CN115109765B - 酯酶pnbA-BS突变体及其在制备l-薄荷醇中的应用 - Google Patents

酯酶pnbA-BS突变体及其在制备l-薄荷醇中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种酯酶pnbA‑BS突变体及其在制备l‑薄荷醇中的应用，所述酯酶pnbA‑BS突变体是以SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第400位丙氨酸突变为脯氨酸获得。以表达酯酶pnbA‑BS突变体A400P的基因工程菌为整细胞催化剂，催化dl‑乙酸薄荷酯的选择性拆分，恒速流加方式加入底物，底物加入量可达1700mM，产物l‑薄荷醇e.e.值>99％，产物累积浓度可达600mM，反应时空得率可达160g/(L·d)。反应体系不添加有机溶剂，减少了化学品的使用，简化了产物分离工艺，是一种绿色、高效、简便的新型l‑薄荷醇制备方法。

Description

酯酶pnbA-BS突变体及其在制备l-薄荷醇中的应用
(一)技术领域
本发明属于生物催化领域，涉及酯酶pnbA-BS突变体及其在生物酶法选择性拆分制备光学纯l-薄荷醇中的应用。
(二)背景技术
薄荷醇是世界三大香料之一，是环状单菇烯醇中需求量最大的香料，为薄荷和薄荷精油中的主要成分。因其分子存在3个手性中心，所以它有4对8种对映异构体，分别为dl-薄荷醇、dl-异薄荷醇、dl-新薄荷醇和dl-新异薄荷醇。8种异构体中，只有l-薄荷醇具有特征的薄荷香气和强烈的清凉作用，气味新鲜轻快，具有兴奋镇痛、杀菌止痒、促渗透、助消化等功效，在食品、日用化工、饮料、医药等领域具有广泛应用。
德之馨公司以间甲酚为原料开发了薄荷醇生成工艺。在路易斯酸催化条件下，间甲酚和丙烯反应生成百里酚，百里酚再经加氢还原得到含有8中异构体的薄荷醇混合物。后续通过精馏得到dl-薄荷醇，再经酯化dl-薄荷醇酯。dl-薄荷醇酯通过选择性拆分得到l-薄荷醇。与化学法拆分相比，生物酶法拆分具有条件温和、绿色环保等优点，为产业界所青睐。然而，由于缺乏同时满足高活力和高对映体选择性的专用酶，目前生物酶法还达不到实际应用的要求。
为了提高酯酶的l-对映体选择性及其催化制备l-薄荷醇的效率，对源自Bacillussubtilis 168的酯酶pnbA-BS进行分子改造，获得了在选择性拆分dl-乙酸薄荷酯中具有严格l-对映体选择性的突变体。该酯酶pnbA-BS突变体在大肠杆菌中表达，获得基因工程菌。以该基因工程菌为催化剂，反应体系不添加有机溶剂，同时采取底物流加方式减轻底物抑制，建立了一种高效、绿色、简便的l-薄荷醇制备方法。该方法底物加载量可达1700mM，产物浓度可达600mM，产物e.e.值>99％，时空产率可达160.52g/(L·d)。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种具有严格l-薄荷醇对映体选择性的酯酶pnbA-BS突变体及其在制备l-薄荷醇中的应用。通过对酯酶pnbA-BS的半理性设计，获得了酯酶突变体pnbA-BS-A400P，该突变体在选择性拆分dl-乙酸薄荷酯中具有严格的l-对映体选择性。以表达酯酶突变体pnbA-BS-A400P的基因工程菌湿菌体为催化剂，催化dl-乙酸薄荷酯的选择性拆分，结合底物工程和介质工程，形成了一种绿色、高效、简便的新型l-薄荷醇制备方法，该方法产物光学纯度高，反应体系不添加有机溶剂，并且反应时空得率可达160g/(L·d)。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种酯酶pnbA-BS突变体，所述酯酶pnbA-BS突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第400位丙氨酸突变为脯氨酸获得的，记为酯酶突变体pnbA-BS-A400P，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明还提供一种所述酯酶pnbA-BS突变体的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示。
本发明还涉及一种含所述酯酶pnbA-BS突变体编码基因的重组载体以及基因工程菌。所述重组载体按如下方法构建：如SEQ ID NO.3所示酯酶pnbA-BS突变体编码基因插入pET28a载体上的Nco I和Xho I位点，得到重组载体pET28a-pnbA-BS-A400P。所述基因工程菌按如下方法构建：将重组载体pET28a-pnbA-BS-A400P导入重组菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，得到所述的基因工程菌E.coli BL21(DE3)//pET28a-pnbA-BS-A400P。
此外，本发明还提供一种酯酶pnbA-BS突变体在催化dl-乙酸薄荷酯制备l-薄荷醇中的应用，所述应用为：将含酯酶pnbA-BS突变体编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体制得的冻干菌体或湿菌体经超声破碎提取的纯酶液为催化剂，以dl-乙酸薄荷酯为底物，以pH 5.0～9.0、100mM PBS缓冲液为反应介质构成反应体系，在10～50℃、600rpm条件下转化反应8～24h，获得含l-薄荷醇的反应液，反应液经离心去除菌体并收集有机相，有机相经分离纯化，获得l-薄荷醇。所述反应体系中，催化剂为纯酶液时用量以蛋白含量计为1～5g/L(优选3.5g/L)，催化剂为冻干菌体时用量为10～30g/L(优选20g/L)，催化剂为湿菌体时用量为30～80g/L(优选50g/L)。底物加入量为100～1700mM，优选1300mM。
进一步，所述湿菌体按如下方法制备：将含酯酶pnbA-BS突变体编码基因的工程菌接种至含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养12h，获得种子液，将种子液以体积浓度2％的接种量接种至新鲜的含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养至OD600为0.5～0.7，再加入终浓度为0.5mM的IPTG，24℃诱导16h，获得诱导培养液，再将诱导培养液于4℃和8000rpm下离心10min，弃去上清液，收集湿菌体。湿菌体经真空冷冻干燥24h，获得冻干菌体。
进一步，所述纯酶液按如下方法制备：(1)将湿菌体以1g：20mL的比例加入pH 8.1、50mM的Tris-HCl缓冲液中，在125W、工作2s、间隔6s的条件下超声破碎15min，离心，取上清即为粗酶液；(2)取粗酶液加至DEAE离子交换柱(柱内径1.6cm，柱高15cm)中，在手动模式下进行上样，用Buffer A平衡后，依次用体积比9:1，4:1，3:1以及1:1的Buffer A和Buffer B的混合液作为洗脱液洗脱杂蛋白和目的蛋白，洗脱速率3.0mL/min，每个洗脱液洗脱1.5个柱体积，收集体积比4:1的洗脱液对应的流出液，流出液用截留分子量为10kDa超滤管浓缩脱盐，收集截留液；(3)将步骤(2)截留液上样于凝胶过滤层析柱(柱内径1.6cm，柱高60cm，填料为丙烯葡聚糖凝胶S-200)，用50mM，pH 8.1的Tris-HCl缓冲液作为洗脱液；洗脱速率为0.5mL/min，控制压力在0.42～0.47Mpa间保持稳定；收集具有酯酶活力的流出液并用截留分子量为10kDa的超滤管进行浓缩，取截留液即得到酯酶pnbA-BS突变体纯酶液；所述Buffer A：50mM的Tris-HCl缓冲液，pH 8.1；所述Buffer B：1M的NaCl溶于50mM的Tris-HCl缓冲液，pH 8.1。
进一步，在反应过程中底物可以是一次加入或者恒速流加方式加入。当底物加载量小于1000mM时，在反应开始时一次加入，反应时间8～14h。当底物加载量为1000～1700mM，底物按恒速流加方式进行：初始底物浓度为250mM，剩余底物通过恒速微量泵注入到反应体系中，恒速流加时间为10h，底物流加完成后再继续反应4～14h。
进一步，所述反应液分离纯化方法为：所得反应液在12000rpm下离心10min去除菌体，取上层有机相加适量无水硫酸钠进行除水处理，然后在12000rpm下再离心1min；取上层有机相经有机膜过滤去除菌体蛋白；滤液采用硅胶柱层析法分离有机相中的底物d-乙酸薄荷酯和l-乙酸薄荷酯及产物l-薄荷醇分离，填料为300目硅胶，湿法上样，流动相为乙酸乙酯：正己烷＝1：20(体积比)，流速为1.5mL/min，洗脱4个柱体积，收集l-薄荷醇洗脱峰，用减压蒸馏除去溶剂，到产物l-薄荷醇。
根据本发明的研究发现，酯酶pnbA-BS的400位点对活性及对映体选择性的提高都起关键作用。在酯酶pnbA-BS的400位点所有突变中，突变体A400P催化选择性水解dl-乙酸薄荷酯具有严格的l-对映体选择性，为l-薄荷醇的工业化生产提供了一个潜在的生物催化剂。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在于：(1)分子改造所得的酯酶pnbA-BS突变体A400P，在选择性水解dl-乙酸薄荷酯中具有严格的l-对映体选择性，产物是光学纯的l-薄荷醇。(2)以表达酯酶pnbA-BS突变体A400P的基因工程菌作为催化剂，采用底物流加方式减轻底物抑制，底物加载量可达1700mM，产物l-薄荷醇e.e.值>99％，产物累积浓度可达600mM，反应时空得率可达160g/(L·d)。(3)反应体系不添加有机溶剂，减少了化学品的使用，产物提取简便，不需要有机溶剂萃取步骤，是一种绿色、高效、简便的新型l-薄荷醇制备方法。
(四)附图说明
图1为酯酶pnbA-BS选择性拆分dl-乙酸薄荷酯合成底物l-薄荷醇的方法示意图。
图2为实施例3底物和产物标样的气相色谱图；溶剂(2.997～3.987min)；标样d-薄荷醇(20.615min)，标样l-薄荷醇(20.774min)，标样l-乙酸薄荷酯(21.097min)，标样d-乙酸薄荷酯(21.638min)。
图3为酯酶pnbA-BS及突变体pnbA-BS A400P纯酶液的SDS-PAGE胶图；从左到右，泳道M，Blue plus II protein marker；泳道1，酯酶pnbA-BS；泳道2，pnbA-BS突变体A400P。
图4为实施例4酯酶pnbA-BS关键位点突变子核酸胶图，(a)泳道1为编码pnbA-BS的PCR产物，泳道2-11分别为编码下列位点突变子的PCR产物：G105A、G106A、A107G、A107V、E188A、A190G、A190V、M193A、T326A、A330G、A330V；(b)泳道1-5分别为编码下列位点突变子的PCR产物：L331A、M358 A、A400G、A400V、L403A。
图5为实施例4酯酶pnbA-BS关键位点突变子SDS-PAGE胶图，泳道1-18依次为宿主菌、pnbA-BS、G105A、G106A、A107G、A107V、E188A、A190G、A190V、M193A、T326A、A330G、A330V、L331A、M358 A、A400G、A400V、L403A。
图6为实施例5酯酶pnbA-BS 400位点突变子核酸胶图，(a)泳道1-13依次为泳道1-13：A400P，A400K，A400Q，A400R，A400H，A400M，A400L，A400E，A400T，A400I，A400N，A400F，A400D；(b)泳道1-5依次为A400V，A400C，A400S，A400G，A400W。
图7为实施例5酯酶pnbA-BS 400位点突变子SDS-PAGE胶图，泳道1-20依次为pnbA-BS、A400P、A400K、A400Q、A400R、A400H、A400M、A400L、A400E、A400T、A400I、A400N、A400F、A400D、A400V、A400C、A400S、A400G、A400Y、A400W。
图8为实施例2酯酶pnbA-BS纯酶液和实施例7酯酶突变体pnbA-BS-A400P纯酶液催化拆分dl-乙酸薄荷酯合成l-薄荷醇的比较，(a)标准样品；(b)酯酶pnbA-BS纯酶液催化拆分dl-乙酸薄荷酯；(c)酯酶突变体pnbA-BS-A400P纯酶液催化拆分dl-乙酸薄荷酯。
图9为实施例8酯酶突变体pnbA-BS-A400P选择性拆分dl-乙酸薄荷酯合成l-薄荷醇的最适催化pH。
图10为实施例9酯酶突变体pnbA-BS-A400P选择性拆分dl-乙酸薄荷酯合成l-薄荷醇的最适催化温度。
图11为实施例10酯酶突变体pnbA-BS-A400P选择性拆分dl-乙酸薄荷酯合成l-薄荷醇的最适助溶剂添加量。
图12为实施例11酯酶突变体pnbA-BS-A400P选择性拆分dl-乙酸薄荷酯合成l-薄荷醇时不同底物浓度下反应进程。
图13为实施例12酯酶突变体pnbA-BS-A400P选择性拆分dl-乙酸薄荷酯合成l-薄荷醇时底物流加方式下反应进程。
图14为实施例12酯酶突变体pnbA-BS-A400P选择性拆分dl-乙酸薄荷酯合成l-薄荷醇时底物dl-乙酸薄荷酯(a)和产物l-薄荷醇(b)的气相-质谱联用(GC-MS)谱图。
图15为硅胶柱层析和加压蒸馏后所得l-薄荷醇固体粉末。
图16为产物l-薄荷醇的1H(a)和13C(b)的核磁共振(NMR)谱图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
LB液体培养基组成：胰化蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，用1M的NaOH调节pH值到7.0～7.5，定容至1L。在121℃高压灭菌20min，4℃储存。
实施例1：表达酯酶pnbA-BS编码基因的获取
利用已公开的来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis SB-14；Department ofBioscience,Section for Microbiology,Aarhus Universitet,Denmark)的酯酶pnbA-BS编码基因(GenBank：PSI04734.1)，经过密码子优化后，人工合成(杭州擎科生物技术有限公司提供基因合成服务)该酯酶pnbA-BS编码基因，核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示。
基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a-pnbA-BS的构建：将SEQ ID NO.2所示酯酶pnbA-BS编码基因插入pET28a载体的Nco I和Xho I限制性酶切位点，得到重组载体pET-28a-pnbA-BS；将重组载体pET-28a-pnbA-BS导入宿主细胞E.coli BL21(DE3)，得到基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a-pnbA-BS。
实施例2：酯酶pnbA-BS的湿菌体与冻干菌体、粗酶液的分离纯化及比酶活测定
1、湿菌体E.coli BL21(DE3)/pET-28a-pnbA-BS及其冻干菌体的制备
将基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a-pnbA-BS接种于含有终浓度100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃、200rpm下培养过夜，然后以体积浓度2％的接种量转接于含有100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃、200rpm培养至菌体浓度OD600至0.6～0.8，向培养物中加入终浓度0.5mM的IPTG，在24℃下诱导培养16h，获得诱导培养液。同样条件下，以不添加IPTG的培养液为未诱导对照培养液。再将诱导培养液于4℃、8000rpm下离心10min，弃去上清液；然后用pH 8.0、50mM Tris-HCl缓冲液重悬菌体，于4℃和8000rpm下离心10min，弃去上清液，收集湿菌体。湿菌体经真空冷冻干燥24h，获得冻干菌体。
2、粗酶液的制备
称取步骤1得到的湿菌体1g，分别加入15mL的50mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)充分重悬菌体后，然后在冰浴(0℃)条件下对菌悬液进行超声破碎。在125W下超声破碎10min，工作1s，间歇3s，以相同条件重复破碎3次。破碎菌液在4℃和8000rpm下离心10min，除去沉淀，所得到的上清液即为目的蛋白的粗酶液。
3、目的蛋白的分离纯化
(1)将步骤2制得的粗酶液按照阴离子交换层析使用说明，取粗酶液加至DEAE离子交换柱(柱内径1.6cm，柱高15cm)中，在手动模式下进行上样，用Buffer A平衡后，依次用不同体积比(9:1，4:1，3:1以及1:1)的Buffer A(Buffer A：50mM的Tris-HCl缓冲液，pH 8.1；)和Buffer B(Buffer B：1M的NaCl溶于50mM的Tris-HCl缓冲液，pH 8.1)混合而成的洗脱液洗脱杂蛋白和目的蛋白。程序进行自动设定洗脱：洗脱速率3.0mL/min，收集体积比4:1的洗脱液对应的流出液，流出液用截留分子量为10kDa超滤管浓缩脱盐，然后截留液用于凝胶过滤层析进一步分离纯化。
(2)将步骤(1)获得的截留液1mL上样于凝胶过滤层析柱(柱内径1.6cm，柱高60cm，填料丙烯葡聚糖凝胶S-200，限压为0.5Mpa)，用50mM，pH 8.1的Tris-HCl缓冲液作为洗脱液；设置洗脱速率为0.5mL/min，控制压力在0.42～0.47Mpa间保持稳定。洗脱量为1.5个柱体积，每1mL流出液收集一管，采用步骤6方法检测流出液中酯酶活力，收集具有酯酶活力的洗脱液并用截留分子量为10kDa的超滤管进行浓缩，取截留液即得到酯酶pnbA-BS纯酶液，存于4℃备用。
4、SDS-PAGE检测样品的制备
取未诱导对照培养液和诱导培养液各1mL，在12000rpm离心1min，弃去上清，留取菌体。菌体随后各加入100μL超纯水，将菌重悬成菌悬液。之后，各取20μL菌悬液，加入4μL6x Protein Loading Buffer混匀后，煮沸10min。煮沸结束后，12000rpm离心1min，各取15μL上清液用于SDS-PAGE检测，蛋白质Marker为BluePlus Protein Marker(14-120kDa)。
酯酶pnbA-BS纯酶液的纯度经SDS-PAGE凝胶电泳验证，SDS-PAGE电泳结果如图3泳道1所示。酯酶pnbA-BS经SDS-PAGE电泳后均为单一条带，表明分离纯化后的酯酶pnbA-BS为电泳纯。酯酶pnbA-BS的亚基理论大小分别为53.8kDa，而在SDS-PAGE电泳上的表观大小约为50kDa。
5、蛋白浓度测定
根据BCA法蛋白质浓度测定试剂盒绘制蛋白浓度标准曲线，测得的线性关系公式为Y＝0.0561X+0.1652，其中Y：是562nm处的吸光度值，X：为BSA溶液浓度(mg/mL)，标准偏差为R2＝0.998。然后根据标准蛋白浓度曲线计算蛋白浓度，进而计算比酶活。每次做三组平行实验，计算平均值和标准误差。
经蛋白浓度测定，步骤3制备的酯酶pnbA-BS的纯酶液蛋白浓度为15.83mg/mL。
6、酶活测定
(1)酯酶pnbA-BS的比酶活测定
酯酶pnbA-BS的酶活力采用多功能酶标仪的单因素动力学方法测定在405nm处吸光值的变化来计算酶活。根据对硝基苯酚浓度与在405nm处吸光值绘制标准曲线，然后根据标准曲线计算待测样品中对硝基苯酚浓度，进而计算比酶活。比酶活测定体系：0.5mM对硝基苯酚丁酸酯，3μg纯酶，加50mM磷酸盐缓冲液(pH 9.0)补足200μL。对硝基苯酚丁酸酯用二甲基亚砜作为溶剂预先配成200mM的底物溶液。酶活力单位(U)的定义为：在上述反应条件下，每分钟生成1.0μmol对硝基苯酚所需要的酶量。
每次做三组平行实验，计算平均值和标准误差。酯酶pnbA-BS的比酶活计算公式如公式1：
式中，X——比酶活，U/mg；A——对硝基苯酚浓度，μM；V1——反应液的总体积，L；t——反应时间，min；V2——添加的酶液体积，mL；C——蛋白浓度，mg/mL。
经比酶活测定，步骤3制备的酯酶pnbA-BS纯酶液的比酶活是5.79U/mg。
实施例3：酯酶pnbA-BS选择性拆分dl-乙酸薄荷酯合成l-薄荷醇的初始反应体系构建
1.反应体系
初始未优化的反应体系10mL：底物dl-乙酸薄荷酯终浓度100mM、实施例2步骤1制备的酯酶pnbA-BS湿菌体终浓度50g/L，加入pH 7.0的100mM PBS缓冲液中构成反应体系10mL。通过滴加1M NaOH水溶液维持pH 7.0，在600rpm和30℃下反应8h。同样条件下，以不加催化剂为空白对照。
反应结束后取200μL反应液于12000rpm离心2min，取上清加入800μL乙酸乙酯萃取。萃取结束后，在12000rpm下离心1min，取上层有机相500μL加入0.8g无水硫酸钠进行除水处理，然后在12000rpm下再离心1min，取100μL上清液，利用气相色谱法检测上清液中l-薄荷醇、d-薄荷醇、d-乙酸薄荷酯和l-乙酸薄荷酯的峰面积，根据各自的标准曲线计算浓度，再根据公式(2)-(5)计算相应催化反应转化率C、l-薄荷醇的产物e.e.p值和对映体选择率E。每次做三组平行实验，计算平均值和标准误差。
l-薄荷醇和d-薄荷醇标准曲线方程：Y＝26217X-18986，其中Y为峰面积，X为d-乙酸薄荷酯或l-乙酸薄荷酯浓度，单位：mM。
d-乙酸薄荷酯和l-乙酸薄荷酯标准曲线方程：Y＝58715X+22787，其中Y为峰面积，X为d-乙酸薄荷酯或l-乙酸薄荷酯浓度，单位：mM。
式中，R1—d-乙酸薄荷酯浓度，mM；S1—l-乙酸薄荷酯浓度，mM；R2—d-薄荷醇浓度，mM；S2—l-薄荷醇浓度，mM。
2.气相色谱条件
气相色谱仪，Agilent 6890N；手性色谱柱，色谱柱：手性柱CP7501(50m×250μm×0.25μm)；检测器，FID，225℃；载气，N2；载气流量，50mL/min；分流比：1:50；进样量：1.0μL；进样口温度：225℃。
底物和产物升温程序：100℃保持8min，4℃/min升到140℃保持5min，40℃/min升到180℃保持1min，共25min。
以乙酸乙酯为溶剂，分别加入d-乙酸薄荷酯(10mM)、l-乙酸薄荷酯(10mM)、d-薄荷醇(10mM)和l-薄荷醇(10mM)的标样，气相色谱图见图2所示。
图2表明底物(dl-乙酸薄荷酯)、副产物(d-薄荷醇)和产物(l-薄荷醇)的保留时间分别如下：d-薄荷醇(20.615min)，l-薄荷醇(20.774min)，l-乙酸薄荷酯(21.097min)，d-乙酸薄荷酯(21.638min)。
实施例4：表达酯酶pnbA-BS单点突变体基因工程菌的构建
以实施例1的质粒pET28a-pnbA-BS为模板，采用表1引物对pnbA-BS进行单点突变，利用全质粒扩增PCR技术构建突变体质粒。
表1用于pnbA-BS单点突变引物序列
PCR扩增体系见表2所示。
表2PCR扩增反应体系
PCR反应进程为：95℃预变性5min；之后，以95℃变性15s，60℃复性15s，72℃保持1min20s为一个循环，重复循环30次；最后，72℃保持5min。PCR产物(G105A、G106A、A107G、A107V、E188A、A190G、A190V、M193A、T326A、A330G、A330V、L331A、M358 A、A400G、A400V、L403A)经0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，同样条件下，以质粒pET28a-pnbA-BS为对照，结果见图4所示。从图4中可看到约8000bp处有明亮的条带，条带与质粒的理论值相符。
PCR产物经37℃酶切1h去除甲基化的模板，酶切体系如表3所示。
表3PCR产物中甲基化模板的消化体系
DpnⅠ酶切后的PCR产物，直接转化表达宿主菌大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，得到大肠杆菌基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a-pnbA-BS-Mut，Mut代表突变子。转化子经菌落PCR验证后接入含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养12h，离心收集菌体，提取质粒，测序。同样条件下，以宿主菌大肠杆菌E.coli BL21(DE3)和E.coli BL21(DE3)/pET-28a-pnbA-BS为对照，测序结果经软件分析氨基酸序列，分别获得G105A、G106A、A107G、A107V、E188A、A190G、A190V、M193A、T326A、A330G、A330V、L331A、M358A、A400G、A400V、L403A突变子，蛋白胶图如5所示。
根据实施例3方法催化与分析，结果如表4，G105A、G106A、A107G、A107V、E188A、A190G、A190V、M193A、T326A、A330G、A330V、L331A、M358A、A400G、A400V、L403A突变子全部能提高l-薄荷醇对映体选择性，其中E.coli BL21(DE3)/pET28a-pnbA-BS-G105S和E.coliBL21(DE3)/pET28a-pnbA-BS-A190V的E值有显著提高，分别为38.5和39.8。
表4pnbA-BS突变子结果
实施例5：表达酯酶pnbA-BS 400饱和突变体基因工程菌的构建
以实施例1的质粒pET28a-pnbA-BS为模板，采用表5引物对400位进行饱和突变，利用全质粒扩增PCR技术构建突变体质粒，PCR产物的核酸胶图见图6所示。
表5用于pnbA-BS的400位点饱和突变引物序列
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同样条件下，以实施例3方法制备得到大肠杆菌基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a-pnbA-BS-A400X，X代表不同于丙氨酸的其它19种氨基酸。转化子经菌落PCR验证后接入含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养12h，离心收集菌体，提取质粒，送去测序。测序结果经软件分析氨基酸序列，400位由丙氨酸分别成功突变为不同于丙氨酸的其它19中氨基酸。饱和突变子的蛋白胶图如图7所示。
根据实施例3方法催化与分析，结果如表6，除了A400Y和A400W，400位点所有有活力的突变体均提高了l-对映体选择性，其中E.coli BL21(DE3)/pET28a-pnbA-BS-A400P最佳，e.e.p值97.1％，E值466.6。
表6pnbA-BS的400位点饱和突变结果
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实施例6：酯酶突变体pnbA-BS-A400P的湿菌体、粗酶液的分离纯化以及纯酶的活力和动力学参数
按实施例2方法，制备E.coli BL21(DE3)/pET28a-pnbA-BS和E.coli BL21(DE3)/pET28a-pnbA-BS-A400P诱导上清液。同样条件下，制备得到酯酶突变体pnbA-BS-A400P的粗酶液及纯酶液，酯酶突变体pnbA-BS-A400P纯酶液的蛋白胶图如图3泳道2所示。经蛋白浓度测定，酯酶突变体pnbA-BS-A400P的纯酶液蛋白浓度14.92mg/mL。经比酶活测定，酯酶突变体pnbA-BS-A400P的比酶活为1.40U/mg。酯酶突变体pnbA-BS-A400P的动力学参数如表7所示，Km和Kcat/Km值分别为0.94mM和1.93mM-1s-1。
表7pnbA-BS及突变体A400P的动力学参数
实施例7：酯酶pnbA-BS纯酶液和酯酶突变体pnbA-BS-A400P纯酶液催化拆分dl-乙酸薄荷酯合成l-薄荷醇的比较
以实施例2方法制备的酯酶pnbA-BS纯酶液(蛋白用量为3.5g/L)及酯酶突变体pnbA-BS-A400P纯酶液(蛋白用量为3.5g/L)为催化剂，反应温度为30℃、pH为7.0，其他操作及反应条件同实施例3。每次做三组平行实验，计算平均值和标准误差。标准品d-乙酸薄荷酯、l-乙酸薄荷酯、d-薄荷醇、l-薄荷醇的气相色谱图如图8中a所示，酯酶pnbA-BS纯酶液催化反应的上清液气相色谱图如图8中b所示，24h内100mM dl-乙酸薄荷酯接近转化完全，产物d-薄荷醇和l-薄荷醇的浓度相近，表明酯酶pnbA-BS具有高活力以及低立体选择性。酯酶突变体pnbA-BS-A400P纯酶液催化反应的上清液气相色谱图如图8中c所示，只有单一产物峰，产物为光学纯l-薄荷醇，表明酯酶突变体pnbA-BS-A400P具有严格的l-对映体选择性。
实施例8：酯酶突变体pnbA-BS-A400P选择性拆分dl-乙酸薄荷酯合成l-薄荷醇的最适催化pH
以实施例2方法制备的E.coli BL21(DE3)/pET28a-pnbA-BS-A400P冻干菌体(用量为20g/L)为催化剂，将实施例3反应体系的pH设为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和8.5，其他操作及反应条件同实施例3。每次做三组平行实验，计算平均值和标准误差。结果如图9所示，当pH为5.5时，l-薄荷醇的转化率为3.23％。当pH偏中性或弱碱性时，转化率也较高，当pH为7.0时，转化率高达35.56％。当pH 8.0和pH 8.5时，转化率分别为8.49％和4.81％。由此可见，最适的反应pH为7.0。
实施例9：酯酶突变体pnbA-BS-A400P选择性拆分dl-乙酸薄荷酯合成l-薄荷醇的最催化温度
以实施例2方法制备的E.coli BL21(DE3)/pET28a-pnbA-BS-A400P冻干菌体(用量为20g/L)为催化剂，将实施例3温度改为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃和50℃，其他操作及反应条件同实施例3。每次做三组平行实验，计算平均值和标准误差，结果如图10所示。在20℃时，l-薄荷醇的转化率为20.50％；当催化温度为30℃时，转化率已达到43.75％。当温度升高至40和50℃时，转化率降至4.019％和2.1705％。综上，最佳反应温度为30℃。
实施例10：酯酶突变体pnbA-BS-A400P选择性拆分dl-乙酸薄荷酯合成l-薄荷醇的最适助溶剂添加量
以实施例2方法制备的E.coli BL21(DE3)/pET28a-pnbA-BS-A400P冻干菌体(用量为20g/L)为催化剂，将实施例3反应温度设为30℃、pH为7.0，并加入体积浓度为0-8％(选取0、2、4、6、和8％)的助溶剂无水乙醇，其他操作及反应条件同实施例3。每次做三组平行实验，计算平均值和标准误差。如图11所示，当助溶剂不添加时，l-薄荷醇的10小时转化率为43.38％，助溶剂浓度在0～6％之间时，助溶剂增加有利于反应的进行，6％的浓度时，8小时转化率为42.9％。当添加助溶剂时，转化率增加幅度不大。因此，反应中不使用助溶剂较为经济。
实施例11：酯酶突变体pnbA-BS-A400P选择性拆分dl-乙酸薄荷酯合成l-薄荷醇时不同底物浓度下反应进程
以实施例2方法制备的E.coli BL21(DE3)/pET28a-pnbA-BS-A400P冻干菌体(用量为20g/L)为催化剂，底物终浓度分别为100mM、250mM、500mM、750mM和1000mM，其他操作及反应条件同实施例3。间隔2h取样，反应时长为14h。如图12所示，当底物浓度为100mM时，4h内转化率接近50％；当底物浓度为250mM时，6小时内dl-乙酸薄荷酯转化率接近50％；当底物浓度为500mM时，14h内dl-乙酸薄荷酯转化率达47.79％；底物浓度的提高进一步的表现出抑制作用，当底物浓度为750mM时，14h内dl-乙酸薄荷酯的转化率为36.25％；当底物浓度为1M时，14h内dl-乙酸薄荷酯转化率仅为20.48％，随着底物终浓度的提高，催化活性被抑制但并未完全失活。当底物浓度≧250mM时，所有反应e.e.p值均>99％。催化dl-乙酸薄荷酯的底物浓度为500mM，l-薄荷醇产量104.95g/L。
实施例12：酯酶突变体pnbA-BS-A400P选择性拆分dl-乙酸薄荷酯合成l-薄荷醇时底物流加方式下反应进程
以实施例2方法制备的E.coli BL21(DE3)/pET28a-pnbA-BS-A400P冻干菌体(用量为20g/L)为催化剂，底物初始浓度250mM，剩余底物以恒速流加方式流加10h至终浓度分别为1M、1.1M、1.2M、1.3M、1.4M和1.8M，达到终浓度后继续反应3～14h，其他操作及反应条件同实施例3。间隔1h取样，反应总时长为13～24h。如图13所示，当底物浓度为1.0M时，反应14h后dl-乙酸薄荷酯的转化率达48.9％；当底物浓度为1.1M时，反应15h后dl-乙酸薄荷酯转化率为48％；当底物浓度为1.2M时，反应18h后dl-乙酸薄荷酯的转化为46.5％；当底物浓度为1.3M时，反应20h后dl-乙酸薄荷酯的转化率为46.2％；当底物浓度为1.4M时，反应21h后dl-乙酸薄荷酯的转化率为38.6％。当底物浓度为1.7M时，反应24h后dl-乙酸薄荷酯的转化率为31.65％。底物浓度为1.0M时，在13h内转化率达48.9％，产物e.e.p值>99％，时空产率为160.52g/(L·d)，证明了底物恒速流加有助于减轻底物抑制，提高底物加载量至1.7M，也提高了产物终浓度至600mM。
经气相色谱-质谱联用分析，1.3M底物经20h反应后所得反应液中的底物和产物分别确认为dl-乙酸薄荷酯和l-薄荷醇(图14中a和b)。气相色谱-质谱联用仪型号为Agilent7890A/5975C，气相色谱条件如实施例2(不需要检测器FID)，质谱检测条件如下：辅助加热器温度，250℃；MS四极杆温度，150℃；离子源温度，230℃；质谱扫描范围，30-500amu；发射电流，200μA；电子能量，70eV。
实施例13：酯酶突变体pnbA-BS-A400P选择性拆分dl-乙酸薄荷酯时产物l-薄荷醇的分离提取及鉴定
1.l-薄荷醇的分离提取
实施例12中1.3M底物经20h反应后所得反应液(主要含有l-薄荷醇和d-乙酸薄荷酯以及少量的l-构型的乙酸薄荷酯)在12000rpm下离心10min除去菌体，取上层有机相加适量无水硫酸钠进行除水处理，然后在12000rpm下再离心1min。取上层有机相过0.22μm有机滤膜进一步去除菌体蛋白，收集滤液，所得滤液上样硅胶层析柱(以粒径300目的硅胶为填料，湿法上样)。为了分离反应液中的底物(d-乙酸薄荷酯以及少量的l-乙酸薄荷酯)和产物l-薄荷醇，对洗脱剂组成进行研究，最终确定乙酸乙酯：正己烷＝1：20(体积比)为流动相洗脱可以达到较好的效果。流速为1.5mL/min，洗脱4个柱体积。利用碱性高锰酸钾和碘缸进行显色鉴别底物和产物，产物薄荷醇使碱性紫色高锰酸钾褪色，底物乙酸薄荷酯放入碘缸40秒显黄色。收集l-薄荷醇洗脱峰，通过减压蒸馏除去溶剂获得l-薄荷醇，如图15所示为所得l-薄荷醇固体粉末。
2.l-薄荷醇的鉴定
得到的产品进行气相色谱分析，同实施例3步骤2。产物经手性气相色谱分析，为光学纯的l-薄荷醇。产物经进一步的1H和13C核磁共振分析，所得的结构信息也与薄荷醇相符(图16中a和b)。产物1H NMR(600MHz,溶剂氘代氯仿)的化学位移信息：δ3.42(td,J＝10.5,4.3Hz,1H),2.25–2.14(m,1H),2.01–1.83(m,1H),1.75–1.64(m,1H),1.64–1.59(m,1H),1.58–1.34(m,2H),1.18–1.07(m,1H),1.03–0.95(m,2H),0.93(dd,J＝9.3,6.8Hz,6H),0.89–0.84(m,1H),0.82(d,J＝7.0Hz,3H)。产物13C NMR(151MHz,溶剂氘代氯仿)的化学位移信息：δ71.52(s),50.14(s),45.06(s),34.55(s),31.64(s),25.82(s),23.14(s),22.21(s),21.01(s),16.09(s)。
序列表
<110> 浙江工业大学、浙江英沃迪生物科技有限公司
<120> 酯酶pnbA-BS突变体及其在制备l-薄荷醇中的应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1467
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis )
<400> 1
atgacccata aaaccgtgac cacccattat ggtaaagtta aaggtaccac cgaaaacggc 60
gtgcatatct ggaaaggtat tccgtatgcc aaaccgccga tcggccagct gcgctttaaa 120
gcacctgaac caccggaagt ttgggaagat atcctggatg caacagcata tggcccgatt 180
tgtccgcagc cgccggatct gctgagtctg tcatatgcag aactgcctca gcagagcgaa 240
gattgtctgt atgttaatgt ttttgcgccg gataccccga gccagaatct gcctgttatg 300
gtttggattc atggtggtgc attttatctg ggtgcaggta gcgaacctct gtatgatggt 360
agccgtctgg cggcccaggg tgaagttatt gttgttacgc tgaattatcg tctgggtccg 420
tttggttttc tgcatctgag cagctttgat gaagcatata gtgataatct gggtctgctg 480
gatcaggcag cagcactgaa atgggtgcgt gataatatta gcgcatttgg tggtgatccg 540
gataatgtta ccgtttttgg tgaaagcgca ggtggtatga gtattgctgc actgctggca 600
atgccggcag caaaaggtct gtttcagaaa gcaattatgg aaagcggtgc aagccgtacc 660
atgaccaaag aaaaagcagc aagcacagca gcagcctttc tgcaggttct gggtatttca 720
gaaagccagc tggatcgtct gcatacagta agcgcagaag atctgctgaa cgcagccgat 780
cagctgcgta aagcagaaaa tgaaaatctg tttcagctgc tgtttcagcc ggtgctggat 840
ccgaaaaccc tgccagccga accagaaaaa gcaattgcag aaggtaccgc agcaggtatc 900
ccactgctga ttggtaccaa tcgtgatgaa ggttatctgt tttttacacc ggatagtgat 960
gtgcattctc aggaaacatt tgatgcagca ctggaatatc tgctgggtca gccgctggca 1020
aaaaaagcag cagatctgta tccgcgtagc ctggaaagcc agattcatat gatgaccgat 1080
ctgctgtttt ggcgtccggc agttgcatgt gcaagcgcac agagccatta tgcaccggtt 1140
tggatgtatc gttttgattg gcatagcgat aaaccgccgt ataataaagc atttcatgca 1200
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gttaccgatg aagttaaaca gctgagccat accgttcaga gcgcatggac cacctttgca 1320
aaaaccggta atccgagcac cgaagatgtt aaatggccgg catatcatga agaaacccgt 1380
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Glu Asp Ile Leu Asp Ala Thr Ala Tyr Gly Pro Ile Cys Pro Gln Pro
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Pro Asp Leu Leu Ser Leu Ser Tyr Ala Glu Leu Pro Gln Gln Ser Glu
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gttaccgatg aagttaaaca gctgagccat accgttcaga gcgcatggac cacctttgca 1320
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Claims (10)

1.一种酯酶pnbA-BS突变体，其特征在于，所述酯酶pnbA-BS突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第400位丙氨酸突变为脯氨酸获得的。
2.一种含权利要求1所述酯酶pnbA-BS突变体的编码基因的重组载体，其特征在于，所述重组载体是将酯酶pnbA-BS突变体编码基因插入pET28a载体上的Nco I和Xho I位点，得到重组载体pET28a-pnbA-BS-A400P。
3.一种权利要求2所述重组载体构建的重组基因工程菌，其特征在于，所述重组基因工程菌是将所述重组载体导入宿主菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中获得的。
4.一种权利要求1所述酯酶pnbA-BS突变体在催化dl-乙酸薄荷酯制备l-薄荷醇中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述应用为：将含酯酶pnbA-BS突变体编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体制得的冻干菌体或湿菌体经超声破碎提取的纯酶液为催化剂，以dl-乙酸薄荷酯为底物，以pH 5.0～9.0、100mM PBS缓冲液为反应介质构成反应体系，在10～50℃、600rpm条件下转化反应8～24h，获得含l-薄荷醇的反应液，反应液经离心去除菌体并收集有机相，有机相经分离纯化，获得l-薄荷醇。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述反应体系中，催化剂为纯酶液时用量以蛋白含量计为1～5g/L，催化剂为冻干菌体时用量为10～30g/L，催化剂为湿菌体时用量为30～80g/L；底物加入量为100～1700mM。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述湿菌体和冻干菌体按如下方法制备：将含酯酶pnbA-BS突变体编码基因的工程菌接种至含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养12h，获得种子液，将种子液以体积浓度2％的接种量接种至新鲜的含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养至OD600为0.5～0.7，再加入终浓度为0.5mM的IPTG，24℃诱导16h，获得诱导培养液，再将诱导培养液于4℃和8000rpm下离心10min，弃去上清液，收集湿菌体；湿菌体经真空冷冻干燥24h，获得冻干菌体。
8.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述纯酶液按如下方法制备：(1)将湿菌体以1g：20mL的比例加入pH 8.1、50mM的Tris-HCl缓冲液中，在125W、工作2s、间隔6s的条件下超声破碎15min，离心，取上清即为粗酶液；(2)取粗酶液加至DEAE离子交换柱中，手动上样，用Buffer A平衡后，依次用体积比9:1，4:1，3:1以及1:1的Buffer A和Buffer B的混合液作为洗脱液洗脱杂蛋白和目的蛋白，洗脱速率3.0mL/min，每个洗脱液洗脱1.5个柱体积，收集体积比4:1的洗脱液对应的流出液，流出液用截留分子量为10kDa超滤管浓缩脱盐，收集截留液；(3)将步骤(2)截留液上样于凝胶过滤层析柱，填料为丙烯葡聚糖凝胶S-200，用50mM，pH8.1的Tris-HCl缓冲液作为洗脱液；洗脱速率为0.5mL/min，控制压力在0.42～0.47Mpa间保持稳定；收集具有酯酶活力的流出液并用截留分子量为10kDa的超滤管进行浓缩，取截留液即得到酯酶pnbA-BS突变体纯酶液；所述Buffer A：50mM的Tris-HCl缓冲液，pH 8.1；所述Buffer B：1M的NaCl溶于50mM的Tris-HCl缓冲液，pH 8.1。
9.如权利要求5所述的应用，其特征在于在反应过程中底物一次加入或者恒速流加方式加入；当底物加载量小于1000mM时，在反应开始时一次加入，反应时间8～14h；当底物加载量为1000～1700mM，底物按恒速流加方式进行：初始底物浓度为250mM，剩余底物通过恒速微量泵注入到反应体系中，恒速流加时间为10h，底物流加完成后再继续反应4～14h。
10.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述反应液分离纯化方法为：所得反应液在12000rpm下离心10min去除菌体，取上层有机相加适量无水硫酸钠进行除水处理，然后在12000rpm下再离心1min；取上层有机相经有机膜过滤去除菌体蛋白；滤液进行硅胶柱层析，填料为300目硅胶，湿法上样，流动相为体积比1:20的乙酸乙酯：正己烷，流速为1.5mL/min，洗脱4个柱体积，收集l-薄荷醇洗脱峰，用减压蒸馏除去溶剂，到产物l-薄荷醇。
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