ES2383702T3

ES2383702T3 - Nuevo polipéptido que tiene una actividad de esterasa, y esterasa recombinante y su uso

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Publication number: ES2383702T3
Application number: ES06829433T
Authority: ES
Inventors: Gerhard Steinbauer; Michael Stanek; Peter Pojarliev; Wolfgang Skranc; Helmut Schwab; Marcel Wubbolts; Joannes Kierkels; Harald Pichler; Manuela Hermann; Christoph Zenzmaier
Original assignee: DSM Fine Chemicals Austria Nfg GmbH and Co KG
Current assignee: Patheon Austria GmbH and Co KG
Priority date: 2005-12-27
Filing date: 2006-12-08
Publication date: 2012-06-25
Anticipated expiration: 2026-12-08
Also published as: PL1966373T3; WO2007073845A8; US20100151541A1; IL192400A0; US8642312B2; CA2635380C; SG170757A1; CN101351548B; BRPI0621280A8; WO2007073845A2; CN101351548A; NO20082864L; WO2007073845A3; CA2635380A1; IL192400A; BRPI0621280A2; US20120220014A1; KR101388391B1; HK1128306A1; JP5119166B2

Abstract

Un polipéptido o una proteína recombinante que exhibe una identidad de al menos 98 % con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID No:1 y que tiene una actividad para la resolución de racematos de ésteres de ácidos 2-alquil-5-halopent-4-enocarboxílicos de la fórmula (I) . en la que R es un radical alquilo de C1-C6, R1 es alquilo de C1-C4, y X es cloro, bromo o yodo.

Description

Nuevo polipéptido que tiene una actividad de esterasa, y esterasa recombinante y su uso

El invento se refiere a un nuevo polipéptido que tiene una actividad de esterasa, que tiene especialmente una actividad de 2-alquil-5-halopent-4-eno-carboxil-esterasa, y a una proteína recombinante activa enzimáticamente, que tiene una actividad de esterasa, y a su uso para resolver racematos de mezclas de enantiómeros de ésteres de ácidos 2-alquil-5-halopent-4-eno-carboxílicos.

Los ácidos 2-alquil-5-halopent-4-eno-carboxílicos y sus ésteres, enriquecidos en cuanto a enantiómeros, son valiosos compuestos intermedios para preparar productos farmacéuticos, tales como, por ejemplo, delta-aminogamma-hidroxi-omega-arilalcanocarboxamidas, que tienen propiedades inhibidoras de la renina y se pueden utilizar como agentes antihipertensivos en formulaciones farmacéuticas.

Las esterasas se emplean generalmente en la resolución de racematos y la asimetrización. Sin embargo, solo están disponibles comercialmente muy pocas esterasas apropiadas para preparar compuestos quirales. El uso de extractos de extractos de esterasas procedentes de los hígados de cerdos es conocido a la escala preparativa. Una esterasa de hígado de cerdo (PLE) fue aislada hace mucho tiempo a partir de fuentes naturales, y su actividad ha sido conocida también ya durante un largo tiempo (Simonds, J. P. (1919) Amer. J. Physiol. 48, 141; Bamann, E. y colaboradores (1934) Hoppe-Seyler Z. 229, 15; Falconer J. S. y Taylor, D. B. (1946) Biochem. J. 40, 831-834).

Ya se han llevado a cabo diversos estudios con el fin de caracterizar a una PLE (Heymann, E. y Junge, W. (1979) Eur. J. Biochem. 95, 509-518; Lehner, R. y Verger, T. (1997) Biochemistry 36, 1861-1868). Ha sido posible además mostrar, por ejemplo en el documento de solicitud de patente internacional WO 01/09079, que unos extractos de esterasas procedentes de los hígados de cerdos pueden hidrolizar selectivamente al enantiómero (R) del 5-cloro-2-(1-metiletil)-4-pentenoato de metilo. Sin embargo, el uso de dichos extractos de esterasas procedentes de fuentes naturales, tales como el hígado de un cerdo, está asociado con desventajas. En primer lugar, las calidades de las diferentes tandas varían y por lo tanto hacen difícil optimizar los procesos industriales. En segundo lugar, el uso de recursos animales en la producción de productos farmacéuticos es indeseado, puesto que no siempre se puede excluir la presencia de virus y priones. Por estas razones existe una necesidad de producir esterasas recombinantes de hígados de cerdo de calidad normalizada en microorganismos. La clonación de putativos genes de esterasas se describe por ejemplo en FEBS Lett. (1991), 293, 37-41. La primera expresión funcional de una enzima esterasa activa procedente del hígado de un cerdo fue descrita por primera vez en el documento WO 02/48322. El documento WO 2004/055177 describe la preparación de otras esterasas recombinantes mediante una mutagénesis dirigida a un sitio de la esterasa recombinante de hígado de un cerdo con la SEQ. ID No. 1 (rPLE) procedente del documento WO 02/48322. Como resulta evidente a partir de la descripción del documento WO 2004/055177 y a partir del artículo que tiene como autores los mismos inventores en Protein Engineering, 16, 11391145, 2003, se escogieron las modificaciones de la secuencia de rPLE procedente del documento WO 02/48322, de manera tal que se obtenga una esterasa intestinal recombinante de cerdo (PICE), descrita en la cita de David y colaboradores, (1998) Eur. J. Biochem. 257, 142-148. La resolución de ésteres de ácidos 2-alquil-5-halopent-4-enocarboxílicos racémicos no se describe en ninguno de estos artículos.

Sin embargo, puesto que no ha satisfecho la necesidad de esterasas que tengan la deseada actividad estereoselectiva para ésteres de ácidos 2-alquil-5-halopent-4-eno-carboxílicos y que se puedan preparar con facilidad por vía biotecnológica, un objeto del presente invento fue el de proporcionar una correspondiente nueva esterasa recombinante.

En un intento de aislar y clonar el gen que se describió en FEBS Lett. (1991), 293, 37-41 y en el documento WO 02/48322 para una conocida esterasa de hígado de cerdo (PLE, acrónimo de Pig Liver Esterase) como un ADNc (ácido desoxirribonucleico cromosomal) a partir de un ARNm (ácido ribonucleico mensajero) procedente del hígado de un cerdo, se encontró una segunda y nueva secuencia de esterasa, además de la conocida secuencia de PLE. A continuación de la expresión de las dos secuencias, en que se prepararon las correspondientes proteínas o esterasas, a saber la conocida rPLE y una nueva esterasa “alternativa” recombinante (rAPLE), surgió inesperadamente el conocimiento de que solamente la rAPLE es capaz de efectuar una resolución selectiva de ésteres de ácidos 2-alquil-5-halopent-4-enocarboxílicos racémicos.

Se hizo posible, por lo tanto, alcanzar el objetivo del presente invento mediante un nuevo polipéptido que tiene una actividad de esterasa, y una nueva esterasa recombinante (rAPLE), cuya secuencia de aminoácidos difiere en 21 de un total de 548 aminoácidos con respecto de la conocida secuencia de PLE.

La nueva rAPLE difiere en la secuencia de aminoácidos también con respecto de la conocida carboxil-esterasa intestinal de cerdo (PICE, acrónimo de Pig Intestinal CarboxylEsterase) en 12 de un total de 548 aminoácidos. Sin embargo, la PICE es encontrada en el tracto intestinal de un cerdo.

El presente invento, correspondientemente, se refiere a un polipéptido que tiene una actividad de esterasa, que exhibe una identidad de por lo menos un 98 % con la secuencia de aminoácidos SEQ. ID. No. 1, y tiene una actividad para la resolución de los racematos de ésteres de ácidos 2-alquil-5-halopent-4-eno-carboxílicos de la fórmula (I).

El presente invento se refiere además a una nueva proteína recombinante que tiene una actividad de esterasa, que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ. ID. No. 1, y que tiene una actividad para la resolución de racematos de ácidos 2-alquil-5-halopent-4-eno-carboxílicos de la fórmula (I).

El polipéptido y la rAPLE recombinante del invento tienen la capacidad de resolver de manera estereoselectiva ésteres de ácidos 2-alquil-5-halopent-4-eno-carboxílicos racémicos de la fórmula (I).

en la que R es un radical alquilo de C1-C6, R1 es alquilo de C1-C4, y X es cloro, bromo o yodo.

El polipéptido del invento que tiene una actividad de esterasa, y la nueva esterasa recombinante rAPLE difieren, tal como más arriba se ha señalado, en 21 de un total de 548 aminoácidos con respecto de la secuencia conocida que se describe en FEBS Lett. (1991), 293, 37-41 y en 12 de un total de 548 aminoácidos con respecto de la conocida proteína PICE descrita en David y colaboradores (1998) Eur. J. Biochem. 257, 142-148.

La secuencia proteínica de la nueva rAPLE del invento difiere en las siguientes posiciones de aminoácidos con respecto de la conocida secuencia de la proteína PLE.

APLE Posición PLE

Glu 73 Asp

Ile 75 VaI

Gly 76 VaI

Gly 77 GIu

Leu 80 Thr

Arg 87 GIy

Ile 92 Thr

Pro 93 Leu

Val 129 Leu

Ser 133 Pro

Thr 134 Met

Leu 138 Val

Ala 139 Val

Phe 234 Leu

Ala 236 VaI

Gly 237 Ala

Phe 286 Leu

Ala 287 Thr

Leu 290 Phe

Pro 294 Gln

Thr 302 Pro

La proteína del invento y la nueva rAPLE recombinante pueden además estar en la forma de una secuencia modificada como se muestra en SEQ ID No 1, que se puede obtener por ejemplo por modificaciones usuales, tales como, por ejemplo, intercambio, supresión (= deleción) o adición de aminoácidos en la secuencia en el extremo terminal de N o C, tal como por ejemplo, GluAlaGluAla procedente de la secuencia de señal del factor α, o por fusión con otras proteínas. El invento incluye además unas muteínas que tienen modificaciones dentro de la secuencia proteínica de la enzima del invento que tiene la actividad apropiada, en particular sobre ésteres de ácidos 2-alquil-5-halopent-4-enocarboxílicos. Las muteínas se pueden obtener, por ejemplo, por modificaciones del ADN que codifica la enzima del

invento, por conocidas técnicas de mutagénesis (mutagénesis aleatoria, mutagénesis dirigida a un sitio, evolución dirigida, transposiciones genéticas, etc.) de manera tal que el ADN codifica una enzima que difiere en por lo menos un aminoácido con respecto de la enzima del invento, y por subsiguiente expresión del ADN modificado en una célula anfitriona apropiada. El invento incluye, por lo tanto, también secuencias de ADN modificadas como se muestran en SEQ ID No 1, obtenidas por las mutaciones, supresiones, prolongaciones y fusiones antes descritas, y que codifican unas enzimas que tienen la deseada actividad de esterasa.

La actividad de esterasa, especialmente la actividad de una 2-alquil-5-halopent-4-eno-carboxil-esterasa, es definida en este invento como la capacidad de resolver racematos de ésteres de ácidos 2-alquil-5-halopent-4-enocarboxílicos de la fórmula (I)

El polipéptido del invento y la rAPLE recombinante se pueden preparar tal como se describe seguidamente:

En primer lugar, un ARNm es aislado a partir del hígado de un cerdo usando un estuche apropiado y luego se genera el ADNc por transcripción inversa basándose en el extracto de ARNm. Subsiguientemente, se preparan unos cebadores de PCR específicos basándose en la secuencia del conocido gen de esterasa de hígado de cerdo con el número de acceso al GenBank X63323 (Matsushima y colaboradores, 1991)

La parte de los cebadores, que comprende las apropiadas secuencias de nucleótidos que codifican la proteína PLE y que está presente obligatoriamente en los cebadores, se encuentra en letra negrita. La otra parte de la secuencia de los cebadores comprende por ejemplo una información acerca de sitios de disociación para endonucleasas de restricción (en letra cursiva) o elementos de la secuencia que son importantes para la expresión. Esta parte puede variar en la preparación de la rAPLE del invento.

Luego tiene lugar una amplificación con los cebadores 1 y 2 por métodos de PCR de la técnica anterior. El producto de la PCR (reacción en cadena de la polimerasa) se usa subsiguientemente para preparar por métodos de la técnica anterior construcciones artificiales de expresión para una expresión heteróloga de la proteína rAPLE codificada en el seno de apropiados organismos anfitriones. Éste implica preferiblemente al producto de la PCR que es clonado inicialmente en el seno de apropiados vectores plasmídicos.

Los plásmidos recombinantes obtenidos de esta manera son transformados luego en el seno de un anfitrión apropiado, por ejemplo Escherichia coli. Los insertos de varios clones resultantes son luego secuenciados. Inesperadamente, se identificaron allí 2 grupos de clones recombinantes con diferentes secuencias, siendo uno de ellos idéntico en un 100 % con la secuencia esperada para una PLE de acuerdo con Matsushima y colaboradores, (1991) FEBS Lett. 293, 37-41, y una nueva secuencia de nucleótidos como se muestra en SEQ. ID. No. 2 (secuencia de APLE), que después de una expresión conduce a la secuencia de aminoácidos SEQ. ID. No. 1 del invento.

El presente invento se refiere además a una secuencia de ácido nucleico o de nucleótidos, que codifica el polipéptido del invento y la esterasa recombinante rAPLE. Por ejemplo, dicho ácido nucleico tiene la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ. ID. No. 2. El invento se refiere también además a unas secuencias de nucleótidos que incluyen una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido del invento y la esterasa recombinante rAPLE, o que comprende la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ. ID. No. 2.

Una posibilidad adicional consiste en preparar unos oligonucleótidos apropiados que corresponden a las secuencias de ácidos nucleicos de acuerdo con el presente invento, que codifican la esterasa del invento por técnicas de síntesis normalizadas, por ejemplo con el uso de aparatos automáticos sintetizadores de ADN. La preparación puramente sintética de las secuencias de ácidos nucleicos que codifican la esterasa del invento es particularmente ventajosa para su uso en la producción de productos farmacéuticos o de sus compuestos intermedios, puesto que las enzimas, por lo tanto, no se obtienen a partir de fuentes animales.

Tiene lugar luego una expresión de las dos secuencias encontradas (secuencias de PLE y APLE). La conocida esterasa de hígado de cerdo (PLE, Swiss-Prot ID Q29550) comprende una secuencia de señal terminal de N y una señal de retención ER terminal de C, siendo los 4 últimos aminoácidos HAEL. Con el fin de expresar la conocida PLE y la nueva APLE, se construyen unos vectores en los que las secuencias se introducen dentro de sistemas de expresión apropiados. Estas construcciones de expresión son luego transformadas en el seno de células apropiadas. Unas apropiadas células anfitrionas en este contexto son, por ejemplo, microorganismos, linajes de células animales y plantas. Se pueden emplear microorganismos tanto procarióticos como eucarióticos. Unos preferidos anfitriones procarióticos (bacterias) son Escherichia coli, y cepas de los géneros Bacillus (p.ej. B.subtilis, B.licheniformis,

B.amyloliquefaciens) , Pseudomonas (p.ej. P. fluorescens, P.putida), o Streptomyces (p.ej. S.lividans, S.tendae). Se prefieren los microorganismos eucarióticos, y se prefieren particularmente los hongos. Ejemplos de ellos son Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Kluyveromyces lactis o Aspergillus sp. La expresión puede ser secretoria o intracelular y tanto inducible como constitutiva. Para una expresión en bacterias se puede obtener una selección de señales que son específicas para una especie, entre otras cosas, como cepas comercialmente disponibles y vectores para la expresión de proteínas (proporcionados p.ej. por compañías tales como Invitrogen, Novagen, New England Biolabs), que permiten una expresión inducible o constitutiva, una localización intracelular y secretoria de la proteína diana; además, se puede emplear una tecnología que haga posible o favorezca el plegamiento correcto de proteínas con el fin de dar como resultado una proteína soluble y activa. Las proteínas son expresadas preferiblemente de una manera secretoria, en cuyo caso se construyen preferiblemente unos vectores en los que las secuencias de PLE y APLE están engarzadas en el extremo terminal de N con la secuencia de señal del factor α de S. cerevisiae. Además, es posible preparar unas construcciones artificiales, en las que se haya suprimido adicionalmente el tetrapéptido HAEL terminal de C, que sirve como una señal de retención ER, como se describe por ejemplo en la cita de Hardwick y colaboradores, (1990) EMBO J. 9, 623-630. Una expresión adicional es una expresión inducible de construcciones artificiales con o sin una señal de retención ER. Inesperadamente, unas construcciones artificiales que tienen la señal de retención ER pueden ser expresadas también y conducen a una rAPLE que es capaz de efectuar la resolución selectiva de ésteres de ácidos 2-alquil-5halopent-4-eno-carboxílicos racémicos.

La secuencia de aminoácidos de la nueva esterasa rAPLE, que se deriva de la secuencia de nucleótidos del gen de APLE, se describe en SEQ. ID. No. 1.

Ha sido posible inesperadamente encontrar que el nuevo polipéptido de la proteína rAPLE es capaz, en contraste con la conocida rPLE, en cada caso obtenida por expresión de los segmentos de ADN que codifican APLE y PLE, respectivamente, por ejemplo en el seno de células de P. pastoris, para resolver de una manera estereoselectiva ésteres de ácidos 2-alquil-5-halopent-4-eno-carboxílicos.

El invento se refiere correspondientemente además al uso del polipéptido que tiene una actividad de esterasa y de la esterasa recombinante (rAPLE) del invento, que tienen por lo menos una identidad de 98 % con la secuencia mostrada en SEQ. ID. No. 1, para resolver racematos de ésteres de ácidos 2-alquil-5-halopent-4-eno-carboxílicos de la fórmula (I)

El polipéptido que tiene una actividad de esterasa y la esterasa recombinante (rAPLE) del invento tienen por lo menos una identidad de 98 % con respecto a la secuencia de la proteína mostrada en SEQ. ID. No. 1. También es posible emplear un polipéptido que tiene una actividad de esterasa, o la esterasa recombinante (rAPLE) del invento con unas secuencias de ADN modificadas mostradas en SEQ. ID. No. 1, obtenido/a por modificaciones usuales, tales como, por ejemplo, mutaciones, supresiones, prolongaciones y fusiones, que codifican unas enzimas que tienen la deseada actividad de esterasa.

En este contexto, se obtienen unos ácidos 2-alquil-5-halopent-4-eno-carboxílicos o sus ésteres, enriquecidos en cuanto a enantiómeros de la fórmula (II)

en la que R es un radical alquilo de C1-C6, A es igual a H, R1, en que R1 puede ser alquilo de C1-C4, o R2, en que R2 es un grupo alquilo, pero no es igual a R1, y X es cloro, bromo o yodo, por el recurso de que una mezcla de enantiómeros o un éster de un ácido 2-alquil-5-halopent-4-eno-carboxílico de la fórmula (I)

en la que R, R1 y X son como se han definido más arriba, se convierte por medio del polipéptido del invento o de la rAPLE del invento en la presencia de agua o de un alcohol de la fórmula R2OH, en la que R2 es un grupo alquilo que no es igual a R1, como agente nucleófilo, y a) o bien se aísla el remanente éster de un ácido 2-alquil-5-halopent-4-enocarboxílico enriquecido en cuanto a

enantiómeros de la fórmula (II), en la que A es igual a R1, o b) si se emplea un alcohol como agente nucleófilo, se aísla el resultante éster de un ácido 2-alquil-5-halopent

4-eno-carboxílico enriquecido en cuanto a enantiómeros de la fórmula (II), en la que A es igual a R2, o c) si se emplea agua como agente nucleófilo, se aísla el resultante ácido 2-alquil-5-halopent-4-eno-carboxílico

de la fórmula (II), en la que A es igual a H.

R en la fórmula (II) es un radical alquilo de C1-C6 tal como, por ejemplo, metilo, etilo, n- e i-propilo, n-, i- y t-butilo, pentilo y hexilo. Se prefieren los radicales alquilo de C1-C4 y se prefiere particularmente el radical i-propilo. A es H, R1, cuando R1 es un radical alquilo de C1-C4, preferiblemente un radical alquilo de C1-C2 y particularmente un radical metilo, o R2, cuando R2 es un radical alquilo que no es igual a R1. R2 es de manera particularmente preferible un radical alquilo de C1-C6. X es cloro, bromo o yodo, preferiblemente cloro.

El concepto de “compuestos enriquecidos en cuanto a enantiómeros” significa en este contexto los que exhiben un exceso enantiomérico (ee) de > 80 %, de manera preferible de > 90 % y de manera particularmente preferible de > 97 %.

La enzima del invento se puede usar además en cualquier forma. Por ejemplo, como una dispersión, como una solución, inmovilizada, como una enzima cruda, como una enzima que se ha obtenido a partir de su fuente por una combinación de conocidos métodos de purificación, como células enteras (cuando sea apropiado, inmovilizadas y/o permeabilizadas) que tienen la requerida actividad enzimática (de un modo natural o mediante modificaciones genéticas) o en un material lisado de dichas células.

La temperatura de reacción para la conversión del invento está situada normalmente entre 0 y 90ºC, de manera preferible entre 10 y 60ºC. El pH de la solución de reacción está situado entre 4 y 11, de manera preferible entre 6 y

9.

La elección del disolvente depende del agente nucleófilo que se emplee.

Si, por ejemplo, se emplea agua como el agente nucleófilo, los disolventes que se pueden emplear son agua, una mezcla de agua con un disolvente miscible con agua, por ejemplo con un alcohol tal como, por ejemplo, metanol, etanol, isopropanol, t-butanol, etc., dioxano, tetrahidrofurano, acetona o dimetil sulfóxido, o como un sistema de dos fases de agua y de un disolvente inmiscible con agua, por ejemplo un compuesto aromático, tal como, por ejemplo, tolueno, xileno, etc., un alcano tal como, por ejemplo, hexano, heptano, ciclohexano, etc., un éter tal como por ejemplo, diisopropil éter, metil t-butil éter, etc. Si el agente nucleófilo es un alcohol, el disolvente empleado de manera preferible es el alcohol R2OH en donde R2 es un grupo alquilo que, sin embargo, no es igual a R1. Sin embargo, también es posible usar mezclas del alcohol con un disolvente orgánico tal como, por ejemplo, tetrahidrofurano, heptano, tolueno, hexano, CH3CN, metil t-butil éter, etc.

Después de que haya tenido lugar la resolución de racematos, catalizada enzimáticamente, se aísla el deseado producto final. Éste puede ser o bien el remanente éster de ácido 2-alquil-5-halopent-4-eno-carboxílico enriquecido en cuanto a enantiómeros de la fórmula (II), en la que A es igual a R1, o si el agua es el agente nucleófilo, el ácido 2alquil-5-halopent-4-eno-carboxílico enriquecido en cuanto a enantiómeros de la fórmula (II), en la que A es igual a H, que se ha formado, o si el alcohol es el agente nucleófilo el éster del ácido 2-alquil-5-halopent-4-eno-carboxílico enriquecido en cuanto a enantiómeros de la fórmula (II), en la que A es igual a R2. El aislamiento puede tener lugar, por ejemplo, por métodos convencionales tales como, por ejemplo, extracción, cristalización, cromatografía en columna, destilación, etc.

El método del invento da como resultado los correspondientes ácidos o ésteres de la fórmula (I) en unos rendimientos teóricos que llegan a un rendimiento hasta de 98 % y con un e.e. de hasta > 99 %.

Ejemplo 1: Aislamiento del ARNm y generación del ADNc

0,7 g del hígado procedente de un cerdo recientemente sacrificado, obtenido a partir de un matadero local, se congelaron en nitrógeno líquido y se homogeneizaron con un mortero, y el ARNm liberado se aisló o extrajo usando el estuche de extracción de ARNm Fast Track 2.0 (de Invitrogen, Carlsbad, California, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones dadas por el fabricante (manual del estuche Fast Track 2.0; versión J; 082301; 25-0099). La extracción proporcionó un total de 12,9 μg de ARNm. 0,26 μg de este ARNm se usaron luego como molde para generar el ADNc usando el “sistema de síntesis de Primera Hebra” SuperScript III para una RT-PCR (reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Ejemplo 2 : Amplificación y clonación de fragmentos de ADNc a partir del hígado de un cerdo

Se prepararon cebadores específicos basándose en la secuencia del gen de esterasa del hígado de un cerdo del nº

Las bases homólogas con la conocida secuencia de PLE están en letra negrita. Las secuencias de reconocimiento para endonucleasas de restricción están puestas en cursiva para darles énfasis. La amplificación tuvo lugar en 50 μl de una mezcla con 1 U de la polimerasa de ADN Phusion (de Finnzymes, Espoo, Finlandia), con 500 ng del ADNc como molde, 20 μmol de cada uno de los cebadores 1 y 2, 5 μl de una mezcla de dNTPs (2 mM de cada uno), todos en un tampón de 1xPhusion HF de acuerdo con el manual de “Phusion High-Fidelity ADN Polymerase” [manual de la polimerasa de ADN de alta fidelidad Phusion) (de Finnzymes), comenzando con una operación de desnaturalización durante 30 segundos a 98ºC, seguida por 30 ciclos (de 10 segundos a 98ºC, 20 segundos a 68ºC y 1 minuto a 72ºC) para una amplificación y una incubación final a 70ºC durante 8 min para preparar productos completos. Esta PCR dio como resultado un fragmento de ADN con un tamaño de 1,8 kb (encontrado mediante una electroforesis en gel de agarosa). Este producto de la PCR se purificó luego usando el estuche Qiaquick (de Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo con el manual incluido. Aproximadamente 0,1 μg del producto purificado de la PCR se cortaron con la endonucleasa de restricción EcoRI y se clonaron dentro de los vectores plasmídicos pHILZ y pHIL-D2 pasando por los sitios de disociación con EcoRI. Luego los vectores fueron transformados en el seno de células electrocompetentes TOP10 preparadas de acuerdo con “Current Protocols in Molecular Biology” [Protocolos actuales en biología molecular]. Los insertos de varios clones resultantes fueron secuenciados usando el estuche de “Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing” [Secuenciación en ciclo de terminador por desoxi con un tinte] (de Applied Biosystems Inc., Forster City, California, EE.UU.). Se identificaron de esta manera dos secuencias, una que se correspondía en un 100 % con la secuencia esperada publicada por Matsushima y colaboradores, (1991) FEBS Lett. 293, 37-41, y la otra secuencia que se correspondía con la SEQ ID No. 2.

Ejemplo 3: Introducción de la secuencia de señal del factor y variaciones del extremo terminal de C.

Con el fin de hacer posible una expresión secretoria de la conocida proteína PLE y de la proteína rAPLE del invento, se construyeron unos vectores en los que las secuencias de PLE y de APLE se conectaron en el extremo terminal de N con la secuencia de iniciación del factor α del vector de clonación pPICZ α (de Invitrogen). Además, se prepararon unas construcciones artificiales en las que se había suprimido el tetrapéptido HAEL terminal de C.

PCR I: El par de cebadores EcoRIalfa1/alfaPLE2 se usó para amplificar la secuencia de señal del factor α del vector de clonación pPICZ α (de Invitrogen). La PCR se llevó a cabo en 50 μl de una mezcla de (2 ng del molde, 0,5 μM de cada uno de los cebadores, 0,2 mM de los dNTPs y 1 U de la polimerasa de ADN Phusion (de Finnzymes) todos en un tampón 1xPhusion HF de acuerdo con el manual de “Phusion High-Fidelity ADN Polymerase” (de Finnzymes)). Una desnaturalización a 95ºC durante 3 minutos fue seguida por una amplificación en 30 ciclos (de 30 segundos a 95ºC, 30 segundos a 57ºC y 15 segundos a 72ºC) y una operación final a 72ºC durante 7 min.

PCR II: las secuencias de PLE y APLE fueron amplificadas a partir de los plásmidos pHILZ usando o bien el par de cebadores PLEalfa1/EcoRIPLE+ER2 o el par de cebadores PLEalfa1/EcoRIPLE2 (supresión del tetrapéptido HAEL terminal de C).

Estas PCR se llevaron a cabo de nuevo en 50 μl de mezclas de (2 ng del molde, 0,5 μM de cada cebador, 0,2 mM de los dNTPs y 1 U de la polimerasa de ADN Phusion (de Finnzymes) todos en el tampón 1xPhusion HF de acuerdo con el manual de “Phusion High-Fidelity ADN Polymerase” (de Finnzymes)). Una desnaturalización a 95ºC durante 3 minutos fue seguida por una amplificación en 30 ciclos (de 30 segundos a 95ºC, 30 segundos a 57ºC y 15 segundos a 72ºC) y una operación final a 72ºC durante 7 min.

PCR III: 3 μl de los productos procedentes de las PCR I y PCR II se usaron para combinar estos dos productos mediante una PCR sin cebadores. La prolongación se llevó a cabo en 45 μl de una mezcla con 0,2 mM de los dNTPs y 1 U de la polimerasa de ADN Phusion de Finnzymes) todos en el tampón 1xPhusion HF de acuerdo con el manual de “Phusion High-Fidelity ADN Polymerase” (de Finnzymes). La mezcla de reacción se calentó a 95ºC durante 3 minutos y luego se llevaron a cabo 10 ciclos con 30 segundos a 95ºC y 45 segundos a 72ºC. Para amplificar estos productos de prolongación solapados se añadieron 5 μl de una mezcla de cebadores (3 μl de agua, 1 μl del cebador EcoRIalfa1 5 μM y 1 μl del cebador EcoRIPLE+ER2 o EcoRIPLE2 5 μM). Los productos fueron amplificados con 20 ciclos de PCR (30 segundos a 95º, 30 segundos a 57ºC y 1 minuto a 72ºC) y una única detención de temperatura a 72ºC durante 7 min.

Secuencias de cebadores:

Las regiones con homología para los moldes están en letra negrita y las secuencias de reconocimiento para endonucleasas de restricción están en letra cursiva.

Ejemplo 4: Construcción de construcciones artificiales de expresión para la expresión heteróloga de esterasas de hígados de cerdo en Pichia pastoris

Los productos de PCR de prolongación solapados procedentes del Ejemplo 3 se purificaron usando el estuche de Qiaquick (de Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo con el manual incluido. Se cortaron aproximadamente 0,1 μg de los productos de PCR purificados usando la endonucleasa de restricción EcoRI y se clonaron pasando por el sitio de disociación con EcoRI dentro del vector plasmídico pGAPZA (de Invitrogen). Una orientación correcta del inserto en relación con los promotores se comprobó con la ayuda de disociaciones de control, por ejemplo con NcoI. En cada caso, un clon con un inserto orientado correctamente se seleccionó, secuenció y conservó. Los correspondientes plásmidos fueron denominados de la siguiente manera: Los plásmidos que contenían la conocida secuencia de PLE como se describe en Matsushima y colaboradores, (1991) FEBS Lett. 293, 37-41, fueron denominados pGAPZ A PLE-ER (el tetrapéptido HAEL había sido suprimido) y pGAPZ A PLE+ER (el tetrapéptido HAEL está todavía presente). Los plásmidos derivados de la nueva secuencia de APLE fueron denominados pGAPZ A APLE-ER (el tetrapéptido HAEL había sido suprimido) y pGAPZ A APLE-ER (el tetrapéptido HAEL está todavía presente).

Ejemplo 5: Expresión constitutiva de esterasas de hígados de cerdo en Pichia pastoris

Los plásmidos pGAPZ A PLE-ER, pGAPZ A PLE+ER, pGAPZ A APLE-ER y pGAPZ A APLE+ER fueron transformados en el seno de P. pastoris X-33. La transformación tuvo lugar de acuerdo con las instrucciones del protocolo para el estuche Pichia Expressions procedente de Invitrogen. Los transformantes fueron seleccionados sobre placas de YPD (1 % de un extracto de levadura, 2 % de peptona, 2 % de D-glucosa y 2 % de agar) que contenían 100 mg/l de zeocina. 52 clones resistentes a la zeocina fueron extendidos en estrías sobre placas YPD con 100 mg/l de zeocina y fueron conservados en glicerol al 15 %.

Ejemplo 6: Análisis cualitativo de la actividad de esterasa

Unos transformantes en P. pastoris fueron cultivados sobre placas de YPD con 100 mg/l de zeocina a 30ºC durante 48 h. Las células fueron levantadas sobre filtros de 70 mm de Ø sin cenizas, endurecidos, Whatman 541, y secadas al aire. Los filtros fueron incubados con una solución de 6 mg de acetato de α-naftilo (de Sigma, disueltos en 500 μl de acetona), 2,5 mg de o-dianisidina tetrazotada (Fast Blue Salt BN, Sigma, disuelta en 125 μl de agua) y 5 ml de un tampón de fosfato de potasio 0,1 M, de pH 7, con el fin de visualizar la actividad de esterasa por medio de una reacción colorimétrica. Se detectaron actividades en todos los transformantes que tenían integrado uno de los 4 plásmidos pGAPZ A PLE-ER, pGAPZ A PLE+ER, pGAPZ A APLE-ER y pGAPZ A APLE+ER. Esto prueba la expresión de proteínas funcionales que tienen una actividad de esterasa. Como una comprobación, se ensayó de la misma manera un clon con un vector vacío integrado. En este caso, no era visible ninguna actividad de esterasa significativa en el período de reacción comparable.

Ejemplo 7: Actividad de esterasa estereoselectiva en relación con el 5-cloro-2-(1-metiletil)-4-pentenoato demetilo

Unos transformantes en P. pastoris, como se describen en el Ejemplo 6, se cultivaron sobre placas de YPD con 100 mg/l de zeocina a 30ºC, durante 48 horas. Las células fueron levantadas sobre filtros de 70 mm de Ø sin cenizas, endurecidos, Whatman 541, y secadas al aire. Los filtros fueron incubados o bien con una solución de substrato A (100 μl de 5-cloro-2-(1-metiletil)-4-pentenoato de metilo racémico, 200 μl de un tampón de fosfato de potasio 0,1 M de pH 8; 150 μl de rojo de fenol 10 mg/ml; 450 μl de DMSO y 650 μl de H2O) o con una solución de substrato B (idéntica a la solución A pero que emplea (2S,4E)-5-cloro-2-(1-metiletil)-4-pentenoato de metilo en vez del racemato). Debido a la actividad de esterasa específica sobre los substratos, la liberación del ácido al realizar la hidrólisis del substrato de éster da como resultado una disminución del pH, que a su vez conduce a un cambio a amarillo en el color del indicador de rojo de fenol. Surgió a partir de esto el conocimiento de que unos transformantes que contenían el plásmido pGAPZ A APLE-ER dieron unas señales (coloración de amarillo alrededor de la colonia) después de una incubación durante 3 a 4 horas si ellos fueron ensayados sobre una solución de substrato A, mientras que no se podría encontrar ninguna conversión significativa con la solución de substrato B (figura 1). Los transformantes obtenidos con los plásmidos pGAPZ A PLE-ER o pGAPZ A PLE+ER no mostraron ninguna reacción con las soluciones de substratos A y B en las mismas condiciones. Esto mostró que la rAPLE recombinante tenía una especificidad para substratos que era diferente de la de la rPLE recombinante y que la hidrólisis del 5-cloro-2-(1-metiletil)-4-pentenoato de metilo usando rAPLE tiene lugar de manera estereoselectiva para el enantiómero (R).

Ejemplo 8: Electroforesis en gel de SDS poliacrilamida

10 μl de un tampón de muestra 2x SDS (125 mM de Tris-HCl, de pH 6,8; 4 % de SDS, 20 % de glicerol, 5 % de βmercaptoetanol y 0,05 % de azul de bromofenol) se añadieron a 10 μl de una esterasa de hígado de cerdo disponible comercialmente o a 10 μl de los materiales sobrenadantes concentrados en hasta 60 veces (con columnas Centricon Ultrafiltrations-Spin, procedentes de Sartorius) de los cultivos en P. pastoris (durante 72 h a 100 rpm y 28ºC en 250 ml de un medio YPD en matraces de Erlenmeyer que tenían una capacidad de 2 l con obstáculos) que contenían o bien el plásmido pGAPZ A APLE-ER o un plásmido pGAPZ A vacío (cepa testigo). Después de que las muestras hubieron sido calentadas a 95ºC durante 5 minutos, las proteínas fueron separadas sobre un gel de poliacrilamida al 12,5 % (gel de apilamiento al 4 % ) y teñidas con Coomassie Brilliant Blue R250 para la detección. La SDS-PAGE muestra una banda de proteínas con el tamaño esperado para la rAPLE (~ 60 kDa) en la cepa de levadura que tenía el plásmido pGAPZ A APLE, pero no en la cepa testigo (figura 2). La esterasa de hígado de cerdo disponible comercialmente, que había sido analizada también como comparación, mostró dos bandas de proteínas en el mismo intervalo de tamaños (flecha en la figura 2).

Ejemplo 9: Expresión inducida de esterasas de hígados de cerdo con el promotor AOX1

Los plásmidos pGAPZ A PLE-ER, pGAPZ A PLE+ER, pGAPZ A APLE-ER y pGAPZ A APLE+ER fueron cortados con la endonucleasa de restricción XhoI, y los respectivos fragmentos que codificaban las proteínas APLE y PLE, con o sin la señal de retención ER, fueron clonados pasando por el sitio de disociación con XhoI dentro del vector pPIC9 (de Invitrogen). La orientación correcta de los fragmentos en relación con el promotor AOX1 fue comprobada por medio de unos cortes de control con la endonucleasa de restricción NcoI. Los vectores que tenían el promotor AOX1 fueron denominados, por analogía a los plásmidos nombrados en el Ejemplo 4, pPIC9 PLE-ER, pPIC9 PLE+ER, pPIC9 APLE-ER y pPIC9 APLE+ER, linearizados con SalI y transformados en el seno de P. pastoris KM71. La transformación y la selección en cuanto a la prototrofía para His tuvo lugar de acuerdo con las instrucciones del estuche de expresión en Pichia procedente de Invitrogen. Los transformantes seleccionados y la cepa KM71 se cultivaron sobre un medio completo de acuerdo con el estuche de expresión en Pichia procedente de Invitrogen durante una noche y se indujeron con 1 % de metanol durante 48 h. Los cultivos resultantes fueron 9

analizados por medio del ensayo de desplazamiento cualitativo del pH, que se ha descrito en el Ejemplo 7, ensayando en cada caso 2 μl de los cultivos en las mezclas. La expresión bajo el control de promotor AOX1 inducible condujo a unas actividades enzimáticas de rAPLE muchísimo más altas, por comparación con la situación descrita para la expresión constitutiva en el Ejemplo 7, en relación con el 5-cloro-2-(1-metiletil)-4-pentenoato de 5 metilo racémico. El cambio de color (de rojo a amarillo) del rojo de fenol era detectable después de solamente unos pocos minutos (figura 3). Inesperadamente, la actividad de rAPLE era independiente de la presencia de la señal de retención ER, HAEL, en el extremo terminal de C, es decir que mostraron actividad incluso unas células que expresaban rAPLE con la señal de retención ER. En contraste con esto, unas cepas de levadura destinadas a producir rAPLE no tenían ninguna actividad en relación con el 5-cloro-2-(1-metiletil)-4-pentenoato de metilo

10 racémico.

LISTA DE SECUENCIAS

<110> DSM Fine Chemicals Austria Nfg GmbH & Co KG 5 <120> Nuevo polipéptido que tiene una actividad de esterasa, y esterasa recombinante y su uso

<130> O. Z.1302a

<160> 9 10

<170> PatentIn version 3.3

<210>1 <211>548 15 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> rAPLE 20

<400> 1

<210> 2

<211> 1647 5 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> rAPLE 10

<400> 2

5: <210> 3 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador

10: <400> 3 cagaattcat ggctatcggg cagccagcct cgc 33

15: <210> 4 <211> 30 <212> ADN

<213> Artificial

5: <220> <223> cebador <400> 4 ccggaattca gcctcccctt cacagctcag 30

10: <210> 5 <211> 43 <212> ADN <213> Artificial

15: <220> <223> cebador

<400> 5 tcttcgaaga attcacgatg agatttcctt caatttttac tgc: 43

20: <210> 6 <211> 36 <212> ADN <213> Artificial

25: <220> <223> cebador

30 35: <400> 6 gaggctggct gcccagcttc agcctctctt ttctcg <210> 7 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> cebador 36

40: <400> 7 agagaggctg aagctgggca gccagcctcg ccg 33

45: <210> 8 <211> 39 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador

50: <400> 8 atggtaccga attctcacag ctcagcatgc tttatcttg 39

55: <210> 9 <211> 40 <212> ADN <213> Artificial

60: <220> <223> cebador <400> 9 atggtaccga attctcactt tatcttgggt ggcttctttg 40

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido o una proteína recombinante que exhibe una identidad de al menos 98 % con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID No:1 y que tiene una actividad para la resolución de racematos de ésteres de ácidos 2-alquil-5-halopent-4-enocarboxílicos de la fórmula (I).

en la que R es un radical alquilo de C1-C6, R1 es alquilo de C1-C4, y X es cloro, bromo o yodo.
2. Un polipéptido o una proteína recombinante que tiene una actividad de esterasa de acuerdo con la reivindicación

1, que exhibe una secuencia de aminoácidos que ha sido modificada por una modificación seleccionada entre el 10 conjunto que consiste en mutación, supresión, inserción, prolongación y fusión.
3. Una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido o una proteína recombinante de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-2.

15 4. Una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia mostrada en SEQ ID No. 2.
5. Una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la reivindicación 3 o la reivindicación 4 obtenible aislando un ARNm a partir de un hígado de cerdo, usando un estuche apropiado, luego generando un ADNc por transcripción inversa basándose en el extracto de ARNm, seguido por una amplificación de un fragmento de ácido nucleico usando un

20 primer cebador que comprende la secuencia de nucleótidos GGGCAGCCAGCCTCGC y un segundo cebador que comprende la secuencia de nucleótidos GGGCAGCCAGCCTCGC.
6. El uso de un polipéptido o de una proteína recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-2 para la resolución de racematos de ésteres de ácidos 2-alquil-5-halopent-4-enocarboxílicos de la fórmula (I).

en la que R es un radical alquilo de C1-C6, R1 es alquilo de C1-C4, y X es cloro, bromo o yodo.
7. Un método para preparar ácidos 2-alquil-5-halopent-4-enocarboxílicos o ésteres de los mismos, enriquecidos en cuanto a enantiómeros de la fórmula (II)

en la que R es un radical alquilo de C1-C6, A es igual a H, R1, en que R1 puede ser alquilo de C1-C4, o R2, en que R2 es un grupo alquilo, pero no es igual a R1, y X es cloro, bromo o yodo, que comprende el recurso de que una mezcla de enantiómeros o un éster de un ácido 2-alquil-5-halopent-4-eno-carboxílico de la fórmula (I)

en la que R, R1 y X son como se han definido más arriba, se convierte por medio de un polipéptido o de una esterasa recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-2 en la presencia de agua o de un alcohol de la fórmula R2OH, en la que R2 es un grupo alquilo

5 que no es igual a R1 como agente nucleófilo, y a) o bien se aísla el remanente éster de un ácido 2-alquil-5-halopent-4-enocarboxílico enriquecido en cuanto a enantiómeros de la fórmula (II), en la que A es igual a R1, o b) si se emplea un alcohol como agente nucleófilo, se aísla el resultante éster de un ácido 2-alquil-5-halopent4-eno-carboxílico enriquecido en cuanto a enantiómeros de la fórmula (II), en la que A es igual a R2, o 10 c) si se emplea agua como agente nucleófilo, se aísla el resultante ácido 2-alquil-5-halopent-4-eno-carboxílico de la fórmula (II), en la que A es igual a H.

Figura 1: Actividad de esterasa estereoselectiva sobre el 5-cloro-2-(1-metiletil)-4-pentenoato de metilo

A: Actividad sobre el substrato racémico: Transformantes de P. pastoris X-33

B: Actividad sobre el substrato racémico frente al enantiómero (S) Figura 2: SDS – PAGE de APLE recombinante

1: Escalera de Proteínas Page Ruler® (de Fermentas)

2: PLE disponible comercialmente

3: P. pastoris X-33 con pGAPZ A integrado (cepa testigo)

4: P. pastoris X-33 con pGAPZ A APLE-ER integrado

Figura 3: Expresión inducida de esterasas de hígados de cerdo con el promotor AOX1

1: P. pastoris KM71 con pPIC9 APLE-ER integrado

2: P. pastoris KM71 con pPIC9 APLE-ER integrado

3: P. pastoris KM71 con pPIC9 APLE-ER integrado

4: P. pastoris KM71 con pPIC9 APLE+ER integrado

5: P. pastoris KM71 con pPIC9 APLE+ER integrado

6: P. pastoris KM71 con pPIC9 PLE-ER integrado

7: P. pastoris KM71 con pPIC9 PLE+ER integrado

8: P. pastoris KM71

9: PLE disponible comercialmente

SEQ ID No 1 : Secuencia de proteínas de rAPLE

SEQ ID No 2 : Secuencia de nucleótidos de rAPLE

SEQ ID No 3 : Cebador 1

SEQ ID No 4 : Cebador 2

SEQ ID No 5 : EcoRIalfa1

SEQ ID No 6 : alfaPLE2

SEQ ID No 7 : PLEalfa1

SEQ ID No 8 : EcoRIPLE+ER2

SEQ ID No 9 : EcoRIPLE2