白的DNA不仅可由天然微生物分离，而且也可采用已知的DNA合成方法(例如美国专利第6,472,184号公报和美国专利第5,750,380号公报中记载的方法)进行合成。
在本发明中，“可在严格条件下杂交的DNA”可列举出包含与具有序列号7~10中记载的碱基序列或其互补序列的DNA通过BLAST分析具有80%以上、优选90%以上、进一步优选95%以上同源性的碱基序列的DNA等。另外，严格条件下的杂交可依据以下方法进行：在通常的杂交缓冲液中，于温度为40~70℃、优选60~65℃等下进行反应，在盐浓度为15mM~300mM、优选15mM~60mM等的洗涤液中进行洗涤。
在本发明中，“具有1~数个碱基的取代、缺失和/或添加的碱基序列”中的“1~数个”例如指1~30个左右，优选指1~20个左右，进一步优选指1~10个左右，进一步优选指1~5个左右。
对于实质上不损害酶活性的氨基酸的取代、缺失和/或添加，只要为本领域技术人员，就可容易地选择。另外，编码具有不对酶活性造成实质影响的氨基酸的取代、缺失和/或添加的本发明水解酶蛋白的DNA例如可通过天然突变株或变种取得。
在序列号7~10中记载的碱基序列中，包含具有1~数个碱基的取代、缺失和/或添加的碱基序列的DNA的制备可通过使用诱变剂的方法或部位特异性变异法等通常的突变操作来实现。它们可通过例如PrimeSTAR Mutagenesis Basal Kit (Takara Bio Inc. (タカラバイオ社))或Quik Change Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene公司(ストラタジーン社)制)等市售试剂盒容易地进行。
(3) 重组载体和转化体
根据本发明，可进一步提供含有本发明的DNA的重组载体。在制备重组载体时，通常将本发明的DNA与适合于宿主微生物的启动子一同插入载体中，使该启动子的下游连接本发明DNA的编码区的5'末端一侧。或者也可使用含有启动子的表达载体，向其中插入本发明的DNA。
作为表达载体，若可在宿主微生物内复制增殖，则无特殊限制，可列举出质粒载体、穿梭载体和噬菌体载体。作为具体的质粒载体，可列举出pBR322、pUC18、pHSG298、pUC118、pSTV28、pTWV228、pHY300PLK (以上质粒载体例如可由Takara Bio Inc. (タカラバイオ社)购入)、pET表达载体系列(Novagen公司制)等。作为大肠杆菌-棒状杆菌的穿梭载体，例如可列举出日本特开平3-210184号公报中记载的质粒pCRY30，日本特开平2-276575号公报中记载的质粒pCRY21、pCRY2KE、pCRY2KX、pCRY31、pCRY3KE和pCRY3KX，日本特开平1-191686号公报中记载的质粒pCRY2和pCRY3，日本特开昭58-67679号公报中记载的pAM330，日本特开昭58-77895号公报中记载的pHM1519，日本特开昭58-192900号公报中记载的pAJ655、pAJ611和pAJ1844，日本特开昭57-134500号公报中记载的pCG1，日本特开昭58-35197号公报中记载的pCG2，日本特开昭57-183799号公报中记载的pCG4和pCG11等，或它们的衍生物等。另外，作为噬菌体载体，可列举出λFixII载体(可由Stratagene公司购入)等。
用于表达编码本发明水解酶蛋白的DNA的启动子通常可使用宿主微生物所拥有的启动子，但并不限定于此，若为用于起始本发明水解酶蛋白的DNA的转录的源于原核生物的碱基序列，则可为任意的启动子。具体而言，可列举出乳糖操纵子的启动子、色氨酸操纵子的启动子、源于λ噬菌体的的PL启动子、色氨酸乳糖杂合(tac)启动子[H. A. Bose等,Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 第80卷, 第21页 (1983)]等。在这些启动子中，在提高表达效率的目的下也可使用具有诱导性的启动子。例如，在上述乳糖操纵子的启动子的情况下，可通过添加乳糖或异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导基因表达。
根据本发明，可进一步提供将本发明的DNA或重组载体导入宿主细胞而成的转化体。导入本发明的DNA或重组载体的宿主无特殊限定，但不适合使用具有将2-乙烯基环丙烷-1,1-二甲酸二烷基酯水解为(1S,2S)-1-烷氧基羰基-2-乙烯基环丙烷甲酸以外物质的活性的宿主。另外，也不优选具有使所生成的(1S,2S)-1-烷氧基羰基-2-乙烯基环丙烷甲酸进一步转化为其它化合物的活性的宿主。
对于可在本发明中使用的宿主，可通过使其与2-乙烯基环丙烷-1,1-二甲酸二烷基酯或作为目标物的(1S,2S)-1-烷氧基羰基-2-乙烯基环丙烷甲酸接触，并分析由此得到的化合物来进行选择。
作为可在本发明中使用的宿主微生物，具体而言可列举出埃希杆菌(Escherichia)属细菌(例如大肠杆菌)，另外放线菌(Actinomycetes)属细菌、芽孢杆菌(Bacillus)属细菌、沙雷氏菌(Serratia)属细菌、假单胞菌(Pseudomonas)属细菌、棒状杆菌(Corynebacterium)属细菌、短杆菌(Brevibacterium)属细菌、红球菌(Rhodococcus)属细菌、乳杆菌(Lactobacillus)属细菌、链霉菌(Streptomyces)属细菌、栖热菌(Thermus)属细菌、链球菌(Streptococcus)属细菌等也具有上述性质的微生物也可用作导入本发明的DNA或重组载体的宿主。
具体而言可使用大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、铜绿假单孢菌(Pseudomonas aeruginosa)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、乳酸发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)、红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)、乳链球菌(Streptococcus lactis)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)等具有上述性质的微生物。
另外，在上述微生物中，对于具有将2-乙烯基环丙烷-1,1-二甲酸二烷基酯水解为(1S,2S)-1-烷氧基羰基-2-乙烯基环丙烷甲酸以外物质的活性或使所生成的(1S,2S)-1-烷氧基羰基-2-乙烯基环丙烷甲酸进一步变化为其它化合物的活性的微生物，可通过将编码具有该活性的酶蛋白的基因利用现有方法破坏，用作导入本发明的DNA或重组载体的宿主。
作为向上述宿主微生物中导入基因的方法，可采用利用感受态细胞法[Journalof Molecular Biology, 第53卷, 第159页 (1970)]、脉冲波通电法[J.Indust.Microbiol., 第5卷, 第159页 (1990)]等转化法，利用噬菌体的转导法[E.Ohtsubo, Genetics, 第64页, 第189页 (1970)]，接合转移法[J. G. C. Ottow, Ann.Rev.Microbiol., 第29卷, 第80页 (1975)]，细胞融合法[M.H. Gabor, J. Bacteriol.,第137卷, 第1346页 (1979)]等。只要从这些方法中适宜选择适合宿主微生物的方法即可。
除上述利用表达载体的表达方法外，可通过将连接启动子的编码本发明水解酶蛋白的DNA直接导入宿主微生物染色体中的同源重组技术或利用转座子或插入序列等导入的技术进行表达。因此，本发明的转化体只要表达本发明的酶即可，对基因的导入方法无限定。
(4) 利用转化体的本发明水解酶蛋白的制备
根据本发明，可培养如上操作获得的转化体，从其培养物中采集本发明的水解酶蛋白。
转化体的培养可在含有碳源、氮源、无机盐、各种维生素等的通常的营养培养基中进行，作为碳源，例如可使用葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖等糖类，乙醇、甲醇等醇类，柠檬酸、苹果酸、琥珀酸、马来酸、富马酸等有机酸类，废糖蜜等。作为氮源，例如可分别单独或混合使用氨、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、尿素等。另外，作为无机盐，例如可使用磷酸一氢钾、磷酸二氢钾、硫酸镁等。此外可将蛋白胨、肉膏、酵母提取物、玉米浆、酪蛋白氨基酸、生物素等各种维生素等营养素添加于培养基中。
培养通常在通气搅拌、振荡等需氧条件下进行。培养温度若为宿主微生物能够生长的温度，则无特殊限制，另外对于培养过程中的pH，若为宿主微生物能够生长的pH，则亦无特殊限制。对于培养过程中的pH调节，可添加酸或碱进行。
从培养物中进行酶的采集可以酶活性为指标通过公知的采集方法进行。酶无需纯化至同质，只要纯化至与用途相对应的纯化度即可。
作为本发明中使用的粗纯化级分或纯化酶，从培养转化体得到的培养液中分离出的菌体自不必说，也可使用将培养液、菌体以超声、挤压摩擦等方法破碎获得的破碎物，将该粉碎物用水等提取获得的含有本发明水解酶蛋白的提取物，对该提取物进一步进行硫酸铵盐析、柱色谱等处理获得的本发明水解酶蛋白的粗酶制品或纯化的酶制品。此外，还可使用将上述菌体、破碎物、提取物、粗纯化级分或纯化酶固定于载体上而成的制品。
这些菌体、菌体破碎物、提取物或纯化酶的固定可通过依据本身已知的通常所采用的方法，使菌体等固定于丙烯酰胺单体、海藻酸或角叉菜胶等适当的载体的方法进行。例如，在将菌体固定于载体上时，可使用直接从培养物中回收或用适当的缓冲液(例如0.02M~0.2M左右的磷酸缓冲液(pH6~10)等)洗涤的菌体。
(5) 使用本发明的水解酶蛋白的(1S,2S)-1-烷氧基羰基-2-乙烯基环丙烷甲酸的制备
根据本发明，可提供(1S,2S)-1-烷氧基羰基-2-乙烯基环丙烷甲酸的制备方法，其包括以式(2)表示的制备，即使本发明的水解酶蛋白作用于2-乙烯基环丙烷-1,1-二甲酸二烷基酯制备(1S,2S)-1-烷氧基羰基-2-乙烯基环丙烷甲酸
式(2)中，R表示可被取代的碳原子数1~10的烷基、碳原子数7~20的芳烷基或碳原子数6~12的芳基。
作为以R表示的可被取代的碳原子数1~10的烷基，可列举出碳原子数1~10的取代或无取代的直链状或分支状或环状烷基，可更优选列举出碳原子数1~6的取代或无取代的直链状或分支状或环状烷基。其中，例如可适宜列举出甲基、乙基、异丙基、正丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、叔戊基、新戊基、正己基、环丙基、环丁基、环戊基、环己基等，特别优选碳原子数1~4的烷基。
作为以R表示的可被取代的碳原子数7~20的芳烷基，优选为碳原子数7~12的取代或无取代的芳烷基。其中，可适宜列举出苄基、4-甲基苄基、4-甲氧基苄基、4-氯苄基、4-溴苄基、2-苯基乙基、1-苯基乙基、3-苯基丙基等。
作为以R表示的可被取代的碳原子数6~12的芳基，例如可适宜列举出苯基、1-萘基、2-萘基、邻甲基苯基、间甲基苯基、对甲基苯基、邻甲氧基苯基、间甲氧基苯基、对甲氧基苯基、2,3-二甲基苯基、2,4-二甲基苯基、2,5-二甲基苯基、2,6-二甲基苯基、3,4-二甲基苯基、3,5-二甲基苯基、2,3,5-三甲基苯基、2,3,6-三甲基苯基、2,4,6-三甲基苯基、邻硝基苯基、间硝基苯基、对硝基苯基等。
作为R，优选为甲基、乙基、叔丁基和苄基，进一步优选为乙基。
在使本发明的水解酶蛋白作用于2-乙烯基环丙烷-1,1-二甲酸二烷基酯时，可通过使纯化或粗纯化的本发明的水解酶蛋白、产生本发明的水解酶蛋白的微生物(例如含有编码本发明的水解酶蛋白的DNA的转化体等)或其处理物作用于2-乙烯基环丙烷-1,1-二甲酸二烷基酯来制备(1S,2S)-1-烷氧基羰基-2-乙烯基环丙烷甲酸。
反应的方法无特殊限定，可向含有本发明的水解酶蛋白的液体中加入作为底物的2-乙烯基环丙烷-1,1-二甲酸二烷基酯，在适当的温度(例如10℃~40℃左右)和压力(例如大气压左右)下反应。由此可制备(1S,2S)-1-烷氧基羰基-2-乙烯基环丙烷甲酸。
从反应混合物中分离目标(1S,2S)-1-烷氧基羰基-2-乙烯基环丙烷甲酸的方法无特殊限定，可采用本领域技术人员公知的用于分离或纯化的方法。例如，可通过溶剂萃取、结晶、树脂吸附、柱色谱法等进行，但并不限定于此。
本发明的水解酶蛋白可特别适用于水解2-乙烯基环丙烷-1,1-二甲酸二乙酯来制备(1S,2S)-1-乙氧基羰基-2-乙烯基环丙烷甲酸的方法。
另外，本发明的2-乙烯基环丙烷-1,1-二甲酸二烷基酯可通过以下式(3)的反应来制备
即，可通过使式(3)的原料化合物在碱金属醇盐或碱金属氢化物的存在下与丙二酸酯类反应来制备。
式(3)中，作为R3所表示的可被取代的碳原子数6~12的芳基磺酰基、碳原子数1~10的烷基磺酰基和碳原子数7~20的芳烷基磺酰基，例如可列举出苯磺酰基、对甲基苯磺酰基、1-萘磺酰基、2-萘磺酰基、甲磺酰基、乙磺酰基、丙磺酰基、三氟甲磺酰基和苄基磺酰基等。R3优选为甲磺酰基、苯磺酰基和对甲基苯磺酰基，特别优选为对甲基苯磺酰基。另外，R与上述定义相同。
在这里，式(3)的原料化合物可依据公知的方法(例如Frederic Dolle等,Bioorg. Med. Chem. 2006, 14, 1115-1125 等中记载的方法)制备。另外，可通过以下式(4)的反应来制备
即，可通过在使1,4-丁烯二醇与以R3X表示的化合物反应后结晶，或通过将市售的原料化合物用酸或碱水解制得1,4-丁烯二醇，进而在与以R3X表示的化合物反应后结晶来制备。
式(4)中，X1表示氢原子或R1，X2表示氢原子或R2，R1和R2各自独立表示可被取代的碳原子数2~11的烷基羰基、碳原子数8~21的芳烷基羰基或碳原子数7~13的芳基羰基。但是，X1和X2同时为氢原子的情况除外。优选X1为R1且X2为R2，更优选R1和R2为乙酰基、乙基羰基、叔丁基羰基、苯甲酰基，进一步优选为乙酰基。
通过使用在本发明中制得的(1S,2S)-1-乙氧基羰基-2-乙烯基环丙烷甲酸，可制备作为对正在作为丙型肝炎治疗药开发的各种HCV NS3蛋白酶抑制剂等的制备有用的中间体的(1R,2S)/(1S,2R)-1-氨基-1-乙氧基羰基-2-乙烯基环丙烷及其盐。
通过以下实施例对本发明进行更详细的说明，但本发明不受实施例限定。
实施例
实施例1：对硝基苄基酯酶基因(pnbA，序列号6~10)的克隆
(1) 基因的克隆
由将枯草芽孢杆菌ATCC23857、枯草芽孢杆菌NBRC3026、枯草芽孢杆菌 NBRC3108、枯草芽孢杆菌 NBRC3027和枯草芽孢杆菌 NBRC3013用各菌株保存机构指定的液体培养基分别培养一晚获得的菌体，使用DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen公司(キアゲン社)制)，分别制备染色体DNA。
根据编码源自基因组序列公知株枯草芽孢杆菌ATCC23857的对硝基苄基酯酶(PNBE23857，GenBank登录号ZP_03593235，序列号1)的基因序列(以下记为pnbA23857，序列号6)，设计、合成用于扩增对硝基苄基酯酶基因全长的引物pnbA F和pnbA R。将各自的碱基序列示出于序列表的序列号11 (pnbA F)和12 (pnbA R)中。
以制备的源于各菌株的染色体DNA为模板，以pnbA F、pnbA R为引物，通过聚合酶链式反应(PCR)，分别扩增约1.5kbp的DNA片段。
此时的PCR使用Easy-A高保真PCR克隆酶(Agilent Technologies Japan, Ltd.(アジレント・テクノロジー社)制)，依据附带的操作说明书的条件实施反应。就温度条件而言，在于94℃保持2分钟后，将(94℃、30秒，50℃、30秒，72℃、90秒)重复35个循环，于72℃保持5分钟，结束。
(2) 表达载体的制备
以依据日本特开2005-34025号公报记载的方法制备的质粒pKV32为模板，使用如序列号19所示的引物(pKVXmaIFW)和如序列号20所示的引物(pKVXmaIRV)，通过PCR扩增约4kbp的片段。在将扩增的片段通过限制酶XmaI消化后，使用Ligation-Convenience Kit(Nippom Gene Co., Ltd. (ニッポンジーン社)制)使之自身闭环获得质粒。将得到的质粒命名为pKW32。
此时的PCR使用KOD-plus-Ver.2 (东洋纺社制)，依据附带的操作说明书的条件实施反应。就温度条件而言，在于94℃保持2分钟后，将(94℃、15秒，58℃、30秒，68℃、4分)重复30个循环，于68℃保持5分钟，结束。
(3) 表达用质粒的制备
将在上述(1)中制得的DNA片段分别使用Ligation-Convenience Kit (NippomGene Co., Ltd. (ニッポンジーン社)制)导入在(2)中制备的克隆载体pKW32中。以下将得到的各个质粒分别记为ppnbA23857、ppnbA3026、ppnbA3108、ppnbA3027和ppnbA3013。
对质粒ppnbA3026、ppnbA3108、ppnbA3027和ppnbA3013进行所插入的DNA序列的分析，确认分别含有由1467bp的ORF组成的基因。将这些基因分别命名为pnbA3026、pnbA3108、pnbA3027和pnbA3013。各序列如序列号7 (pnbA3026)、8 (pnbA3108)、9 (pnbA3027)和10(pnbA3013)所示。将各个DNA序列所编码的氨基酸序列命名为PNBE3026、PNBE3108、PNBE3027、PNBE3013。各序列如序列号2 (PNBE3026)、3 (PNBE3108)、4 (PNBE3027)和5(PNBE3013)所示。各氨基酸序列相对于已知的PNBE23857的氨基酸序列(序列号1)分别显示出97%、91%、90%和98%的序列同一性。
实施例2：新的对硝基苄基酯酶的选择性比较
使用在实施例1中制得的5种质粒，依据常规方法对大肠杆菌(Escherichia coli)JM109 (Takara Bio Inc. (タカラバイオ株式会社)制) 进行转化。将得到的重组大肠杆菌分别用含有20mg/l卡那霉素、0.2mM IPTG的液体LB培养基于30℃振荡培养，在培养第20小时收集菌体。
使用得到的菌体，在含有5g/l外消旋体1,1-二乙氧基羰基-2-乙烯基环丙烷(以下称“VCPDE”)和5%二甲亚砜的100mM磷酸钾缓冲液中于30℃、pH 7的条件下反应21小时。
将反应后的反应液通过以下条件的高效液相色谱法(HPLC)进行分析。
柱：CHIRALPAK AD-3 (4.6×250 mm，Daicel Corporation (ダイセル化学社)制)
洗脱液：己烷:乙醇:三氟醋酸=95:5:0.1
流速：0.8ml/min
温度：30℃
检测：UV 210 nm
由分析结果确认生成1-乙氧基羰基-2-乙烯基环丙烷甲酸(以下称“VCPME”)。根据得到的结果，求出作为选择性指标的表示所生成的VCPME的(1S,2S)体与(1R,2S)体比例的“1R2S/1S2S比”、表示(1S,2S)体相对于(1R,2R)体的对映体过剩率的“1S2S体光学纯度”和表示(1S,2S)体与(1S,2R)体比例的“1S2R/1S2S比”，将其结果汇总于表1中。另外，在仅通过质粒pKW32进行转化的菌体中未见对该底物的水解活性。所有酶的“1R2S/1S2S比”均呈现出足够低的值。
PNBE3026、PNBE3108和PNBE3027的3种酶在“1S2S体光学纯度”方面呈现出比序列已知的酶PNBE23857高的值。
另外，PNBE3013在“1S2R/1S2S比”方面呈现出比序列已知的酶PNBE23857低的值。
[表1]
表1
。
合成例
在实施例1中使用的VCPDE如下合成。
向2L四颈瓶中加入93.4g (583mmol)的丙二酸二乙酯、1000mL的甲苯，作为碱加入223mL (569mmol)的20%乙醇钠乙醇溶液。在于室温下搅拌1.5小时后，加入59.4g(278mmol，Aldrich Corporation (アルドリッチ社)制试剂)的反式-1,4-二溴-2-丁烯。在于室温下搅拌2小时后，进一步加入109mL (278mmol)的20%乙醇钠乙醇溶液。在于室温下搅拌1小时后，加入29.1g (136mmol，Aldrich Corporation (アルドリッチ社)制试剂)的反式-1,4-二溴-2-丁烯。在于室温下搅拌4小时后，添加347mL的1M氢氧化钠水溶液，搅拌14小时，然后分离有机层。接着将有机层用132mL的水洗涤2次，在用无水硫酸钠干燥后过滤，将得到的滤液于40℃减压浓缩，作为淡黄色油状物的粗生成物制得99.3g的1,1-二-乙氧基羰基-2-乙烯基环丙烷。该粗生成物中含有83.2g (收率94.9%)的1,1-二-乙氧基羰基-2-乙烯基环丙烷。另外，不含丙二酸二乙酯。
实施例3：本发明的水解酶蛋白(序列号4)的立体结构建模
针对PNBE3027的氨基酸序列，对Protein Data Bank (PDB)进行BLAST检索，选择以下3种晶体结构作为参照结构。需说明的是，在下文中称为A56V的表述表示第56号氨基酸残基丙氨酸(A)被取代为缬氨酸(V)。
・对硝基苄基酯酶突变：A56V、I60V、T73K、L144M、L313F、H322Y、A343V、M358V、Y370F、A400T、G412E、I437T、T459S (PDB id：1C7J)序列同一性89%
・对硝基苄基酯酶突变：I60V、L144M、P317S、H322R、L334S、M358V、Y370F (PDB id：1C7I)序列同一性90%
・对硝基苄基酯酶(PDB id：1QE3)序列同一性91%
对于同源性模型的建立，使用Discovery Studio Modeling (以下记为DSModeling) 2.5版，针对得到的初期建模结构，将CHARMM (Chemistry at HarvardMacromolecular Mechanics)力场分配至各个原子，通过分子力学计算进行结构最优化。结构的最优化通过首先利用Steepest Decent法(最速下降法)进行1000步的计算，接着利用Adapted Basis Newton-Raphson法进行5000步的计算来进行。
底物复合体模型如下建立：相对于得到的同源性模型，将作为底物的VCPDE的S体和R体分别定位于生成(1S,2S)-VCPME的方向和生成(1R,2R)-VCPME的方向，作为初期结构，然后进行能量最小化。在进行能量最小化时，考虑酯酶的水解反应机制，设定以下距离限制条件。
・将形成氧阴离子穴的3个酰胺(Gly106、Ala107、Ala190)的氮原子与被水解的酯键的羰基氧的距离设定为2.0Å以上、3.0Å以内。
・将活性部位Ser189的醇氧原子与被水解的酯键的羰基碳的距离设定为2.0Å以上、3.0Å以内。
将通过以上处理得到的结构作为“1S2S模型”和“1R2R模型”。
实施例4：对硝基苄基酯酶中与识别底物有关的氨基酸残基的推测
首先，在通过实施例3得到的各“1S2S模型”和“1R2R模型”中，将部分或全部存在于距VCPDE的乙烯基的2位碳原子8Å以内的氨基酸残基全部提取。距离的计算使用DiscoveryStudio Visualizer v2.5.5.9350，在所提取的各氨基酸残基中将与各个模型距VCPDE的乙烯基2位碳原子的距离最近的氢原子以外的原子的距离规定为与各氨基酸残基的距离。对于所提取的各氨基酸残基，将规定的距离按照“1S2S模型”中的距离和“1R2R模型”中的距离进行比较，结果将与“1R2R模型”相比“1S2S模型”中的距离较近的氨基酸残基示出于表2中，将与“1S2S模型”相比“1R2R模型”中的距离较近的氨基酸残基示出于表3中。
根据以上结果可推测出，就表2的氨基酸残基而言变化为侧链体积小于野生型氨基酸的氨基酸，而就表3的氨基酸残基而言变化为侧链体积大于野生型氨基酸的氨基酸，可发挥对(1S,2S)体的VCPME的生成有利的选择性。
[表2]
表2
[表3]
表3
在表2和表3中，目标原子(氨基酸残基中的原子)的简称遵从蛋白质结构数据库(PDB)规定的方法。以下示出其实例
CA = 碳，α
CB = 碳，β
CG = 氧，γ
CD = 碳，δ
CE = 碳，ε
CZ = 碳，ζ
OE = 氧，ε。
实施例5：通过诱变实现的对硝基苄基酯酶基因的改变
以在实施例1中得到的质粒ppnbA3027为模板，使用如序列表的序列号13所示引物(L70FW)和如序列号14所示引物(L70RV)，通过QuikChange Multi Site-DirectedMutagenesis Kit (Stratagene公司(ストラタジーン社)制)对编码氨基酸编号70号的亮氨酸的碱基进行随机诱变。将得到的约200个菌落分别用含有20mg/l卡那霉素、0.2mM IPTG的液体LB培养基于30℃振荡培养，在培养第20小时收集菌体。
使用得到的菌体，在含有5g/l或30g/l外消旋体VCPDE、5%二甲亚砜的100mM 磷酸钾缓冲液中于30℃、pH 7的条件下反应21小时。
另外，与前文同样操作，使用如序列表的序列号15所示引物(L313FW)和如序列号16所示引物(L313RV)，对编码氨基酸编号313号的亮氨酸残基的碱基进行随机诱变，使约200个菌落以与上述相同的方法反应。
此外，与前文同样操作，使用如序列表的序列号17所示引物(L270L273FW)和如序列号18所示引物(L270L273RV)，对编码氨基酸编号270和273号的亮氨酸残基的碱基进行随机诱变，使约400个菌落以与上述相同的方法反应。
将反应后的反应液在与实施例2相同的方法和条件下通过HPLC进行分析。作为底物的VCPDE的浓度为5g/l时各变异株的反应结果示出于表4中，30g/l时的结果示出于表5中。另外，对于所得到的克隆，依据常规方法提取各克隆所含有的质粒DNA，分析DNA序列。其结果将得到的各诱变部位在变异后的氨基酸残基一同记入表4和5中。
通过表4的No.1与No.3~6和11的比较，在将氨基酸编号70号的亮氨酸变化为天冬氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸中的任一氨基酸时，所生成的VCPME的(1S,2S)体的光学纯度提高。另外，通过野生体No.1与No.2、7和13的比较，在将氨基酸编号313号的亮氨酸变化为甲硫氨酸、丙氨酸、脯氨酸中的任一氨基酸时，所生成的VCPME的(1S,2S)体的光学纯度也提高。另外，特别是No.8、10和15通过将氨基酸编号70号和313号的亮氨酸同时变化，与野生体相比所生成的VCPME的1R2S/1S2S比提高。
接着，通过表4的No.1与表5的No.16的比较可确认，由于作为底物的VCPDE浓度由5g/l升至30g/l，1S2S体光学纯度降低。由此明确诱变的效果需要在同一底物浓度下进行。另外，通过表5的No.19和21~25与野生体No.16的比较可确认，通过变化氨基酸编号270号的亮氨酸和273号的亮氨酸，1R2S/1S2S比、1S2S体光学纯度和1S2R/1S2S比全部提高
[表4]
表4
[表5]
表5
。
在这里，表4和表5中的各个符号表示以下物质
P：脯氨酸
G：甘氨酸
T：苏氨酸
S：丝氨酸
N：天冬酰胺
A：丙氨酸
M：甲硫氨酸
D：天冬氨酸
F：苯丙氨酸
H：组氨酸
R：精氨酸
E：谷氨酸
Q：谷氨酰胺。
另外，本说明书中的序列号1~20如下所示
序列号1：源于枯草芽孢杆菌ATCC23857的对硝基苄基酯酶(PNBE23857，GenBank登录号ZP_03593235)的氨基酸序列
序列号2：源于枯草芽孢杆菌 NBRC3026的水解酶蛋白的氨基酸序列PNBE3026
序列号3：源于枯草芽孢杆菌NBRC3108的水解酶蛋白的氨基酸序列PNBE3108
序列号4：源于枯草芽孢杆菌NBRC3027的水解酶蛋白的氨基酸序列PNBE3027
序列号5：源于枯草芽孢杆菌NBRC3013的水解酶蛋白的氨基酸序列PNBE3013
序列号6：编码源于枯草芽孢杆菌ATCC23857的对硝基苄基酯酶(PNBE23857，GenBank登录号ZP_03593235，序列号1)的基因序列(pnbA23857)
序列号7：编码源于枯草芽孢杆菌NBRC3026的水解酶蛋白的DNA的碱基序列pnbA3026
序列号8：编码源于枯草芽孢杆菌NBRC3108的水解酶蛋白的DNA的碱基序列pnbA3108
序列号9：编码源于枯草芽孢杆菌NBRC3027的水解酶蛋白的DNA的碱基序列pnbA3027
序列号10：编码源于枯草芽孢杆菌NBRC3013的水解酶蛋白的DNA的碱基序列pnbA3013
序列号11：用于扩增对硝基苄基酯酶基因全长的引物pnbA F
序列号12：用于扩增对硝基苄基酯酶基因全身的引物pnbA R
序列号13：引物(L70FW)
序列号14：引物(L70RV)
序列号15：引物(L313FW)
序列号16：引物(L313RV)
序列号17：引物(L270L273FW)
序列号18：引物(L270L273RV)
序列号19：引物(pKVXmaIFW)
序列号20：引物(pKVXmaIRV)。

Claims (11)

1.水解酶蛋白，所述蛋白由如序列号2~5的任一项所示氨基酸序列组成，具有以高于由如序列号1所示氨基酸序列组成的蛋白质的选择性催化如式(1)所示反应的活性：
。
2.水解酶蛋白，所述水解酶蛋白由在如序列号2~5的任一项所示氨基酸序列中氨基酸编号70号、270号、273号和313号氨基酸中1个以上被侧链体积小于野生型氨基酸的氨基酸所取代的氨基酸序列组成，具有以高于由如序列号1所示氨基酸序列组成的蛋白质的选择性催化如式(1)所示反应的活性：
，
其中，在如序列号2~5的任一项所示氨基酸序列中，至少氨基酸编号70号的亮氨酸被天冬氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸或甘氨酸中的任一氨基酸所取代。
3.权利要求2的水解酶蛋白，其中，在如序列号3或4所示氨基酸序列中，氨基酸编号270号的亮氨酸被丝氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或丙氨酸中的任一氨基酸所取代。
4.权利要求2的水解酶蛋白，其中，在如序列号2或5的任一项所示氨基酸序列中，氨基酸编号270号的异亮氨酸被丝氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或丙氨酸中的任一氨基酸所取代。
5.权利要求2~4中任一项的水解酶蛋白，其中，在如序列号2~5的任一项所示氨基酸序列中，氨基酸编号273号的亮氨酸被精氨酸或组氨酸中的任一氨基酸所取代。
6.权利要求2~4中任一项的水解酶蛋白，其中，在如序列号2~5的任一项所示氨基酸序列中，氨基酸编号313号的亮氨酸被甲硫氨酸、丙氨酸或脯氨酸中的任一氨基酸所取代。
7.权利要求5的水解酶蛋白，其中，在如序列号2~5的任一项所示氨基酸序列中，氨基酸编号313号的亮氨酸被甲硫氨酸、丙氨酸或脯氨酸中的任一氨基酸所取代。
8.水解酶蛋白，所述水解酶蛋白由在如序列号4所示氨基酸序列中氨基酸编号70号的亮氨酸被天冬氨酸所取代，270号的亮氨酸被谷氨酰胺、谷氨酸或丙氨酸中的任一氨基酸所取代，第273号的亮氨酸被精氨酸所取代，且第313号的亮氨酸被甲硫氨酸所取代的氨基酸序列组成，具有以高于由如序列号1所示氨基酸序列组成的蛋白质的选择性催化如式(1)所示反应的活性：
。
9.DNA，所述DNA编码权利要求1~8中任一项的水解酶蛋白。
10.权利要求9的DNA，所述DNA由以下碱基序列组成：
(a) 序列号7~10中记载的碱基序列，所述碱基序列编码以下水解酶蛋白，所述水解酶蛋白具有以高于由如序列号1所示氨基酸序列组成的蛋白质的选择性催化如式(1)所示反应的活性；
。
11.(1S,2S)-1-烷氧基羰基-2-乙烯基环丙烷甲酸的制备方法，所述制备方法包括使权利要求1~8中任一项的水解酶蛋白作用于2-乙烯基环丙烷-1,1-二甲酸二烷基酯制备(1S,2S)-1-烷氧基羰基-2-乙烯基环丙烷甲酸。
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