ES2333201T3

ES2333201T3 - Butinol 1 esterasa.

Info

Publication number: ES2333201T3
Application number: ES01962989T
Authority: ES
Inventors: Bernhard Hauer; Thomas Friedrich; Christoph Nubling; Rainer Sturmer; Wolfgang Ladner
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 2000-08-31
Filing date: 2001-08-30
Publication date: 2010-02-18
Anticipated expiration: 2021-08-30
Also published as: WO2002018560A3; RU2333958C2; MXPA03001333A; RU2412996C2; ATE445702T1; WO2002018560A2; US8008051B2; US20050181472A1; CN1449447A; JP2004507268A; CN100379867C; EP1313860B1; AU8404701A; DE50115182D1; CA2419275A1; US20100196970A1; AU2001284047B2; EE200300086A; JP5398943B2; RU2008114032A

Abstract

Proteína con actividad butinol I esterasa, que comprende por lo menos una secuencia parcial de aminoácidos de conformidad con SEQ ID NO: 3, 4, 5 ó 6, que tiene la facultad para la hidrólisis enantioselectiva de ésteres butinilo de ácidos carboxílicos.

Description

Butinol 1 esterasa.

La presente invención se refiere a proteínas novedosas de Pseudomonas glumae, que tienen una actividad esterasa, en particular una actividad butinol 1 esterasa, a secuencias de ácido nucleico que las codifican, a casetes de expresión, vectores y microorganismos recombinantes; a métodos para preparar tales proteínas y al uso de las mismas para la hidrólisis enzimática de éster, en particular enzimática enantioselectiva, o bien transesterificación de ésteres orgánicos.

Las esterasas y las lipasas son hidrolasas que pueden ser empleadas en procesos industriales para sintetizar compuestos orgánicos ópticamente activos y que son caracterizadas por alta especificidad para sustrato. A través de un mecanismo similar al mecanismo de serina proteasas, puede transferir grupos acilo a nucleófilos, como por ejemplo grupos carbonilo, o bien disociar hidrolíticamente enlaces éster. Las esterasas, lipasas y serina proteasas comparten la triada catalítica, un motivo de secuencia que consiste de los aminoácidos Ser, His y Asp, en donde el átomo de carbono de carbonilo es sometido a ataque nucleofílico por el Ser activo, que, con participación de los demás dos aminoácidos lleva a una distribución de carga. Las esterasas y lipasas pueden también transferir grupos acilo a otros nucleófilos, como por ejemplo grupos tio de un éter tio o aminas activadas.

Las lipasas hidrolizan los ésteres de glicerina de cadena larga y se caracterizan por activación superficial, es decir, el sitio activo se vuelve accesible solamente en presencia de sustrato de lípidos. Las lipasas son estables en solventes orgánicos no acuosos y se emplean en numerosos procesos industriales para resolución cinética de racemato, es decir, un enantiómero es convertido sustancialmente más rápidamente que el otro. Dicho enantiómero puede ser obtenido a continuación a de la solución de reacción debido a propiedades físicas y químicas diferentes.

Nakamura (Nakamura, K y colaboradores, Tetrahedron; Asymmetry 9, (1999), 4429-4439) describe la resolución de racemato de 1-alquin-3-ol por transesterificación en solventes hidrofóbicos con ayuda de lipasas comercialmente disponibles (Amano AK, AH y PS; Amano Pharmaceuticals Co. Ltd.). En esta reacción, la enantioselectividad se eleva con la longitud de cadena del donador de acilo y residuos estéricamente grandes (acetato de cloro, benzoato de vinilo) tienen un efecto negativo sobre la reacción. Yang (Yang, H. y colaboradores, J. Org. Chem. 64, (1999), 1709-1712) describe la preparación enantioselectiva de ácidos ópticamente activos por transesterificación con ésteres de vinilo empleando lipasa B de Cándida antártica como catalizador. En este caso, los ésteres de etilo llevan a una velocidad de reacción claramente más baja y a una menor selectividad. Una lipasa aislada de Burkholderia plantarii (Pseudomonas plantarii o glumae) DSM 6535 se emplea para la acilación enantioselectiva de aminas racémicas con ayuda de etil metoxi-acetato (Balkenhohl, F. y colaboradores J. prakt. Chem. 339, (1997), 381-384).

Las esterasas catalizan enantioselectivamente la formación y ruptura de enlaces éster (reacción directa y reversa). Se prefiere utilizar los ésteres de vinilo en la transesterificación para obtener alcoholes ópticamente activos, puesto que la función alcohol del éster ya no está disponible después de la conversión debido a la tautomerización del aldehído o cetona y por consiguiente se puede evitar la reacción reversa. En contraste a las lipasas, las esterasas no son activadas superficialmente y convierten también los compuestos orgánicos de cadena relativamente corta. Esterasas de especificidad para sustrato diferente han sido aisladas de varios organismos.

Así, la esterasa de Pseudocardia thermophila FERM-BP-6273 se utiliza para hidrolizar ésteres cromano-acéticos ópticamente activos (EP-A-O 892 044).

Una esterasa de Bacillus acidocaldarius hidroliza ésteres de baja enantioselectividad de un rango estrecho de sustratos (Manco, G. y colaboradores, Biochem. J. 332, (1998), 203-212).

La acilasa 1 de Aspergillus se emplea para obtener alcoholes secundarios por transesterificación con ésteres de vinilo en solventes orgánicos no polares, y se prefiere la conversión de alcoholes secundarios que tienen cadenas laterales cortas (Faraldos, J. y colaboradores, Synlett 4, (1997), 367-370). A partir de Pseudomonas fluorescens DSM 50 106 se ha clonado una esterasa específica para lactona unida a membrana (Khalameyzer, V. y colaboradores, Appl. y Environ. Microbiol. 65 (2), (1999), 477-482), y a partir del mutante Q de E. coli una acetilesterasa (Peist, R. y colaboradores, J. Bacteriol. 179, (1997), 7679-7686). Sin embargo, la enantioselectividad y la especificidad para sustrato de estas dos esterasas no han sido estudiadas con más detalles. Rhodococcus sp. NCBM 11216 expresa 4 esterasas, RR1 a RR4, que tienen una especificidad diferente. Para la síntesis de éster a partir de un naftol y un ácido, RRl y RR2 prefieren ácidos con cadenas de carbono cortas, mientras que RR3 y RR4 convierten específicamente ácidos que tienen cadenas de carbono relativamente largas y residuos estéricamente relativamente grandes (Gudelj, M. y colaboradores, J. Mol. Cat. B, Enzymatic 5, (1998), 261-266).

Krebsfänger, N. y colaboradores, describen en Enyzme Microb. Technol., 1998, V. 2, 641-646 el aislamiento de una esterasa a partir de Pseudomonas fluorescens.

Sin embargo, esterasas que tienen una amplia gama de sustratos y una alta enantioselectividad y que pueden emplearse en procesos industriales no están disponibles para preparar pequeñas moléculas orgánicas, como por ejemplo alcoholes ópticamente activos, ácidos o ésteres con cadenas de carbono cortas. Es un objeto de la presente invención el suministro de esterasas que tienen por lo menos una de las propiedades mencionadas arriba.

Este objeto se resuelve, sorprendentemente, proporcionando una proteína que tiene actividad butinol I esterasa, que abarca por lo menos una secuencia de parte de aminoácidos de conformidad con SEQ ID NO: ID NO: 3, 4, 5 ó 6:

a)	FIETLGLERPVLVGHSLGGAIALAVGLDYPER	(SEQ ID NO: 3),

b)	IALIAPLTHTETEP	(SEQ. ID NO: 4),

c)	GGGMMGLRPEAFYAASSDLV	(SEQ. ID NO: 5)

d)	AIDAIFAPEPV	(SEQ. ID NO: 6)

(cada una proporcionada en el código de una letra para aminoácidos, el primer aminoácido en cada caso corresponde al extremo amino-terminal respectivo),

El objeto se logró en particular proporcionando una butinol I esterasa según la reivindicación 2 que comprende una secuencia de aminoácidos de conformidad con SEQ ID NO: 2 25 o bien que es codificada por una secuencia de ácido nucleico de conformidad con SEQ ID NO: 1.

Para mayor simplicidad, de aquí en adelante las proteínas mencionadas arriba se denominan butinol I esterasas.

Los "equivalentes funcionales" o análogos de los polipéptidos o proteínas divulgados específicamente son para propósitos de la presente invención polipéptidos o proteínas que difieren de ellos pero siguen teniendo la actividad enzimática definida en las reivindicaciones de patente, así como las características estructurales definidas en las reivindicaciones de patente.

Tales "equivalentes funcionales" de conformidad con la presente invención se refieren particularmente a mutantes que tienen en por lo menos una de las posiciones de secuencia de SEQ ID NO:2 un aminoácido que difiere del aminoácido específicamente mencionado pero sin embargo tiene por lo menos una de las actividades biológicas de la invención. Los "equivalentes funcionales" comprenden por consiguiente los mutantes disponibles por uno o más adiciones, sustituciones, deleciones y/o inversiones de aminoácidos, y es posible que tales modificaciones ocurran en cualquier posición de secuencia en la medida en que llevan a un mutante que tiene el perfil de propiedades de la inversión. Una equivalencia funcional existe en particular también cuando existe una correlación cualitativa entre el mutante y un polipéptido no modificado en el patrón de reactividad, es decir, existen diferencias en cuanto a la velocidad de conversión de sustratos idénticos, por ejemplo.

Tales "equivalentes funcionales" abarcan también naturalmente polipéptidos que pueden obtenerse a partir de otros organismos, y variantes que ocurren naturalmente. Por ejemplo, regiones de secuencias homólogas pueden encontrarse mediante comparación de secuencias, y enzimas equivalentes pueden ser determinadas de conformidad con los requerimientos específicos de la invención.

Tales "equivalentes funcionales" comprenden también fragmentos del polipéptido de la invención según SEQ ID NO: 2 que siguen teniendo las características de actividad y estructura reivindicadas.

Tales "equivalentes funcionales" son adicionalmente proteínas de fusión que tienen una de las secuencias de polipéptidos aquí descritas o equivalentes funcionales derivadas de ellas y por lo menos otra secuencia heteróloga, diferente funcionalmente, en vínculo funcional N- o C-terminal (es decir, sin perjuicio funcional mutuo sustancial de las partes de la proteína de fusión). Ejemplos no limitativos de tales secuencias heterólogas son, por ejemplo, péptidos de señal, enzimas, inmunoglobulinas, antígenos superficiales, receptores o ligandos de receptores.

Los "equivalentes funcionales" son de conformidad con la presente invención homólogos de los polipéptidos o proteínas específicamente divulgados. Tienen por ejemplo una homología de por lo menos el 60%, de preferencia por lo menos el 75%, en particular por lo menos el 85%, por ejemplo, 90%, 95% ó 99%, con la secuencia específicamente divulgada según SEQ ID NO:2, de conformidad con lo calculado por el algoritmo de Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. (EUA) 85 (8), 1988, 2444-2448.

Homólogos de las proteínas o polipéptidos de la presente invención pueden ser generados por mutagénesis, por ejemplo por mutación de puntos o contracción de la proteína. El término "homólogo" como se emplea aquí se refiere a una forma variante de la proteína que actúa como agonista o antagonista de la actividad de proteína.

Homólogos de las proteínas de la presente invención pueden ser identificados mediante el tamizado (screening) de bibliotecas de combinación de mutantes como por ejemplo, mutantes truncados.

Es posible, por ejemplo, generar una biblioteca (banco) variada de variantes de proteína mediante mutagénesis de combinación a nivel de ácido nucleico como por ejemplo, por ligación enzimática de una mezcla de oligonucleótidos sintéticos. Existe un gran número de métodos que pueden ser utilizados para producir bibliotecas o bancos de homólogos potenciales a partir de una secuencia de oligonucleótidos degenerada. La síntesis química de una secuencia de gen degenerada puede efectuarse en un sintetizador automático de ADN, y el gen sintético puede ser ligado en un vector de expresión adecuado. El uso de un grupo degenerado de genes hace posible proporcionar todas las secuencias en una mezcla las cuales codifican el lote deseado de secuencias de proteínas potenciales. Métodos para sintetizar oligonucleótidos degenerados se conocen por parte de los expertos en la materia (por ejemplo, Narang, S.A. (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura y colaboradores (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura y colaboradores, (1984) Science 198: 1056; Ike y colaboradores (1983) Nuclelc Acids Res. 11: 477).

Además, pueden emplearse bibliotecas (bancos) de fragmentos del codón de proteína para generar una población variada de fragmentos de proteína para tamizado y para selección subsecuente de homólogos de una proteína de la invención. En una modalidad, una biblioteca de fragmentos de secuencias de codificación puede generarse mediante el tratamiento de un fragmento bicatenario por reacción en cadena de la polimerasa de una secuencia codificadora con una nucleasa en condiciones en las cuales el corte se lleva a cabo solamente aproximadamente una vez por molécula, mediante la desnaturalización del ADN bicatenario, la renaturalización de ADN para formar ADN bicatenario que puede comprender pares de sentido/antisentido de productos cortados diferentes, la remoción de secciones de cadena única de los duplicados recién formados por tratamiento con S1 nucleasa y el ligado de la biblioteca de fragmentos resultante en un vector de expresión, Es posible, a través de este método, derivar una biblioteca de expresión que codifica fragmentos N-terminales, C-terminales e internos que tienen tamaños diferentes de la proteína de la presente invención.

Se conocen varias técnicas en el estado de la técnica para tamizar productos génicos a partir de bibliotecas de combinación que han sido producidas mediante mutaciones de la punta a truncada y para el tamizado de bibliotecas ADNc para productos génicos con una propiedad seleccionada. Estas técnicas pueden ser adaptadas a un tamizado rápido de bibliotecas de genes que han sido generadas por mutagénesis de combinación de homólogos de la invención. Las técnicas más frecuentemente utilizadas para tamizar grandes bibliotecas de genes sometidas a análisis de alto rendimiento comprenden la clonación de la biblioteca de genes en vectores de expresión replicables, la transformación de células adecuadas con la biblioteca de vector resultante y la expresión de los genes de combinación bajo condiciones en las cuales la detección de la actividad requerida facilita el aislamiento del vector que codifica el gen cuyo producto ha sido detectado. La mutagénesis de ensamble recursivo (REM), una técnica que incrementa la frecuencia de mutantes funcionales en las bibliotecas, puede ser utilizada en combinación con pruebas de tamizado para identificar homólogos (Arkin y Yourvan (1992) PNAS 89:7811-7815; Delgrave y colaboradores (1993) Protein Engineering 6(3) :327-331).

En la reivindicación 2 se definen equivalentes funcionales preferidos de acuerdo con la invención y tienen una secuencia que se desvía de SEQ ID NO: 2 en por lo menos una posición, y de preferencia dicha alteración en la secuencia cambia la actividad esterasa solamente de manera insignificante, es decir, en no más que aproximadamente \pm 90,
en particular no más que \pm 50% o no más que \pm 30%. Este cambio puede ser determinado empleando un sustrato de referencia como por ejemplo butirato de butinol bajo condiciones estandarizadas (como por ejemplo, 20 mM de sustrato, 10 mM de amortiguador de fosfato, pH 7.4, T = 20ºC).

Las butinol I esterasas de acuerdo con la invención tienen de preferencia un peso molecular de aproximadamente 40 a 42 kDa, en particular aproximadamente 41.3 kDa, de conformidad con lo determinado por electroforesis en gel SDS. Pueden obtenerse en particular de Pseudomonas glumae Lu 2023 con número de depósito DSM 13176. Otras variantes de cepas son accesibles, por ejemplo, a partir de Pseudomonas glumae Lu 8093 mediante selección, como por ejemplo mediante cultivo en placas de medio mínimo, con fenilacetato de etilo como única fuente de carbono.

La invención incluye también polinucleótidos según la definición en las reivindicaciones de patente adjuntas.

Objeto de la invención son en particular secuencias de ácido nucleico (secuencias de ARN y ADN, mono- o bicatenario, como por ejemplo, cADN y mARN), que codifican para uno de los polipéptidos o proteínas que se mencionaron arriba.

La invención se refiere tanto a moléculas de ácido nucleico aislada que codifican para polipéptidos o bien para proteínas de la invención o secciones biológicamente activas de las mismas, y a fragmentos de ácido nucleico que pueden emplearse, por ejemplo, para su uso como sondas de hibridación o primers para identificar o amplificar ácidos nucleicos codificadores de la invención.

Las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden comprender además secuencias no trasladadas del extremo 3' y/o 5' de la región codificadora del gen.

Una molécula de ácido nucleico "aislada" es separada de otras moléculas de ácido nucleico que están presentes en la fuente natural del ácido nucleico y pueden además estar esencialmente libres de otro material celular o medio de cultivo si es producida por técnicas recombinantes, o bien libre de precursores químicos u otros químicos si se sintetiza químicamente.

Una molécula de ácido nucleico de la presente invención puede ser aislada mediante el uso de técnicas estandarizadas de biología molecular y la información de secuencia proporcionada de conformidad con la presente invención. Por ejemplo, se puede aislar ADNc de una biblioteca de ADNc adecuada empleando una de las secuencias completas específicamente divulgadas o una sección de la misma como sonda de hibridación y técnicas de hibridación estándares (de conformidad con lo descrito, por ejemplo, en Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual [Clonación Molecular: Un Manual de Laboratorio], 2ª Edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbar Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. 1989). Es también posible, que una molécula de ácido nucleico, que comprende una de las secuencias divulgadas o una sección de la misma, sea aislada por reacción en cadena de polimerasa empleando los primers de oligonucleótidos creados con base en esta secuencia. El ácido nucleico amplificado de esta forma puede ser clonado en un vector adecuado y caracterizado por análisis de secuencia de ADN. Los oligonucleótidos de la invención también pueden ser producidos por métodos estándares de síntesis, por ejemplo empleando un sintetizador de ADN automático.

La invención comprende además las moléculas de ácido nucleico que son complementarias de las secuencias de nucleótidos específicamente descritos, o una sección de las mismas, según la definición en la reivindicación 6.

Las secuencias de nucleótidos de la presente invención hacen posible generar sondas y primers que pueden ser utilizados para identificar y/o clonar secuencias homólogas en otros tipos de células y organismos. Tales sondas y primers comprenden habitualmente una región de secuencia de nucleótidos que se hibrida bajo condiciones estrictas en por lo menos aproximadamente 12, de preferencia por lo menos aproximadamente 25, como por ejemplo, 40, 50 ó 75 nucleótidos consecutivos de una cadena de sentido ("sense") de una secuencia de ácido nucleico de la presente invención o una cadena de antisentido ("antisense") correspondiente.

Secuencias de ácido nucleico adicionales de la presente invención son derivadas de SEQ ID NO: 1 y difieren de dicha secuencia por adición, sustitución, inserción o deleción de uno o varios nucleótidos, pero siguen codificando para proteínas con la actividad de butinol I esterasa de la presente invención dentro del rango de variación mencionado arriba en actividad enzimática.

La presente invención abarca también secuencias de ácido nucleico que comprenden lo que se conoce como mutaciones silenciosas o bien son modificadas, en comparación con una secuencia mencionada específicamente, según la utilización de codón de una fuente especial u organismo huésped, así como variantes que ocurren naturalmente como por ejemplo variantes de empalme o variantes alélicas de las mismas. También son objeto secuencias que pueden obtenerse por sustituciones conservadoras de nucleótidos (es decir, el aminoácido relevante es reemplazado por un aminoácido con la misma carga, tamaño, polaridad y/o solubilidad).

También son objeto de la invención moléculas derivadas de los ácidos nucleicos específicamente divulgados a través de polimorfismo de secuencia. Estos polimorfismos genéticos pueden existir debido a la variación natural entre individuos en una población. Estas variaciones naturales resultan normalmente en una variación de 1 a 5% en cuanto a la secuencia de nucleótidos de un gen.

Los polinucleótidos de la invención pueden encontrarse mediante inspección sistemática de bibliotecas genómicas o de ADNc y opcionalmente pueden multiplicarse a partir de ahí a través de reacción en cadena de polimerasa empleando primers adecuados y después, por ejemplo, pueden ser aislados con sondas adecuadas. Otra posibilidad es transformar microorganismos adecuados con polinucleótidos o vectores de la invención, multiplicar los microorganismos y por consiguiente los polinucleótidos, y después aislarlos. Una posibilidad adicional es sintetizar polinucleótidos de la invención por vías químicas.

La propiedad de poder "hibridar" en polinucleótidos se refiere a la capacidad de un polinucleótido o de un oligonucleótido para enlazarse en condiciones estrictas con una secuencia casi complementaria, mientras que en estas condiciones no exista ningún enlace no especifico entre las partes no complementarias. Para este propósito, las secuencias deben tener una complementariedad de 70-100%, de preferencia de 90-100%. La propiedad de secuencias complementarias de unirse específicamente entre sí se aprovecha, por ejemplo, en la técnica Northen blot o Southern blot o bien en reacción en cadena de polimerasa o RT-PCR en el caso de enlace de primers. Oligonucleótidos con una longitud de 30 pares de bases o más se emplean normalmente para este propósito. Condiciones estrictas significan, por ejemplo, en la técnica Northern blot el uso de una solución de lavado, de preferencia por ejemplo búfer 0,1xSSC con SDS al 0.1% (20x SSC: NaCl de 3M, citrato de Na de 0,3M, pH 7,0) caliente a 50 - 70ºC, preferiblemente 60-65ºC, para eluir sondas de ADNc no específicamente hibridadas u oligonucleótidos. En este caso, de conformidad con lo mencionado arriba, solamente ácidos nucleicos con un alto grado de comp1ementariedad permanecen unidos entre sí. El establecimiento de condiciones estrictas es conocido de los expertos en la materia y se describe, por ejemplo, en Ausubel y colaboradores, Current Protocols in Molecular Biology [Protocolos Actuales en Biología Molecular], John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6.

También son objeto de la invención casetes de expresión que incluyen por lo menos un polinucleótido de conformidad con la presente invención enlazado operativamente con secuencias de ácido nucleico reguladoras. De preferencia, una secuencia de promotor se localiza 5' corriente arriba del polinucleótido de la invención y facilita de esta manera una expresión controlada de la butinol 1 esterasa. De manera particularmente preferible, una secuencia de terminador y también opcionalmente, elementos reguladores habituales adicionales se localizan 3' corriente abajo del polinucleótido de la presente invención, cada uno de ellos está enlazado operativamente con la secuencia que codifica butinol 1 esterasa. Un enlace operativo significa el arreglo secuencial de promotor, secuencia codificadora, terminador y, opcionalmente, otros elementos reguladores de tal manera que cada uno de los elementos reguladores pueda cumplir su función antes, durante o después de la expresión de la secuencia codificadora como se contempla. Ejemplos de secuencias adicionales operativamente enlazables son secuencias de enfoque y también amplificadores de traducción, realzadores, señales de poliadenilación y similares. Elementos reguladores útiles adicionales incluyen marcadores seleccionables, geles reportero, señales de amplificación, orígenes de replicación y similares.

Además de las secuencias de regulación artificiales, la secuencia de regulación natural todavía puede estar presente delante del gen estructural actual. Por medio de modificación genética es posible, opcionalmente, eliminar dicha regulación natural e incrementar o disminuir la expresión de los genes. Sin embargo, la construcción del casete de expresión puede también ser más simple, es decir que no se insertan señales reguladoras adicionales delante del gen estructural, y no es removido el promotor natural con su regulación. En lugar de esto, la secuencia reguladora natural es mutada de tal manera que la regulación ya no se efectúe y la expresión génica es incrementada o disminuida. Las secuencias de ácido nucleico pueden estar presentes en una o varias copias del casete de expresión.

Ejemplos de promotores útiles son: promotor cos, tac, trp, tet, trp- tet, lpp, lac, lpp-lac, laclq, T7, T5, T3, gal, trc, ara, SP6, I-PR o 1-PL, los cuales se utilizan de manera provechosa en bacterias Gram negativas; y también los promotores Gram positivos amy y SPO2, los promotores de levadura ADC1, MFa, AC, P-60, CYCl, GAPDH o bien los promotores vegetales CaMV/35S, SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, nos o bien el promotor de ubiquitina o promotor de faseolina. Se da preferencia particular a la utilización de promotores inducibles como por ejemplo promotores inducibles por la luz y particularmente promotores inducibles por la temperatura tales como el promotor P_{r}P_{1}.

En principio es posible utilizar todos los promotores naturales con sus secuencias reguladoras. Además, es también provechoso y posible utilizar promotores sintéticos.

Las secuencias reguladoras deben facilitar la expresión específica de las secuencias de ácido nucleico y la expresión de proteína. Según el organismo huésped, esto puede significar, por ejemplo, que el gen es expresado o sobre-expresado solamente después de inducción, o bien que es expresado y/o sobre-expresado inmediatamente.

En este contexto, es posible que las secuencias reguladoras o factores tengan una influencia positiva y por consiguiente incrementen o disminuyan la expresión. Por consiguiente, los elementos reguladores pueden ser incrementados provechosamente a nivel de transcripción mediante la utilización de señales de transcripción fuertes tales como promotores y/o realzadores ("enhancer"). Aparte de esto, sin embargo, es también posible incrementar la traslación, por ejemplo incrementando la estabilidad del ARNm.

Un casete de expresión de la presente invención es producido por la fusión de un promotor adecuado con un polinucleótido adecuado que codifica butinol I esterasa y también con un terminador o señal de poliadenilación. Para este propósito, se utilizan técnicas de recombinación y clonación habituales tales como las descritas, por ejemplo, en T. Maniatis, E.F. Fritsch y J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual [Clonación Molecular: Un Manual de Laboratorio], Cold Spring Harbar Laboratory, Cold Spring Harbar, NY (1989) y también en T. J. Silhavy, M.L. Berman y L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions [Experimentos con Fusiones de Genes], Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) y en Ausubel, F.M. y colaboradores, Current Protocols in Molecular Biology [Protocolos Actuales en Biología Molecular], Greene Publishing Assoc. y Wiley Interscience (1987).

Objeto de la invención son también vectores recombinantes para transformar huéspedes eucarióticos y procarióticos que llevan un polinucleótido de la invención o un casete de expresión de la invención. Tales vectores permiten la expresión de butinol 1 esterasa en un organismo huésped adecuado. Vectores son bien conocidos por parte de expertos en la materia y pueden encontrarse, por ejemplo, en "Cloning Vectors" [Vectores de Clonación] (Pouwels P. H. Y colaboradores, eds., Elsevier, Ámsterdam-Nueva York-Oxford, 1985). Por vectores se entienden, además de plásmidos, también a todos los demás vectores conocidos por parte de los expertos en la materia como por ejemplo, fagos, virus tales como SV40, CMV, baculovirus y adenovirus, transposones, elementos IS fásmidos, cósmidos, así como ADN lineal o circular. Estos vectores pueden ser replicados autónomamente o bien de manera cromosomática en el organismo huésped.

Con la ayuda de los vectores de la invención es posible producir microorganismos recombinantes que, por ejemplo, han sido transformados con por lo menos un vector de la invención y pueden emplearse para la producción de esterasa recombinante. De manera provechosa, los casetes de expresión recombinante de la presente invención descritos arriba son introducidos como parte de un vector de expresión a un sistema huésped adecuado, y expresados. Se da preferencia aquí a métodos corrientes de clonación y transfección conocidos por parte de los expertos en la materia, para expresar dichos ácidos nucleicos en el sistema de expresión respectivo. Sistemas adecuados se describen, por ejemplo, en Current Protocols in Molecular Biology [Protocolos Actuales en Biología Molecular], F. Ausubel y colaboradores, eds., Wiley Interscience, Nueva York 1997.

Organismos huéspedes adecuados para transformación con vectores de la invención son en principio todos los organismos que facilitan la expresión de los polinucleótidos de la presente invención, de sus variantes alélicas, sus equivalentes funcionales o derivados de los mismos. Organismos huéspedes se refieren, por ejemplo, a bacterias, hongos, levaduras, células vegetales o animales. Los organismos preferidos son bacterias tales como las bacterias de los géneros Escherichia como por ejemplo, Escherichia coli, streptomyces, Bacillus o Pseudomonas, microorganismos eucarióticos, como por ejemplo Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus, células eucarióticas superiores de animales o plantas, por ejemplo células Sf9 o CHO. Organismos exitosamente transformados pueden ser seleccionados a través de genes marcadores también contenidos en el vector o en el casete de expresión. Ejemplos de tales genes marcadores son genes para la resistencia a los antibióticos y para enzimas que catalizan una reacción de tinción que provoca la tinción de las células transformadas. Tales células pueden ser seleccionadas a través de una clasificación automática de células. Organismos que han sido exitosamente transformados con un vector y que llevan un gen apropiado de resistencia a los antibióticos pueden seleccionarse por medios o sustratos que contienen los antibióticos apropiados. Proteínas marcadoras presentadas en la superficie de las células pueden ser utilizadas para selección por medio de cromatografía de afinidad.

Así, también son objeto de la invención microorganismos que llevan un vector de la invención y también a mutante de Pseudomonas glumae, Lu 2023, con número de depósito DSM 13176, que expresa de manera endógena butinol 1 esterasa. Las butinol 1 esterasas de la presente invención en particular catalizan por lo menos una de las reacciones siguientes:

a) hidrólisis enantioselectiva de ésteres ópticamente activos de la fórmula I

(I),R^{1}-COO-R^{2}

en donde R^{1} es un alquilo C_{1}-C_{10}, alquenilo C_{2}-C_{10}, alquinilo C_{2}-C_{10} de cadena recta o ramificada, insustituido, monosustituido o polisustituido, y R^{2} es alquilo C_{1}-C_{10}, alquenilo C_{2}-C_{10}, alquinilo C_{2}-C_{10,} aralquilo C_{7}-C_{15} de cadena recta o ramificado, insustituido, monosustituido o polisustituido, o bien un radical aromático mononuclear o polinuclear, insustituido o monosustituido,

R^{1} y/o R^{2} comprenden por lo menos un átomo de carbono asimétrico,

en donde de manera particularmente preferible o bien el átomo de carbono de R unido al átomo de carbono de enlace éster o bien el átomo de carbono de R2 unido al oxigeno de enlace de éster es un átomo de carbono asimétrico; y

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b) transesterificación enantioselectiva de un éster de la fórmula I con un alcohol ópticamente activo de la fórmula II

(II),R^{2}-OH

en donde R^{2} tiene uno de los significados antes mencionados y, opcionalmente tiene por lo menos un átomo de carbono asimétrico,

en donde de manera particularmente preferible el átomo de carbono que lleva el grupo OH es un átomo de carbono asimétrico.

También son objeto de la invención métodos para la hidrólisis enantioselectiva de ésteres utilizando una butinol I esterasa definida en las reivindicaciones de patente, donde la butinol I esterasa entra en contacto con una mezcla de estereoisómeros de un éster ópticamente activo de la fórmula I y los compuestos ópticamente activos que provienen de la hidrólisis estereoselectiva de uno de dos estereoisómeros y/o el enantiómero de éster no hidrolizado se obtienen a partir del medio de la reacción. Sin embargo, es también posible que el butinol I esterasa hidrolice los ésteres de la fórmula I que no son ópticamente activos.

También son objeto de la invención métodos para la transesterificación enantioselectiva, en los que una mezcla estereoisomérica de un alcohol ópticamente activo de la fórmula II entra en contacto con un éster de la fórmula I en presencia de una butinol I esterasa definida en las reivindicaciones de patente, y el estereoisómero de alcohol sin reaccionar es obtenido a partir del medio de la reacción; o bien, una mezcla de estereoisómeros de un éster ópticamente activo de la fórmula I entra en contacto con un alcohol de la fórmula II en presencia de la butinol I esterasa, y se obtiene un estereoisómero del alcohol ópticamente activo contenido en el éster a partir del medio de la reacción. Se utilizan de preferencia ésteres de vinilo en la transesterificación como agentes de acilación para un alcohol ópticamente activo. Esto es de provecho puesto que después de la conversión la función alcohol del éster vinilo ya no está disponible para la reacción reversa debido a tautomerización. La butinol I esterasa cataliza también los procesos de transesterificación en los cuales ni el éster ni el alcohol son ópticamente activos.

Sustratos preferidos para la hidrólisis de éster son ésteres del etanol, del propanol, del butanol y, de manera particularmente preferible, ésteres de butinilo (ésteres de butinol, ésteres del 1-metilprop-2-inol) con ácidos carboxilicos tales como, por ejemplo, ácido acético, ácido propanoico, ácido butírico, ácido pentanoico, ácido hexanoico, ácido heptanoico, ácido octanoico ácido láctico, ácido 2-etilhexanoico, ácido 3-metilbutirico, ácido metoxiacético, ácido 2-metilpropiónico, ácido 2-butenoico, ácido 3-cloropropiónico y ácido 2-metilpentanoico. Se prefieren particularmente éster de ácido butírico (butirato de butinilo) y éster butinilo de ácido metilbutírico (metilbutirato de butinilo).

Alcoholes preferidos en la transesterifieación son etanol, propanol y butano, de manera particularmente preferida butinol.

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Los ésteres preferidos en la transesterificación son ésteres de vinilo tales como, por ejemplo, acetato de vinilo, propionato de vinilo y butirato de vinilo.

Los medios de reacción utilizados en los métodos antes mencionados son solventes orgánicos como por ejemplo, alcanos, éteres, tolueno, dioxano, metil isobutil cetona, metil terc-butil éter (MTBE) y similares. En la hidrólisis de ésteres, también pueden emplearse mezclas elaboradas a partir de la solución búfer utilizada y de solventes orgánicos como, por ejemplo, MTBE y heptano o tolueno.

La resolución de racemato, es decir, la enantioselectividad, y la velocidad de reacción pueden también ser influenciadas a través del tamaño y de la hidrofobicidad de la porción de ácido. La reacción se efectúa de preferencia a temperatura ambiente a un pH comprendido entre 6 y 9, de manera particularmente preferible a un pH comprendido entre 7,0 y 7,4. La esterasa puede ser empleada en forma de una enzima aislada o purificada, como células del microorganismo que expresa la esterasa, como sobrenadante de cultivo, lisado celular o extracto de dicho organismos, o bien como esterasa inmovilizada. Los productos de la reacción pueden ser aislados de la solución de reacción por métodos de separación químicos o físicos conocidos del experto en la materia. Se puede aislar butinol I esterasa de la mezcla de la reacción por filtración a través de membrana.

Es posible inmovilizar la esterasa con la ayuda de poliacrilamida, ácido alginico o carragenanos. Es también posible enlazar la esterasa covalentemente o bien por adsorción a vehículos adecuados a través de métodos conocidos. La butinol I esterasa es inmovilizada de preferencia por liofilización en diatomita o por precipitación en sulfato de amonio.

De conformidad con lo mencionado arriba, la butinol I esterasa puede obtenerse a partir de Pseudomonas glumae Lu 2023. Sin embargo, puede también prepararse a través de métodos de síntesis de péptidos conocidos.

Además, la butinol I esterasa puede también obtenerse a partir de organismos eucarióticos o procarióticos, si dichos organismos expresan butinol 1 esterasa, como por ejemplo microorganismos que llevan un vector de la invención.

Así, objeto de la invención también son métodos para la preparación de butinol I esterasa, en los que se cultivan microorganismos que producen butinol 1 esterasa o un microorganismo transformado con un vector de la invención, se induce, opcionalmente, la expresión de butinol I esterasa y la butinol I esterasa es aislada del cultivo. Los microorganismos pueden cultivarse y fermentarse empleando métodos conocidos. Por ejemplo, bacterias pueden ser multiplicadas en medio TB o LB a una temperatura de 20 a 40ºC y a un pH comprendido entre 6 y 9. Condiciones de cultivo adecuadas se describen con detalles por ejemplo, en T. Maniatis, E.F. Fritsch, y J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual [Clonación Molecular: Un Manual de Laboratorio], Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbar, NY. 1989).

Después del cultivo, las células son abiertas, y se obtiene butinol I esterasa a partir del lisado con métodos de aislamiento de proteína. Las células pueden ser abiertas de conformidad con lo deseado ya sea por ultrasonido de alta frecuencia, por alta presión, como por ejemplo en una prensa French, por ósmosis, por la acción de detergentes, enzimas líticas o bien solventes orgánicos, por agentes de homogeneización, de preferencia molinos de perlas de vidrio, o bien por una combinación de dos o más métodos presentados arriba. Después de la centrifugación, las proteínas y otras moléculas solubles permanecen en el sobrenadante. La precipitación del ADN utilizando cloruro de manganeso puede producir una solución claramente menos viscosa. Las proteínas pueden ser precipitadas selectivamente utilizando sal ("precipitación por sales"), por ejemplo sulfato de amonio o fosfato de potasio. La precipitación puede también ocurrir a través del cambio de pH o del cambio de temperatura o bien a través de solventes orgánicos tales como metanol, etanol o acetona. Después de la precipitación con sal, estas sales pueden ser removidas mediante
diálisis.

Se puede lograr una purificación adicional de butinol I esterasa mediante la utilización de métodos cromatográficos conocidos tales como cromatografía con tamices moleculares (filtración en gel), cromatografía Q-Sepharose, cromatografía de intercambio de iones así como cromatografía hidrofóbica, y también mediante la utilización de otros métodos habituales tales como ultrafiltración, cristalización y electroforesis en gel nativa.

Los siguientes ejemplos no limitativos ilustran la invención con mayores detalles con referencia a las figuras adjuntas en las cuales:

La Figura 1 representa una alineación de secuencia de una secuencia parcial de aminoácido de acuerdo con la invención de butinol I esterasa con una secuencia parcial de una esterasa especifica para lactona de Pseudomonas fluorescens.

Investigación: secuencia parcial del clon LU2898 de la invención. Sujeto: la secuencia parcial de la enzima P. fluorescencia (Núm. de Acceso: 0878637).

Ejemplo 1 Selección de mutante de Pseudomonas glumae que expresa butinol 1 esterasa

El punto inicial del tamizado fue la cepa Pseudomonas (Burkholderia) glumae Lu 8093 producto de lipasa. La lipasa producida por esta cepa hace posible llevar a cabo numerosas reacciones interesantes (Balkenhohl, F. Y colaboradores, J. prakt. Chem. 339, (1997), 381-384). Ésteres lácticos, ésteres metilbutiricos y ésteres fenilacéticos, sin embargo, no son sustratos para la lipasa y no pueden ser hidrolizados por dicha cepa de ninguna otra forma.

Los productos de hidrólisis son, sin embargo, aprovechables como fuentes de carbono. Por consiguiente, se buscaron mutantes de Lu 8093 que pueden hidrolizar dichos ésteres y crecer utilizando los productos de hidrólisis como fuente de carbono. Mutantes con actividad esterasa novedosa deben por consiguiente ser reconocidos por crecimiento en dichos ésteres.

Condiciones de selección: se cultivó Lu 8093 en medio durante 16 horas y se cosechó por centrifugación. Las células fueron lavadas dos veces con solución salina. Se colocaron en placas 10^{6} células en placas de medio mínimo que contenía 0,5 ó 1,0 g/l de fenilacetato de etilo como la única fuente de carbono. Inicialmente, sin embargo, no se observó crecimiento. Solamente después de 4 a 6 días pudieron reconocerse colonias individuales. Su número creció adicionalmente en los días siguientes.

A partir de los mutantes positivos para esterasa obtenidos de esta forma, se seleccionó el mutante Lu 2023. De manera sorprendente, la actividad esterasa novedosa fue también adecuada para hidrólisis selectiva de moléculas orgánicas relativamente pequeñas. A título de ejemplo, se mostró una hidrólisis selectiva para éster de butinol.

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Ejemplo 2 Fermentación de Pseudomonas glumae Lu 2023

Para obtener la butinol I esterasa, se cultivó Pseudomonas glumae Lu 2023 a escala 14-1 y se cosechó la biomasa activa.

En el laboratorio, Pseudomonas glumae Lu 2023 fue sembrado en placas de agar con medio de sal mineral M12 y 1 g/l de EPA y se incubó a una temperatura de 28ºC durante 36 a 48 horas. Fue después posible almacenar las placas a una temperatura de 4ºC durante cuatro semanas.

La fermentación de la cepa fue efectuada en un fermentador Infors xxy 14-1. Para el precultivo, se inocularon 250 ml de medio con 2 a 3 bucles de Pt y se incubó a 200 revoluciones por minuto a una temperatura de 28ºC durante 24 horas. El cultivo principal fue efectuado en las condiciones siguientes:

Temperatura: 28ºC

Alimentación de aire: 7 l/min.

Agitación: 600 revoluciones por minuto

Tiempo de fermentación: aproximadamente 24 horas

Medición integrada de pH y pO_{2}

Medio para precultivo y cultivo principal

15 g/l de autolisado de levadura Springer al 65%

1,6 g/l de sulfato de magnesio x 7 agua

0,02 g/l de cloruro de calcio x 2 de agua

3,5 g/l de dihidrogenfosfato de potasio

3,5 g/l de hidrogenfosfato dipotásico

5 g/l de hidrogenfosfato de diamonio

6 ml de agente anti espuma Pluriol P2000.

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Los ingredientes mencionados arriba fueron disueltos en agua desionizada y la solución fue ajustada a pH 6.5 utilizando una solución de amoniaco al 25%. 5 ml/l solución de elementos menores (trace elements) y 2 g/l de glucosa fueron filtrados en forma estéril separadamente.

Después de la esterilización y de la terminación del medio, se introdujo 0,5 g/l de fenilacetato de etilo en el fermentador. La adición de Pluriol P2000 controló la aparición de espuma durante la fermentación. La fermentación fue detenida cuando el pO_{2} en el fermentador se elevó otra vez por el 85%. El contenido del fermentador fue después centrifugado a una temperatura inferior a 15ºC y a aproximadamente 9000 a 10000 g, y se desechó el efluente claro. La masa celular fue congelada a una temperatura de - 16ºC.

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Ejemplo 3 Purificación de butinol I esterasa a partir de Pseudomonas glumae Lu 2023

Células de Pseudomonas glumae (Lu 2023) (100 ml, peso húmedo: 50 g) fueron lisadas en un molino de perlas de vidrio (100 ml de perlas de vidrio, diámetro: 0,5 mm) a una temperatura de 4ºC y a 3000 revoluciones por minuto. Después de centrifugación (10000 revoluciones por minuto, 30 minutos), y lavado de las perlas de vidrio, el sobrenadante (300 ml) fue sometido a precipitación en cloruro de manganeso (pH 7 a 7,5; concentración final: 50 mM). Después de otra centrifugación, el sobrenadante fue ajustado a pH 8. 0 y se agregó EDTA a una concentración de 50 mM. Este volumen fue purificado por cromatografia en Q-Sepharose (300 ml). Después de aplicar la muestra, la columna fue lavada con 50 mM de Tris/HCl. La fracción de interés fue recogida y concentrada por ultrafiltración (100 kDa). Se separó butinol I esterasa de una esterasa no especifica por cromatografía en tamiz molecular (diámetro: 5 cm, altura: 90 cm; material: S-300). La fracción activa obtenida fue turbia y fue concentrada otra vez. La esterasa estaba evidentemente unida a la membrana. La fracción de membrana fue primero digerida por una proteasa (tripsina, proporción en peso: 1: 50 a l: 100). Esto provocó que todas las proteínas desaparecieran de la fracción de membrana aparte de unas pocas bandas en la electroforesis en gel de poliacrilamida SDS. La actividad fue conservada.

Dichas bandas estaban separadas entre ellas por electroforesis en gel nativo (SDS al 0,04%), y un ensayo de actividad identificó la esterasa en dicho gel nativo. Dicha esterasa fue eluida a partir del gel y después apareció en forma de una banda clara en una electroforesis en gel de poliacrilamida SDS de desnaturalización.

La proteína purificada de esta forma fue transferida por absorción en una membrana PVDF y secuenciada, o bien, después de disociación de tripsina, los péptidos fueron separados por HPLC de fase reversa y secuenciados. Puesto que la terminal amina de la proteína estaba bloqueada, se obtuvieron solamente péptidos trípticos. Las diversas secuencias de aminoácido mostraron homologías débiles con una muconato cicloisomerasa, EC 5.5.1.1, a partir de Acinetobacter iwoffii y Pseudomonas putidas, y también lactana esterasa de Pseudomonas fluorescens. El péptido que tiene la secuencia AIDAIFAPEGV mostró homología con pectina esterasas (EC 3.1.1.11).

El dibujo en la Figura 1 muestra un alineamiento de secuencia de una secuencia parcial de aminoácidos de la presente invención con una secuencia parcial de esterasa especifica para lactona de Pseudomonas fluorescens.

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Ejemplo 4 Inmovilización de butinol I esterasa

Se emplearon diversos métodos para la inmovilización.

1. - La butinol 1 esterasa fue sustancialmente desactivada por precipitación con acetona en presencia de diatomita. 25 mg de proteína fueron mezclados con 3,5 g de diatomita (Merck), y 1.4 1 de acetona (-20ºC) se agregaron durante 10 minutos. El soporte cargado fue después removido a través de filtro por succión de vidrio G3, el residuo de filtro fue lavado con acetona fría y secado.

2. - La butinol I esterasa no se une a Accurel (Akzo).

3. - Fue posible inmovilizar butinol 1 esterasa (2,3 unidades/g, ensayo EPA) en diatomita por liofilización. Para ese propósito, la solución de enzima fue mezclada con diatomita y congelada a una temperatura de -80ºC. A continuación, la sustancia sólida fue secada por liofilización.

4. - Butinol 1 esterasa (454 multiunidades/g ensayo EPA) fue inmovilizado por precipitación con sulfato de amonio. Para este propósito, la enzima fue precipitada a saturación de 80% de sulfato de amonio en presencia de diatomita.

Ejemplo 5 Resolución de racemato utilizando butinol I esterasa a partir de Pseudomonas glumae Lu 2023 Procedimiento (mezcla estándar)

100 unidades de butinol I esterasa reaccionaron con 20 mmol de butirato de butinol (butirato de l-metilprop-2-inilo) en búfer de fosfato (200 ml, 10 mmolar, pH 7,4) con agitación. El pH fue continuamente medido y mantenido a aproximadamente 7,4 por adición de una solución de hidróxido de sodio. En los momentos indicados en la Tabla 1, se tomaron muestras y se extrajo dos veces con metil terc-butil éter (MTBE), y la fase orgánica fue analizada por GC (Chiraldex GTA). Se removió la butinol I esterasa de la mezcla de la reacción por filtración en membrana.

Con su concentración creciente, el enantiómero de éster menos preferido fue convertido de manera cada vez mayor. Después de aproximadamente 45 minutos, esto provocó una baja del exceso de enantiómeros (valor ee) de S butinol en la mezcla de la reacción.

El valor ee del producto alcanzó su máximo a 84% (83-97,9%) después de aproximadamente 30 a 40 minutos. El valor ee del sustrato se elevó a más del 99% en el transcurso de 90 minutos. El ee (exceso de enantiómero) es definido como la cantidad de enantiómero preferentemente convertido en porcentaje menos la cantidad del enantiómero menos preferentemente convertido, en porcentaje. En la mayoría de los casos, esto corresponde a la pureza óptica. La caída en el pH fue lineal hasta 30 minutos. De aproximadamente 100 minutos en adelante, el cambio de pH fue insignificante.

Después de la extracción, la actividad esterasa residual en la fase acuosa siguió siendo de aproximadamente 50%.

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TABLA 1

1

La Tabla 1 muestra el exceso de enantiómero dependiente del tiempo en la conversión de butirato de butinol utilizando butinol I esterasa. Según la convención R/S por Cahn, Prelog e Ingold, las configuraciones R y S definen los dos enantiómeros de una molécula quiral. La conversión es la porción de éster convertido en la mezcla de la reacción.

Ejemplo 6 Dependencia de la especificidad de butinol 1 esterasa del tamaño e hidrofobicidad/carga de la porción de ácido del éster Planteamiento estándar

100 unidades de butinol I esterasa reaccionaron con 20 mmol de éster de butinol de búfer de fosfato (200 ml, 10 mmolar, pH 7,4) con agitación. El pH fue medido continuamente y mantenido a 7,0 por titulación continua. Muestras tomadas fueron extraídas dos veces con metil terc-butil éter (MTBE), y la fase orgánica fue analizada por GC (Chiraldex GTA).

Resultados

La calidad de la resolución de racemato y la velocidad de reacción dependieron del tamaño y de la hidrofobicidad de la porción de ácido. Los mejores sustratos para butinol esterasa fueron butirato de butinol y metil-butirato de butinol. Las lipasas son inactivas con estos sustratos. Esto es también cierto en el caso de ésteres de cadena larga como por ejemplo n-decanoato de butinilo.

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TABLA 2

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2

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La Tabla 2 muestra el exceso de enantiómero en la conversión de ésteres con la butinol I esterasa en dependencia de la porción de ácido del éster convertido.

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Ejemplo 7 Transesterificación en medio orgánico empleando butinol I esterasa

10 mmoles de rac-butinol y 5 mmoles de butirato de vinilo fueron disueltos en 50 ml de metil terc-butil éter (MTBE) y mezclados con 9 unidades de butinol I esterasa (3.3 g) soportadas en diatomita, y la mezcla fue agitada a temperatura ambiente durante 24 horas. Después de la filtración, el solvente fue removido y la mezcla del producto fue caracterizada por GC.

A una conversión de 47%, permanecieron (R)-butinol (18% de ee) y butirato de (S)-butinol (45% de ee).

En metil isobutil cetona, se obtuvieron (R)-butinol con 16% de ee y butirato de (S)-butinol con 52% de ee a una conversión del 43%.

La Tabla 3 muestra el exceso de enantiómero en la conversión de ésteres con la butinol I esterasa en dependencia de la porción de ácido del éster convertido.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 3

4

<110> BASF Aktiengesellschaft

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<120> Butinol I Esterasa

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<130> M/42107 Butinol 1 Esterasa

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<140>

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<141>

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<160> 6

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 1530

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<212> ADN

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<213> Pseudomonas glumae LU 2023

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)...(1530)

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<400> 1

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6

7

8

9

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<210> 2

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<211> 510

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<212> PRT

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<213> Pseudomonas glumae LU 2023.

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<400> 2

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10

11

12

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<210> 3

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<211> 32

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<212> PRT

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<213> Pseudomonas glumae LU 2023

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<400> 3

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\hskip1cm13

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<210> 4

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<211> 14

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<212> PRT

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<213> Pseudomonas glumae LU 2023

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<400> 4

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\hskip1cm14

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<210> 5

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<211> 20

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<212> PRT

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<213> Pseudomonas glumae LU 2023

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<400> 5

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\hskip1cm15

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<210> 6

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<211> 11

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<212> PRT

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<213> Pseudomonas glumae LU 2023

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<400> 6

\hskip1cm16

Claims

1. Proteína con actividad butinol I esterasa, que comprende por lo menos una secuencia parcial de aminoácidos de conformidad con SEQ ID NO: 3, 4, 5 ó 6, que tiene la facultad para la hidrólisis enantioselectiva de ésteres butinilo de ácidos carboxílicos.

2. Proteína con actividad butinol I esterasa que comprende una secuencia de aminoácidos de conformidad con SEQ ID NO: 2, o una secuencia de aminoácidos homóloga a la misma, con un grado de homología de al menos 60% calculado según el algoritmo de Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 85 (8), 1988, 2444-2448, la cual tiene la facultad para la hidrólisis enantioselectiva de ésteres butinilo de ácidos carboxílicos.

3. Proteína de conformidad con una de las reivindicaciones precedentes que comprende una cadena polipeptídica con un peso molecular de aproximadamente 41300 Da.

4. Proteína de conformidad con una de las reivindicaciones precedentes caracterizada porque puede obtenerse a partir de Pseudomonas glumae Lu 2023 con número de depósito DSM 13176.

5. Proteína de conformidad con una de las reivindicaciones precedentes caracterizada porque adicionalmente cataliza por lo menos una de las reacciones siguientes:

(I)R^{1}-COO-R^{2}

en donde

R^{1} es un alquilo C_{1}-C_{10}, alquenilo C_{2}-C_{10}, alquinilo C_{2}-C_{10}, de cadena recta o ramificada, insustituido o monosustituido o polisustituido y R^{2} es un alquilo C_{1}-C_{10}, alquenilo C_{2}-C_{10}, alquinilo C_{2}-C_{10}, aralquilo C_{7}-C_{15}, de cadena recta o ramificado, insustituido o monosustituido o polisustituido o un radical aromático mononuclear o polinuclear, insustituido o monosustituido o polisustituido,

R^{1} y/o R^{2} comprenden por lo menos un átomo de carbono asimétrico; y

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b) transesterificación enantioselectiva de un éster de la fórmula 1 con un alcohol ópticamente activo

de la fórmula II

R^{2}-OH (II),

en donde R^{2} tiene uno de los significados antes mencionados y, opcionalmente, tiene por lo menos un átomo de carbono asimétrico.

6. Polinucleótido, que codifica para una proteína de conformidad con una de las reivindicaciones precedentes, y las secuencias que la hibridan en condiciones estrictas o complementarias a la misma, que comprende respectivamente una secuencia de nucleótidos de por lo menos 30 residuos de nucleótidos sucesivos en una secuencia de ácido nucleico de conformidad con SEQ ID NO: 1 o una secuencia de nucleótidos complementaria a la misma de al menos 30 residuos de nucleótidos sucesivos.

7. Casete de expresión que comprende por lo menos un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 6 operativamente enlazado a por lo menos una secuencia reguladora de ácido nucleico.

8. Vector recombinante para transformar un huésped eucariótico o procariótico, que comprende un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 6, o un casete de expresión de conformidad con la reivindicación 7.

9. Método para preparar una proteína de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 5, en donde un microorganismo que produce la proteína de manera endógena o un microorganismo transformado con un vector de conformidad con la reivindicación 8 es cultivado y la proteína es aislada del cultivo.

10. Método de conformidad con la reivindicación 9, en donde el microorganismo es pseudomonas glumae Lu 2023 con número de depósito DSM 13176.

11. Proteína que puede ser obtenida de conformidad con un método según la reivindicación 9 ó 10, que comprende al menos una secuencia parcial de aminoácidos según SEQID NO: 3, 4, 5 ó 6, la cual está facultada para la hidrólisis enantioselectiva de ésteres butinilo de ácidos carboxílicos.

12. Pseudomonas glumae Lu 2023 con número de depósito DSM 13176 y variantes y mutantes del mismo.

13. Microorganismo caracterizado porque lleva un vector de conformidad con la reivindicación 8.

14. Método para la hidrólisis enantioselectiva de éster utilizando una proteína de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 5, en donde

a) la proteína se pone en contacto con una mezcla de estereoisómeros de un éster ópticamente activo de la fórmula I; y

b) los compuestos ópticamente activos que provienen de la hidrólisis estereoselectiva de uno de los estereoisómeros y/o el enantiómero de éster no hidrolizado se obtienen a partir del medio de la reacción.

15. Un método para la transesterificación enantioselectiva, en donde

a) una mezcla de estereoisómeros de un alcohol ópticamente activo de la fórmula II se pone en contacto con un éster de la fórmula I en presencia de una proteína según una de las reivindicaciones 1 a 5 y el estereoisómero de alcohol sin reaccionar es obtenido del medio de la reacción; o

b) una mezcla de estereoisómeros de un éster ópticamente activo de la fórmula I se pone en contacto con un alcohol de la fórmula II en presencia de una proteína de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 5 y un estereoisómero del alcohol ópticamente activo contenido en el éster es obtenido a partir del medio de la reacción.

16. Un método de conformidad con la reivindicación 15, en donde un éster de vinilo se utiliza para la transesterificación como agente de acilación para un alcohol ópticamente activo.

17. Un método de conformidad con una de las reivindicaciones 14, 15 ó 16, en donde el medio de la reacción utilizado es un solvente orgánico.