KR101081012B1

KR101081012B1 - 클로로히드린 및 하이드록시카르복실산 에스테르 부제가수분해 효소 유전자

Info

Publication number: KR101081012B1
Application number: KR1020030069618A
Authority: KR
Inventors: 나카가와아쯔시; 스즈끼도시오; 신미오아쯔히코; 가토고; 이도가키히데아키
Original assignee: 다이소 가부시키가이샤
Priority date: 2002-10-07
Filing date: 2003-10-07
Publication date: 2011-11-09
Also published as: EP1408107A2; ATE461998T1; US7335502B2; EP1408107A3; US20060257988A1; KR20040031664A; DE60331802D1; EP1408107B1; US20040132154A1; US7112428B2

Abstract

광학활성 카르복실산, 그 에난티오머 에스테르, 및 락톤의 합성에 유용한 부제가수분해효소 유전자를 제공한다.

엔테로박터속에 속하는 세균인 Entcrobacter sp. DS-S-75 균주(FERM BP-5494) 유래의 하이드록시카르복실산 에스테르 부제 수해효소(EnHCH), 서열번호l의 염기 서열로 표현되는 EnHCH 유전자, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코드화하는 유전자 및 2002년 9월 13일자로 수탁번호 FERM P190l4 (2003년 9월 8일에 부다페스트 조약에 기해 기탁이관이 청구되어 기탁번호 FERM BP-08466호를 부여받음)로서 독립 행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터 (International Patent Organism Depositary National Institute of Advanced Industrial Science and Technology)에 기탁되어 있는 대장균 DH5a (pKK-EnHCH).

Description

클로로히드린 및 하이드록시카르복실산 에스테르 부제 가수분해 효소 유전자{CHLOROHYDRIN AND HYDROXY CARBOXYLIC ESTER HYDROLASE GENE}

도 1은 콜로니 하이브리다이제이션에 의해 얻어진 pBluescriptⅡ KS에 클로닝된 EnHCH 유전자(pBl-EnHCH)의 모식도이다.

도 2는 pKK-EnHCH1∼4의 구축에 있어서의 PCR 프라이머의 해설이다.

도 3은 도 2에서 얻어진 PCR 산물의 플라스미드 pKK223-3으로의 서브클로닝을 나타내고 있다.

도 4는 재조합 단백질의 SDS-PAGE 사진이다.

본 발명은 의약, 농약, 및 강유전성 액정 등에 사용되는 광학활성 화합물 또는 그 중간체의 합성에 있어서, 유용한 키랄 빌딩 블록이 될 수 있는 광학활성 클로로히드린, 광학활성 3-하이드록시-γ-부티로락톤, 광학활성 하이드록시 카르복실산, 및 그의 에난티오머 알킬에스테르의 제조시 유용한 생체 촉매인 하이드록시카르복실산 에스테르 부제 가수분해 효소 (Hydroxy Carboxylic ester Hydrolase: Enl1CH라 약칭한다), 그것을 코드하는 유전자, 그 유전자를 함유하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터에 의하여 형질 전환된 형질전환체 및 그 형질전환체를 사용한 상기 효소의 제조 방법에 관한 것이다. 또한 상기 효소 및 싱기 형질전환체를 사용한 광활성체의 제조 방법에 관한 것이다.

광학활성 화합물의 제법으로서는 대응하는 광학활성 출발물로부터 목적물로 변환시키는 화학적 합성법 외에, 대응하는 라세미체를 광학 분할제로 처리하여 광학활성체로 분할하는 방법이 일반적이지만, 최근, 미생물 또는 효소를 사용하여 부제 환원이나 부제 가수분해 반응을 이용하는 생물학적 방법에 의하여 광학활성체를 분리하는 방법이 보고되어 있다.

광학활성 4-클로로-3-하이드록시카르복실산 에스테르의 제법으로서는, 산타니엘로(E, Santanie11o) 등이, 4-클로로-3-옥소부탄산 에틸로부터 빵 효모를 사용한 부제 환원법에 의한 S체 4-클로로-3-하이드록시부탄산 에틸의 제법을 보고한 바 있다 (E. Santaniello 등 저, J, Chem Research, 1984년, p132-l33). 또한 다카하시 등도 4-클로로-3-옥소부탄산 에틸의 미생물을 사용한 부제 환원에 의하여 광학활성 4-클로로-3-하이드록시부탄산 에틸의 제법을 보고하고 있다 (일본공개특허공보61-146191호 공보).

효소를 사용한 제법에서는, 피터스 등 (Peters 등)은 로도코커스 에리쓰로폴리스 (Rhodococcus erythropo1is)의 카르보닐 리덕타제를 사용한 부제 환원법에 의하여 메틸3-옥소부탄산 혹은 4-클로로-3-옥소부탄산 에틸로부터의 S체 3-하이드록시부탄산 메틸 및 R체 4-클로로-3-하이드록시부탄산 에틸의 제법을 보고하고 있다 (J. Peters 등 저, Appl. Microbiol, Biotechno1., 1992년, 제38권, p. 334-340, 및 T. Zelinski 등 저, J. Biotechno1., l994년, 제33권, p.283-292). 또한, 기요미즈 등은 스포로보로마이세스 살로모니콜로 (Sporoboromyces salmonico1or) AKU4429 균주의 알데히드 리덕터제를 사용한 R체 4-클로로-3-하이드록시부탄산 에틸의 부제 환원법에 의한 제법을 보고하고 있다 (기요미즈 등 저, Biotechnol. Lett., l990년, 제12권, p. 593-596 및 기요미즈 등 저, App1. Microbiol. Biotechnol, 1990년, 제56권, p. 2374-2377).

그러나, 이들 미생물 혹은 효소를 사용하는 부제 환원법에 의한 프로키랄 β- 케토에스테르체로부터의 광학활성 β-하이드록시에스테르체의 생산법에 있어서는, 그 반응에 고가의 NADH (니코틴 아미드 아데닌 디뉴클레오티드) 또는 NADPH(니코틴 아미드 아데닌 디뉴클레오티드 인산) 등의 보효소를 필요로 하고, 또한 그 산화체로부터 다시 한번 환원체로 변환하는 반응을 필요로 하기 때문에 글루코스 옥시다제 또는 개미산 하이드로게나제 등의 효소를 별도 필요로 하고, 그 반응 공정이 율속반응이 되는 등의 관점에서 공업적 제법이라고는 하기 어렵다.

광학활성 3-하이드록시부탄산 에스테르의 제법으로서는, 효모 (Hamdani 등)저, Tetrahedron:Asymmetery, 1991년, 제2권, p. 867-870)이나 할로박테리아 할로븀 (Halobactcrium halobium) (Ehrler 및 Seebach 저, Helv, Chim, Acta., 1989년, 제72권, p793-799) 등의 미생물을 사용한 아세트초산 에스테르로부터의 부제 환원법에 의한 S체 3-하이드록시부탄산 에스테르의 제법이 알려져 있다. 그러나, 이 경우도 반응에 고가의 NADH (니코틴아미드아데닌 디뉴클레오티드) 또는 NADPH (니코틴아미드아데닌 디뉴클레오티드 인산) 등의 보효소를 필요로 한다.

또한 상기 할로박테리아 할로븀(Halobactcrium halobium)을 라세미체 3-하이드록시부탄산 에스테르에 작용하게 한 경우, 카르복실산 에스테르 가수분해 반응에 의하여 R체 3-하이드록시부탄산 에스테르가 잔존하는 것이 보고되어 있다. 그러나, 입체 선택적인 에스테르 분해 활성을 갖는 미생물을 사용한 라세미체 3-하이드록시부탄산 에스테르로부터의 고광학 순도의 S체 3-하이드록시부탄산 에스테르의 제법은 알려져 있지 않다.

광학활성 2-하이드록시부탄산 에스테르의 제법으로서는, 리파제를 사용한 2 급 알코올의 에스테르 교환 반응에 의한 2-하이드록시 헥사데칸 에스테르나 2-하이드록시 테트라코산산 에스테르로부터의 제법이 알려져 있다 (스기가이라 등 저, 유기 합성 화학회지, 1995년, 제53권, p.48-58). 그러나, 카르복실산 에스테르의 가수분해 반응에 의한 광학활성2-하이드록시부탄산 에스테르의 제법은 알려져 있지 않다.

또한 광학활성 젖산의 미생물 혹은 효소를 이용한 제법으로서는, 젖산균을 사용한 글루코스로부터의 발효법 (Brin 저, Biochem Prepn., 1953년, 제3권, p.61 및 Andersen 및 Greaves 저, Ind. Eng. Chem., 1942년, 제34권, p.34)나 슈도모나스 (Pseudomonas)속의 미생물을 사용한 2-할로프로피온산으로부터의 탈할로겐화 효소에 의한 제법 (Soda 등 저, Biodegradation, 1995년, 제6권, p.223-227)이 알려져 있다. 그러나, 카르복실산 에스테르를 입체 선택적으로 가수분해하는 것에 의한 광학활성 젖산 에스테르나 젖산의 제법은 알려져 있지 않다.

또한 광학활성 테트라히드로푸란-2-카르복실산 에스테르의 효소를 이용한 제 법으로서는, 각종 자연계 유래의 프로테아제, 리파제 (국제공개 제 01/92553호 팜플렛, 국제공개 제01/92554호 팜플렛), 에스테라제 (일본공개특허공보 제2002-171994호 공보)를 사용한 라세미체로부터의 입체 선택적 가수분해에 의한 제법이 알려져 있다. 그러나 R체 테트라히드로푸란-2-카르복실산 메틸을 고광학 순도로 얻는 제법은 없다. 또한 고가의 효소를 구입하여야 한다.

이와 같은 이유에서, 분리한 균체를 배양하고, 고성능의 효소를 저렴하게 또한 대량으로 생산하고, 광학활성 하이드록시 카르복실산 및 그 에난티오머 알킬에스테르의 간편한 제조에 응용하는 것이 강하게 요망되었다.

또한 상기 효소의 유전자를 클로닝할 수 있다면, 유전자 공학기법을 사용하여 상기 효소를 저렴하고 대량으로 제조하는 것이 가능하게 되므로, 상기 효소를 코드하는 유전자를 클로닝하는 것이 강하게 소망되고 있다.

이와 같은 점을 해결하는 것으로서, 이미 본 발명자들은 입체 선택적 에스테르 가수분해 반응을 가져오는 엔테로박터 (Enterobacter)속에 속하는 세균인? Enterobacter sp. DS-S-75 균주 (FERM BP-5494)를 토양으로부터 분리하고, 라세미체 4-클로로-3-하이드록시부탄산 에스테르와 같은 클로로히드린에 미생물균체 또는 그 균체 산생물을 작용시켜, 입체 선택적 탈클로로화 및 에스테르 가수분해 반응에 의하여 S체 4-클로로-3-하이드록시부탄산 에스테르를 광학활성 3-하이드록시-γ-부티로락톤으로 변환하여, 잔존하는 또 한편의 R체 4-클로로-3-하이드록시부탄산 에스테르를 동시에 회수하는 방법을 밝혀낸 바 있다 (특개평9-47296호 공보 및 미국 특허 제5,776,766호 명세서, 스즈키 등 저, Enzyme and Microb. Technol., 1999년 제24권, p.13-20).

이어서,? 상기 미생물 균체 반응 기질 특이성에 대하여 연구를 진행한 결과, 상기 미생물이 널리 하이드록시카르복실산 에스테르를 입체 선택적으로 가수분해하는 성질을 발견하기에 이르렀다 (일본특허출원 평13-391726호 명세서). 또한, 연구를 진행한 결과, 상기 균체 내에서 상기 미생물 균체 반응에 관여하는 부제 가수분해 효소(EnHCH)의 정제에 성공하여, 이것을 코드하는 EnHCH 유전자를 취득하는데 성공하였다.

입체식별성이 향상되고, 미생물의 촉매 능력을 종래와 비교하여 비약적으로 증대시킬 수 있을 뿐만 아니라, 재조합 DNA 기법에 의해 광학활성체를 대량생산할 수 있는 클로로히드린 및 하이드록시카르복실산 에스테르 부제 가수분해 효소 (EnHCH) 및 그 유전자를 제공한다. 또한 상기 유전자를 포함하는 벡터, 형질전환체 및 상기 효소를 사용하는 광학활성체의 제조 방법도 제공한다. 또한, 형질전환체에서 안정적으로 유전자 발현되는 EnHCH의 시그널 펩티드를 코드하는 유전자도 제공한다.

[과제를 해결하기 위한 수단]

본 발명에 의하면, 아래의 염기 서열:

(a) 서열번호 1에 기재된 염기 서열,

(b) 서열번호 1에 기재된 염기 서열에 있어서, 1부터 복수개의 염기가 결실, 부가 또는 치환되어 있는 염기서열로서, 클로로히드린 및 하이드록시카르복실산 에스테르 부제 가수분해 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열,

(c) 서열번호 1에 기재된 염기 서열과 스트린젠트 (stringent)한 조건하에서 하이브리다이즈하는 염기서열로서 클로로히드린 및 하이드록시카르복실산 에스테르 부제 가수분해 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열,

(d) 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열,

(e) 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1부터 복수개의 아미노산이 결실, 부가 또는 치환되어 있는 아미노산 서열로서, 클로로히드린 및 하이드록시카르복실산 에스테르 부제 가수분해 효소 활성을 갖는 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열, 또는

(f) 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열과 적어도 60% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로서, 클로로히드린 및 하이드록시카르복실산 에스테르 부제 가수분해효소 활성을 갖는 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열,

의 어느 하나의 염기서열로 이루어지는 유전자가 제공된다.

또한, 본 발명에 의하면 아래의 아미노산 서열:

(a) 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열

(b) 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1부터 복수개의 아미노산이 결실, 부가 또는 치환되어 있는 아미노산 서열로서, 클로로히드린 및 하이드록시카르복실산 에스테르 부제 가수분해 효소 활성을 갖는 아미노산 서열, 또는

(c) 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열과 적어도 60% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로서, 클로로히드린 및 하이드록시카르복실산 에스테르 부제 가수분해 효소 활성을 갖는 아미노산 서열

의 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질이 제공된다.

또한, 본 발명에 의하면, 본 발명의 형질전환체를 사용한 휴지 균체 반응을 위한, 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 시그널 펩티드가 제공된다.

또한 본 발명에 의하면, 서열번호 8의 염기 서열로 이루어진 시그널 펩티드를 코드하는 DNA가 제공된다.

또한 본 발명에 의하면 본 발명의 유전자를 포함한 벡터가 제공된다. 바람직하게는 벡터는 시그널 펩티드를 코드하는 DNA를 포함하고, 더욱 바람직하게는, 플라스미드 pKK-EnHCHl이다.

또한 본 발명에 의하면, 상기 벡터를 포함하는 형질전환체가 제공된다. 바람직하게는 숙주는 대장균이고, 보다 바람직하게는, 대장균 JMl09주 또는 DH5α균주이다.

또한 본 발명에 의하면 본 발명의 유전자 또는 단백질을 사용하는 것을 포함하는 본 발명의 단백질의 제조방법을 제공한다.

또한 본 발명에 의하면, 본 발명의 단백질, 형질전환체를 사용한 광학활성체의 제조방법이 제공된다.

발명의 실시형태

이하, 본 발명의 실시 형태에 대하여 상세하게 설명한다.

본 발명에 의하면, 아래의 염기 서열:

(a) 서열번호 1에 기재된 염기 서열,

의 어느 하나의 염기서열로 이루어지는 유전자에 관한 것이다.

본 명세서에 있어서「l부터 복수개의 아미노산이 결실, 부가 또는 치환되어 있다」는 것은, 예를 들면 1～20개, 바람직하게는 1～15개, 보다 바람직하게는 1～10개, 더욱 바람직하게는 l～5개의 임의의 수의 아미노산이 결실, 부가 또는 치환되는 것을 의미한다. 본 명세서에 있어서「l부터 복수개의 염기가 결실, 부가 또 는 치환되어 있다」는 것은, 예를 들면 1～20개, 바람직하게는 1～15개, 보다 바람직하게는 1～10개, 더욱 바람직하게는 1～5개의 임의의 수의 염기가 결실, 부가 또는 치환되어 있는 것을 의미한다.

본 명세서에 있어서「스트리젠트한 조건 하에서, 하이브리다이즈할 수 있다」는 것은, DNA 또는 RNA등의 핵산을 프로브로서 사용하여, 콜로니-하이브리다이제이션법, 플라크 하이브리다이제이션법, 또는 서던 블롯 하이브리다이제이션법 등을 사용함으로써 얻어지는 핵산을 의미하고, 구체적으로는, 콜로니 혹은 플라크 유래 DNA 또는 상기 DNA의 단편을 고정화한 필터를 사용하여,? 0.7 ~ l.0M의 NaCl 존재 하에서, 65℃에서 하이브리다이제이션을 실시한 후, 0.1 ~ 2배 정도의 SSC 용액 (l배 농도의 SSC 용액의 조성은? 150mM 염화나트륨, 15mM 구연산나트륨)을 사용하고, 65℃ 조건하에서 필터를 세정함으로써 동정할 수 있는 DNA를 들 수 있다. 하이브리다이제이션은, Molecular C1oning: A laboratory Mannual. 2nd Ed.,? Cold Spring Harbor Laboratory Cold spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY., 1989. 이하 "Molecular Cloning 제 2판"으로 약칭한다)등으로 기재되어 있는 방법에 준하여 행할 수 있다.

스트리젠트한 조건하에서 하이브리다이즈할 수 있는 DNA로서는, 프로브로서 사용하는 DNA의 염기 서열과 일정 이상의 상동성을 갖는 DNA를 들 수 있고, 상동성은 예를 들면 60% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 특히 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상이다.

본 명세서에 있어서, 「클로로히드린 및 하이드록시카르복실산 에스테르 부제 가수분해 효소」란, 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질로 이루어지고,? 분자량은, 75.0kDa이고, 분자량 37.5kDa의 서브유니트의 호모 이량체이고, 등전점은 6.7이다.

본 명세서에 있어서「클로로히드린 및 하이드록시카르복실산 에스테르 부제 가수분해효소 활성」이란,

????????Cl-CH₂-CHOH-CH₂-COOR^{1???????????????}[1]

(식중, R¹은 C1 ~ C4의 알킬기이다. )

로 표시되는 바와 같은 라미세체 클로로히드린을 입체 선택적으로 탈클로로 및 가수분해시켜,

로 표시되는 S체 3-하이드록시-γ-부티로락톤을 생성시켜, R체 클로로히드린을 잔존시킨다. 또한 화학식〔3〕:

??????R²-(CH₂)n-CHOH-(CH₂)m-COOR¹?????????[3]

(식중, R¹은 C1 ~ C4의 알킬기이고, R²는 메틸기 또는 벤질기이며,?R²가 메틸기일 때, m이 0이면 n은 0 또는 1이고, m이 1이면 n는 0이다. R²가 벤질기인 때, m이 0이고, n은 1이다.)

으로 표시되는 바와 같은 라세미체 하이드록시 카르복실산 에스테르를 입체선택적으로 가수분해하여, 광학활성 하이드록시카르복실산을 생성하고, 그 에난티오머 에스테르를 잔존시킨다. 또한 아래 화학식 [4〕:

(식중, R¹은 C1 ~ C4의 알킬기이다.)

로 표시되는 바와 같은, 라세미체 테트라히드로푸란-2-카르복실산 에스테르를 입체 선택적으로 가수분해하고, R체 테트라히드로푸란-2-카르복실산 에스테르를 잔존하게 하는 작용을 말한다.

또한 본 발명의 유전자의 취득 방법은 특별히 한정되지 않는다. 본 명세서 중에 개시한 서열번호 1에 기재된 염기 서열은 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열 정보에 기초하여 적당한 프로브나 프라이머를 조제하고, 그것들을 사용하여 해당 유전자가 존재할 것으로 예측되는 DNA 라이브러리를 스크리닝함으로써 목적으로 하 는 유전자를 단리할 수 있다.

구체적으로는, 본 발명의 서열번호 1에 나타낸 EnHCH 유전자는 예를 들면 엔테로박터속에 속하는 미생물 DS-S-75 균주(FERM BP-5494)의 염색체 DNA로부터 분리할 수 있다. 그 유전자 공여체로부터의 EnHCH 유전자를 갖는 DNA 단편의 취득은, 예를 들면 정제 효소 EnHCH의 폴리펩티드 사슬의 부분 아미노산 서열을 기초로 할 수 있다. 즉, 정제 효소를 엔도펩티다제에 의하여 소화하고, 단백질 시퀀서에 의하여 각 단편의 아미노산 서열의 일부를 결정하고, 이것을 원료로 하여 폴리머라제 연쇄반응 (PCR)용 프라이머를 합성한다. 이어서 엔테로박터속 DS-S-75 균주의 염색체 DNA를 주형으로 한? PCR을 행하고,? EnHCH 유전자의 일부를 증폭시켜, 그 염기 서열을 명백히 한다. 얻어진 EnHCH 유전자의 부분 염기 서열을 프로브로 하여, 유전자 공여체의 염색체 DNA로부터 상법에 의하여 제작한 DNA 라이브러리로부터? 하이브리다이제이션을 사용하여 목적으로 하는 유전자의 DNA 단편을 얻을 수 있다.

취득한 EnHCH 유전자의 DNA염기 서열의 결정법으로서는, 예를 들면 디데옥시시퀀스법을 들 수 있다. 이 방법에는, PCR에 의하여 유전자를 증폭하는 방법이나 핵산 분해 효소에 의하여 결실시키는 방법 등의, 유전자공학 분야에서 관용되는 여러가지 기법이 포함된다. 이러한 방법에 의하여 서열번호 l에 표시되어진 목적으로 하는 DNA 염기 서열중에 전체 아미노산을 코드하는 오픈 리딩 프레임 (ORF)를 확인할 수 있다.

본 발명의 EnHCH를 코드하는 DNA는 EnHCH 활성을 갖는 아미노산 서열이 실질적으로 서열번호 2에 표시된 폴리펩티드를 코드하는 염기 서열을 포함하는 것을 특 징으로 한다. 여기서, EnHCH 활성을 갖는 한, 서열번호 2에 나타낸 아미노산 서열에 대하여 아미노산의 1개 또는 수개의 결실, 삽입, 치환 등이 있어도 된다. 예를 들면, DNA가 코드하는 아미노산 서열에 대하여 아미노산의 몇개의 결실, 삽입, 치환 등을 일으키도록 DNA를 개변하는 것은, 합성 올리고뉴클레오티드를 사용한 부위 특이적 변이 도입법 등의 주지의 방법으로 적절하게 실시할 수 있다. 또한 서열번호 1에 나타낸 DNA 또는 그 DNA를 적절하게 개변한 DNA를 주형으로 하여, Mn²⁺이온의 존재 하 (통상 0.5 ~ 10mM의 농도), 또는 특정 뉴클레오티드의 농도를 낮추어 PCR법을 실시함으로써 랜덤하게 변이가 도입된 DNA를 얻을 수 있다. 이와 같이 하여 얻어진 DNA 중에, EnHCH의 활성을 갖는 단백질을 코드하는 것이, 본원 발명에 포함되는 것은 말할 것도 없다.

또한 본 발명은, 아래의 아미노산 서열:

(a) 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열

(c) 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열과 적어도 60% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로서, 클로로히드린 및 하이드록시카르복실산 에스테르 부제가수분해 효소 활성을 갖는 아미노산 서열 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질에도 관한 것이기도 하다.

본 명세서에 있어서,「서열번호 2에 기재된 아미노산 서열과 적어도 60% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열」이라 함은, 서열번호 2의 아미노산 서열과의 상동성이 60% 이상이면 특별한 제한은 없고, 예를 들면, 60% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 또한 바람직하게는 90% 이상, 특히 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상인 것을 의미한다.

본 발명의 효소의 정제 방법은, 특별히 한정되지 않지만, 통상의 단백질의 정제 방법을 적당하게 조합함으로써 정제할 수 있다. 예를 들면, 균체를 초음파에 의하여 파쇄한 후, 황산암모늄에 의한 염석을 수행하고,? 침전의 용해물을 소수 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피를 조합함으로써 도데실황산나트륨 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (이하 SDS-PAGE라 약칭한다)에 의해 단일하게 될 때까지 정제할 수 있다.

또한 본 발명은 EnHCH의 상류에 위치하는 서열번호 7로 나타내는 25 아미노산으로 이루어지는 시그널 펩티드와 그것을 코드하는 유전자 (서열번호 8에 나타낸다)를 제공한다. 이 시그널 펩티드에 의하여 상기 유전자를 도입한 대장균의 형질전환체로부터 높은 EnHCH 활성을 균체 배양액의 상태로 얻을 수 있다. 배양액을 제균하면 활성은 없어지고, 배지 중에는 효소가 존재하지 않으므로, 과잉 반응 방지나, 생성물의 추출이 용이하다. 또한 경우에 따라서는, 상기 시그널 서열의 유전자만을 다른 유용한 유전자에게 연결할 수 있다.

또한 본 발명은 EnHCH 활성을 나타내는 아미노산 서열을 코드하는 유전자의 염기 서열을 포함하는 발현 플라스미드를 제공한다. EnHCH의 유전 정보를 담당하는 DNA 단편으로부터 필요한 부분을 벡터에 넣음으로써 숙주 세포에 도입하여 형질전환체를 얻을 수 있다. 이와 같은 벡터로서 바람직한 것은, 숙주 세포 중에서 자율 복제 가능하고, 또한 재조합 숙주 세포만을 선별할 수 있는 적당한 선택 마커 등이 부여된 것을 들 수 있고, 적당한 숙주 세포 내에서, 본 발명의 유전자를 발현할 수 있는 것이다. 또한, 이와 같은 벡터는 공지의 벡터 등으로부터 공지 기술을 사용하여 당업자가 용이하게 제조할 수 있는 것이어도 되고, 상업적으로 판매되고 있는 것이어도 된다. 특히 바람직한 것은 플라스미드 pKK-223-3이다.

또한, 본 발명은, 아미노산 서열이 실질적으로 서열번호 2에 나타내는 폴리펩티드를 코드하는 DNA에 의하여 형질전환된, EnHCH 활성을 갖는 효소의 생산능을 갖는 미생물을 제공한다.

사용되는 숙주 세포로서는, 얻어진 재조합 벡터로서 형질전환되고, 또한 본유전자를 발현시킬 수 있는 것이면 특별한 제한없이 사용할 수 있다. 이와 같은 숙주 세포로서는 본 발명의 목적에 따라서 본 유전자의 발현을 달성할 수 있는 한, 그램 음성균 또는 그램 양성균의 구별없이, 그리고, 원핵세포 또는 진핵세포의 구별 없이, 동물 유래 세포이든 식물 유래 세포이든 사용할 수 있다.

구체적으로 본 발명에 사용할 수 있는 숙주 세포로서는, 예를 들면,? 대장균 (Escherichia coli), 엔테로박터속, 사카로미세스속, 크산토모나스속, 아세토박터속, 슈도모나스속, 글루코노박터속, 아조토박터속, 리조븀속, 클렙시엘라속, 살모넬라속 및 세라티아속으로부터 선택되는 미생물을 들 수 있지만, 바람직하게는 대장균을 사용한다. 특히 바람직한 것은 대장균 DH5α이다. DH5α(pKK-EnHCH1)는, 2002년 9월 13일자로 수탁번호 FERM P-19014로서 독립행정법인 산업기술연구소 특허생물기탁센터에 기탁되었으며, 2003년 9월 8일에 부다페스트 조약에 기해 기탁이관이 청구되어 기탁번호 FERM BP-08466호를 부여받았다.

형질전환체는, 적당한 영양 배지 중에서 배양을 함으로써 보다 대량으로 얻을 수 있다. 배양에 사용되는 배지는 미생물의 생육에 필요한 탄소원, 질소원, 무기물질 등을 포함하는 통상의 배지이면 된다. 예를 들면 탄소원으로서 글루코스, 프럭토스 등의 탄수화물, 글리세롤, 만니톨, 솔비톨, 프로필렌글리콜 등의 알코올류, 초산, 구연산, 사과산. 말레산, 푸마르산. 글루콘산과 그 염류 등의 유기산, 또는 그것들의 혼합물을 사용할 수 있다. 질소원으로서 황산암모늄, 질산암모늄. 인산암모늄 등의 무기질소 화합물 및 요소, 펩톤, 카제인, 효모 엑기스, 육류 엑기스, 콘 스팁 리쿼 등의 유기 질소 화합물과 그것들의 혼합물을 들 수 있다. 그 밖에, 무기염으로서 인산염, 마그네슘염, 칼륨염, 망간염, 철염, 아연염, 구리염 등, 또한 필요에 따라 비타민류를 가하여도 된다. 또한 고효소 활성을 갖는 형질전환균체를 얻기 위한 효소유도 첨가물로서, 상기 배지 및 펩톤 배지, 부이온 배지 등의 영양배지에 사용하는 균주에 따라, 효과적으로 목적으로 하는 DNA를 발현시키기 위하여, 암피실린, 카나마이신, 클로람페니콜 등의 항생물질을 배양액에 첨가해도 되고, 이소프로필β-D(-)-티오갈락토피라노시드 (IPTG) 등의 프로모터의 활성화 유도제를 사용할 수도 있다. 배양은 호기적 조건 하에서 pH 4 ~ 10, 20 ~ 60℃의 임의의 온도 범위로 제어하여 1 ~ 5일간 배양을 하면 좋지만, 사용하는 형질전환체에 의하여 최적의 조건으로 배양하면 더욱 효과적이다.

얻어진 EnHCH 산생 형질전환체의 세포로부터 상기 효소의 추출은 다음과 같은 방법으로 할 수 있다. 1) 프렌치 프레스나 초음파 파쇄에 의한 기계적(물리적) 방법, 2) 리조팀 등의 효소 처리방법, 3) 자기 용해법, 4) 침투압을 이용한 추출법 등의 방법에 의하여 형질전환체를 파괴하여 실시할 수 있다.? 또 대장균 DH5α(pKK-EnHCH])는 세포를 파쇄하지 않고도, 배양액의 상태에서 고활성인 효소로서 이용할 수 있다.

본 방법으로 생산되는 효소는, 기원의 엔테로박터속에서의 EnHCH의 폴리펩티드 서열과 일치하는 것에만 한정되지 않고 염기 서열 변환이나 유전자 변환 등의 유전자 교환 수법을 이용하여 얻어지는 폴리펩티드이고, EnHCH 활성을 나타내는 것으로 해석하여야 한다. 즉, 펩티드 서열 중의 아미노산의 1개 또는 수개가 결손된 것, 또는 그 펩티드 서열 중의 아미노산의 l개 또는 수개가 다른 아미노산으로 변경된 것도 포함한다.

이와 같이 하여 제조된 입체 선택적 가수분해 효소를 대량으로 생산하는 형질전환체는, 저렴한 배지중에서 대량으로 조제할 수 있고, 바이오리액터로서 R체 4-클로로-3-하이드록시카르복실산 에스테르, S체 3-하이드록시-γ-부티로락톤, 광학활성 하이드록시카르복실산, 및 그 에난티오머 에스테르, R체 테트라히드로푸란-2-카르복실산 에스테르의 제조 등에 이용할 수 있다.

특히 대장균 DH5α(pKK-EnHCH1)은, 유전자 공여체 (엔테로박터속 DS-S-75 균주)와 비교하여 높은 반응성을 나타내고, 그 중에서도 S체 3-하이드록시-γ-부티로락톤, R체 3-하이드록시부탄산, S체 2-하이드록시부탄산을 단시간에 고광학 순도로 얻을 수 있다.

실시예

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세하게 설명한다. 단, 본 발명은 이러한 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

〔실시예 1〕EnHCH 효소의 정제

효소 활성의 측정은 0.5M 인산 칼륨 완충액(pH7.15)에 1% (v/v) 4-클로로-3-하이드록시부탄산 메틸을 기질로 하여, 30℃에서 반응을 하고, 유리된 클로로 이온을 이와자키 등의 방법 (Bul1. Chem, Soc. Japan, 25. 226(1952))에 따라서 비색 정량하였다. 1분간에 1 μmo1의 클로로 이온를 유리시키는 효소량을 1U로 하였다. 단백질의 정량은, 280nm에서의 흡수를 측정하여 실시하였다.

엔테로박터속 DS-S-75 균주 (FERM BP-5494)를 PYG 배지 (1% 펩톤, 1% 효모 추출물, 1% 글리세롤, pH7.2)에서 배양하고, 원심분리에 의하여 균체를 조제하였다.

얻어진 습균체를 초고압 세포 파쇄장치에 의하여 균체를 파쇄한 후, 원심분리에 의하여 균체 잔사를 제거하여 무세포 추출액을 얻었다. 이것에 황산암모늄을 첨가하여 50% 포화도에서 침전한 분획을 회수하였다. 또한 1.6M의 황산암모늄을 포함하는 10mM 트리스-황산 완충액 (pH7.8)으로 평형화한 Butyl-toyoper1에 의한 소수 크로마토그래피를 실시하였다. 황산암모늄 농도를 0M까지 감소시켜 상기 효소의 활성분획을 회수하였다. 이 분획에 황산암모늄을 첨가하여 80% 포화에서의 침전을 l0mM 트리스-황산 완충액 (pH7.8)에 용해시키고, 동완충액으로 투석을 하였다. 투 석 후, 동완충액으로 평형화한 DEAE-sepharose에 의한 이온 교환 컬럼 크로마토그래피를 하였다. 동완충액의 농도구배 (10-200mM)로 용출을 하고, 상기 효소의 활성분획을 회수하였다. 이 분획에, 한외여과막 (Macrosep 10K, 일본 폴 사제)에 의하여 탈염 농축하였다. 농축액을 0.1M 인산 칼륨 완충액으로 평형화한 Sephadex-G150에 의한 겔 여과 컬럼 크로마토그래피를 행하고, 상기 효소의 활성 분획을 회수하였다.

얻어진 부제 가수분해 효소 표품은, SDS-PAGE로 해석한 결과, 단일 밴드가 되고, 그 분자량은 37.5kDa이었다. 겔 여과 컬럼 크로마토그래피 및? 10-20%의 농도 구배를 시행한 분리 겔을 사용한 Native-PAGE의 결과, 분자량은 75kDa이었다. 이러한 결과로부터, 상기 효소는 분자량 37.5kDa의 서브 유니트의 호모 이량체인 것을 알 수 있었다.

정제의 요약을 다음 표 1에 나타내었으나, 정제 효소의 비활성은 7690 U/mg-단백질이고, 조(粗) 효소 추출책과 비교하여 22l배이였다.

?	용량 (ml)	총단백질량 (mg)	총활성 (U)	비활성 (U/mg)	수율 (%)	정제도(배)
조추출액	?90	?2540	?88300	?34.8	?100	?1.0
0-50% 황산암모늄 침전	?200	?1680	?53800	?32.0	?61.0	?0.90
부틸 토요펄	?173	?142	?38100	?269	?43.2	?7.70
0-80% 황산암모늄 침전	?38.3	?132	?23000	?174	?26.0	?5.0
DEAE-Sepharose	?75.3	?5.95	?28200	?4750	?32.0	?136
Sephadex G-150	?16.8	?2.54	?19500	?7690	?22.1	?221

〔실시예 2〕EnHCH 효소의 부분 아미노산 서열의 해석

정제한 EnHCH 효소 45 μg을 키모트립신으로 37℃ 1시간 처리하였다. 12.5% 분리 겔을 사용하여 SDS-PACE를 행하고, PVDF막에 전사하여 N 말단? 및 내부 부분 아미노산 서열을 아미노산 시퀀서에 의하여 결정하였다. 결정된 아미노산 서열을 서열번호 3 및 4에 나타내었다.

〔실시예 3〕EnHCH 유전자의 클로닝

(1) 엔테로박터속으로부터의 염색체 DNA의 조제

엔테로박터속 DS-S-75 균주 (FERM BP-5494)를 PYG 배지 5ml 중에서 20시간 배양하고, 원심분리에 의해 균체를 회수하였다. 균체를 490ml의 TE 용액 (10mM 트리스-염산 pH8.0, 1mM EDTA)에 현탁하고, 10% SDS를 30ml, 20mg/ml 프로테아제 K를 50ml 첨가하여, 50℃에서 1시간 반응시켰다. 그 후, 등량의 페놀:클로로포름:이소아밀알콜 (25:24:1)에 의한 추출을 수행한 후, 0.1배량의 3M 아세트산나트륨 용액을 첨가하고, 0.6 배량의 2-프로판올을 가만히 중층하였다. 그 결과 계면에 생성된 DNA를 유리막대에 실 형상으로 감아 회수하였다.

얻어진 DNA를 500ml의 TE 용액에 용해시켰다. 약 1.1mg의 염색체 DNA를 얻었다.

(2) 프로브의 제작

아미노산 시퀀서에 의해 결정된 서열번호 3 및 4의 아미노산 서열로부터 예상되는 DNA 서열을 코돈 축중을 고려하여 PCR 프라이머를 합성하고 (서열번호 5 및 6), (1)에서 추출한 염색체 DNA 50ng을 주형으로 하여 ExTaq DNA 폴리머라제 (TAKARA HOLDINGS INC. 제조)를 사용하여 PCR (열변성 96℃, 30초, 어닐링 50℃, 1분, 신장 반응 72℃, 1분)을 40사이클 수행하고, 4℃까지 냉각한 다음 아가로스 겔 전기영동에 의해 증폭 DNA를 확인하고, DNA 단편을 상법에 의해 아가로스 겔로부터 회수하였다. 계속하여, 그 DNA 단편을 pUC118 (TAKARA HOLDINGS INC. 제조)에 서브클로닝하고, 염기 서열을 DNA 시퀀서에 의해 결정하였다. 그 결과, 결정된 DNA 염기 서열 중에, 미리 결정된 부분 아미노산 서열 (서열번호 3 및 4)을 코딩하는 영역을 확인할 수 있었으므로, 얻어진 증폭 DNA를 상법에 따라 ³²P로 라벨링하여, 프로브 DNA로 하였다.

(3) 제한 효소 지도의 작성

추출된 DS-S-75 균주의 염색체 DNA를 다양한 제한 효소로 절단하고, 1% 아가로스 겔을 사용하여 전기영동한 다음, 니트로셀룰로오스 멤브레인에 전사시켰다. 풍건 후, (2)에서 제작한 프로브를 사용하여, 65℃에서 20시간 하이브리다이제이션 반응을 행하였다.

하이브리다이제이션을 행한 멤브레인은, ① 2×SSC, 65℃, 15분, ② 1×SSC, 65℃, 30분 세정하고, X선 필름과 증감지를 붙여, 오토라디오그램을 촬영하였다. 이 결과, 다양한 시그널을 비교함으로써, EnHCH 유전자 영역 근방의 제한 효소 지도를 제작하였다.

(4) 게놈 라이브러리로부터의 유전자의 클로닝

(3)에서 제작한 제한 효소 지도에서 목적으로 하는 EnHCH 유전자의 전체 길이가 포함되는 것을 고려하여, 플라스미드 pBluescriptⅡ KS (Toyobo. co., Ltd. 제조)의 EcoRⅠ부위에 약 6000 염기쌍의 DS-S-75 균주의 염색체 DNA에 유래하는 다 종의 DNA 단편을 삽입한 게놈 라이브러리를 제작하였다. 이것을 대장균 DH5 α균주에 도입하여 얻어진 형질전환체 160 개체를 니트로셀룰로오스 멤브레인에 레플리카한 다음, 0.5N NaOH에 멤브레인을 담가 용균하고, 1M 트리스-염산 (pH7.5)에 멤브레인을 담가 중화하였다. 풍건 후, (2)에서 제작한 프로브를 사용하여, 65℃에서 20시간 하이브리다이제이션 반응을 행하였다.

하이브리다이제이션을 행한 멤브레인은, ① 2×SSC, 65℃, 15분, ② 1×SSC, 65℃, 30분, ③ 0.5×SSC, 65℃, 1시간 세정하고, X선 필름과 증감지를 붙여, 오토라디오그램을 촬영하였다. 이 결과, 양성 시그널을 제공하는 1개의 형질전환체를 얻었다.

(4) 염기 서열의 결정

상기 양성 균주로부터 상법에 의해 플라스미드를 추출하여, pBl-EnHCH를 얻었다. 이것을, 엑소뉴클레아제 Ⅲ 및 녹두의 엔도뉴클레아제 (mung bean endonuclease)에 의해 삽입 유전자 단편을 다양하게 결실시키고, 각각의 시료의 염기 서열을 디데옥시법에 의해 결정하고, 얻어진 서열을 중첩하여, BamHⅠ-PstⅠ 사이에서 염기 서열을 결정하였다. 결정된 염기 서열과 그 염기 서열로부터 추정되는 아미노산 서열을 서열표의 서열번호 1에 나타내었다. 또, pBl-EnHCH의 모식도를 도 1에 나타내었다. 도 1에 나타낸 바와 같이, ORF를 사이에 두는 BamHⅠ-PstⅠ부위 사이에서 염기 서열의 결정을 행하였다. ORF는 1086bp, 362 아미노산을 코딩하고 있다. 이 중에서, N 말단측 25 아미노산은 시그널 펩티드이다.

또, 서열번호 3 및 4에 나타낸 정제 EnHCH의 부분 아미노산 서열은, 양성 균 주 유래의 삽입 DNA 단편의 염기 서열로부터 추정되는 아미노산 서열 중에 존재하며, 그 부분 아미노산 서열이 완전히 일치하였다.

〔실시예4〕재조합 플라스미드의 제작

EnHCH 유전자의 개시 코돈으로 추정되는 ATG 서열은 3개소에 존재하였다. 플라스미드 pKK223-3의 tac 프로모터의 지배 하에 연결하고, 상기 각 개시 코돈 및 정제 효소의 N 말단부터 번역하도록 이하의 순서에 따라 구축을 수행하였다 (도 2, 도 3). 이들 각각의 ATG 서열의 바로 상류에 EcoRⅠ 인식 서열을 부여하기 위해, 서열번호 9 ∼ 12에 나타낸 PCR 프라이머를 설계하고, M13 프라이머를 조합하고, pBl-EnHCH1 50ng을 주형으로 하여 PCR (열변성 96℃, 30초, 어닐링 50℃, 30초, 신장 반응 72℃, 1분)을 30사이클 수행하였다(정제 효소의 N 말단에 대해서는, 메티오닌으로 치환하였다 (도 2)). 도 2에 나타낸 바와 같이, 개시 코돈으로서 추정되는 3종의 ATG 서열에 대하여, EcoRⅠ을 바로 상류에 부가한 PCR 프라이머를 설계하고, pUC118 유래의 M13 프라이머와 조합하여 PCR을 행하였다. 또, 정제 효소의 N 말단인 발린부터 번역하도록 하기 위해, 발린을 메티오닌으로 치환한 PCR 프라이머를 설계하고, 동일하게 PCR을 행하였다. 4℃까지 냉각한 다음, 아가로스 겔 전기영동에 의해 증폭 DNA를 확인하고, 각종 DNA 단편을 상법에 의해 아가로스 겔로부터 회수하였다. 계속하여, 그 DNA 단편을 BKL 키트 (TAKARA HOLDINGS INC. 제조)를 사용하여 평활, 인산화한 다음, pUC118의 HincⅡ 제한 효소 부위에 서브클로닝하고, 각각에 대하여, 상류 약 400 염기의 서열을 DNA 시퀀서에 의해 결정하였다.

얻어진 4 종 플라스미드를 제한 효소 Tth111Ⅰ과 PstⅠ으로 소화시킨 다음, pBl-EnHCH의 Tth111Ⅰ-PstⅠ 단편을 상법에 의해 삽입하고, 또 EcoRⅠ-PstⅠ 소화 단편을 pKK223-3 (Pharmacia 제조) 벡터의 동　부위에 삽입하여, 발현 플라스미드 pKK-EnHCH1,　pKK-EnHCH2,　pKK-EnHCH3,　pKK-EnHCH4를 얻었다 (도 3). 도 3에 나타낸 바와 같이, 먼저, pUC118에 평활 말단에서 서브 클로닝하여, 상류측 약 400 bp의 염기 서열을 결정하였다. PCR 신장 에러가 없는지를 확인한 후, Tth111Ⅰ-PstⅠ 사이의 서열을 pBl-EnHCH의 것과 치환하고, EcoRⅠ-PstⅠ에서 pKK223-3의 tac 프로모터 하류에 연결하였다.

〔실시예 5〕재조합 대장균의 제작

대장균 JM109 및 DH5α의 컴피턴트 셀을 조제하여, pKK-EnHCH로 형질 전환함으로써, 재조합 대장균 JM109(pKK-EnHCH1), DH5α(pKK-EnHCH1)을 얻었다. 그리고, DH5α(pKK-EnHCH2)는 얻을 수 없었다. 또, 대조 시료로서 벡터로만 형질 전환한 JM109(pKK-223-3), DH5α(pKK223-3)도 얻었다.

〔실시예 6〕재조합 대장균에 있어서의 EnHCH 유전자의 발현

(1) 배양액의 조제

실시예 5에서 얻은 형질전환체를 시험관에 5ml 넣은 LB 배지 (1% 폴리펩톤, 0.5% 효모 추출물, 1% 염화나트륨)에서, 20시간, 37℃에서 호기적으로 배양하였다. 또한, 대조로서 pKK223-3으로 형질 전환한 JM109 균주, DH5α균주도 동일하게 배양하였다. 또, 엔테로박터속 DS-S-75 균주에 대해서는, 시험관에 5ml 넣은 PYG 배지 (1% 폴리펩톤, 1% 효모 추출물, 1% 글리세린)를 20시간 30℃에서 호기적으로 종배양하여, 각종 균주로부터 배양액 시료를 얻었다.

(2) 재조합체의 가수분해 활성의 평가

250mM 트리스-황산 완충액에 최종 농도 0.05% (v/v)가 되도록 p-니트로페닐 부티레이트를 첨가하여, 반응액으로 하였다. 이 3ml에 상기에서 조제한 배양액 시료 20ml를 첨가하고 30℃에서 반응시켜, 가수분해 반응에 의해 생성되는 p-니트로페놀에 유래하는 400nm의 흡광도의 증대를 측정하였다. 결과를 표 2에 나타내었다. 또, 1U는, 30℃에서 1분당 1 μmol의 p-니트로페놀의 생성량을 나타내며, 조제한 배양액당 비활성 (specific activity)을 산출하였다.

균주명	비활성(U/ml)
엔테로박터속 DS-S-75 균주	3.16
JM109(pKK-EnHCH1)	12.6
JM109(pKK-EnHCH2)	13.8
JM109(pKK-EnHCH3)	2.76
JM109(pKK-EnHCH4)	2.37
JM109(pKK223-3)	0
DH5α(pKK-EnHCH1)	34.0
DH5α(pKK223-3)	0

그 결과, pKK-EnHCH에 의해 형질 전환된 대장균은, 가수분해 활성을 가지며, JM109 (pKK-EnHCH1), JM109 (pKK-EnHCH2), DH5α(pKK-EnHCH1)의 활성은 엔테로박터속 DS-S-75 균주와 비교하여 대폭 향상되었다. 그 중에서도 DH5α(pKK-EnHCH1)의 배양액당 가수분해 활성은 약 10.8배였다. 또, JM109 (pKK-EnHCH1), DH5α(pKK-EnHCH1)의 배양액을 제균하면 활성은 없어져, 배지 중에는 효소가 존재하지 않음을 알 수 있었다.

JM109 (pKK-EnHCH1), JM109 (pKK-EnHCH2), JM109 (pKK-EnHCH3), JM109 (pKK- EnHCH4)의 4 균주에서는, JM109 (pKK-EnHCH2)가 가장 고활성이었다. 또, 도 2에 나타낸 염기 서열상 2번째의 ATG 서열의 바로 상류에는, 리보솜이 결합하는 SD (Shine-Dalgarno) 서열이 보임에 따라, EnHCH 유전자 본래의 개시 코돈은 2번째의 ATG임이 시사되었다 (서열번호 1). 즉, 도 2에 나타낸 아미노산 서열의 2번째의 메티오닌 잔기가, 본래 DS-S-75 균주에서 번역될 수 있는 EnHCH의 N 말단이다. 그 결과, 본 유전자는, 1086 bp로 이루어지며, 362 아미노산을 코딩하고 있음이 시사되었다.

(3) 재조합 단백질의 SDS-PAGE

(1)에서 조제한 JM109 (pKK-EnHCH1), JM109 (pKK-EnHCH2), JM109 (pKK-EnHCH3), JM109 (pKK-EnHCH4)의 배양액 시료를 원심분리에 의해 집균하고, 20mM 인산칼륨 완충액으로 현탁한 다음, 초음파 파쇄하였다. 각 5 μg의 추출 단백질 시료 및 엔테로박터속 DS-S-75 균주로부터 정제한 EnHCH를 SDS-PAGE (10% 분리 겔)에 제공하고, 쿠마시 브릴리언트 그린으로 염색하였다. 그 결과, 모든 재조합 대장균의 재조합 효소에서 엔테로박터속 DS-S-75 균주로부터 정제한 EnHCH와 동일한 위치에 밴드가 확인되었다 (도 4). 사용한 분자량 마커와 분자량을 이하에 기재한다. 포스포릴라아제 B (97,400), 소 혈청 알부민 (66,200), 오브알부민 (45,000), 탄산 탈수효소 (carbonic anhydrase)(31,000), 트립신 저해제 (trypsin inhibitor) (2l,500). 도 4에 있어서, 좌측 레인으로부터 유전자 공여체 (DS-S-75 균주) 유래 정제 EnHCH, JM109 (pKK223-3)의 추출액, JM109 (pKK-EnHCH1)의 추출액, JM109 (pKK-EnHCH2)의 추출액, JM109 (pKK-EnHCH3)의 추출액, JM109 (pKK-EnHCH4)의 추출 액, 분자량 마커; 포스포릴라아제 B (97,400), 소 혈청 알부민 (66,200), 오브알부민 (45,000), 탄산 탈수효소 (3l,000), 트립신 저해제 (21,500)이다. 유전자 공여체의 정제 EnHCH와 동일한 위치에 재조합 EnHCH의 밴드를 확인할 수 있었다.

실시예 2에 나타낸 바와 같이, 정제 효소의 N 말단 아미노산은 발린이었다. 또, 서열번호 2로 나타낸 EnHCH의 추정 아미노산 서열의 N 말단측에는, 많은 소수성 잔기, 양으로 하전된 잔기, 및 절단되는 인식 서열로서 Ala-Xaa-Ala 서열이 존재함에 따라, 번역 개시 메티오닌으로부터 25 잔기의 아미노산 서열은 시그널 펩티드임이 시사되었다 (서열번호 7).

(4) 재조합 EnHCH 효소의 N 말단 아미노산 서열의 해석

(1)에서 조제한 JM109 (pKK-EnHCH1)의 세포 파쇄액의 20%∼50% 황산암모늄 침전 시료를 투석하고, 10% 분리 겔을 사용하여 SDS-PAGE를 행하고, PVDF막에 전사하여, N 말단 서열을 아미노산 시퀀서에 의해 결정하였다. 10 잔기를 결정한 결과, 엔테로박터속 DS-S-75 균주로부터 정제한 EnHCH의 N 말단 서열과 일치하였다. 또, (3)의 SDS-PAGE의 결과, 밴드가 동일한 위치에 있으므로, 대장균에 있어서도 시그널 펩티드의 절단이 행해지고 있음이 명백해졌다. 또, JM109 (pKK-EnHCH1), JM109 (pKK-EnHCH2)의 활성이 JM109 (pKK-EnHCH3), JM109 (pKK-EnHCH4)에 비해 높으므로, 본 시그널 펩티드는, 대장균에서의 안정적인 발현에 중요하다고 할 수 있다.

〔실시예 7〕재조합 대장균에 의한 카르복실산 에스테르의 광학 분할

(l) 4-클로로-3-하이드록시부탄산 메틸의 광학 분할

300ml의 삼각 플라스크에 암피실린을 포함하는 LB 배지 60ml를 조제하고, DH5α(pKK-EnHCH1)을 37℃에서 16시간 진탕 배양하였다. 또, 대조로서 벡터로만 형질 전환한 DH5α(pKK223-3)를 조제하였다. 또, 엔테로박터속 DS-S-75 균주에 대해서는, PYG 배지 60ml에서 배양하였다. 각각의 배양액에 최종 농도가 5%(w/v)가 되도록 탄산칼슘과 8%(w/v)가 되도록 라세미체 4-클로로3-하이드록시부탄산 메틸 에스테르를 기질로서 첨가하여, 30℃에서 1시간 진탕 반응시켰다. 또, 엔테로박터속 DS-S-75 균주에 대해서는, 동일하게 최종 농도 2%의 기질에서 24시간 진탕 반응도 아울러 행하였다. 반응 종료 후, 원심분리에 의해 제균하고, 반응액 중에 잔존하는 4-클로로-3-하이드록시부탄산 메틸 에스테르의 농도를 가스 크로마토그래피 (컬럼 담체: PEG20M, 60-80메쉬)에 의해 분석하였다. 그리고, 상기 제균액으로부터 등량의 아세트산 에틸로 추출하고, ASTEC, Inc. 제조의 G-TA (0.25mm×30m)를 사용한 가스 크로마토그래피에 의해, 잔존하는 4-클로로-3-하이드록시부탄산 메틸의 광학 순도를 측정하였다. 그 결과, 체류시간은 R체 14.7분, S체 15.7분이었다. 분석 조건: 컬럼 온도 110℃, 검출기 온도 200℃, 운반가스 질소; 유속, 0.8ml/분, 검출기 FID; 분할비 100/1.

그리고, 아세트산 에틸 추출을 2회 행하고, 수층(水層) 분획을 증발기에 의해 농축하였다. 무수 황산마그네슘에 의해 탈수하여, 3-하이드록시-γ-부티로락톤의 시럽을 얻었다. 시럽 10ml에 1,2-디클로로에탄 500ml, 트리플루오로 아세트산 무수물 100ml를 첨가하여 30분 방치함에 따라 트리플루오로화를 행하고, 감압 하에서 용매를 제거한 후, 에탄올에 용해시키고, G-TA (0.25mm×30m)를 사용한 가스 크로마토그래피에 의해 3-하이드록시-γ-부티로락톤의 광학 순도를 측정하였다. 체류 시간은 R체 18.7분, S체 19.9분이었다. 분석 조건: 컬럼 온도 120℃, 검출기 온도 200℃, 운반가스 질소; 유속, 0.8ml/분, 검출기 FID; 분할비 100/1.

그 결과, DH5α(pKK-EnHCH1)은, 유전자 공여체 (엔테로박터속 DS-S-75 균주)와 비교하여 반응 속도가 향상되었다. 또, 높은 입체식별성을 가지며, R체 4-클로로-3-하이드록시부탄산 메틸, 생성한 S체 3-하이드록시-γ-부티로락톤 모두 고광학 순도이며, S체 4-클로로-3-하이드록시부탄산 에틸의 거의 전량이 S체 3-하이드록시 -γ-부티로락톤으로 변환되었다. 또, DH5α(pKK223-3)에 분할 능력은 없었다. 반응 후, 잔존한 R체 4-클로로-3-하이드록시부탄산 메틸의 광학 순도 및 반응 개시 전의 라세미체 4-클로로-3-하이드록시부탄산 메틸의 양을 100%라고 하였을 때의 수율, 생성한 S체 3-하이드록시 -γ-부티로락톤의 광학 순도의 측정 결과를 표3에 나타내었다.

	4-클로로-3-하이드록시 부탄산 메틸		3-하이드록시 -γ- 부티로락톤
	광학 순도(%ee)	수율(%)	광학 순도(%ee)
DH5α(pKK-EnHCH1) (1hr) (기질 8%)	99.1(R)	49.2	99.9(S)
DH5α(pKK-223-3) (1hr) (기질 8%)	0	100	생성 없음
DS-S-75 (1hr) (기질 8%)	11.8(R)	88.4	N.D.
DS-S-75 (24hr) (기질 2%)	99.5(R)	48.0	95.9(S)

(2) 3-하이드록시부탄산 에틸의 광학 분할

실시예7의 (1)과 마찬가지로 균체 각 종을 배양하고, 각각의 배양액에 최종 농도가 5%(w/v)가 되도록 탄산칼슘과 8%(w/v)가 되도록 라세미체 3-하이드록시부탄산 에틸을 기질로서 첨가하여, 30℃에서 1시간 진탕 반응하였다. 또, 엔테로박터속 DS-S-75 균주에 대해서는, 동일하게 4시간 진탕 반응도 아울러 행하였다. 반응 종료 후, 균체를 원심분리에 의해 제거하였다.

반응액 중에 잔존하는 3-하이드록시부탄산 에틸의 농도를 가스 크로마토그래피(컬럼 담체: PEG20M, 60-80 메쉬)에 의해 분석하였다. 그리고, 상기 제균액을 등량의 아세트산 에틸로 2회 추출하고, 아세트산 에틸층을 감압 하에서 용매를 제거하여 3-하이드록시부탄산 에틸의 시럽을 얻었다. 트리플루오로 아세트산 무수물로 트리플루오로화한 후, ASTEC, Inc. 제조의 G-TA(0.25mm×30m)를 사용한 가스 크로마토그래피에 의해 광학 순도를 측정하였다. 체류시간은 R체 8.1 분, S 체 12.1분이었다. 분석 조건: 컬럼 온도 90℃, 검출기 온도 200℃, 운반가스 질소; 유속, 0.7ml/분, 검출기 FID; 분할비 100/1.

한편, 수층으로 분획된 3-하이드록시부탄산의 농도도, 가스 크로마토그래피 (컬럼 담체: PEG20M, 60-80 메쉬)에 의해 분석하였다. 이 때, 수용액의 pH를 인산에 의해 pH 4로 하여 행하였다. 수층을 증발기에 의해 농축하여, 3-하이드록시부탄산의 시럽을 얻었다. 30ml의 삼각 플라스크에 시럽을 50mg 넣고, 얼음 냉각하면서 4-디메틸 아미노피리딘을 122mg, 디클로로메탄을 10ml, 에탄올을 100ml, 염산1-에틸3-(3-디메틸 아미노프로필)카르보디이미이드를 115mg 첨가하여 10분 정도 교반한 후, 덮개를 덮어 실온에서 하루밤 교반하였다. 유기층을 1N 염산으로 2회 세정한 후, 데시케이터에서 용매를 제거하고, 3-하이드록시부탄산 에틸로 변환시켰다. 이 것을 동일한 방식으로 트리플루오로화한 후, 가스 크로마토그래피에 의해 광학 순도를 측정하였다.

그 결과, DH5α(pKK-EnHCH1)은, 유전자 공여체 (엔테로박터속 DS-S-75 균주)와 비교하여 반응 속도가 향상되었다. 양 균주 모두 높은 입체식별성을 가지고 있었다. 또, DH5α(pKK223-3)에 분할 능력은 없었다. 반응 후, 잔존한 S체 3-하이드록시부탄산 에틸의 광학 순도, 및 반응 개시 전의 라세미체 3-하이드록시부탄산 에틸의 양을 100%라고 하였을 때의 수율, 생성한 R체 3-하이드록시부탄산의 광학 순도의 측정 결과를 표4에 나타내었다.

	3-하이드록시부탄산 에틸		3-하이드록시부탄산
	광학 순도(%ee)	수율(%)	광학 순도(%ee)
DH5α(pKK-EnHCH1) (1hr) (기질 8%)	99.2(S)	49.2	99.9(R)
DH5α(pKK-223-3) (1hr) (기질 8%)	0	100	생성 없음
DS-S-75 (1hr) (기질 8%)	37.1(S)	72.0	N.D.
DS-S-75 (4hr) (기질 8%)	99.1(S)	49.0	98.2(R)

(3) 재조합 대장균에 의한 2-하이드록시부탄산 에틸의 광학 분할

라세미체 3-하이드록시부탄산 에틸을 라세미체 2-하이드록시부탄산 에틸로 바꾼 것 이외에는 실시예 7의 (2)와 동일한 방법으로 반응하였다. 단, 반응 시간은 재조합 대장균은 24시간, DS-S-75 균주는 24 및 36시간으로 하였다. 반응 종료 후, 실시예 7의 (2)와 동일한 방법으로, 농도, 광학 순도의 해석을 하였다. 체류시간은 R체 7.4분, S체 7.8분이었다. 광학 순도 분석 조건: 컬럼 온도 90℃, 검출기 온도 200℃, 운반가스 질소; 유속, 0.7ml/분, 검출기 FID; 분할비 100/1.

그 결과, DH5α(pKK-EnHCH1)은, 유전자 공여체 (엔테로박터속 DS-S-75 균주)와 비교하여 반응 속도가 향상되며, 또 높은 입체식별성을 가지고 있었다. 반응 후, 잔존한 R체 2-하이드록시부탄산 에틸의 광학 순도, 및 반응 개시 전의 라세미체 2-하이드록시부탄산 에틸의 양을 100%라고 하였을 때의 수율, 생성한 S체 2-하이드록시부탄산의 광학 순도의 측정 결과를 표 5에 나타내었다.

	2-하이드록시부탄산 에틸		2-하이드록시부탄산
	광학 순도(%ee)	수율(%)	광학 순도(%ee)
DH5α(pKK-EnHCH1) (24hr) (기질 8%)	98.3(R)	49.0	98.9(S)
DH5α(pKK-223-3) (24hr) (기질 8%)	0	100	생성 없음
DS-S-75 (24hr) (기질 8%)	77.3(R)	60.1	N.D.
DS-S-75 (36hr) (기질 8%)	99.2(R)	49.3	95.1(S)

(4) 재조합 대장균에 의한 테트라하이드로퓨란-2-카르복실산 메틸의 광학 분할

실시예 7의 (1)과 마찬가지로 균체 각 종을 배양하고, 각각의 배양액에 최종 농도가 5%(w/v)가 되도록 탄산칼슘과 1%(w/v)가 되도록 라세미체 테트라하이드로퓨란-2-카르복실산 메틸을 기질로서 첨가하여, 30℃에서 2시간 진탕 반응하였다. 또, 엔테로박터속 DS-S-75 균주에 대해서는, 동일하게 4시간 및 24시간 진탕 반응하였다. 반응 종료 후, 균체를 원심분리에 의해 제거하였다.

반응액 중에 잔존하는 테트라하이드로퓨란-2-카르복실산 메틸의 농도를 가스 크로마토그래피 (컬럼 담체: PEG20M, 60-80 메쉬)에 의해 분석하였다. 그리고, ASTEC, Inc. 제조의 G-TA (0.25mm×30m)를 사용한 가스 크로마토그래피에 의해 광학 순도를 측정하였다. 체류시간은 R체 8.4분, S체 9.5분이었다. 분석 조건: 컬럼 온도 110℃, 검출기 온도 240℃, 운반가스 질소; 유속, 0.7ml/분, 검출기 FID; 분할비 100/1.

그 결과, DH5α(pKK-EnHCH1)은, 유전자 공여체 (엔테로박터속 DS-S-75 균주)와 비교하여 반응 속도가 향상되었다. 반응 후, 잔존한 R체 테트라하이드로퓨란-2-카르복실산 메틸의 광학 순도, 및 반응 개시 전의 라세미체 테트라하이드로퓨란-2-카르복실산 메틸의 양을 100%라고 하였을 때의 수율을 표 6에 나타내었다.

	테트라하이드로퓨란2-카르복실산 메틸
	광학 순도(%ee)	수율(%)
DH5α(pKK-EnHCH1) (2hr) (기질 1%)	98.1(R)	39.6
DH5α(pKK-223-3) (2hr) (기질 1%)	0	95.0
DS-S-75 (24hr) (기질 1%)	95.7(R)	54.4
DS-S-75 (48hr) (기질 1%)	99.9(R)	46.8

(5) 재조합 대장균에 의한 젖산 에틸의 광학 분할

실시예 7의 (1)과 마찬가지로 균체 각 종을 배양하고, 각각의 배양액에 최종 농도가 5% (w/v)가 되도록 탄산칼슘과 6%(w/v)가 되도록 라세미체 젖산 에틸을 기질로서 첨가하여, 30℃에서 24시간 진탕 반응하였다. 또, 엔테로박터속 DS-S-75 균주에 대해서는, 동일하게 48시간 및 100시간 진탕 반응하였다. 반응 종료 후, 균체 를 원심분리에 의해 제거하였다.

반응액 중에 잔존하는 젖산 에틸의 농도를 가스 크로마토그래피 (컬럼 담체: PEG20M, 60-80 메쉬)에 의해 분석하였다. 그리고, 실시예 7의 (1)과 마찬가지로, 상기 제균액을 등량의 아세트산 에틸로 2회 추출하고, 아세트산 에틸층을 감압 하에서 용매를 제거하여 젖산 에틸의 시럽을 얻었다. 트리플루오로 아세트산 무수물로 트리플루오로화한 후, ASTEC, Inc.사의 G-TA(0.25mm×30m)를 사용한 가스 크로마토그래피에 의해 광학 순도를 측정하였다. 체류시간은 R체 10.1 분, S 체 11.8분이었다. 분석 조건: 컬럼 온도 70℃, 검출기 온도 200℃, 운반가스 질소; 유속, 0.7ml/분, 검출기 FID; 분할비 100/1.

그 결과, DH5α(pKK-EnHCH1)은, 유전자 공여체 (엔테로박터속 DS-S-75 균주)와 비교하여 반응 속도가 향상되었다. 반응 후, 잔존한 R체 젖산 에틸의 광학 순도, 및 반응 개시 전의 라세미체 젖산 에틸의 양을 100%라고 하였을 때의 수율을 표 7에 나타내었다.

	젖산 에틸
	광학 순도(%ee)	수율(%)
DH5α(pKK-EnHCH1) (24hr) (기질 6%)	98.7(R)	41.5
DH5α(pKK-223-3) (24hr) (기질 6%)	0	100
DS-S-75 (48hr) (기질 6%)	33.5(R)	65.2
DS-S-75 (100hr) (기질 6%)	98.7(R)	28.0

(6) 재조합 대장균에 의한 4-페닐-2-하이드록시부탄산 에틸의 광학 분할

실시예 7의 (1)과 마찬가지로 균체 각 종을 배양하고, 각각의 배양액에 최종 농도가 5% (w/v)가 되도록 탄산칼슘과 2% (w/v)가 되도록 라세미체 4-페닐-2-하이드록시부탄산 에틸을 기질로서 첨가하여, 30℃에서 24시간 진탕 반응하였다. 또, 엔테로박터속 DS-S-75 균주에 대해서는, 동일하게 48시간 및 100시간 진탕 반응하였다. 반응 종료 후, 균체를 원심분리에 의해 제거하였다.

반응액 중에 잔존하는 4-페닐-2-하이드록시부탄산 에틸의 농도를 가스 크로마토그래피 (컬럼 담체: PEG20M, 60-80 메쉬)에 의해 분석하였다. 그리고, 상기 제균액을 등량의 아세트산 에틸로 2회 추출하고, 아세트산 에틸층을 감압 하에서 용매를 제거하여 4-페닐-2-하이드록시부탄산 에틸의 시럽을 얻었다. 에탄올에 용해시키고, DAICEL사 제조의 CHIRAL CELL OD (25cm×0.46cm)를 사용한 고속 액체 크로마토그래피에 의해 광학 순도를 분석하였다. 분석 조건:　전개 용매; 헥산:이소프로판올(100:1), 유속; 0.5ml, 컬럼 온도 25℃, 검출기 UV; 250nm.

그 결과, DH5α(pKK-EnHCH1)은, 유전자 공여체 (엔테로박터속 DS-S-75 균주)와 비교하여 반응 속도가 향상되었다. 반응 후, 잔존한 R체 4-페닐-2-하이드록시부탄산 에틸의 광학 순도, 및 반응 개시 전의 라세미체 젖산 에틸의 양을 100%라고 하였을 때의 수율을 표 8에 나타내었다.

	4-페닐-2-하이드록시부탄산 에틸
	광학 순도(%ee)	수율(%)
DH5α(pKK-EnHCH1) (24hr) (기질 2%)	98.1(R)	9.6
DH5α(pKK-223-3) (24hr) (기질 2%)	0	100
DS-S-75 (48hr) (기질 2%)	5.27(R)	73.3
DS-S-75 (100hr) (기질 2%)	98.1(R)	9.6

DH5α(pKK-EnHCH1)에 의해, R체 4-클로로-3-하이드록시부탄산 메틸, S체 3-하이드록시 -γ-부티로락톤, S체 3-하이드록시부탄산 에틸, R체 3-하이드록시부탄산, R체 2-하이드록시부탄산 에틸, S체 2-하이드록시부탄산, R체 테트라하이드로퓨란-2-카르복실산 메틸, R체 젖산 에틸, R체 4-페닐-2-하이드록시부탄산 에틸을 생산할 수 있었다. 또한, 유전자 공여체 (엔테로박터속 DS-S-75 균주)와 동등하거나 그 이상의 입체식별성을 가지며, 반응 속도는 압도적으로 빨랐다. 즉, EnHCH를 코딩하는 유전자를 도입함에 따라, 높은 입체 선택적 가수분해 활성능을 갖는 재조합 대장균을 얻을 수 있었다. 특히, 실시예 7의 (1) - (3)에 나타낸 바와 같은 하이드록시카르복실산 에스테르는 특히 입체 선택성이 높았다.

입체식별성이 향상되고, 미생물의 촉매 능력을 종래와 비교하여 비약적으로 증대시킬 수 있을 뿐만 아니라, 재조합 DNA 기법에 의해 광학활성체를 대량생산할 수 있는 클로로히드린 및 하이드록시카르복실산 에스테르 부제 가수분해 효소 (EnHCH) 및 그 유전자가 제공된다. 또한 상기 유전자를 포함하는 벡터, 형질전환체 및 상기 효소를 사용하는 광학활성체의 제조 방법도 제공된다. 또한, 형질전환체에서 안정적으로 유전자 발현되는 EnHCH의 시그널 펩티드를 코드하는 유전자도 제공된다.

<110> DAISO CO., LTD. <120> CHLOROHYDRIN AND HYDROXY CARBOXYLIC ESTER HYDROLASE <150> JP 2002-293512 <151> 2002-10-07 <160> 12 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1990 <212> DNA <213> Enterobacter sp. <220> <221> CDS <222> (742)..(1827) <400> 1 aagtggcctt ggcagagagg ttgcgttatt gatggcttcc gaaggggcat cggtcggtat 60 tgctgacctc agtctggcct cagccgaaga ggtggtccgg gaaatacaac tggctggcgg 120 tgaagcgatt gccgttggca tggatgtctc ggacgagcag cagactcagg cgggaaccga 180 cgcgctggtg aatcgttatg gcagtcttga tattctggta tctaatgccg ggatccagat 240 tgtcagtccc ctggatgaat acccgtttgc tgactggcgg aagatgatgg ctgttcatct 300 tgacggggca tttctgacca cccgggcagc actgaaacat atgtacaaaa acccgcaagg 360 ggggacggtc atttatattg gctctgtgca ttcccatgaa gcctcccggc tgaaggcggc 420 gtatgtgacc gccaaacatg ggctgatggg gctggctaag gtggtcgcga aggagggggc 480 tgttcatcac gttcgctcgc atgtagtttg cccgggcttt gttgatacgc cgctggttaa 540 aaagcagatc cctgagcagg cccgtgagct gggtatcagc gaagaggatg tcgtcaaaaa 600 tattatgctg gcggaaaccg ttgacgggca gtttacatcg gaggcggata ttgccgaaac 660 agtacgtttt ctggtgacat ttccttccat ggcgctcacc ggacagtcaa ttacggtcag 720 ccacggatgg ggaatgcgct g atg aga aaa acc atg caa cgc agt 765 Met Arg Lys Thr Met Gln Arg Ser 1 5 ttg ctc tca gcc ctg gtg ctg gtg gct tcc tgt tgt cat ggg gcc tgg 813 Leu Leu Ser Ala Leu Val Leu Val Ala Ser Cys Cys His Gly Ala Trp 10 15 20 gca gta tct gct cag gta acc cgc gat acc ctc ggc aca atg gag aaa 861 Ala Val Ser Ala Gln Val Thr Arg Asp Thr Leu Gly Thr Met Glu Lys 25 30 35 40 cag tat caa cag atg tgg gag aaa gaa aat ggc ccg ctg acg ttg tcg 909 Gln Tyr Gln Gln Met Trp Glu Lys Glu Asn Gly Pro Leu Thr Leu Ser 45 50 55 cct ccg gcc ccc ctg gcg acg ctg tta tca tcg cta ccc aaa aac agc 957 Pro Pro Ala Pro Leu Ala Thr Leu Leu Ser Ser Leu Pro Lys Asn Ser 60 65 70 aat aac ccc gag tat aat acg ctc gac agc cgt gat gcg ttg act gcg 1005 Asn Asn Pro Glu Tyr Asn Thr Leu Asp Ser Arg Asp Ala Leu Thr Ala 75 80 85 ctg acc caa aag tac gtg acg gat aaa caa tcc ata gcc cga att atc 1053 Leu Thr Gln Lys Tyr Val Thr Asp Lys Gln Ser Ile Ala Arg Ile Ile 90 95 100 aat gtg gat gtc gcg gtg ccg gga cga aaa att ccg gta cgg atc tac 1101 Asn Val Asp Val Ala Val Pro Gly Arg Lys Ile Pro Val Arg Ile Tyr 105 110 115 120 aac ccg cat ccg gat ata gca acc ggg gtg att ttc ttc att cat ggt 1149 Asn Pro His Pro Asp Ile Ala Thr Gly Val Ile Phe Phe Ile His Gly 125 130 135 ggg ggg cat ctg agt ggt tcg gtg gat gtt tac gac ccg ata gcc cgt 1197 Gly Gly His Leu Ser Gly Ser Val Asp Val Tyr Asp Pro Ile Ala Arg 140 145 150 cat ctg gcg gct gca acc ggt aat acc gtc gtg gca gtg gac tat cgg 1245 His Leu Ala Ala Ala Thr Gly Asn Thr Val Val Ala Val Asp Tyr Arg 155 160 165 cgg gcg ccg gag tcc ccc tat ccg gag gga ctt cac gat gcg cgt gat 1293 Arg Ala Pro Glu Ser Pro Tyr Pro Glu Gly Leu His Asp Ala Arg Asp 170 175 180 gtc ctg atg cag gtt tac gct gta ctg gat cag aac cat gtt ccc tgg 1341 Val Leu Met Gln Val Tyr Ala Val Leu Asp Gln Asn His Val Pro Trp 185 190 195 200 aaa ccg caa ctg act ctg gcc gga gac agc gga ggt ggg gca ttc agc 1389 Lys Pro Gln Leu Thr Leu Ala Gly Asp Ser Gly Gly Gly Ala Phe Ser 205 210 215 gcc acg ctt gcc ggc gat tta cag act gaa cac ccg ggc ttt atc tcc 1437 Ala Thr Leu Ala Gly Asp Leu Gln Thr Glu His Pro Gly Phe Ile Ser 220 225 230 cgc ctg gag ctg att tat ccc agc ctg gat tac acg ttg tcc tgg cct 1485 Arg Leu Glu Leu Ile Tyr Pro Ser Leu Asp Tyr Thr Leu Ser Trp Pro 235 240 245 tcc gct gat gaa aat ggg cag ggt aaa ttg ctt gat aaa agc aaa gtg 1533 Ser Ala Asp Glu Asn Gly Gln Gly Lys Leu Leu Asp Lys Ser Lys Val 250 255 260 gcc tgg tac ttc agt cag tat ttt cag cat ggt gaa gac aga gcg tcg 1581 Ala Trp Tyr Phe Ser Gln Tyr Phe Gln His Gly Glu Asp Arg Ala Ser 265 270 275 280 ctt tca ccg ttg tac aga tca gtc acg cgg gcg ttt ccg ccc aca ctt 1629 Leu Ser Pro Leu Tyr Arg Ser Val Thr Arg Ala Phe Pro Pro Thr Leu 285 290 295 att ttt agt ggc ggt ctg gat cca tta cgt gat gag gat ttt gct ttt 1677 Ile Phe Ser Gly Gly Leu Asp Pro Leu Arg Asp Glu Asp Phe Ala Phe 300 305 310 gtt gcc cga ctg aaa agc gcc gga gtg ccg gtc agg cat atc cac ttc 1725 Val Ala Arg Leu Lys Ser Ala Gly Val Pro Val Arg His Ile His Phe 315 320 325 ccg ggg atg gta cat gca ttt ctg atg ctt gaa aat ctg gtg ccg cag 1773 Pro Gly Met Val His Ala Phe Leu Met Leu Glu Asn Leu Val Pro Gln 330 335 340 caa act gca cag gtt tat cag gct acc gct gat ttc att gcc aca cca 1821 Gln Thr Ala Gln Val Tyr Gln Ala Thr Ala Asp Phe Ile Ala Thr Pro 345 350 355 360 gcc cat tag gtctgagggg cagtttccgc aactgcccct gtgatttcgt 1870 Ala His taacgaatta cctgttcgtg gcgtgatttg ttttcattgg gacagaaacg cagcctttta 1930 agcctgctgt ctggtcgctg ccagcacaat ttcgcggata cagacgtttt gaggctgcag 1990 1990 <210> 2 <211> 362 <212> PRT <213> Enterobacter sp. <400> 2 Met Arg Lys Thr Met Gln Arg Ser Leu Leu Ser Ala Leu Val Leu Val 1 5 10 15 Ala Ser Cys Cys His Gly Ala Trp Ala Val Ser Ala Gln Val Thr Arg 20 25 30 Asp Thr Leu Gly Thr Met Glu Lys Gln Tyr Gln Gln Met Trp Glu Lys 35 40 45 Glu Asn Gly Pro Leu Thr Leu Ser Pro Pro Ala Pro Leu Ala Thr Leu 50 55 60 Leu Ser Ser Leu Pro Lys Asn Ser Asn Asn Pro Glu Tyr Asn Thr Leu 65 70 75 80 Asp Ser Arg Asp Ala Leu Thr Ala Leu Thr Gln Lys Tyr Val Thr Asp 85 90 95 Lys Gln Ser Ile Ala Arg Ile Ile Asn Val Asp Val Ala Val Pro Gly 100 105 110 Arg Lys Ile Pro Val Arg Ile Tyr Asn Pro His Pro Asp Ile Ala Thr 115 120 125 Gly Val Ile Phe Phe Ile His Gly Gly Gly His Leu Ser Gly Ser Val 130 135 140 Asp Val Tyr Asp Pro Ile Ala Arg His Leu Ala Ala Ala Thr Gly Asn 145 150 155 160 Thr Val Val Ala Val Asp Tyr Arg Arg Ala Pro Glu Ser Pro Tyr Pro 165 170 175 Glu Gly Leu His Asp Ala Arg Asp Val Leu Met Gln Val Tyr Ala Val 180 185 190 Leu Asp Gln Asn His Val Pro Trp Lys Pro Gln Leu Thr Leu Ala Gly 195 200 205 Asp Ser Gly Gly Gly Ala Phe Ser Ala Thr Leu Ala Gly Asp Leu Gln 210 215 220 Thr Glu His Pro Gly Phe Ile Ser Arg Leu Glu Leu Ile Tyr Pro Ser 225 230 235 240 Leu Asp Tyr Thr Leu Ser Trp Pro Ser Ala Asp Glu Asn Gly Gln Gly 245 250 255 Lys Leu Leu Asp Lys Ser Lys Val Ala Trp Tyr Phe Ser Gln Tyr Phe 260 265 270 Gln His Gly Glu Asp Arg Ala Ser Leu Ser Pro Leu Tyr Arg Ser Val 275 280 285 Thr Arg Ala Phe Pro Pro Thr Leu Ile Phe Ser Gly Gly Leu Asp Pro 290 295 300 Leu Arg Asp Glu Asp Phe Ala Phe Val Ala Arg Leu Lys Ser Ala Gly 305 310 315 320 Val Pro Val Arg His Ile His Phe Pro Gly Met Val His Ala Phe Leu 325 330 335 Met Leu Glu Asn Leu Val Pro Gln Gln Thr Ala Gln Val Tyr Gln Ala 340 345 350 Thr Ala Asp Phe Ile Ala Thr Pro Ala His 355 360 <210> 3 <211> 27 <212> PRT <213> Enterobacter sp. <400> 3 Val Ser Ala Gln Val Thr Arg Asp Thr Leu Gly Thr Met Glu Lys Gln 1 5 10 15 Tyr Gln Gln Met Trp Glu Lys Glu Asn Gly Pro 20 25 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Enterobacter sp. <400> 4 Arg Arg Ala Pro Glu Ser Pro Tyr Pro 1 5 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed primer sequence based on partial peptide sequence of EnHCH <400> 5 aarcartayc arcaratgtg g 21 <210> 6 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed primer sequence based on partial peptide sequence of EnHCH <400> 6 Arg Thr Ala Asn Gly Gly Asn Ser Trp Tyr Thr Cys Asn Gly Gly Asn 1 5 10 15 Gly Cys <210> 7 <211> 25 <212> PRT <213> Enterobacter sp. <220> <221> SIGNAL <222> (1)..(25) <400> 7 Met Arg Lys Thr Met Gln Arg Ser Leu Leu Ser Ala Leu Val Leu Val 1 5 10 15 Ala Ser Cys Cys His Gly Ala Trp Ala 20 25 <210> 8 <211> 75 <212> DNA <213> Enterobacter sp. <400> 8 atgagaaaaa ccatgcaacg cagtttgctc tcagccctgg tgctggtggc ttcctgttgt 60 catggggcct gggca 75 <210> 9 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed primer sequence for construction of pKK-EnHCH1 <400> 9 ccgaattcat ggggaatgcg ctgatgag 28 <210> 10 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed primer sequence for construction of pKK-EnHCH2 <400> 10 ccgaattcat gagaaaaacc atgcaacg 28 <210> 11 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed primer sequence for construction of pKK-EnHCH3 <400> 11 ccgaattcat gcaacgcagt ttgctctc 28 <210> 12 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed primer sequence for construction of pKK-EnHCH4 <400> 12 ccgaattcat gtctgctcag gtaacccgc 29

Claims

(a) 서열번호 1에 기재된 염기 서열과,

(b) 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열,

중에서 선택된 어느 하나의 염기서열로 이루어지는 유전자.
아래의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질.

(a) 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열
서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진, 제 2항에 기재된 단백질을 사용한 휴지 균체 반응을 위한 시그널 펩티드.
서열번호 8의 염기 서열로 이루어진, 청구항 3에 기재된 시그널 펩티드를 코드하는 DNA.
제 1항에 기재된 유전자를 포함하는 벡터.
제5항에 있어서, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 사용한 휴지 균체 반응을 위한 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 시그널 펩티드를 코드하는, 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 DNA를 추가로 포함하는 벡터.
제 6항에 있어서, 상기 벡터는 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터에 기탁 번호 FERM BP-08466로 기탁되어 있는 플라스미드 pKK-EnHCHl인 벡터.
제 1항에 기재된 유전자 또는 제 5항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 기재된 벡터를 포함하는 형질전환체.
제 8항에 있어서, 숙주가 대장균인 형질전환체.
제 9항에 있어서, 숙주가 대장균 JMl09 균주 또는 DH5α균주인 형질전환체.
제 1항에 기재된 유전자를 발현하여 제 2항에 기재된 단백질을 제조하는 방법.
제8항에 기재된 형질전환체를 배양하는 단계와,

아래 화학식 [1〕

　　　　　　　　Cl-CH₂-CHOH-CH₂-COOR¹[1]

(식중, R¹은 C1 ~ C4의 알킬기이다. )

로 표시되는 라미세체 클로로히드린을 상기 배양액에 첨가하여 입체 선택적으로 탈클로로 및 가수분해시켜, 아래 화학식 [2〕

로 표시되는 S체 3-하이드록시-γ-부티로락톤을 생성시켜, R체 클로로히드린을 잔존시키는 단계

를 포함하는 광학 활성 화합물을 제조하는 방법.
제8항에 기재된 형질전환체를 배양하는 단계와,

아래 화학식 [3〕

　　　　　　R²-(CH₂)n-CHOH-(CH₂)m-COOR¹　　　　　　　　　[3]

(식중, R¹은 C1 ~ C4의 알킬기이고, R²는 메틸기 또는 벤질기이며,　R²가 메틸기일 때, m이 0이면 n은 0 또는 1이고, m이 1이면 n는 0이다. R²가 벤질기인 때, m이 0이고, n은 1이다.)

으로 표시되는 라세미체 하이드록시 카르복실산 에스테르를 상기 배양액에 첨가하여 입체 선택적으로 탈클로로 및 가수분해하여, 광학활성 하이드록시카르복실산을 생성하고, 그 에난티오머 에스테르를 잔존시키는 단계

를 포함하는 광학 활성 화합물을 제조하는 방법.
제8항에 기재된 형질 전환체를 배양하는 단계와,

아래 화학식 [4〕

(식중, R¹은 C1 ~ C4의 알킬기이다.)

로 표시되는 라세미체 테트라히드로푸란-2-카르복실산 에스테르를 상기 배양액에 첨가하여 입체 선택적으로 탈클로로 및 가수분해하여, R체 테트라히드로푸란-2-카르복실산 에스테르를 잔존시키는 단계

를 포함하는 광학 활성 화합물을 제조하는 방법.