DE10258327A1

DE10258327A1 - Artifizielle Esterasen

Info

Publication number: DE10258327A1
Application number: DE2002158327
Authority: DE
Inventors: Uwe T. Prof. Dr. Bornscheuer; Anna Dr. Musidlowska-Persson; Harald Dr. Trauthwein
Original assignee: Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2002-12-13
Filing date: 2002-12-13
Publication date: 2004-06-24
Also published as: AU2003288237A1; WO2004055177A2; WO2004055177A3

Abstract

Die Erfindung betrifft artifizielle Esterasen, wobei bei den Esterasen, ausgehend von der Aminosäuresequenz einer Schweineleberesterase, mindestens ein definierter Aminosäureaustausch vorgenommen wurde, wodurch die Enantioselektivität des Enzyms geändert und zum Teil die Aktivität und Temperaturstabilität verbessert werden kann.

Description

Die Erfindung betrifft künstlich mutierte, enzymatisch aktive, rekombinante Esterasen, die von einer Schweineleberesterasesequenz abgeleitet sind und hohe enzymatische Aktivität besitzen.

Die Bedeutung von Esterasen als Biokatalystoren in der organischen Synthese oder als Zusatzstoffe in Haushaltsprodukten, wie z. B. Waschmitteln, nimmt seit vielen Jahren stetig zu. Dabei liegt ein Schwerpunkt der Forschung auf der Bereitstellung neuer Esterasen, die sich zum einen durch ihre hohe Enantioselektivität bei der Umsetzung ihrer Substrate und zum anderen durch eine hohe enzymatische Aktivität auszeichnen.

Trotz der großen Bedeutung und der vielfältigen Anwendungsmöglichkeiten stehen erst wenige rekombinante Esterasen zur Verfügung. Dies galt bis vor kurzem insbesondere auch für Schweineleberesterasen, die nur als Extrakte erhältlich waren. Diese Extrakte besitzen vielfältige Nachteile. Neben Schwankungen des Esteraseanteils zwischen verschiedenen Chargen, ist insbesondere die Anwesenheit weiterer Hydrolasen im Extrakt problematisch. Darüber hinaus war es bisher nicht möglich die Extrakte in die einzelnen enthaltenen Isoenzyme zu trennen, so dass auch dadurch die Extrakte in ihren enzymatischen Eigenschaften schwankten. Weiterhin besteht bei der Extraktion der Enzyme, z.B. aus Schweinelebergewebe, die Gefahr einer viralen oder toxischen Verunreinigung des Extraktes.

Um diese Probleme zu lösen wurde die Klonierung putativer Schweineleberesterase-Gene durchgeführt (Matsushima, M., et al. FEBS Lett. 293, 37–41 (1991); Swiss-Prot. Acc. No. Q29550), aber die funktionelle Expression eines aktiven Schweineleberesterase-Enzyms ist mit den dort erhaltenen Konstrukten nicht gelungen. Alternativ wurde auch versucht andere Esterasen aus höheren Organismen, wie z. B. eine putative Glycerol-Ester Hydrolase aus dem Verdauungstrakt von Schweinen zu gewinnen (beschrieben in David, L. et al. Eur. J. Biochem. 257, 142–148 (1998); Smialowski-Fleter, S. et al., Eur. J. Biochem. 269, 1109–1117 (2002)). Aber auch dieses rekombinante putative Esterasegen konnte bisher nicht enzymatisch aktiv exprimiert werden.

Die Expression einer reinen rekombinanten funktionsfähigen Schweineleberesterase ist erst spät gelungen (WO 02/48322). Durch die heterologe biotechnologische Herstellung der rekombinanten Esterase konnten erstmals reine Enzyme ohne die Verunreinigung mit anderen Hydrolasen oder Isoenzymen erhalten werden. Die erhaltenen Esterasen zeichnen sich durch eine sehr gute Enantioselektivität gegenüber vielen Substraten aus, die sich auch deutlich von den Eigenschaften der herkömmlichen Schweineleberesterase-Extrakten abhebt.

Für viele, insbesondere technische Anwendungen, wären allerdings Enzyme mit abgewandelten Eigenschaften wie z.B. einer anderen Enantioselektivität oder einer erhöhten Aktivität wünschenswert.

Bei dem Versuch die oben beschriebene putative Glycerol-Esterhydrolase ausgehend von der Aminosäuresequenz der rekombinanten Schweineleberesterase Seq. ID No. 1 (WO 02/48322) durch positionsgerichtete Mutagenese herzustellen, wurden eine Reihe artifizielle mutante Enzyme erzeugt, wobei die enzymatische Aktivität und Temperaturstabilität einiger der erhaltenen artifiziellen Enzyme überraschender weise höher ist, als die der rekombinanten Schweineleberesterase oder der erzeugten Glycerol-Esterhydrolase. Weiterhin zeigen die artifiziellen Mutanten eine gegenüber der rPLE veränderte Enantioselektivität.

Somit wird die Aufgabe durch rekombinante Esterasen enthaltend eine Aminosäuresequenz Seq. ID No. 1 oder einer Variante davon mit mindestens 50 %, bevorzugt von über 70%, besonders bevorzugt von über 80%, ganz besonders bevorzugt von über 90% Sequenzhomologie gelöst, wobei ausgehend von Seq ID No. 1 die Aminosäuresequenz in mindestens einer der Positionsbereiche von 74 bis 79, 90 bis 95, 110 bis 114, 127 bis 141, 193 bis 197, 234 bis 239, 288 bis 296, 365 bis 372 mutiert ist. Bevorzugt ist mindestens eine der Positionen 76, 77, 92, 93, 112, 129, 133, 134, 138, 139, 195, 236, 237, 290, 294, 367 und 370 mutiert. Dabei ist der Austausch, der durch die Seq. ID No. 1 vorgegebenen Aminosäure in den genannten Positionen durch eine andere natürliche oder modifizierte Aminosäure möglich.

Dabei enthalten bevorzugte Mutanten ausgehend von der Aminosäuresequenz Seq. ID No. 1 die folgenden Aminosäurenaustausche:

– Position 76: Valin (V) durch Alanin (A),
– Position 77: Glutaminsäure (E) durch Glycin (G),
– Position 92: Threonin (T) durch Isoleucin (I),
– Position 93: Leucin (L) durch Prolin (P),
– Position 112: Lysin (K) durch Arginin (R)
– Position 129: Leucin (L) durch Valin (V)
– Position 133: Prolin (P) durch Serin (S)
– Position 134: Methionin (M) durch Threonin (T)
– Position 138: Valin (V) durch Leucin (L),
– Position 139: Valin (V) durch Alanin (A),
– Position 195: Prolin (P) durch Threonin (T),
– Position 236: Valin (V) durch Alanin (A),
– Position 237: Alanin (A) durch Glycin (G),
– Position 290: Phenylalanin (F) durch Leucin (L),
– Position 294: Glutamin (Q) durch Prolin (P),
– Position 367: Tyrosin (Y) durch Phenylalanin (F),
– Position 370: Alanin (A) durch Threonin (T).

Bevorzugte Mutanten besitzen die angegebenen Aminosäurenaustausche in den Positionen 92, 93, 112, 138, 139, 236, 237, 367, 370, die sich durch eine erhöhte Aktivitätssteigerung gegenüber den getesteten Modellsubstraten auszeichnen (siehe dazu auch 3). Dabei fällt auf, dass die bevorzugten Mutationen nicht in der direkten Umgebung zum aktiven Zentrum der Esterase, die durch die Aminosäuren der Positionen 80, 186 und 431 gebildet wird, liegen, was zu erwarten gewesen wäre. Enzyme, die in den Positionen 76, 77 195, 290 und 294 mutiert sind zeigen allerdings ebenfalls eine erhöhte enzymatische Aktivität gegenüber den Modellsubstraten. Besonders bevorzugte Enzyme enthalten Mutationen in den Positionen 76, 77, 112, 236 und 237. Artifizielle mutante Enzyme mit einer Mutation in den Positionen 112, 129, 133, 134 zeichnen sich vor allem durch eine hohe spezifische Aktivität bei höheren Temperaturen, bevorzugt bei über 65°C, aus (2). Aber auch Mutationen in den Positionen 195, 236, 237, 290, 294 zeigen eine gesteigerte spezifische Aktivität bei erhöhten Temperaturen.

Durch die Einführung von Mutationen an den entsprechenden Positionen erfolgt nicht nur eine Erhöhung der Aktivität, sondern es erfolgt auch eine Variation der Enantioselektivität des Enzyms. Bezüglich einzelner Substrate konnte auch eine erhebliche Steigerung der Enantioselektivität festgestellt werden. Insbesondere die Einführung einer Mutation in Position 77 der rPLE (Seq. ID No. 1) zeigt eine starken Einfluss auf die Enantioselektivität (6). Weiterhin zeigt sich z. B. bei der Hydrolyse von Carbonsäureestern, dass die Verwendung der rPLE verstärkt zur Bildung von (S)-Enantiomeren führt, während die artifiziellen Enzyme für die Synthese von (R)-Enantiomeren zu bevorzugen sind.

Weiterhin sind Gegenstand der vorliegenden Erfindung artifizielle Esterasen, die ausgehend von der Seq. ID No. 1 N-terminal um bis zu 75, bevorzugt bis zu 50, besonders bevorzugt bis zu 25 Aminosäuren und/oder C-terminal bis zu 100, bevorzugt bis zu 50, besonders bevorzugt bis zu 25, insbesondere bis zu 5 Aminosäuren verkürzte Teilsequenzen besitzen.

Die beanspruchten künstlich mutierten Esterasen umfassen neben den reinen Proteinen auch posttranslational modifizierte Enzyme.

Künstlich mutierte Proteine basierend auf der Aminosäuresequenz Seq. ID No. 1 können direkt als Enzym eingesetzt werden oder als Untereinheit mit gleichen oder unterschiedlichen natürlich vorkommenden oder künstlich mutierten Untereinheiten multimerisieren. So können z. B. die beanspruchten Proteine mit den bekannte natürlich vorkommende Untereinheiten der Schweineleberesterasen des α-, β oder γ-Typs enzymatisch aktive Multimere bilden.

Neben der erhöhten enzymatischen Aktivität besitzen die mutagenisierten Enzyme weitere Vorteile. Insbesondere sind die Enzyme als rekombinante Proteine exprimierbar und somit in reiner Form, also ohne die störenden und schwer zu beseitigenden Verunreinigungen durch andere Hydrolasen oder Isoenzyme, erhältlich. Dabei gelingt die Expression unter Erhalt der Enzymfunktion auch mit gängigen Wirtszellen, wie z. B. mit P. pastoris. Darüber hinaus können einfach Fusionsproteine erzeugt werden, die z. B. an ihrem C-terminalen Ende weitere funktionelle Domänen, wie z. B. eine myc-his Domäne zur leichteren Aufreinigung, enthalten. Der N-Terminus kann ebenfalls fusionierte funktionelle peptidische Domänen enthalten, dabei sind insbesondere Sekretionssignaldomänen von Interesse, wie z. B. der α-Faktor-Signalsequenz oder die ompA-Signalsequenz. Aber auch der N-Terminus der natürlichen Aminosäuresequenz (Swiss. Prot Acc. No. Q29550 oder einer Variante davon mit einer Homologie von über 50%, bevorzugt über 70%, besser über 80% kann N-terminal fusioniert sein.

Die Herstellung der artifiziellen mutanten Enzyme gelingt über eine Expression der entsprechenden mutierten Nukleinsäuresequenzen. Die Einführung der Mutationen wird dabei ausgehend von Seq. ID No. 29 durch die zielgerichtete Mutagenese, z. B. mit Hilfe des QuickChange-Kits von Stratagene, unter Verwendung entsprechender Primer, durchgeführt.

Somit sind ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung Nukleinsäuren, codierend für die erfindungsgemäßen rekombinanten künstlich mutierten Schweineleberesterasen oder Nukleinsäuren die zu diesen codierenden Schweineleberesterase-Nukleinsäuren komplemtär sind und unter stringenten Bedingungen hybridisierenden, wobei ausgehend von der Seq. ID No. 29, die für das Peptid mit der Seq. ID No. 1 codiert, die mindestens in einem Codon der Positionen 76, 77, 92, 93, 112, 129, 133, 134, 138, 139, 195, 236, 237, 290, 294, 367 und 370 mutiert sind. So können z. B. Mutationen an den Positionen 227, 230, 275, 278, 335, 385, 397 und 399, 401 und 402, 412, 416 und 417, 583, 707, 710, 870, 881 und 882, 1100, 1108 eingeführt werden, wobei bevorzugte Basenaustausche aus den mutierten Sequenzen Seq. ID No. 30 bis 38 ersichtlich sind.

Unter dem Begriff der stringenten Hybridisierungsbedingungen ist eine Hybridisierungstemperatur von 60°C, 0,1×SSC in 0.1% SDS zu verstehen. Die codierenden DNA-Sequenzen können, wie z.B. auch in WO 02/48322 beschrieben, in herkömmliche Vektoren kloniert und nach Transfektion von Wirtszellen mit solchen Vektoren in Zellkultur exprimiert werden. Ein geeigneter Vektor ist z. B. der pUC19-Vektor oder der pCYTEX-Vektor für die Transformation von E. coli oder der pPICZα-Vektor für die Transformation der Hefe Pichia pastoris. Innerhalb der Species Aspergillus sp., Schwanniomyces sp., Kluyveromyces sp., Yarrowia sp., Arxula sp., Saccharomyces sp., Hansenula sp. oder Pichia sp. sind weitere interessante einzellige Organismen, die sich als Wirt für die biotechnologische Expression rekombinanter Enzyme als geeignet erwiesen haben. Als bevorzugte Wirtsorganismen sind, neben P. pastoris Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus orycae, Schwanniomyces occidentalis, Kluyveromyces lactis, Yarrowia lipolytica, Arxula adeninivrans, Pichia methanolica, Pichia guilliermondii. oder Hansenula polymorpha zu nennen.

Die codierenden DNA-Fragmente müssen in den Vektoren im offenen Leseraster zu einem Promotor liegen. Als Promotoren sind vor allem starke Promotoren, wie z. B. der lac-, lambda-, T7- ,T4-, der Rhamnose induzierbare-Promotor oder der Alkoholoxidase (AOXI)-Promotor, bevorzugt. Die Vektoren können weitere funktionelle Bereiche enthalten. Neben den Selektionsmarkern und Replikationsstartpunkten sind vor allem genregulatorische Elemente, wie z. B. Operatoren, Repressoren oder Transkriptionsfaktoren von Interesse. Insbesondere eine Konstruktion von Vektoren, die eine reversible, induzierbare oder reprimierbare Expression der rekombinanten mutierten Esterasen zulässt, können eingesetzt werden.

Bevorzugte Wirtszellen zur Transfektion mit Vektoren, enthaltend die mutierten Sequenzen zur Expression der Esterasen, sind einzellige pro- oder eukaryotische Organismen, wie z. B. Aspergillus sp., S. cerevisiae, Hansenula sp., E. coli oder P. pastoris.

Somit ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung die Verwendung von DNA-Fragmenten, die für eine erfindungsgemäße mutanten Schweineleberesterasen und gegebenenfalls für weitere daran fusionierte N- und/oder C-terminale Domänen codieren, zur Klonierung in Vektoren. Weiterhin ist Gegenstand der Erfindung die Verwendung dieser Vektoren zur Transformation von Zellen sowie die Verwendung solcher transformierten Zellen oder Zellkulturen zur Expression der rekombinanten zielgerichtet mutierten artifiziellen Esterasen. Die exprimierten Esterasen können z. B. in monomerer Form isoliert werden, aber auch die Herstellung enzymatisch aktiver multimerer Schweineleberesterasen ist möglich, wobei unterschiedliche Einheiten des Multimers unterschiedliche Mutationen tragen können.

Durch die hohe Reinheit der rekombinanten Enzyme und durch die gesteigerte spezifische Aktivität und zum Teil auch durch die geänderte Enantioselektivität der beanspruchten künstlich mutierten Enzyme eignen Sie sich in besonderem Maße in der organischen Synthese. Als Substrate für die katalytische Umsetzung kommen vor allem aromatisch-aliphatische und aliphatisch-aliphatische Ester in Frage, hierbei vor allem Carbonsäureester chiraler oder prochiraler Alkohole, wobei die Carbonsäurekomponente bevorzugt 2 bis 5 Kohlenstoffatome umfasst und auch verzweigt sein kann. Die enzymatisch-katalytische Racematspaltung der Carbonsäureester, insbesondere der Acetate, ist dabei gegenüber der Umsetzung mit rPLE durch eine verstärkte R-Enantioselektivität gekennzeichnet.

Das Optimum der Enzymaktivität von rekombinanten Schweineleberesterasen, die monomere Untereinheiten gemäß Seq. Id. No. 1 enthalten, liegt bei einem pH zwischen 5 und 10, bevorzugt zwischen 7,5 und 9,5, und bei einer Temperatur zwischen 20°C und 90°C, bevorzugt zwischen 40°C und 80°C, besonders bevorzugt zwischen 50°C oder 65°C und für Enzyme die an den Positionen 129, 133, 134, 195, 236, 237, 290, 294 zusätzlich zwischen 50°C und 80°C.

Weiterhin können die erfindungsgemäßen rekombinanten Enzyme auch bei der Racematspaltung von Carbonsäuren oder bei der Umsetzung von prostereogenen Verbindungen, insbesondere von Diolen oder Dicarbonsäuren eingesetzt werden.

Kurze Beschreibung der Figuren:

1. Zeigt die pH-Abhängigkeit der enzymatischen Aktivität der hergestellten artifiziellen Esterasen, 2 die Temperaturabhzängigkeit. In 3 ist die ermittelte spezifische Aktivität der mutanten Esterasen im Vergleich zu handelsüblichen Esterase-Extrakten und der rPLE gegen über Buttersäuremethylester im Vergleich zu Prolin-β-Naphthylamid dargestellt. 4 und 5 zeigt die Enantioselektivität der Hydrolyse unter Verwendung der mutierten Esterasen bezüglich ausgewählter Substrate.

6: 6 zeigt den Pichia pastoris-Expressionsvektor pPICZαA, der die folgenden wichtigen Sequenz-Elemente beinhalten:

1–940 bp	5'AOX1 Promotor
941–1207 bp	α-Faktor-Signalsequenz
1208–1274 bp	multiple Klonierungsstelle
1275–1304 bp	c-myc-Epitop
1320–1337 bp	his-Tag
1341–1682 bp	3'AOX1 Terminationsstelle
1683–2094 bp	TEF1, S. cerevisiae-Transkryptions-Elongations-Faktor1-Promotor
2095–2162 bp	EM7, synthetischer prokaryotischer Promotor
2163–2537 bp	Sh ble: Streptoalloteichus hindustanus Bleomycin-Gen (verantwortlich für Zeocinresistenz)
2538–2855 bp	CYC1 Terminationsstelle (aus dem S. cerevisiae-CYC1-Gen)
2866–3539 bp	pUC ori (Replikationsursprung für E. coli)

Im folgenden sind zur Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung einige Ausführungsbeispiele gegeben:

Allgemeines:

Für die Klonierung in E. coli und Expression in P. pastoris wurde ein shuttle-Vektor pPICZαA von Invitrogen benutzt (6).

Die zur Klonierung und Expression verwendeten Stämme sind im folgenden aufgelistet:

Gewebepräparation, mRNA Isolierung, und Klonierung der rPLE-cDNA Die Klonierung des nativen Schweineleberesterasegens in E. coli DH5α, enthaltend die für die rPLE codierende Seq. ID No. 29, erfolgt gemäß der Vorschrift aus WO 02/48322 (Beispiel 1 und 2), wobei direkt im Anschluss an die rPLE Sequenz Seq. ID No. 29 eine Sequenz, codierend für ein myc-Epitop und einen his-tag (Seq. ID No. 41), kloniert (pPICZα-mPLE*-tag) ist.

Für die Isolierung der Plasmid-DNA aus E. coli DH5α wurde eine Plasmid-Präparationsmethode verwendet, die auf der alkalischen Lyse von Zellen und der spezifischen Bindung von DNA an Ionenaustauschersäulen (QIAgen) beruht.

Zur Gewinnung der DNA in kleinen Mengen (ca. 1 μg) wurde das Plasmid-Miniprep-Kit (QIAgen) verwendet, nach Abtrennung der Zellen einer 3 ml ÜN-Kultur durch Zentrifugation (16000 × g, 1 min, Tischzentrifuge) und Verwerfen des Kulturüberstandes, erfolgte die weitere Durchführung der Plasmidisolierung nach Angaben des Herstellers. Zur Präparation größerer Mengen Plasmid-DNA (ca. 10 μg) wurde ein Plasmid-Midiprep-Kit (QIAgen) benutzt. Als Ausgangsmaterial diente in diesem Fall eine 50 ml ÜN-Kultur, die 10 min bei 4000 × g und 4°C zentrifugiert wurde. Die Plasmid-Isolation aus dem Zellpellet wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt.

Zur positionsgerichteten Mutagenese wird der so erhaltene Verktor, pPICZα-mPLE*-tag verwendet.

Beispiel 1: Positionsgerichtete Mutagenese
Die Mutagenese wird ausgehend von dem pPICZα-mPLE*-tag Template durchgeführt. Die einzelnen Mutationen codierend für die Aminosäureaustausche werden dabei gemäß Tab. 1 sukzessive, jeweils ausgehend von der im vorherigen Mutationsschritt gewonnen Nukleinsäure eingeführt.
Die positionsgerichtete Mutagenese wird über eine PCR-Reaktion mit Hilfe des QuikChange^TM Site Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) unter Beachtung der vom Hersteller angegebenen Verfahrensbedingungen durchgeführt. Dabei wird das verwendete pPICZα-mPLE*-tag Plasmid mit zwei komplementären Primern, die die gewünschte Mutation enthalten, mit Hilfe der Pfu-DNA-Polymerase amplifiziert, wobei die in Tab. 2 angegebenen Primer für die positionsgerichtete Mutagenese verwendet werden. Das Reaktionsgemisch enthaltend die methylierte Matrizen-DNA wird anschließend zu deren Abbau 1 h bei 37°C durch Zugabe von 1 μl Dpnl verdaut. Zum Aufreinigen der erhaltenen künstlich mutierten DNA-Sequenzen nach der PCR wurde der QIAquick PCR Purification Kit nach vom Hersteller (QIAgen) gegebenen Angaben benutzt.
So wurden 17 Aminosäure-Codons in Seq. ID No. 29 durch den Austausch von 21 Nukleotiden verändert.
Die PCR-Reaktion wurde unter folgenden Bedingungen durchgeführt:
Ansatz zur Mutagenese durch QuikChange-Methode.
PCR-Thermocycler-Programm zur Mutagenese mit Hilfe des QuikChange^TM-Verfahrens.
Die auf diese Weise vorbereiteten, mutierten Plasmide werden in E. coli transformiert zur weiteren Vermehrung transformiert. Die Transformation von E. coli (XL10-Gold oder DH5α) mit den erhaltenen DNA-Plasmiden erfolgt durch chemische Behandlung (Mg²⁺, DMSO) und Hitzeschock kompetenter Zellen.
Es wurden für maximal 10 Transformationen 50 ml LB-Medium 1:100 (0,5% (w/v) Hefeextrakt, 1% (w/v) Trypton, 1% (w/v) NaCl, (2% (w/v) Agar für die Agarplatten) mit einer E. coli Übernacht-Kultur angeimpft und 2 – 3 Stunden bei 37°C und 200 upm bis zu einer OD₆₀₀ von 0,4 – 0,7 inkubiert. Die Transformationskultur wurde steril in ein 50 ml Falcon-Röhrchen überführt und die Zellen 10 min bei 1750 × g und 4°C abzentrifugiert. Das Zellpellet wurde in 2 ml eiskalter TSS-Lösung (10% (w/v) PEG 6000, 5% (v/v) DMSO, 50 mM MgSO₄, ad 100 ml LB-Medium, autoklaviert) resuspendiert, in zehn 1,5 ml Eppendorf-Tubes (je 200 μl) verteilt und anschließend 5 min auf Eis gekühlt. Anschließend werden 1 – 3 μl der Plasmid-DNA zu je 200 μl Zellsuspension pipettiert und der Transformationsansatz auf Eis gestellt. Nach 20 min werden die Zellen zunächst 30 – 45 sec bei 42°C im Wasserbad (Hitzeschock) und nach Zugabe von 800 μl LB-Medium 1 h bei 37°C inkubiert. Zur Positiv-Selektion der erfolgreich transformierten Zellen wird die Zellsuspension auf LB_LSZeocin-Agarplatten (1% (w/v) Hefeextrakt, 1% (w/v) Trypton, 0,5% (w/v) NaCl, (2% (w/v) Agar für die Agarplatten) ausgestrichen und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die Isolierung und Aufarbeitung der mutierten Plasmid DNA erfolgt wie oben für den rPLE-Vektor beschrieben. Anschließend wird die mutierte Nukleinsäuresequenz zur Kontrolle sequenziert.
Ein Teil der isolierten mutierten Plasmid DNA wird für die Erzeugung der folgenden mutanten Nukleinsäuresequenz verwendet.
Es wurden so neun mutierte Nukleinsäuresequenzen erzeugt. Die codierenden DNA-Sequenzen der artifiziellen Esterasen sind in Seq. ID No. 2 bis 10 wiedergegeben. Die Zusammenstellung der Mutationen auf Basis der Aminosäuresequenzen sind in Tab. 1 dargestellt.
Tab.1: Mutationen in den Aminosäuresequenzen der Varianten der rPLE
Tab. 2: Sequenzen der für die zielgerichtete Mutagenese verwendeten Primer
Beispiel 2: Herstellung der veränderten Enzyme
Die aus Beispiel 1 erhaltenen Plasmide werden zur Vorbereitung größerer Mengen linearisierten Plasmids für die Transformation von P. pastoris einem präparativen Restriktionsverdau mit Pmel unterzogen. Dazu werden 6 μg Plasmid DNA mit der folgenden Pufferlösung versetzt:

dH₂O	ad 65 μl
Puffer4 (Promega)	6,5 μl
BSA-Lösung	0,65 μl
Pmel	5 μl

Die Plasmid DNA wird über Nacht bei 25°C verdaut.
Zum Aufreinigen der verdauten Plasmid DNA wird der QIAquick PCR Purification Kit nach Anleitung des Herstellers (QIAgen) benutzt.
Zur Transformation in P. pastoris werden 50ml YPD-Medium (Yeast-Extract-Peptone-Dextrose-Medium; 1% (w/v) Hefe-Extrakt, 2% (w/v) Pepton, nach dem Autoklavieren 10% (v/v) 10 × D-Lösung zugeben, (2% (w/v) Agar für die Agarplatten) mit P. pastoris X33 unter Schütteln bei 30°C bis zu einer OD₆₀₀ von 1,0 herangezogen. Die erhaltene Zellsuspension wird für 10 min bei 1500 × g und Raumtemperatur zentrifugiert, der Überstand verworfen und die Zellen einmal mit 25 ml sterilem Wasser gewaschen. Die Zellen werden nochmals abzentrifugiert, in 1 ml 100 mM LiCl aufgenommen, dann wird die Zellsuspension in ein Mikroreaktionsgefäß überführt. Die Zellen werden erneut sedimentiert (max. Geschwindigkeit in der Tischzentrifuge, 15 s), der Überstand abpipettiert und verworfen und das Zellpellet in 400 μl 100 mM LiCl resuspendiert. 50 μl-Portionen der resuspendierten Zellen werden in 1,5-ml-Mikroreaktionsgefaße zur direkten Weiterverarbeitung aufgeteilt. Kurz vor der Transformation werden die Zellen nochmals abzentrifugiert und die LiCl-Lösung über den Zellen wird entfernt. Zur Transformation werden Lösungen in folgender Reihenfolge zu den Zellen pipettiert: 240 μl 50% (w/v) PEG, 36 μl 1 M LiCl, 25 μl 2 mg × ml-1 fragmentierte Heringssperma-DNA und 5–10 μg Plasmid-DNA in 50 μl sterilem Wasser. Die Zellen werden durch 1 min vortexen vollständig gelöst und anschließend 30 min ohne Schütteln bei 30°C und danach 20–25 min bei 42°C (Hitzeschock) mit der Plasmid DNA inkubiert. Die Zellen werden abzentrifugiert (3500–6000 × g), der Überstand verworfen und das Pellet in 1 ml YPD resuspendiert und bei 30°C geschüttelt. Nach 1 h und nach 4 h werden jeweils 25-, 50- und 100-μl-Portionen auf YPD-Agarplatten mit 100 μg ml^–1 Zeocin ausplattiert. Die Agarplatten werden bei 30°C bis zum Erscheinen von sichtbaren Kolonien bebrütet (2–3 Tage).
Zur Identifizierung enzymatisch aktiver P. pastoris Klone werden einzelne transformierte Zellen auf YPD-Zeocin-Agarplatten überführt. Nach 24 Stunden Inkubation bei 30°C werden in den Deckel der Petrischale alle 24 h 100 μl Methanol zugegeben, um die Produktion der Esterase zu induzieren. Nach 2–3 Tagen werden die Agarplatten mit 10 ml Softagar (0,5% Agar in Wasser), gemischt mit 100 μl α-Naphthylacetat (40 mg/ml in DMF) und 100 μl Fast Red TR (100 mg/ml in DMSO), beschichtet. Während der Hydrolyse entsteht α-Naphthol, der mit Fast Red einen farbigen Komplex bildet. Positive Klone färben sich braun.
Nach der Identifizierung enzymatisch aktiver Klone werden in einem 50-ml-Rörchen mit 10 ml BMGY-Medium (2% (w/v) Pepton, 1% (w/v) Hefeextrakt, 1 (v/v) Glycerin, nach dem Autoklavieren, 10% (v/v) Phosphatpuffer (1 M, pH 6,0), 0,2% (v/v) 500xB zugeben) mit den Klone geimpft. Die Expression erfolgt in kleinem Maßstab bei 30°C und 200 upm. Bei OD₆₀₀ im Bereich 2–6 (nach ca. 16 h) werden die Zellen abzentrifugiert (2000 × g, 5 min, RT) und in 2 ml BMMY-Medium (2% (w/v) Pepton, 1% (w/v) Hefeextrakt, nach dem Autoklavieren, 10% (v/v) Phosphatpuffer (1 M, pH 6,0), 0,2% (v/v) 500×B, 0,5% (v/v) Methanol zugeben) resuspendiert. Mit dieser Suspension wurden 20 ml des BMMY-Mediums in 100 ml Kolben (bis OD von ca. 1) angeimpft. Die Kulturen wurden bei 30°C und 200 upm inkubiert und alle 24 h Methanol (0,5% des Kulturvolumen) zugegeben. Es werden Proben nach 0,5, 24 und 48 h entnommen. der Überstand, der das exprimierte Enzym enthält wird durch Ultrafiltration aufkonzentriert. Dazu werden Centrikons-Plus 20 30K mit einer Ultracel-PL Membrane benutzt, die eine 25 bis 100-fache Konzentration der Esteraselösung erlaubt. Die Bestimmung der Aktivität des konzentrierten Überstandes erfolgt mit Hilfe des pNPA-Assays. Nach der Aufkonzentrierung durch Ultrafiltration wird der Erfolg der Enzymexpression mit einer nativen PAGE kontrolliert.
Zur Expression größerer Enzymmengen werden 100 ml BMGY-Medium in 500-ml-Kolben in einer Übernacht-Kultur (3ml YPD-Medium) angeimpft und bei 30°C und 200 rpm inkubiert. Bei OD₆₀₀ im Bereich 2–6 (nach ca. 16 h) werden die Zellen abzentrifugiert (2000 × g, 5 min, RT) und in 10 ml BMMY-Medium resuspendiert. Mit dieser Suspension werden 200 bis 400 ml des BMMY-Mediums in 1 l bzw. 2 l Kolben (bis OD von ca. 1) angeimpft. Die Kulturen werden bei 30°C und 200 rpm inkubiert, alle 24 h wird Methanol (0,5% des Kulturvolumen) zugegeben. Die Kultivierung wird 72 Stunden durchgeführt, danach werden die Zellen abzentrifugiert und der Überstand weiterverarbeitet. Zur Bestimmung der Aktivität der exprimierten Enzyme wird ein pNPA-Assay (Vorschrift siehe Bsp. 3.4) durchgeführt.
Die Ergebnisse der pNPA-Assays sind in Tab. 3 dargestellt.
Tab. 3: Volumetrische und spezifische Aktivität im Überstand nach der Kultivierung und Aufkonzentrierung
Beispiel 3: Weitere Charakterisierung der Enzyme
3.1. Bestimmung des Molekulargewichts
Das Molekulargewicht der Enzyme wurde mit einem Ferguson Plot (natives Gel) und einem Gradienten-Gel (PhastSystem) bestimmt:
Mit Hilfe eines Ferguson Plots wurden bevorzugt Enzyme Trimere mit einem Molekulargewicht von ca. 180 kDa gefunden. Mit dem Gradienten-Gel (PhastSystem), bei dem die halblogarhythmische Auftragung von Molekulargewicht gegen Wanderungsstrecke des Proteins eine lineare Abhängigkeit zeigt, wird ebenfalls ein Molekulargewicht von ca. 180 kDa ermittelt.
3.2. Bestimmung des isoelektrischen Punktes:
Die isoelektrische Fokussierung der Enzyme wurde mittels PhastSystem durchgeführt. Es wurden dazu zwei verschiedene Gele benutzt, eines mit einem pH-Bereich von 3 – 9 und das zweite mit einem pH-Bereich von 4 – 6.5.
Zusätzlich wurden als Vergleich alle isoelektrischen Punkte auch theoretisch mit einem Computerprogramm (DNAsis) berechnet. Die Zusammenstellung der Ergebnisse ist in Tab. 4 wiedergegeben.
Tab. 4: Ergebnisse der pl-Bestimmung
3.3. Proteingehaltbestimmung
Die Bestimmung des Proteingehaltes wurde auf einem SDS-PAGE-Gel durchgeführt. Für die Standardkurve wurden verschiedene Konzentrationen an BSA benutzt. Die Intensität der Proteinbanden wurden mit dem Computerprogramm NIH-Imager nach dem Scannen des Gels gemessen und auf diese Weise der Proteingehalt berechnet (Tab. 5). Herkömmliche Methoden (Bradford, BCA-Test) haben sich für die Bestimmung des Proteingehalts im Überstand einer Pichia-Kultur als nicht geeignet erwiesen, da im Medium störende peptidhaltige Bestandteile enthalten sind.
Tab. 5: Proteingehalte der rekombinanten Enzyme.
3.4. Kinetische Daten
Die Bestimmung der kinetischen Daten erfolgte mittels pNPA-Assays (Konzentrationsbereich 0,1–5 mM). K_m und V_max wurden aus einem Lineweaver-Burk-Plot berechnet.
Tab. 6: Kinetische Daten der rekombinanten Enzyme
Bestimmung der Esteraseaktivitäten mit Hilfe des pNPA-Assay
Zur photometrischen Bestimmung von Esteraseaktivität wird die Hydrolyse von p-Nitrophenylacetat (pNPA) verwendet. Als Produkt entsteht p-Nitrophenol das bei einer Wellenlänge von 410 nm quantifiziert wird. Der molare Extinktionskoeffizient (ε) ist pH-abhängig, im folgenden sind die für verschiedene pH-Werte bestimmten Extinktionskoeffizienten angegeben.
Extinktionskoeffizienten für p-Nitrophenol in Abhängigkeit vom pH-Wert.
Die Messung der Reaktionsgeschwindigkeit erfolgt während einer Minute in Abständen von einer Sekunde in einer 1 ml Küvette bei Raumtemperatur. Die eingesetzte Assay-Lösung besteht aus 800 μl Natriumphosphatpuffer (50 mM, pH 7,5), 100 μl Enzymlösung und 100 μl Substratlösung (pNPA in DMSO, 10 mM für Standardmessungen oder von 0,1 bis 100 mM für enzymkinetische Bestimmungen). Als Blindprobe wird immer die Autohydrolyse des pNPAs in Puffer gemessen. 1 U der Esteraseaktivität entspricht der Menge an Enzym, die während einer Minute 1 μmol p-Nitrophenol freisetzt.
Beispiel 4: pH-Profile der enzymatischen Aktivität
Die pH-Profile wurden mit Hilfe des pNPA-Assays (Durchführung siehe Bsp. 3) bestimmt. Die Aktivitätsmessung erfolgte in Phosphatpuffer bei den entsprechenden pH-Werten. Die Profile sind sehr ähnlich mit Ausnahme der Mutante GEH-PLEe. Die höchste Aktivität wurde für alle Enzyme im Bereich von pH 8 bis 9 beobachtet (Tab. 7, 1).
Tab. 7: Volumetrische und spezifische Aktivität der rekombinanten Enzyme bei pH-Optimum
Die pH-Profile der rekombinanten mutanten Enzyme sind graphisch in 1 wiedergegeben. Die höchste Aktivität wurde für jedes Enzym als 100% betrachtet und mit den anderen Aktivitäten verglichen.
Beispiel 5: Temperaturprofile
Die Temperaturprofile wurden mittels pH-Stat-Methode (Durchführung siehe Bsp. 6) bei verschiedenen Temperaturen bestimmt. Als Substrat wurde Tributyrin verwendet. Für 30 ml substrathaltiger Emulsion wurde jeweils 0.5 U (pNPA) an Enzym verwendet. Die freigesetzte Buttersäure wurde mit 0.01 M NaOH titriert, wobei der pH-Wert konstant bei 7.5 gehalten wurde. (Ergebnisse siehe Tab. 8, 2). Mit steigender Anzahl an Mutationen steigt auch die Temperaturstabilität der Enzyme: bei 70°C ist rPLE nicht mehr aktiv und rGEH hat sein Optimum.
Tab. 8: Spezifische Aktivität der rekombinanten Enzyme bei Temperatur-Optimum.
Die Temperatur-Profile der rekombinanten mutanten Enzyme sind in 2 wiedergegeben. Die höchste Aktivität wurde für jedes Enzym als 100% betrachtet und mit den anderen Aktivitäten verglichen.
Beispiel 6: Hydrolyse von Buttersäuremethylester und Prolin-β-Naphthylamid
Die Hydrolyse von Buttersäuremethylester wurde mit der pH-Stat-Methode durchgeführt, wobei zu einer Substratlösung (30 ml) bestehend aus 2% w/v Gummi Arabicum, 5% v/v Substrat in Wasser, die mit einen Homogenisator emulgiert ist, eine bekannte Menge an Enzym zugegeben wird. Die in der Reaktion freigesetzte Säure wird mit Natronlauge zurücktitriert, um den pH-Wert konstant zu halten. Dazu wird die freigesetzte Buttersäure mit 0.01 M NaOH titriert wobei der pH-Wert konstant bei 7.5 gehalten wird (bei 37°C).
Aus der Menge an verbrauchter Natronlauge wird die Menge der freigesetzten Säure berechnet, die mit der Aktivität des Enzyms korreliert. 1 U entspricht dabei der Menge an Enzym, die 1 μmol Säure pro Minute freisetzt.
Für 30 ml substrathaltiger Emulsion werden jeweils 1 U (aus pNPA-Assay) an Enzym verwendet.
Die Ergebnisse der Hydrolyse sind in Tab. 9 wiedergegeben.
Die Hydrolyse von Prolin-β-Naphthylamid wird mit einem Fast Garnet Assay photometrisch verfolgt. Dazu wird jeweils 0.5 U (pNPA) an Enzym eingesetzt. In der Reaktion freigesetztes β-Naphthylamin bildet einen rosafarbigen Komplex mit Fast Garnet der bei 520 nm (ε = 24,03·10³ M^–1 cm^–1) detektiert werden kann.
Zur Durchführung der Reaktion wird das Reaktionsgemisch (500μl) bestehend aus Tris/HCl (0,1 M, pH 8,0), 50 μl Substratlösung (0,2 mM in DMSO) und Esteraselösung (0,4 – 0,5 U (aus pNPA-Assay)) in einem Thermomixer bei 37°C zur Reaktion gebracht. Nach 30 min wird Fast Garnet-Lösung (1,5 ml, 15% w/v, erst mit Ethanol gelöst dann mit 4% Brij-Lösung nachgefüllt) zugegeben und die Absorption sofort gemessen.
1 U Amidaseaktivität entspricht der Menge an Enzym, die während einer Minute 1 μmol β-Naphthylamin freisetzt.
Die Ergebnisse der Hydrolyse sind ebenfalls in Tab.9 wiedergegeben.
Tab. 9: Ergebnisse der Hydrolyse von Buttersäuremethylester und Prolin-β-Naphthylamid (als Vergleichssubstanz) mit allen rekombinanten Enzymen.
Die Ergebnisse der Reaktionen sind ebenfalls in Diagramm 3 dargestellt. Dort wird die spezifischen Aktivität kommerziell erhältlicher (PLE Fluka und PLE Chirazyme E2) und rekombinanter Esterasen gegen Buttersäuremethylester zu Prolin-β-Naphthylamid gezeigt. Dabei zeigt sich eine gesteigerte Aktivität der Mutanten a bis f und h gegenüber der rPLE.
Beispiel 7: Untersuchung der Stereoselektivitäten der enzymatischen Hydrolyse
Die Hydrolyse wird in 1,5 ml Reaktionsgefäßen in einem Thermomixer (Eppendorf) bei 37°C durchgeführt. Für 1 ml Substratlösung (10 mM in Natriumphosphatpuffer pH 7,5, 50 mM) werden immer 0,5 U Esterase (bezogen auf den pNPA-Test) verwendet. Zu den in den Tabellen angegebenen Zeiten werden Proben aus dem Reaktionsgemsich entnommen. Zum Abbruch der Reaktion wird das Gemisch mit Methylenchlorid extrahiert und die organische Phase über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet.
Die Bestimmung der Enantiomerenreinheit und des Umsatzes erfolgt gaschromatographisch. Die Ergebnisse sind in Tab. 10 bis 15 und in 4 gezeigt.
Tab. 10: Enantioselektivität von verschiedenen rekombinanten Esterasen in der Hydrolyse von 1-Phenyl-1-Ethylacetat. Alle Enzyme zeigen eine (R)-Präferenz
Tab. 11: Enantioselektivität von verschiedenen rekombinanten Esterasen in der Hydrolyse von 1-Phenyl-1-Propylacetat. Alle Enzyme zeigen eine (R)-Präferenz
Tab. 12: Enantioselektivität von verschiedenen rekombinanten Esterasen in der Hydrolyse von 1-Phenyl-3-Butylacetat.
Tab. 13: Enantioselektivität von verschiedenen rekombinanten Esterasen in der Hydrolyse von 1-Phenyl-2-Propylacetat. Alle Enzyme zeigen eine (S)-Präferenz
Tab. 14: Enantioselektivität von verschiedenen rekombinanten Esterasen in der Hydrolyse von 1-Phenyl-2-Pentylacetat.
Tab. 15: Enantioselektivität von verschiedenen rekombinanten Esterasen in der Hydrolyse von 1-Phenyl-2-Butylacetat. Alle Enzyme zeigen eine (S)-Präferenz.
4 gibt die erhaltenen Ergebnisse graphisch wieder. Oberhalb der X-Achse: (S)-Präferenz, unterhalb: (R)-Präferenz. Werte oberhalb der X-Achse zeigen S-Präferenz des jeweiligen Enzyms an, Werte unterhalb der X-Achse zeigen R-Präferenz. Durch die eingeführten Mutationen wurde die R-Präferenz der Esterase erhöht bzw. die S-Präferenz erniedrigt. Somit sind die getesteten mutierten Enzyme für die Herstellung von R-Enantiomeren besonders geeignet.
Beispiel 8: Weitere Untersuchung zur Enantioselektivität
Um die Mutation genauer einzugrenzen, die besonders starken Einfluss auf die Enantioselektivität der Hydrolyse besitzen wurden zwei weitere artifizielle mutante Enzyme Seq. ID No. 39 (PLE-GEHa1) und 40 (PLE-GEHa2) wie in Beispiel 1 und 2 beschrieben hergestellt. Als Modelsubstrat wurde 1-Phenyl-ethylacetat (grau) und 1-Phenyl-1-ethylacetat (schwarz) verwendet und wie in Beispiel 7 beschrieben enzymatisch umgesetzt. Der E-Wert wird bei einem Umsatz von ca. 50% berechnet. Die Ergebnisse sind in 5 dargestellt. 5 zeigt, dass vor allem der Aminosäureaustausch in Position 77 für die Steigerung der Enantioselektivität hin zu den R-Enantiomeren verantwortlich ist.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Artifizielle Esterasen enthaltend eine Aminosäuresequenz Seq. ID No. 1 oder einer Variante davon mit einer Sequenzhomologie von mindestens 50 % dadurch gekennzeichnet, dass ausgehend von Seq ID No. 1 die Aminosäuresequenz mindestens eine Mutation in den Positionsbereichen von 74 bis 79, 90 bis 95, 110 bis 114, 127 bis 141, 193 bis 197, 234 bis 239, 288 bis 296, 365 bis 372 besitzt, wobei das Enzym N-terminal um bis zu 75 Aminosäuren und/oder C-terminal um bis zu 100 verkürzt vorliegen kann.
Artifizielle Esterasen gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass ausgehend von der Aminosäuresequenz Seq. ID No. 1 mindestens einer der folgenden Aminosäurenaustausche vorliegt: – Position 76: Valin (V) durch Alanin (A), – Position 77: Glutaminsäure (E) durch Glycin (G), – Position 92: Threonin (T) durch Isoleucin (I), – Position 93: Leucin (L) durch Prolin (P), – Position 112: Lysin (K) durch Arginin (R), – Position 129: Leucin (L) durch Valin (V), – Position 133: Prolin (P) durch Serin (S), – Position 134: Methionin (M) durch Threonin (T), – Position 138: Valin (V) durch Leucin (L), – Position 139: Valin (V) durch Alanin (A), – Position 195: Prolin (P) durch Threonin (T), – Position 236: Valin (V) durch Alanin (A), – Position 237: Alanin (A) durch Glycin (G), – Position 290: Phenylalanin (F) durch Leucin (L), – Position 294: Glutamin (Q) durch Prolin (P), – Position 367: Tyrosin (Y) durch Phenylalanin (F), – Position 370: Alanin (A) durch Threonin (T).
Artifizielle Esterasen mit einer erhöhten spezifischen Aktivität gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2 dadurch gekennzeichnet, dass sie in mindestens einer der Positionen 76, 77, 92, 93, 112, 138, 133, 195, 290, 294, 236, 237, 367, 370 mutiert sind.
Artifizielle Esterasen mit einer gegenüber rPLE veränderten Enantioselektivität gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sie in der Positionen 77 mutiert sind.
Artifizielle Esterasen mit einer erhöhten Temperaturstabilität gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sie in mindestens einer der Positionen 112, 129, 133, 134 195, 236, 237, 290, 294 mutiert sind.
Artifizielle Esterasen gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Aminosäuresequenz gemäß Seq. ID No. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 enthalten.
Multimere Esterasen enthaltend mindestens eine artifizielle Esterase gemäß einem der vorherigen Ansprüche als Untereinheit.
Rekombinante Nukleinsäuren codierend für artifizielle Esterasen gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei ausgehend von der Seq. ID No. 29, mindestens eines der Codons 76, 77, 92, 93, 112, 129, 133, 134, 138, 139, 195, 236, 237 290, 294, 367, 370 mutiert ist oder eine mit deren komplementärer Sequenz unter stringenten Bedingungen hybridisierenden Nukleinsäure, die in der mindestens eines der genannten Codons mutiert ist.
Rekombinante Nukleinsäuren codierend für artifizielle Esterasen gemäß Anspruch 7 dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuren eine Sequenz gemäß Seq. ID No. 30, 31, 32, 33, 34, 35. 36, 37 oder 38 enthalten.
Rekombinante Vektoren enthaltend eine Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 8 oder 9.
Expressionssysteme umfassend eine Wirtszelle, die mit einem rekombinanten Vektor gemäß Anspruch 10 transfiziert ist.
Verwendung von rekombinanten Nukleinsäuren gemäß Anspruch 8 oder 9 oder Vektoren gemäß Anspruch 10 oder eines Expressionssystems gemäß Anspruch 11 zur Expression artifizieller Esterasen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 oder multimerer Esterasen gemäß Anspruch 7.
Verwendung von artifiziellen Esterasen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 oder von multimeren Esterasen gemäß Anspruch 7 zur biokatalytischen Umsetzung von Carbonsäurederivaten.
Verwendung von artifiziellen Esterasen oder von multimeren Esterasen gemäß Anspruch 13 zur Hydrolyse oder Synthese von Carbonsäureestern.
Verwendung von artifiziellen Esterasen oder von multimeren Esterasen gemäß Anspruch 13 zur enantioselektiven Umsetzung von Carbonsäurederivaten.
Verwendung von artifizielle Esterasen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 oder von multimeren Esterasen gemäß Anspruch 7 als Zusatzstoff in Waschmitteln oder Haushaltsreinigern.