ES2333201T3 - Butinol 1 esterasa. - Google Patents
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Abstract
Proteína con actividad butinol I esterasa, que comprende por lo menos una secuencia parcial de aminoácidos de conformidad con SEQ ID NO: 3, 4, 5 ó 6, que tiene la facultad para la hidrólisis enantioselectiva de ésteres butinilo de ácidos carboxílicos.
Description
Butinol 1 esterasa.
La presente invención se refiere a proteínas
novedosas de Pseudomonas glumae, que tienen una actividad
esterasa, en particular una actividad butinol 1 esterasa, a
secuencias de ácido nucleico que las codifican, a casetes de
expresión, vectores y microorganismos recombinantes; a métodos para
preparar tales proteínas y al uso de las mismas para la hidrólisis
enzimática de éster, en particular enzimática enantioselectiva, o
bien transesterificación de ésteres orgánicos.
Las esterasas y las lipasas son hidrolasas que
pueden ser empleadas en procesos industriales para sintetizar
compuestos orgánicos ópticamente activos y que son caracterizadas
por alta especificidad para sustrato. A través de un mecanismo
similar al mecanismo de serina proteasas, puede transferir grupos
acilo a nucleófilos, como por ejemplo grupos carbonilo, o bien
disociar hidrolíticamente enlaces éster. Las esterasas, lipasas y
serina proteasas comparten la triada catalítica, un motivo de
secuencia que consiste de los aminoácidos Ser, His y Asp, en donde
el átomo de carbono de carbonilo es sometido a ataque nucleofílico
por el Ser activo, que, con participación de los demás dos
aminoácidos lleva a una distribución de carga. Las esterasas y
lipasas pueden también transferir grupos acilo a otros nucleófilos,
como por ejemplo grupos tio de un éter tio o aminas activadas.
Las lipasas hidrolizan los ésteres de glicerina
de cadena larga y se caracterizan por activación superficial, es
decir, el sitio activo se vuelve accesible solamente en presencia de
sustrato de lípidos. Las lipasas son estables en solventes
orgánicos no acuosos y se emplean en numerosos procesos industriales
para resolución cinética de racemato, es decir, un enantiómero es
convertido sustancialmente más rápidamente que el otro. Dicho
enantiómero puede ser obtenido a continuación a de la solución de
reacción debido a propiedades físicas y químicas diferentes.
Nakamura (Nakamura, K y colaboradores,
Tetrahedron; Asymmetry 9, (1999), 4429-4439)
describe la resolución de racemato de
1-alquin-3-ol por
transesterificación en solventes hidrofóbicos con ayuda de lipasas
comercialmente disponibles (Amano AK, AH y PS; Amano
Pharmaceuticals Co. Ltd.). En esta reacción, la enantioselectividad
se eleva con la longitud de cadena del donador de acilo y residuos
estéricamente grandes (acetato de cloro, benzoato de vinilo) tienen
un efecto negativo sobre la reacción. Yang (Yang, H. y
colaboradores, J. Org. Chem. 64, (1999), 1709-1712)
describe la preparación enantioselectiva de ácidos ópticamente
activos por transesterificación con ésteres de vinilo empleando
lipasa B de Cándida antártica como catalizador. En este caso, los
ésteres de etilo llevan a una velocidad de reacción claramente más
baja y a una menor selectividad. Una lipasa aislada de
Burkholderia plantarii (Pseudomonas plantarii o
glumae) DSM 6535 se emplea para la acilación enantioselectiva
de aminas racémicas con ayuda de etil
metoxi-acetato (Balkenhohl, F. y colaboradores J.
prakt. Chem. 339, (1997), 381-384).
Las esterasas catalizan enantioselectivamente la
formación y ruptura de enlaces éster (reacción directa y reversa).
Se prefiere utilizar los ésteres de vinilo en la transesterificación
para obtener alcoholes ópticamente activos, puesto que la función
alcohol del éster ya no está disponible después de la conversión
debido a la tautomerización del aldehído o cetona y por
consiguiente se puede evitar la reacción reversa. En contraste a
las lipasas, las esterasas no son activadas superficialmente y
convierten también los compuestos orgánicos de cadena relativamente
corta. Esterasas de especificidad para sustrato diferente han sido
aisladas de varios organismos.
Así, la esterasa de Pseudocardia
thermophila FERM-BP-6273 se
utiliza para hidrolizar ésteres cromano-acéticos
ópticamente activos (EP-A-O 892
044).
Una esterasa de Bacillus acidocaldarius
hidroliza ésteres de baja enantioselectividad de un rango estrecho
de sustratos (Manco, G. y colaboradores, Biochem. J. 332, (1998),
203-212).
La acilasa 1 de Aspergillus se emplea para
obtener alcoholes secundarios por transesterificación con ésteres
de vinilo en solventes orgánicos no polares, y se prefiere la
conversión de alcoholes secundarios que tienen cadenas laterales
cortas (Faraldos, J. y colaboradores, Synlett 4, (1997),
367-370). A partir de Pseudomonas
fluorescens DSM 50 106 se ha clonado una esterasa específica
para lactona unida a membrana (Khalameyzer, V. y colaboradores,
Appl. y Environ. Microbiol. 65 (2), (1999),
477-482), y a partir del mutante Q de E. coli
una acetilesterasa (Peist, R. y colaboradores, J. Bacteriol. 179,
(1997), 7679-7686). Sin embargo, la
enantioselectividad y la especificidad para sustrato de estas dos
esterasas no han sido estudiadas con más detalles. Rhodococcus
sp. NCBM 11216 expresa 4 esterasas, RR1 a RR4, que tienen una
especificidad diferente. Para la síntesis de éster a partir de un
naftol y un ácido, RRl y RR2 prefieren ácidos con cadenas de carbono
cortas, mientras que RR3 y RR4 convierten específicamente ácidos
que tienen cadenas de carbono relativamente largas y residuos
estéricamente relativamente grandes (Gudelj, M. y colaboradores, J.
Mol. Cat. B, Enzymatic 5, (1998), 261-266).
Krebsfänger, N. y colaboradores, describen en
Enyzme Microb. Technol., 1998, V. 2, 641-646 el
aislamiento de una esterasa a partir de Pseudomonas
fluorescens.
Sin embargo, esterasas que tienen una amplia
gama de sustratos y una alta enantioselectividad y que pueden
emplearse en procesos industriales no están disponibles para
preparar pequeñas moléculas orgánicas, como por ejemplo alcoholes
ópticamente activos, ácidos o ésteres con cadenas de carbono cortas.
Es un objeto de la presente invención el suministro de esterasas
que tienen por lo menos una de las propiedades mencionadas
arriba.
Este objeto se resuelve, sorprendentemente,
proporcionando una proteína que tiene actividad butinol I esterasa,
que abarca por lo menos una secuencia de parte de aminoácidos de
conformidad con SEQ ID NO: ID NO: 3, 4, 5 ó 6:
| a) | FIETLGLERPVLVGHSLGGAIALAVGLDYPER | (SEQ ID NO: 3), |
| b) | IALIAPLTHTETEP | (SEQ. ID NO: 4), |
| c) | GGGMMGLRPEAFYAASSDLV | (SEQ. ID NO: 5) |
| d) | AIDAIFAPEPV | (SEQ. ID NO: 6) |
(cada una proporcionada en el código de una
letra para aminoácidos, el primer aminoácido en cada caso
corresponde al extremo amino-terminal
respectivo),
El objeto se logró en particular proporcionando
una butinol I esterasa según la reivindicación 2 que comprende una
secuencia de aminoácidos de conformidad con SEQ ID NO: 2 25 o bien
que es codificada por una secuencia de ácido nucleico de
conformidad con SEQ ID NO: 1.
Para mayor simplicidad, de aquí en adelante las
proteínas mencionadas arriba se denominan butinol I esterasas.
Los "equivalentes funcionales" o análogos
de los polipéptidos o proteínas divulgados específicamente son para
propósitos de la presente invención polipéptidos o proteínas que
difieren de ellos pero siguen teniendo la actividad enzimática
definida en las reivindicaciones de patente, así como las
características estructurales definidas en las reivindicaciones de
patente.
Tales "equivalentes funcionales" de
conformidad con la presente invención se refieren particularmente a
mutantes que tienen en por lo menos una de las posiciones de
secuencia de SEQ ID NO:2 un aminoácido que difiere del aminoácido
específicamente mencionado pero sin embargo tiene por lo menos una
de las actividades biológicas de la invención. Los "equivalentes
funcionales" comprenden por consiguiente los mutantes disponibles
por uno o más adiciones, sustituciones, deleciones y/o inversiones
de aminoácidos, y es posible que tales modificaciones ocurran en
cualquier posición de secuencia en la medida en que llevan a un
mutante que tiene el perfil de propiedades de la inversión. Una
equivalencia funcional existe en particular también cuando existe
una correlación cualitativa entre el mutante y un polipéptido no
modificado en el patrón de reactividad, es decir, existen
diferencias en cuanto a la velocidad de conversión de sustratos
idénticos, por ejemplo.
Tales "equivalentes funcionales" abarcan
también naturalmente polipéptidos que pueden obtenerse a partir de
otros organismos, y variantes que ocurren naturalmente. Por ejemplo,
regiones de secuencias homólogas pueden encontrarse mediante
comparación de secuencias, y enzimas equivalentes pueden ser
determinadas de conformidad con los requerimientos específicos de
la invención.
Tales "equivalentes funcionales" comprenden
también fragmentos del polipéptido de la invención según SEQ ID NO:
2 que siguen teniendo las características de actividad y estructura
reivindicadas.
Tales "equivalentes funcionales" son
adicionalmente proteínas de fusión que tienen una de las secuencias
de polipéptidos aquí descritas o equivalentes funcionales derivadas
de ellas y por lo menos otra secuencia heteróloga, diferente
funcionalmente, en vínculo funcional N- o C-terminal
(es decir, sin perjuicio funcional mutuo sustancial de las partes
de la proteína de fusión). Ejemplos no limitativos de tales
secuencias heterólogas son, por ejemplo, péptidos de señal,
enzimas, inmunoglobulinas, antígenos superficiales, receptores o
ligandos de receptores.
Los "equivalentes funcionales" son de
conformidad con la presente invención homólogos de los polipéptidos
o proteínas específicamente divulgados. Tienen por ejemplo una
homología de por lo menos el 60%, de preferencia por lo menos el
75%, en particular por lo menos el 85%, por ejemplo, 90%, 95% ó 99%,
con la secuencia específicamente divulgada según SEQ ID NO:2, de
conformidad con lo calculado por el algoritmo de Pearson y Lipman,
Proc. Natl. Acad. Sci. (EUA) 85 (8), 1988,
2444-2448.
Homólogos de las proteínas o polipéptidos de la
presente invención pueden ser generados por mutagénesis, por
ejemplo por mutación de puntos o contracción de la proteína. El
término "homólogo" como se emplea aquí se refiere a una forma
variante de la proteína que actúa como agonista o antagonista de la
actividad de proteína.
Homólogos de las proteínas de la presente
invención pueden ser identificados mediante el tamizado (screening)
de bibliotecas de combinación de mutantes como por ejemplo, mutantes
truncados.
Es posible, por ejemplo, generar una biblioteca
(banco) variada de variantes de proteína mediante mutagénesis de
combinación a nivel de ácido nucleico como por ejemplo, por ligación
enzimática de una mezcla de oligonucleótidos sintéticos. Existe un
gran número de métodos que pueden ser utilizados para producir
bibliotecas o bancos de homólogos potenciales a partir de una
secuencia de oligonucleótidos degenerada. La síntesis química de
una secuencia de gen degenerada puede efectuarse en un sintetizador
automático de ADN, y el gen sintético puede ser ligado en un vector
de expresión adecuado. El uso de un grupo degenerado de genes hace
posible proporcionar todas las secuencias en una mezcla las cuales
codifican el lote deseado de secuencias de proteínas potenciales.
Métodos para sintetizar oligonucleótidos degenerados se conocen por
parte de los expertos en la materia (por ejemplo, Narang, S.A.
(1983) Tetrahedron 39:3; Itakura y colaboradores (1984) Annu. Rev.
Biochem. 53:323; Itakura y colaboradores, (1984) Science 198: 1056;
Ike y colaboradores (1983) Nuclelc Acids Res. 11: 477).
Además, pueden emplearse bibliotecas (bancos) de
fragmentos del codón de proteína para generar una población variada
de fragmentos de proteína para tamizado y para selección subsecuente
de homólogos de una proteína de la invención. En una modalidad, una
biblioteca de fragmentos de secuencias de codificación puede
generarse mediante el tratamiento de un fragmento bicatenario por
reacción en cadena de la polimerasa de una secuencia codificadora
con una nucleasa en condiciones en las cuales el corte se lleva a
cabo solamente aproximadamente una vez por molécula, mediante la
desnaturalización del ADN bicatenario, la renaturalización de ADN
para formar ADN bicatenario que puede comprender pares de
sentido/antisentido de productos cortados diferentes, la remoción
de secciones de cadena única de los duplicados recién formados por
tratamiento con S1 nucleasa y el ligado de la biblioteca de
fragmentos resultante en un vector de expresión, Es posible, a
través de este método, derivar una biblioteca de expresión que
codifica fragmentos N-terminales,
C-terminales e internos que tienen tamaños
diferentes de la proteína de la presente invención.
Se conocen varias técnicas en el estado de la
técnica para tamizar productos génicos a partir de bibliotecas de
combinación que han sido producidas mediante mutaciones de la punta
a truncada y para el tamizado de bibliotecas ADNc para productos
génicos con una propiedad seleccionada. Estas técnicas pueden ser
adaptadas a un tamizado rápido de bibliotecas de genes que han sido
generadas por mutagénesis de combinación de homólogos de la
invención. Las técnicas más frecuentemente utilizadas para tamizar
grandes bibliotecas de genes sometidas a análisis de alto
rendimiento comprenden la clonación de la biblioteca de genes en
vectores de expresión replicables, la transformación de células
adecuadas con la biblioteca de vector resultante y la expresión de
los genes de combinación bajo condiciones en las cuales la
detección de la actividad requerida facilita el aislamiento del
vector que codifica el gen cuyo producto ha sido detectado. La
mutagénesis de ensamble recursivo (REM), una técnica que incrementa
la frecuencia de mutantes funcionales en las bibliotecas, puede ser
utilizada en combinación con pruebas de tamizado para identificar
homólogos (Arkin y Yourvan (1992) PNAS 89:7811-7815;
Delgrave y colaboradores (1993) Protein Engineering 6(3)
:327-331).
En la reivindicación 2 se definen equivalentes
funcionales preferidos de acuerdo con la invención y tienen una
secuencia que se desvía de SEQ ID NO: 2 en por lo menos una
posición, y de preferencia dicha alteración en la secuencia cambia
la actividad esterasa solamente de manera insignificante, es decir,
en no más que aproximadamente \pm 90,
en particular no más que \pm 50% o no más que \pm 30%. Este cambio puede ser determinado empleando un sustrato de referencia como por ejemplo butirato de butinol bajo condiciones estandarizadas (como por ejemplo, 20 mM de sustrato, 10 mM de amortiguador de fosfato, pH 7.4, T = 20ºC).
en particular no más que \pm 50% o no más que \pm 30%. Este cambio puede ser determinado empleando un sustrato de referencia como por ejemplo butirato de butinol bajo condiciones estandarizadas (como por ejemplo, 20 mM de sustrato, 10 mM de amortiguador de fosfato, pH 7.4, T = 20ºC).
Las butinol I esterasas de acuerdo con la
invención tienen de preferencia un peso molecular de aproximadamente
40 a 42 kDa, en particular aproximadamente 41.3 kDa, de conformidad
con lo determinado por electroforesis en gel SDS. Pueden obtenerse
en particular de Pseudomonas glumae Lu 2023 con número de
depósito DSM 13176. Otras variantes de cepas son accesibles, por
ejemplo, a partir de Pseudomonas glumae Lu 8093 mediante
selección, como por ejemplo mediante cultivo en placas de medio
mínimo, con fenilacetato de etilo como única fuente de carbono.
La invención incluye también polinucleótidos
según la definición en las reivindicaciones de patente adjuntas.
Objeto de la invención son en particular
secuencias de ácido nucleico (secuencias de ARN y ADN, mono- o
bicatenario, como por ejemplo, cADN y mARN), que codifican para uno
de los polipéptidos o proteínas que se mencionaron arriba.
La invención se refiere tanto a moléculas de
ácido nucleico aislada que codifican para polipéptidos o bien para
proteínas de la invención o secciones biológicamente activas de las
mismas, y a fragmentos de ácido nucleico que pueden emplearse, por
ejemplo, para su uso como sondas de hibridación o primers para
identificar o amplificar ácidos nucleicos codificadores de la
invención.
Las moléculas de ácido nucleico de la invención
pueden comprender además secuencias no trasladadas del extremo 3'
y/o 5' de la región codificadora del gen.
Una molécula de ácido nucleico "aislada" es
separada de otras moléculas de ácido nucleico que están presentes
en la fuente natural del ácido nucleico y pueden además estar
esencialmente libres de otro material celular o medio de cultivo si
es producida por técnicas recombinantes, o bien libre de precursores
químicos u otros químicos si se sintetiza químicamente.
Una molécula de ácido nucleico de la presente
invención puede ser aislada mediante el uso de técnicas
estandarizadas de biología molecular y la información de secuencia
proporcionada de conformidad con la presente invención. Por
ejemplo, se puede aislar ADNc de una biblioteca de ADNc adecuada
empleando una de las secuencias completas específicamente
divulgadas o una sección de la misma como sonda de hibridación y
técnicas de hibridación estándares (de conformidad con lo descrito,
por ejemplo, en Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T. Molecular
Cloning: A Laboratory Manual [Clonación Molecular: Un Manual de
Laboratorio], 2ª Edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold
Spring Harbar Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. 1989). Es
también posible, que una molécula de ácido nucleico, que comprende
una de las secuencias divulgadas o una sección de la misma, sea
aislada por reacción en cadena de polimerasa empleando los primers
de oligonucleótidos creados con base en esta secuencia. El ácido
nucleico amplificado de esta forma puede ser clonado en un vector
adecuado y caracterizado por análisis de secuencia de ADN. Los
oligonucleótidos de la invención también pueden ser producidos por
métodos estándares de síntesis, por ejemplo empleando un
sintetizador de ADN automático.
La invención comprende además las moléculas de
ácido nucleico que son complementarias de las secuencias de
nucleótidos específicamente descritos, o una sección de las mismas,
según la definición en la reivindicación 6.
Las secuencias de nucleótidos de la presente
invención hacen posible generar sondas y primers que pueden ser
utilizados para identificar y/o clonar secuencias homólogas en otros
tipos de células y organismos. Tales sondas y primers comprenden
habitualmente una región de secuencia de nucleótidos que se hibrida
bajo condiciones estrictas en por lo menos aproximadamente 12, de
preferencia por lo menos aproximadamente 25, como por ejemplo, 40,
50 ó 75 nucleótidos consecutivos de una cadena de sentido
("sense") de una secuencia de ácido nucleico de la presente
invención o una cadena de antisentido ("antisense")
correspondiente.
Secuencias de ácido nucleico adicionales de la
presente invención son derivadas de SEQ ID NO: 1 y difieren de
dicha secuencia por adición, sustitución, inserción o deleción de
uno o varios nucleótidos, pero siguen codificando para proteínas
con la actividad de butinol I esterasa de la presente invención
dentro del rango de variación mencionado arriba en actividad
enzimática.
La presente invención abarca también secuencias
de ácido nucleico que comprenden lo que se conoce como mutaciones
silenciosas o bien son modificadas, en comparación con una secuencia
mencionada específicamente, según la utilización de codón de una
fuente especial u organismo huésped, así como variantes que ocurren
naturalmente como por ejemplo variantes de empalme o variantes
alélicas de las mismas. También son objeto secuencias que pueden
obtenerse por sustituciones conservadoras de nucleótidos (es decir,
el aminoácido relevante es reemplazado por un aminoácido con la
misma carga, tamaño, polaridad y/o solubilidad).
También son objeto de la invención moléculas
derivadas de los ácidos nucleicos específicamente divulgados a
través de polimorfismo de secuencia. Estos polimorfismos genéticos
pueden existir debido a la variación natural entre individuos en
una población. Estas variaciones naturales resultan normalmente en
una variación de 1 a 5% en cuanto a la secuencia de nucleótidos de
un gen.
Los polinucleótidos de la invención pueden
encontrarse mediante inspección sistemática de bibliotecas genómicas
o de ADNc y opcionalmente pueden multiplicarse a partir de ahí a
través de reacción en cadena de polimerasa empleando primers
adecuados y después, por ejemplo, pueden ser aislados con sondas
adecuadas. Otra posibilidad es transformar microorganismos
adecuados con polinucleótidos o vectores de la invención,
multiplicar los microorganismos y por consiguiente los
polinucleótidos, y después aislarlos. Una posibilidad adicional es
sintetizar polinucleótidos de la invención por vías químicas.
La propiedad de poder "hibridar" en
polinucleótidos se refiere a la capacidad de un polinucleótido o de
un oligonucleótido para enlazarse en condiciones estrictas con una
secuencia casi complementaria, mientras que en estas condiciones no
exista ningún enlace no especifico entre las partes no
complementarias. Para este propósito, las secuencias deben tener
una complementariedad de 70-100%, de preferencia de
90-100%. La propiedad de secuencias complementarias
de unirse específicamente entre sí se aprovecha, por ejemplo, en la
técnica Northen blot o Southern blot o bien en reacción en cadena
de polimerasa o RT-PCR en el caso de enlace de
primers. Oligonucleótidos con una longitud de 30 pares de bases o
más se emplean normalmente para este propósito. Condiciones
estrictas significan, por ejemplo, en la técnica Northern blot el
uso de una solución de lavado, de preferencia por ejemplo búfer
0,1xSSC con SDS al 0.1% (20x SSC: NaCl de 3M, citrato de Na de 0,3M,
pH 7,0) caliente a 50 - 70ºC, preferiblemente
60-65ºC, para eluir sondas de ADNc no
específicamente hibridadas u oligonucleótidos. En este caso, de
conformidad con lo mencionado arriba, solamente ácidos nucleicos con
un alto grado de comp1ementariedad permanecen unidos entre sí. El
establecimiento de condiciones estrictas es conocido de los expertos
en la materia y se describe, por ejemplo, en Ausubel y
colaboradores, Current Protocols in Molecular Biology [Protocolos
Actuales en Biología Molecular], John Wiley & Sons, N. Y.
(1989), 6.3.1-6.3.6.
También son objeto de la invención casetes de
expresión que incluyen por lo menos un polinucleótido de conformidad
con la presente invención enlazado operativamente con secuencias de
ácido nucleico reguladoras. De preferencia, una secuencia de
promotor se localiza 5' corriente arriba del polinucleótido de la
invención y facilita de esta manera una expresión controlada de la
butinol 1 esterasa. De manera particularmente preferible, una
secuencia de terminador y también opcionalmente, elementos
reguladores habituales adicionales se localizan 3' corriente abajo
del polinucleótido de la presente invención, cada uno de ellos está
enlazado operativamente con la secuencia que codifica butinol 1
esterasa. Un enlace operativo significa el arreglo secuencial de
promotor, secuencia codificadora, terminador y, opcionalmente,
otros elementos reguladores de tal manera que cada uno de los
elementos reguladores pueda cumplir su función antes, durante o
después de la expresión de la secuencia codificadora como se
contempla. Ejemplos de secuencias adicionales operativamente
enlazables son secuencias de enfoque y también amplificadores de
traducción, realzadores, señales de poliadenilación y similares.
Elementos reguladores útiles adicionales incluyen marcadores
seleccionables, geles reportero, señales de amplificación, orígenes
de replicación y similares.
Además de las secuencias de regulación
artificiales, la secuencia de regulación natural todavía puede estar
presente delante del gen estructural actual. Por medio de
modificación genética es posible, opcionalmente, eliminar dicha
regulación natural e incrementar o disminuir la expresión de los
genes. Sin embargo, la construcción del casete de expresión puede
también ser más simple, es decir que no se insertan señales
reguladoras adicionales delante del gen estructural, y no es
removido el promotor natural con su regulación. En lugar de esto, la
secuencia reguladora natural es mutada de tal manera que la
regulación ya no se efectúe y la expresión génica es incrementada o
disminuida. Las secuencias de ácido nucleico pueden estar presentes
en una o varias copias del casete de expresión.
Ejemplos de promotores útiles son: promotor cos,
tac, trp, tet, trp- tet, lpp, lac, lpp-lac, laclq,
T7, T5, T3, gal, trc, ara, SP6, I-PR o
1-PL, los cuales se utilizan de manera provechosa en
bacterias Gram negativas; y también los promotores Gram positivos
amy y SPO2, los promotores de levadura ADC1, MFa, AC,
P-60, CYCl, GAPDH o bien los promotores vegetales
CaMV/35S, SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, nos o bien el promotor de
ubiquitina o promotor de faseolina. Se da preferencia particular a
la utilización de promotores inducibles como por ejemplo promotores
inducibles por la luz y particularmente promotores inducibles por la
temperatura tales como el promotor P_{r}P_{1}.
En principio es posible utilizar todos los
promotores naturales con sus secuencias reguladoras. Además, es
también provechoso y posible utilizar promotores sintéticos.
Las secuencias reguladoras deben facilitar la
expresión específica de las secuencias de ácido nucleico y la
expresión de proteína. Según el organismo huésped, esto puede
significar, por ejemplo, que el gen es expresado o
sobre-expresado solamente después de inducción, o
bien que es expresado y/o sobre-expresado
inmediatamente.
En este contexto, es posible que las secuencias
reguladoras o factores tengan una influencia positiva y por
consiguiente incrementen o disminuyan la expresión. Por
consiguiente, los elementos reguladores pueden ser incrementados
provechosamente a nivel de transcripción mediante la utilización de
señales de transcripción fuertes tales como promotores y/o
realzadores ("enhancer"). Aparte de esto, sin embargo, es
también posible incrementar la traslación, por ejemplo
incrementando la estabilidad del ARNm.
Un casete de expresión de la presente invención
es producido por la fusión de un promotor adecuado con un
polinucleótido adecuado que codifica butinol I esterasa y también
con un terminador o señal de poliadenilación. Para este propósito,
se utilizan técnicas de recombinación y clonación habituales tales
como las descritas, por ejemplo, en T. Maniatis, E.F. Fritsch y J.
Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual [Clonación
Molecular: Un Manual de Laboratorio], Cold Spring Harbar Laboratory,
Cold Spring Harbar, NY (1989) y también en T. J. Silhavy, M.L.
Berman y L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions [Experimentos
con Fusiones de Genes], Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring
Harbor, NY (1984) y en Ausubel, F.M. y colaboradores, Current
Protocols in Molecular Biology [Protocolos Actuales en Biología
Molecular], Greene Publishing Assoc. y Wiley Interscience
(1987).
Objeto de la invención son también vectores
recombinantes para transformar huéspedes eucarióticos y
procarióticos que llevan un polinucleótido de la invención o un
casete de expresión de la invención. Tales vectores permiten la
expresión de butinol 1 esterasa en un organismo huésped adecuado.
Vectores son bien conocidos por parte de expertos en la materia y
pueden encontrarse, por ejemplo, en "Cloning Vectors" [Vectores
de Clonación] (Pouwels P. H. Y colaboradores, eds., Elsevier,
Ámsterdam-Nueva York-Oxford, 1985).
Por vectores se entienden, además de plásmidos, también a todos los
demás vectores conocidos por parte de los expertos en la materia
como por ejemplo, fagos, virus tales como SV40, CMV, baculovirus y
adenovirus, transposones, elementos IS fásmidos, cósmidos, así como
ADN lineal o circular. Estos vectores pueden ser replicados
autónomamente o bien de manera cromosomática en el organismo
huésped.
Con la ayuda de los vectores de la invención es
posible producir microorganismos recombinantes que, por ejemplo,
han sido transformados con por lo menos un vector de la invención y
pueden emplearse para la producción de esterasa recombinante. De
manera provechosa, los casetes de expresión recombinante de la
presente invención descritos arriba son introducidos como parte de
un vector de expresión a un sistema huésped adecuado, y expresados.
Se da preferencia aquí a métodos corrientes de clonación y
transfección conocidos por parte de los expertos en la materia,
para expresar dichos ácidos nucleicos en el sistema de expresión
respectivo. Sistemas adecuados se describen, por ejemplo, en
Current Protocols in Molecular Biology [Protocolos Actuales en
Biología Molecular], F. Ausubel y colaboradores, eds., Wiley
Interscience, Nueva York 1997.
Organismos huéspedes adecuados para
transformación con vectores de la invención son en principio todos
los organismos que facilitan la expresión de los polinucleótidos de
la presente invención, de sus variantes alélicas, sus equivalentes
funcionales o derivados de los mismos. Organismos huéspedes se
refieren, por ejemplo, a bacterias, hongos, levaduras, células
vegetales o animales. Los organismos preferidos son bacterias tales
como las bacterias de los géneros Escherichia como por ejemplo,
Escherichia coli, streptomyces, Bacillus o Pseudomonas,
microorganismos eucarióticos, como por ejemplo Saccharomyces
cerevisiae, Aspergillus, células eucarióticas superiores de
animales o plantas, por ejemplo células Sf9 o CHO. Organismos
exitosamente transformados pueden ser seleccionados a través de
genes marcadores también contenidos en el vector o en el casete de
expresión. Ejemplos de tales genes marcadores son genes para la
resistencia a los antibióticos y para enzimas que catalizan una
reacción de tinción que provoca la tinción de las células
transformadas. Tales células pueden ser seleccionadas a través de
una clasificación automática de células. Organismos que han sido
exitosamente transformados con un vector y que llevan un gen
apropiado de resistencia a los antibióticos pueden seleccionarse por
medios o sustratos que contienen los antibióticos apropiados.
Proteínas marcadoras presentadas en la superficie de las células
pueden ser utilizadas para selección por medio de cromatografía de
afinidad.
Así, también son objeto de la invención
microorganismos que llevan un vector de la invención y también a
mutante de Pseudomonas glumae, Lu 2023, con número de
depósito DSM 13176, que expresa de manera endógena butinol 1
esterasa. Las butinol 1 esterasas de la presente invención en
particular catalizan por lo menos una de las reacciones
siguientes:
a) hidrólisis enantioselectiva de ésteres
ópticamente activos de la fórmula I
(I),R^{1}-COO-R^{2}
en donde R^{1} es un alquilo
C_{1}-C_{10}, alquenilo
C_{2}-C_{10}, alquinilo
C_{2}-C_{10} de cadena recta o ramificada,
insustituido, monosustituido o polisustituido, y R^{2} es alquilo
C_{1}-C_{10}, alquenilo
C_{2}-C_{10}, alquinilo
C_{2}-C_{10,} aralquilo
C_{7}-C_{15} de cadena recta o ramificado,
insustituido, monosustituido o polisustituido, o bien un radical
aromático mononuclear o polinuclear, insustituido o
monosustituido,
R^{1} y/o R^{2} comprenden por lo menos un
átomo de carbono asimétrico,
en donde de manera particularmente preferible o
bien el átomo de carbono de R unido al átomo de carbono de enlace
éster o bien el átomo de carbono de R2 unido al oxigeno de enlace de
éster es un átomo de carbono asimétrico; y
\vskip1.000000\baselineskip
b) transesterificación enantioselectiva de un
éster de la fórmula I con un alcohol ópticamente activo de la
fórmula II
(II),R^{2}-OH
en donde R^{2} tiene uno de los
significados antes mencionados y, opcionalmente tiene por lo menos
un átomo de carbono
asimétrico,
en donde de manera particularmente preferible el
átomo de carbono que lleva el grupo OH es un átomo de carbono
asimétrico.
También son objeto de la invención métodos para
la hidrólisis enantioselectiva de ésteres utilizando una butinol I
esterasa definida en las reivindicaciones de patente, donde la
butinol I esterasa entra en contacto con una mezcla de
estereoisómeros de un éster ópticamente activo de la fórmula I y los
compuestos ópticamente activos que provienen de la hidrólisis
estereoselectiva de uno de dos estereoisómeros y/o el enantiómero de
éster no hidrolizado se obtienen a partir del medio de la reacción.
Sin embargo, es también posible que el butinol I esterasa hidrolice
los ésteres de la fórmula I que no son ópticamente activos.
También son objeto de la invención métodos para
la transesterificación enantioselectiva, en los que una mezcla
estereoisomérica de un alcohol ópticamente activo de la fórmula II
entra en contacto con un éster de la fórmula I en presencia de una
butinol I esterasa definida en las reivindicaciones de patente, y el
estereoisómero de alcohol sin reaccionar es obtenido a partir del
medio de la reacción; o bien, una mezcla de estereoisómeros de un
éster ópticamente activo de la fórmula I entra en contacto con un
alcohol de la fórmula II en presencia de la butinol I esterasa, y
se obtiene un estereoisómero del alcohol ópticamente activo
contenido en el éster a partir del medio de la reacción. Se
utilizan de preferencia ésteres de vinilo en la transesterificación
como agentes de acilación para un alcohol ópticamente activo. Esto
es de provecho puesto que después de la conversión la función
alcohol del éster vinilo ya no está disponible para la reacción
reversa debido a tautomerización. La butinol I esterasa cataliza
también los procesos de transesterificación en los cuales ni el
éster ni el alcohol son ópticamente activos.
Sustratos preferidos para la hidrólisis de éster
son ésteres del etanol, del propanol, del butanol y, de manera
particularmente preferible, ésteres de butinilo (ésteres de butinol,
ésteres del
1-metilprop-2-inol)
con ácidos carboxilicos tales como, por ejemplo, ácido acético,
ácido propanoico, ácido butírico, ácido pentanoico, ácido
hexanoico, ácido heptanoico, ácido octanoico ácido láctico, ácido
2-etilhexanoico, ácido
3-metilbutirico, ácido metoxiacético, ácido
2-metilpropiónico, ácido
2-butenoico, ácido 3-cloropropiónico
y ácido 2-metilpentanoico. Se prefieren
particularmente éster de ácido butírico (butirato de butinilo) y
éster butinilo de ácido metilbutírico (metilbutirato de
butinilo).
Alcoholes preferidos en la transesterifieación
son etanol, propanol y butano, de manera particularmente preferida
butinol.
\newpage
Los ésteres preferidos en la transesterificación
son ésteres de vinilo tales como, por ejemplo, acetato de vinilo,
propionato de vinilo y butirato de vinilo.
Los medios de reacción utilizados en los métodos
antes mencionados son solventes orgánicos como por ejemplo,
alcanos, éteres, tolueno, dioxano, metil isobutil cetona, metil
terc-butil éter (MTBE) y similares. En la
hidrólisis de ésteres, también pueden emplearse mezclas elaboradas a
partir de la solución búfer utilizada y de solventes orgánicos
como, por ejemplo, MTBE y heptano o tolueno.
La resolución de racemato, es decir, la
enantioselectividad, y la velocidad de reacción pueden también ser
influenciadas a través del tamaño y de la hidrofobicidad de la
porción de ácido. La reacción se efectúa de preferencia a
temperatura ambiente a un pH comprendido entre 6 y 9, de manera
particularmente preferible a un pH comprendido entre 7,0 y 7,4. La
esterasa puede ser empleada en forma de una enzima aislada o
purificada, como células del microorganismo que expresa la
esterasa, como sobrenadante de cultivo, lisado celular o extracto
de dicho organismos, o bien como esterasa inmovilizada. Los
productos de la reacción pueden ser aislados de la solución de
reacción por métodos de separación químicos o físicos conocidos del
experto en la materia. Se puede aislar butinol I esterasa de la
mezcla de la reacción por filtración a través de membrana.
Es posible inmovilizar la esterasa con la ayuda
de poliacrilamida, ácido alginico o carragenanos. Es también
posible enlazar la esterasa covalentemente o bien por adsorción a
vehículos adecuados a través de métodos conocidos. La butinol I
esterasa es inmovilizada de preferencia por liofilización en
diatomita o por precipitación en sulfato de amonio.
De conformidad con lo mencionado arriba, la
butinol I esterasa puede obtenerse a partir de Pseudomonas glumae
Lu 2023. Sin embargo, puede también prepararse a través de
métodos de síntesis de péptidos conocidos.
Además, la butinol I esterasa puede también
obtenerse a partir de organismos eucarióticos o procarióticos, si
dichos organismos expresan butinol 1 esterasa, como por ejemplo
microorganismos que llevan un vector de la invención.
Así, objeto de la invención también son métodos
para la preparación de butinol I esterasa, en los que se cultivan
microorganismos que producen butinol 1 esterasa o un microorganismo
transformado con un vector de la invención, se induce,
opcionalmente, la expresión de butinol I esterasa y la butinol I
esterasa es aislada del cultivo. Los microorganismos pueden
cultivarse y fermentarse empleando métodos conocidos. Por ejemplo,
bacterias pueden ser multiplicadas en medio TB o LB a una
temperatura de 20 a 40ºC y a un pH comprendido entre 6 y 9.
Condiciones de cultivo adecuadas se describen con detalles por
ejemplo, en T. Maniatis, E.F. Fritsch, y J. Sambrook, Molecular
Cloning: A Laboratory Manual [Clonación Molecular: Un Manual de
Laboratorio], Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbar,
NY. 1989).
Después del cultivo, las células son abiertas, y
se obtiene butinol I esterasa a partir del lisado con métodos de
aislamiento de proteína. Las células pueden ser abiertas de
conformidad con lo deseado ya sea por ultrasonido de alta
frecuencia, por alta presión, como por ejemplo en una prensa French,
por ósmosis, por la acción de detergentes, enzimas líticas o bien
solventes orgánicos, por agentes de homogeneización, de preferencia
molinos de perlas de vidrio, o bien por una combinación de dos o
más métodos presentados arriba. Después de la centrifugación, las
proteínas y otras moléculas solubles permanecen en el sobrenadante.
La precipitación del ADN utilizando cloruro de manganeso puede
producir una solución claramente menos viscosa. Las proteínas pueden
ser precipitadas selectivamente utilizando sal ("precipitación
por sales"), por ejemplo sulfato de amonio o fosfato de potasio.
La precipitación puede también ocurrir a través del cambio de pH o
del cambio de temperatura o bien a través de solventes orgánicos
tales como metanol, etanol o acetona. Después de la precipitación
con sal, estas sales pueden ser removidas mediante
diálisis.
diálisis.
Se puede lograr una purificación adicional de
butinol I esterasa mediante la utilización de métodos
cromatográficos conocidos tales como cromatografía con tamices
moleculares (filtración en gel), cromatografía
Q-Sepharose, cromatografía de intercambio de iones
así como cromatografía hidrofóbica, y también mediante la
utilización de otros métodos habituales tales como ultrafiltración,
cristalización y electroforesis en gel nativa.
Los siguientes ejemplos no limitativos ilustran
la invención con mayores detalles con referencia a las figuras
adjuntas en las cuales:
La Figura 1 representa una alineación de
secuencia de una secuencia parcial de aminoácido de acuerdo con la
invención de butinol I esterasa con una secuencia parcial de una
esterasa especifica para lactona de Pseudomonas
fluorescens.
Investigación: secuencia parcial del clon LU2898
de la invención. Sujeto: la secuencia parcial de la enzima P.
fluorescencia (Núm. de Acceso: 0878637).
El punto inicial del tamizado fue la cepa
Pseudomonas (Burkholderia) glumae Lu 8093
producto de lipasa. La lipasa producida por esta cepa hace posible
llevar a cabo numerosas reacciones interesantes (Balkenhohl, F. Y
colaboradores, J. prakt. Chem. 339, (1997),
381-384). Ésteres lácticos, ésteres metilbutiricos y
ésteres fenilacéticos, sin embargo, no son sustratos para la lipasa
y no pueden ser hidrolizados por dicha cepa de ninguna otra
forma.
Los productos de hidrólisis son, sin embargo,
aprovechables como fuentes de carbono. Por consiguiente, se
buscaron mutantes de Lu 8093 que pueden hidrolizar dichos ésteres y
crecer utilizando los productos de hidrólisis como fuente de
carbono. Mutantes con actividad esterasa novedosa deben por
consiguiente ser reconocidos por crecimiento en dichos ésteres.
Condiciones de selección: se cultivó Lu 8093 en
medio durante 16 horas y se cosechó por centrifugación. Las células
fueron lavadas dos veces con solución salina. Se colocaron en placas
10^{6} células en placas de medio mínimo que contenía 0,5 ó 1,0
g/l de fenilacetato de etilo como la única fuente de carbono.
Inicialmente, sin embargo, no se observó crecimiento. Solamente
después de 4 a 6 días pudieron reconocerse colonias individuales.
Su número creció adicionalmente en los días siguientes.
A partir de los mutantes positivos para esterasa
obtenidos de esta forma, se seleccionó el mutante Lu 2023. De
manera sorprendente, la actividad esterasa novedosa fue también
adecuada para hidrólisis selectiva de moléculas orgánicas
relativamente pequeñas. A título de ejemplo, se mostró una
hidrólisis selectiva para éster de butinol.
\vskip1.000000\baselineskip
Para obtener la butinol I esterasa, se cultivó
Pseudomonas glumae Lu 2023 a escala 14-1 y se
cosechó la biomasa activa.
En el laboratorio, Pseudomonas glumae Lu
2023 fue sembrado en placas de agar con medio de sal mineral M12 y
1 g/l de EPA y se incubó a una temperatura de 28ºC durante 36 a 48
horas. Fue después posible almacenar las placas a una temperatura
de 4ºC durante cuatro semanas.
La fermentación de la cepa fue efectuada en un
fermentador Infors xxy 14-1. Para el precultivo, se
inocularon 250 ml de medio con 2 a 3 bucles de Pt y se incubó a 200
revoluciones por minuto a una temperatura de 28ºC durante 24 horas.
El cultivo principal fue efectuado en las condiciones
siguientes:
Temperatura: 28ºC
Alimentación de aire: 7 l/min.
Agitación: 600 revoluciones por minuto
Tiempo de fermentación: aproximadamente 24
horas
Medición integrada de pH y pO_{2}
Medio para precultivo y cultivo principal
15 g/l de autolisado de levadura Springer al
65%
1,6 g/l de sulfato de magnesio x 7 agua
0,02 g/l de cloruro de calcio x 2 de agua
3,5 g/l de dihidrogenfosfato de potasio
3,5 g/l de hidrogenfosfato dipotásico
5 g/l de hidrogenfosfato de diamonio
6 ml de agente anti espuma Pluriol P2000.
\newpage
Los ingredientes mencionados arriba fueron
disueltos en agua desionizada y la solución fue ajustada a pH 6.5
utilizando una solución de amoniaco al 25%. 5 ml/l solución de
elementos menores (trace elements) y 2 g/l de glucosa fueron
filtrados en forma estéril separadamente.
Después de la esterilización y de la terminación
del medio, se introdujo 0,5 g/l de fenilacetato de etilo en el
fermentador. La adición de Pluriol P2000 controló la aparición de
espuma durante la fermentación. La fermentación fue detenida cuando
el pO_{2} en el fermentador se elevó otra vez por el 85%. El
contenido del fermentador fue después centrifugado a una
temperatura inferior a 15ºC y a aproximadamente 9000 a 10000 g, y
se desechó el efluente claro. La masa celular fue congelada a una
temperatura de - 16ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Células de Pseudomonas glumae (Lu 2023)
(100 ml, peso húmedo: 50 g) fueron lisadas en un molino de perlas
de vidrio (100 ml de perlas de vidrio, diámetro: 0,5 mm) a una
temperatura de 4ºC y a 3000 revoluciones por minuto. Después de
centrifugación (10000 revoluciones por minuto, 30 minutos), y
lavado de las perlas de vidrio, el sobrenadante (300 ml) fue
sometido a precipitación en cloruro de manganeso (pH 7 a 7,5;
concentración final: 50 mM). Después de otra centrifugación, el
sobrenadante fue ajustado a pH 8. 0 y se agregó EDTA a una
concentración de 50 mM. Este volumen fue purificado por
cromatografia en Q-Sepharose (300 ml). Después de
aplicar la muestra, la columna fue lavada con 50 mM de Tris/HCl. La
fracción de interés fue recogida y concentrada por ultrafiltración
(100 kDa). Se separó butinol I esterasa de una esterasa no
especifica por cromatografía en tamiz molecular (diámetro: 5 cm,
altura: 90 cm; material: S-300). La fracción activa
obtenida fue turbia y fue concentrada otra vez. La esterasa estaba
evidentemente unida a la membrana. La fracción de membrana fue
primero digerida por una proteasa (tripsina, proporción en peso: 1:
50 a l: 100). Esto provocó que todas las proteínas desaparecieran
de la fracción de membrana aparte de unas pocas bandas en la
electroforesis en gel de poliacrilamida SDS. La actividad fue
conservada.
Dichas bandas estaban separadas entre ellas por
electroforesis en gel nativo (SDS al 0,04%), y un ensayo de
actividad identificó la esterasa en dicho gel nativo. Dicha esterasa
fue eluida a partir del gel y después apareció en forma de una
banda clara en una electroforesis en gel de poliacrilamida SDS de
desnaturalización.
La proteína purificada de esta forma fue
transferida por absorción en una membrana PVDF y secuenciada, o
bien, después de disociación de tripsina, los péptidos fueron
separados por HPLC de fase reversa y secuenciados. Puesto que la
terminal amina de la proteína estaba bloqueada, se obtuvieron
solamente péptidos trípticos. Las diversas secuencias de aminoácido
mostraron homologías débiles con una muconato cicloisomerasa, EC
5.5.1.1, a partir de Acinetobacter iwoffii y Pseudomonas
putidas, y también lactana esterasa de Pseudomonas
fluorescens. El péptido que tiene la secuencia AIDAIFAPEGV
mostró homología con pectina esterasas (EC 3.1.1.11).
El dibujo en la Figura 1 muestra un alineamiento
de secuencia de una secuencia parcial de aminoácidos de la presente
invención con una secuencia parcial de esterasa especifica para
lactona de Pseudomonas fluorescens.
\vskip1.000000\baselineskip
Se emplearon diversos métodos para la
inmovilización.
1. - La butinol 1 esterasa fue sustancialmente
desactivada por precipitación con acetona en presencia de diatomita.
25 mg de proteína fueron mezclados con 3,5 g de diatomita (Merck),
y 1.4 1 de acetona (-20ºC) se agregaron durante 10 minutos. El
soporte cargado fue después removido a través de filtro por succión
de vidrio G3, el residuo de filtro fue lavado con acetona fría y
secado.
2. - La butinol I esterasa no se une a Accurel
(Akzo).
3. - Fue posible inmovilizar butinol 1 esterasa
(2,3 unidades/g, ensayo EPA) en diatomita por liofilización. Para
ese propósito, la solución de enzima fue mezclada con diatomita y
congelada a una temperatura de -80ºC. A continuación, la sustancia
sólida fue secada por liofilización.
4. - Butinol 1 esterasa (454 multiunidades/g
ensayo EPA) fue inmovilizado por precipitación con sulfato de
amonio. Para este propósito, la enzima fue precipitada a saturación
de 80% de sulfato de amonio en presencia de diatomita.
100 unidades de butinol I esterasa reaccionaron
con 20 mmol de butirato de butinol (butirato de
l-metilprop-2-inilo)
en búfer de fosfato (200 ml, 10 mmolar, pH 7,4) con agitación. El
pH fue continuamente medido y mantenido a aproximadamente 7,4 por
adición de una solución de hidróxido de sodio. En los momentos
indicados en la Tabla 1, se tomaron muestras y se extrajo dos veces
con metil terc-butil éter (MTBE), y la fase orgánica
fue analizada por GC (Chiraldex GTA). Se removió la butinol I
esterasa de la mezcla de la reacción por filtración en membrana.
Con su concentración creciente, el enantiómero
de éster menos preferido fue convertido de manera cada vez mayor.
Después de aproximadamente 45 minutos, esto provocó una baja del
exceso de enantiómeros (valor ee) de S butinol en la mezcla de la
reacción.
El valor ee del producto alcanzó su máximo a 84%
(83-97,9%) después de aproximadamente 30 a 40
minutos. El valor ee del sustrato se elevó a más del 99% en el
transcurso de 90 minutos. El ee (exceso de enantiómero) es definido
como la cantidad de enantiómero preferentemente convertido en
porcentaje menos la cantidad del enantiómero menos preferentemente
convertido, en porcentaje. En la mayoría de los casos, esto
corresponde a la pureza óptica. La caída en el pH fue lineal hasta
30 minutos. De aproximadamente 100 minutos en adelante, el cambio
de pH fue insignificante.
Después de la extracción, la actividad esterasa
residual en la fase acuosa siguió siendo de aproximadamente
50%.
\vskip1.000000\baselineskip
La Tabla 1 muestra el exceso de enantiómero
dependiente del tiempo en la conversión de butirato de butinol
utilizando butinol I esterasa. Según la convención R/S por Cahn,
Prelog e Ingold, las configuraciones R y S definen los dos
enantiómeros de una molécula quiral. La conversión es la porción de
éster convertido en la mezcla de la reacción.
100 unidades de butinol I esterasa reaccionaron
con 20 mmol de éster de butinol de búfer de fosfato (200 ml, 10
mmolar, pH 7,4) con agitación. El pH fue medido continuamente y
mantenido a 7,0 por titulación continua. Muestras tomadas fueron
extraídas dos veces con metil terc-butil éter
(MTBE), y la fase orgánica fue analizada por GC (Chiraldex
GTA).
La calidad de la resolución de racemato y la
velocidad de reacción dependieron del tamaño y de la hidrofobicidad
de la porción de ácido. Los mejores sustratos para butinol esterasa
fueron butirato de butinol y metil-butirato de
butinol. Las lipasas son inactivas con estos sustratos. Esto es
también cierto en el caso de ésteres de cadena larga como por
ejemplo n-decanoato de butinilo.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La Tabla 2 muestra el exceso de enantiómero en
la conversión de ésteres con la butinol I esterasa en dependencia
de la porción de ácido del éster convertido.
\vskip1.000000\baselineskip
10 mmoles de rac-butinol y 5
mmoles de butirato de vinilo fueron disueltos en 50 ml de metil
terc-butil éter (MTBE) y mezclados con 9 unidades
de butinol I esterasa (3.3 g) soportadas en diatomita, y la mezcla
fue agitada a temperatura ambiente durante 24 horas. Después de la
filtración, el solvente fue removido y la mezcla del producto fue
caracterizada por GC.
A una conversión de 47%, permanecieron
(R)-butinol (18% de ee) y butirato de
(S)-butinol (45% de ee).
En metil isobutil cetona, se obtuvieron
(R)-butinol con 16% de ee y butirato de
(S)-butinol con 52% de ee a una conversión del
43%.
La Tabla 3 muestra el exceso de enantiómero en
la conversión de ésteres con la butinol I esterasa en dependencia
de la porción de ácido del éster convertido.
\vskip1.000000\baselineskip
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(Tabla pasa a página
siguiente)
<110> BASF Aktiengesellschaft
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Butinol I Esterasa
\vskip0.400000\baselineskip
<130> M/42107 Butinol 1 Esterasa
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1530
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pseudomonas glumae LU
2023
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(1530)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 510
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pseudomonas glumae LU
2023.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pseudomonas glumae LU
2023
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm13
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Pseudomonas glumae LU
2023
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 4
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Pseudomonas glumae LU
2023
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pseudomonas glumae LU
2023
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm16
Claims (17)
1. Proteína con actividad butinol I esterasa,
que comprende por lo menos una secuencia parcial de aminoácidos de
conformidad con SEQ ID NO: 3, 4, 5 ó 6, que tiene la facultad para
la hidrólisis enantioselectiva de ésteres butinilo de ácidos
carboxílicos.
2. Proteína con actividad butinol I esterasa
que comprende una secuencia de aminoácidos de conformidad con SEQ
ID NO: 2, o una secuencia de aminoácidos homóloga a la misma, con un
grado de homología de al menos 60% calculado según el algoritmo de
Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 85 (8), 1988,
2444-2448, la cual tiene la facultad para la
hidrólisis enantioselectiva de ésteres butinilo de ácidos
carboxílicos.
3. Proteína de conformidad con una de las
reivindicaciones precedentes que comprende una cadena polipeptídica
con un peso molecular de aproximadamente 41300 Da.
4. Proteína de conformidad con una de las
reivindicaciones precedentes caracterizada porque puede
obtenerse a partir de Pseudomonas glumae Lu 2023 con número
de depósito DSM 13176.
5. Proteína de conformidad con una de las
reivindicaciones precedentes caracterizada porque
adicionalmente cataliza por lo menos una de las reacciones
siguientes:
a) hidrólisis enantioselectiva de ésteres
ópticamente activos de la fórmula I
(I)R^{1}-COO-R^{2}
en
donde
R^{1} es un alquilo
C_{1}-C_{10}, alquenilo
C_{2}-C_{10}, alquinilo
C_{2}-C_{10}, de cadena recta o ramificada,
insustituido o monosustituido o polisustituido y R^{2} es un
alquilo C_{1}-C_{10}, alquenilo
C_{2}-C_{10}, alquinilo
C_{2}-C_{10}, aralquilo
C_{7}-C_{15}, de cadena recta o ramificado,
insustituido o monosustituido o polisustituido o un radical
aromático mononuclear o polinuclear, insustituido o monosustituido
o polisustituido,
R^{1} y/o R^{2} comprenden por lo menos un
átomo de carbono asimétrico; y
\vskip1.000000\baselineskip
b) transesterificación enantioselectiva de un
éster de la fórmula 1 con un alcohol ópticamente activo
de la fórmula II
R^{2}-OH
(II),
en donde R^{2} tiene uno de los
significados antes mencionados y, opcionalmente, tiene por lo menos
un átomo de carbono
asimétrico.
6. Polinucleótido, que codifica para una
proteína de conformidad con una de las reivindicaciones precedentes,
y las secuencias que la hibridan en condiciones estrictas o
complementarias a la misma, que comprende respectivamente una
secuencia de nucleótidos de por lo menos 30 residuos de nucleótidos
sucesivos en una secuencia de ácido nucleico de conformidad con SEQ
ID NO: 1 o una secuencia de nucleótidos complementaria a la misma de
al menos 30 residuos de nucleótidos sucesivos.
7. Casete de expresión que comprende por lo
menos un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 6
operativamente enlazado a por lo menos una secuencia reguladora de
ácido nucleico.
8. Vector recombinante para transformar un
huésped eucariótico o procariótico, que comprende un polinucleótido
de conformidad con la reivindicación 6, o un casete de expresión de
conformidad con la reivindicación 7.
9. Método para preparar una proteína de
conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 5, en donde un
microorganismo que produce la proteína de manera endógena o un
microorganismo transformado con un vector de conformidad con la
reivindicación 8 es cultivado y la proteína es aislada del
cultivo.
10. Método de conformidad con la reivindicación
9, en donde el microorganismo es pseudomonas glumae Lu 2023
con número de depósito DSM 13176.
11. Proteína que puede ser obtenida de
conformidad con un método según la reivindicación 9 ó 10, que
comprende al menos una secuencia parcial de aminoácidos según SEQID
NO: 3, 4, 5 ó 6, la cual está facultada para la hidrólisis
enantioselectiva de ésteres butinilo de ácidos carboxílicos.
12. Pseudomonas glumae Lu 2023 con número
de depósito DSM 13176 y variantes y mutantes del mismo.
13. Microorganismo caracterizado porque
lleva un vector de conformidad con la reivindicación 8.
14. Método para la hidrólisis enantioselectiva
de éster utilizando una proteína de conformidad con una de las
reivindicaciones 1 a 5, en donde
a) la proteína se pone en contacto con una
mezcla de estereoisómeros de un éster ópticamente activo de la
fórmula I; y
b) los compuestos ópticamente activos que
provienen de la hidrólisis estereoselectiva de uno de los
estereoisómeros y/o el enantiómero de éster no hidrolizado se
obtienen a partir del medio de la reacción.
15. Un método para la transesterificación
enantioselectiva, en donde
a) una mezcla de estereoisómeros de un alcohol
ópticamente activo de la fórmula II se pone en contacto con un
éster de la fórmula I en presencia de una proteína según una de las
reivindicaciones 1 a 5 y el estereoisómero de alcohol sin
reaccionar es obtenido del medio de la reacción; o
b) una mezcla de estereoisómeros de un éster
ópticamente activo de la fórmula I se pone en contacto con un
alcohol de la fórmula II en presencia de una proteína de conformidad
con una de las reivindicaciones 1 a 5 y un estereoisómero del
alcohol ópticamente activo contenido en el éster es obtenido a
partir del medio de la reacción.
16. Un método de conformidad con la
reivindicación 15, en donde un éster de vinilo se utiliza para la
transesterificación como agente de acilación para un alcohol
ópticamente activo.
17. Un método de conformidad con una de las
reivindicaciones 14, 15 ó 16, en donde el medio de la reacción
utilizado es un solvente orgánico.
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