DD299195A5

DD299195A5 - Stabilisierung von carboxalesterase

Info

Publication number: DD299195A5
Application number: DD90340233A
Authority: DD
Inventors: Johanna H G M Mutsaers; Cornelis J Van Der Laken; Cornelis P Broekhuizen; Wilhelmus J Quax
Original assignee: ��`��@�K@�Kk��
Priority date: 1989-04-28
Filing date: 1990-04-27
Publication date: 1992-04-02
Also published as: PT93894A; CN1093880C; PT93894B; ZA903242B; IL94238A0; NZ233459A; NO905415D0; EP0395181A1; NO905415L; JPH03505678A; NO306958B1; FI100888B; KR920700284A; HUT59960A; HU904504D0; AU621756B2; CN1046935A; CA2018345A1; HU210677B; WO1990013635A1

Abstract

Carboxylesterase wird durch verschiedene chemische Verbindungen wie Naproxen oder Diclofop inaktiviert. Durch Substituieren oder Modifizieren bestimmter basischer Rueckstaende der Carboxylesterase zeigt dieses Enzym bei der Anwendung verbesserte Stabilitaetseigenschaften. Auf diese Weise koennen selbst bei hohen Substratkonzentrationen stereospezifische Hydrolysereaktionen im grosztechnischen Maszstab durchgefuehrt werden.{Mikrobiologie; mikrobiologischer Prozesz; Substituieren bzw. Modifizieren basischer Rueckstaende; Caboxylesterase; Naproxen; Diclofop; Enzymstabilisation; stereospezifische Hydrolysereaktionen}

Description

Ausgangssituation der Erfindung

Die US-Patentschrift 4.886.7 jO beschreibt die Anwendung von Esterasen bei der stereoselektiven Hydrolyse von Estern von 2-Arylpropionsäuren. In diesen Dokument wird das für die Hydrolyse von (S)-Naproxenestern verantwortliche Enzym charakterisiert. Das entsprechende Esterasegen wurde aus dem Stamm Bacillus subtitle Thai I-8 gewonnen (CBS 679.85). Dieses Gen, das das für die stereoselektive Umwandlung von (R,S)-Naproxenester verantwortliche Enzym kodiert, wurde in E. coil und Bacillus subtilis vermehrt. Es wurde gefunden, daß die Esterasewirksamkeit durch die Einbringung von Mehrfachgenkopien in mehrere Bacillus subtilis (u.a. CBS 673.86) verbessert wurde. Die Eignung des Mikroorganismus und des daraus abgeleiteten Enzyms für den Einsatz in einem Verfahren zur Hydrolyse von S-Naproxenester wurde daher ebenfalls verbessert.

In diesem 'JS-Patent werden nur geringe Substratkonzentrationen (Naproxen oder Ibuprofen) angewendet. Im Gegensatz dazu sind bei kommerziellen Anwendungen hohe Produktkonzentrationen erforderlich, um ökonomisch attraktive Ergebnisse zu erreichen. Allerdings ist bei Tests mit hohen Substratkonzentrationen (unter kommerziellen Bedingungen) eine irreversible Inaktivierung des Enzyms beobachtet worden. So ist beispielsweise Carboxylesterase, die aus Bacillus Thai I-8 gewonnen wurde, innerhalb von einer Stunde fast vollständig inaktiviert worden, nachdem 30g/l Naproxenester hinzugegeben worden sind (pH = 9,T = 40°CundTween80[TM] mittel). Die Esterase als solche ist bei pH = 9 und T = 40°C (mit und ohne Tween 80(TM]) mehrere Stunden lang stabil. Währeno der stereoselektiven Hydrolyse von (R,S)-Naproxenester wurde das Enzym durch das während der Hydrolyse gebildete Naproxen inaktiviert. Aus diesem Grunde konnten hohe Ausbeuten an Naproxen nicht gewonnen werden.

Das Enzym Carboxylesterase kann in verschiedenen anderen stereospezifischen Esterasehydrolysereaktionen eingesetzt werden. Es wird allerdings festgestellt, daß das Produkt (die Säure) dieser Reaktionen oft das Enzym inaktiviert, wenn die Reaktion unter kommerziell interessanten Ausgangsbedingungen des Esters stattfindet.

Die Carboxylesterase kann in der stereospezifischen Hydrolyse von Diclofopestern eingesetzt werden, die zu der entsprechenden enantiomeren reinen (S)-Säure führt. Dieses Verfahren ist in der EP-A-0299559 beschrieben. Das gebildete Diclofop wird das Enzym unter kommerziell attraktiven Umwandlungsbedingungen inaktivieren.

Andere Verbindungen, die das Enzym inaktivieren, sind beispielsweise 2-Naphthoxyessigsäure, Ibuprofen, 2-Naphthol und Phenol. Aus der Literatur ist bekannt, daß Enzyme aufgrund ihrer geringen thermischen Stabilität inaktiviert werden. Bei erhöhten Temperaturen kann es zu einer Auffaltung des Enzyms kommen. Eine Wärmebehandlung bewirkt insbesondere ein Aufspalten der Wasserstoffbindungen (siehe z. B. R. D. Schmid, Advances in Biochemical Engineering 12, Ghose, Flechter & Blakebrough [Hg.], Springer, Berlin [1B79) S.41-115). Eine thermische Auffaltung von Enzymen kann allerdings durch Immobilisierung oder Vernetzung des Enzyms verringert werden. So hat zum Beispiel eine^ernetzung mit Glutaraldehyd die thermische Stabilität von Papain (Royer et Jl., FEMS Lett. 80 {1977] 1) und Subtilopeptidase (Boutirant et al., Biotechnol. Bioeng. 18 [1976] 1719) verbessert. Selbst der Mechanismus der Thermostabilisierung ist noch nicht gut bekannt. E.T. Reese und M. Manders (Biotechnol. Bioeng. 22 [2] 1980 S. 326-336) haben gezeigt, daß Vernetzen (Glutsraldehydbehandlung) nicht zu einer Erhöhung der thermischen Stabilität und Wirksamkeit von Cel'ulase geführt hat. Ähnliche Ergebnisse wurden von N.W.Ugarova (Biokhimiya 42 [7], 1977 S. 1212-1220) gefunden, die darüber berichtet hat, daß eine Modifizierung von Peroxidase mit Glutaraldehyd eine 2,5fache Verringerung der thermischen Stabilität ergeben hat.

Der gegenwärtige Stand der Technik bietet nur sehr spezifische Lösungen für spezifische Probleme (Immobilisierungs- und Vernetzungsverfahren), die nicht generell anwendbar sind. Darüber hinaus ist beobachtet worden, daß die Carboxylesterase bei normalen R^nktionsbedingungen (bis zu 45°C) nicht thermisch inaktiviert wird, sondern daß eine Inaktivierung nur durch bestimmte Verbindungen bei Reaktionsbedingungen erfolgt. Der gegenwärtige Stand der Technik sagt nichts über solche Arten von Inaktivierung aus.

Wenn der Aminosäurerückstand, der die Ursache für die Inaktivierung des Proteins ist, bekannt ist, ist eind alternative Methode für die chemische Modifizierung vorhanden. In diesem Fall kann man den Rückstand durch einen anderen durch ortsspezifische Mutagenese ersetzen, wie beispielsweise von Ausübet et al. (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Son Inc., 1987, New York) beschrieben ist. Auf diese Weise wurde beispielsweise der Oxydationswiderstand von B. alcalophilus Serinprotoase verbessert, indem ein Methioninrückstand durch einen Serinrückstand ersetzt wurde (Europäische Patentanmeldung 0328229).

Die bekannten Stabilisationsverfahren als solche können auf das vorliegende Enzym nicht angewendet werden, da die Natur der Inaktivierung anders ist, v/enn die Inaktivierung durch chemische Verbindungen eine Rolle spielt.

Summarische Beschre'bung der Erfindung

Die Erfindung betrifft eine modifizierte Carboxylesteraso, die eine erhöhte Stabilität in Gegenwart von Verbindungen wie Naproxen zeigt und bei der stereospezifischen Hydrolyse von solchen Verbindungen angewendet werden kann. Demzufolge stellt die Erfindung ein Verfahren zur stereospezifischen Hydrolyse eines optisch aktiven Substrats zur Verfugung, das das

Hydrolysieren des Substrats in Gegenwart einer Carboxylesterase umfaßt, die im Vergleich zum Wildtyp beim Kontaktieren mit 15mg/ml (S)-Naproxen bei 40°C über 1,5 Stunden eine erhöhte Stabilität zeigt. Dieso modifizierte Carboxylesterase kann durch Substituieren oder Modifizieren von mindestens einem basischen Aminosäurerückstand der wilden Carboxylesterase gewonnen werden.

Kurze Beschreibung der Figuren

Figur 1 zeigt die Nucleotidsequenz des kodierenden Bereichs den Gens für Carboxylesterase von Bacillus subtilis Thai I-8 (CBS 679.85).

Figur 2 zeigt die Wirksamkeit der wilden Carboxylesterase und verschiedener Mutantencarboxylesterasen: . « . Wildcprboxylesterase

Ly s 34 GIu Mu tan te Lys 81 GIu Mutante 217 GIu i.lutente

Figur 3 zeigt den Einfluß der Formaldehydbehandlung auf die Wirksamkeit der Carboxylesterase:

_— φ ,. nach der Formaldehydbehandlung

j nach Formaldehyd- und Haproxenbehandlung

Figur 4 zeigt die Umwandlung von Naproxenester mit Hilfe der Carboxylesterase und der modifizierten Carboxylesterase: e nichtmodifiziertes Enzym

μ modifiziertes Gluteranhydrid

^;jfr modifiziertes Succinanhydrid

P modifiziertes Glyoxal

y_ . au Jifiziertes Glutaraldehyd

Q . modifiziertes Formaldehyd

Figur 5 zeigt die Umwandlung von (R,S)-Diclo(opethylester mit Hilfe von Carboxylesterase bzw. modifizierter Carboxylesterase.

Beschreibung der spezifischen Ausführungsformen

Der Begriff „Carboxylesterase" im Sinne dieser Anmeldung bezeichnet eine Esterase, die aus einem Bacillus-Stamm gewonnen werden kann und S-Naproxen stereospezifisch hydrolysieren kann.

Carboxylesterase ist bei Temperaturen bis zu 45⁰C stabil. In Gegenwart von Verbindungen wie Naproxen wird das Enzym schnell inaktiviert. Das Enzym verliert wesentlich an Wirksamkeit innerhalb von 1,5 Stunden in Gegenwart von 15mg/ml (S)-Naproxen bei 40°C. Die Inaktivierung des Enzyms wird durch Zusammenballung des Enzyms begleitet. Diese Inaktivierung oder Destabilisierung ist nicht auf eine thermische Inaktivierung zurückzuführen, sondern steht im Zusammenhang mit der chemischen Wirkung von Verbindungen wie Naproxen auf das Enzym. Die Erfindung basiert auf der Entdeckung, daß positiv geladene Aminosäurerückstände in der Carboxylesterase an der Destabilisierung beteiligt sind. Die Naproxensäure reagiert möglicherweise mit den freien Aminogruppen an der Oberfläche des Enzyms, wodurch die hydrophobe Masse der Naproxensäure die Faltung des Enzyms beeinträchtigen kann.

Diese Auffaltung wird als erhöhte Empfindlichkeit de j Enzyms gegenüber dem proteolytischen Abbau in Gegenwart von Naproxen wahrgenommen. Durch Substituieren (Proteintechnik) oder durch chemisches Modifizieren dieser basischen Rückstände kann die positive Ladung dieser Aminosäuren beseitigt oder urngekehrt werden. Dies würde die Bindung der Naproxensäure an das Enzym verhindern. In diesem Zusammenhang ist zu beachten, daß nur kleine und nicht zu hydrophile chemische Gruppen zur Modifizierung des Enzyms verwendet werden können. Benzaldehyd, zum Beispiel, hat keine positive Wirkung auf die Enzymstabilität. Auch ein Verändern der positiv geladenen Rückstände in andere Rückstände mit positiver Ladung, aber geringerer Empfindlichkeit gegenüber chemische! Modifikation, wie Lysin zu Argininsubstitutionen (siehe beispielsweise R.D.Schmid, Advances in Biochemical Engineering 12, Ghose, Fiechler & Blakebrough [Hg.), Springer, Berlin [1979), 41-115), könnte eine Stabilisierung des Enzyms bewirken.

Folglich stellt die Erfindung unter einem weiteren Aspekt eine modifizierte Carbu/.ylesterase zur Verfügung, die durch Behandeln der Wildcarboxylesterase mit einer Verbindung gewonnen worden ist, welche mindestens eine Gruppe umfaßt, die mit einem positiv geladenen basischen Aminosäurerückstand in der Carboxylesterase reagieren kann. Dies führt zu höheren Produktkonzentrationen und höheren Ausbeuten. Aldehyde (Mono- oder Dialdehyde) wie Formaldehyd, Glutaraldehyd oder Glyoxal und Anhydride wie Glutarsäureanhydrid oder Succinanhydrid sind Beispiele für Verbindungen, die zur Behandlung der Carboxylesterase angewendui werden können.

Allgemein werden 0,05-10 Vol.-% (bezogen auf das Reaktionsgemisch) der Verbindung (Stabilisierungsmittel) zu dem die Wildcarboxylesterase enthaltenden Reaktionsg .misch hinzugegeben. Im typischen Fall werden 0,1-5VoI.-% dieses Stoffes hinzugegeben. Der pH-Wert wird während der Stabilisierung des Enzyms bei mindestens pH = 7, im typischen Fall bei pH = 7 bis 10 aufrechterhalten.

Es wird festgestellt, daß im wesentlichen die gesamte Carboxylesterase nach Zugabe der Verbindung wie Aldehyd oder Anhydrid stabilisiert wird. Die Tatsache, daß die Stabilisierung mit Hilfe von Formaldehyd, einem Monoaldehyd oder einem Anhydrid stattfinden kann, deutet darauf hin, daß das Enzym durch das Formaldehyd oder Anhydrid chemisch modifiziert wird und nicht intramolekular vernetzt wird.

Nacti einem weiteren Aspekt der Erfindung werden neue Enzyme, insbesondere modifizierte Carboxylesterasen zur Verfügung gestellt, die durch Expression von Genen, die das Enzym kodieren, gewonnen werden können, wobei sich dieses von der Wildesterase in mindestens einem in dem entsprechenden Wildenzym vorhandenen batschen Aminosäurerückstand

unterscheidet, und die bei der Anwendung vorbesserte Eigenschaften aufweisen. Es ist überraschenderweise gefunden worden, daß bestimmte Lysin-, Argin- und Histidinrückstände an der Inaktivierung der Carboxylesterase beteiligt sind.

Die Erfindung stellt somit ein stabilisiertes oder modifiziertes Enzym, insbesondere eine stabilisierte oder modifizierte Carboxylesterase, zur Verfügung, das durch Ersetzen von mindestens einem basischen Aminosäurerückstand in dem entsprechenden Wildenzym und Expression des mutierten Gens hergestellt worden ist oder dessen basische Aminosäuren durch die Wirkung von bestimmten chemischen Verbindungen modifiziert sind.

Nach Bestimmung der DNA-Sequenz von Carboxylesterase (siehe Beispiel 1) können Lysin-, Arginin- und Histidinrückstände der Esterase ersetzt werden, indem das Esterasegen mit dem Verfahren der ortsspszifischen Mutageitese mutiert wird (Ausubel et al., 1987, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Son Inc., New York). Auf diese Weise können positiv geladene basische Lysin- und/oder Argininrückstände beispielsweise durch neutrale (nicht geladene) oder negativ geladene Rückstände

(z. B. Glutamin, Serin oder Glutaminsäure) substituiert werden. Auf die gleiche Weise können andere Rückstände (z. B. Histidin), die an der Destabilisierung von Carboxylesterase beteiligt sind, durch andere Rückstände substituiert werden.

Das modifizierte Enzym zeigt in der industriellen Anwendung, z. B. bei der Hydrolyse von Naproxenester, verbesserte Eigenschaften. Unter verbesserten Eigenschaften verstehen wir im Sinne dieser Anmeldung eine hohe Umwandlungsleistung durch verbesserte Stabilität und insbesondere verbesserte Stabilität gegenüber bestimmten chemischen Verbindungen im Vergleich zu dem entsprechenden Wildenzym.

„Carboxylesterase" bedeutet im Sinne dieser Anmeldung eine Esterase, die aus einem Bacillus-Stamm gewonnen werden kann und die stereospezifisch S-Naproxenester hydrolysieren kann. Vorzugsweise ist das Enzym im wesentlichen identisch oder identisch mit der Esterase, die aus einem Bacillus subtilis Stamm, besser noch aus dem Bacillus subtllls Stamm Thai 1-8 (CBS 679.85) gewonnen werden kann. Unter einem Enzym, das im wesentlichen identisch mit der Esterase ist, die aus dem Bacillus subtilis Stamm Thai 1-8 gewonnen werden kann, wird verstanden, daß die eine Esterase kodierende DNA-Sequenz mindestens 70% Homologie in der Nucleotidsoquenz mit der DNA-Sequenz hat, die die Esterase aus dem Bacillus subtilis Stomm Thai 1-8 kodiert.

Zur Bestimmung der Homologie, die in unseren Versuchen nachgewiesen werden konnte, wurde die folgende Gleichung angewendet, die aus dem Analysieren des Einflusses von verschiedenen Faktoren auf die Hybridstabilität abgeleitet worden ist:

Tm = 81 + 16,6(log10Ci) + 0,4(%G + C)-600/n-1,u;%Fehlanpassung) (Current protocols in molecular biology 1987-1988, herausgegeben von Ausubel et al.).

η = Länge der kürzesten Kette der Probe

Ci = lonenstärke(M)

G + C = Basenzusammensetzung

Tm = Hybridisierungstemperatur

Unter der Annahme einer Probenlämje von 300 Basen konnten wir ein homologes Gen nachweisen, das mindestens 67% Homologie innerhalb eines Fragmentes von 300 Basen oder mehr zeigt. Bei der Bestimmung des Homologieprozentsatzes haben wir angenommen, daß der GC-Gehalt von Bacli'us 50% heträgt (Normore, 1973, in Laskin and Lechevalier [Hg.], Handbook of Microbiology Bd. II, CRC Press, Inc. Boca Raton. FIa.).

Dies bedeutet, daß eine modifizierte Carboxylosterase mit mindestens 70% i lomologie mit Bacillus subtilis Thai I-8 Carboxylesterase in der Erfindung enthalten ist.

Alle in dieser Spezifikation zitierten Veröffentlichungen und Patentanmeldungen sind hierin in ihrer Gesamtheit integriert.

Obwohl die vorstehende Erfindung ausführlich durch bii> '.liehe Darstellung und Beispiele zum besseren Verständnis beschrieben worden ist, wird der Fachmann angesichts der Beschreibung dieser Erfindung leicht erkennen, daß bestimmte Veränderungen und Modifikationen möglich sind, ohne daß vom Inhalt und Umfang der Patentansprüche abgewichen wird.

Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfind mg weiter veranschaulichen.

Beispiel 1

Bestimmung der Aminosäuresequenz von Carboxylesterase von Bacillus subtilis 1-85/pNAPT-7 (CBS 673.86) Die Aminosäuresequenz von Carboxylesterase, die von Bacillus subtilis 1-85/pNAPT-7 (CBS 673.86) gemäß Beschreibung in US-4.886.750 stammt, wurde wie folgt bestimmt. Die Nucleotidsequenz des 2.2 Hindlll-Hindlll-EinschubfragmentsvonpNAPT-7 wurde nach der Didesoxykettenabbruchmethode bestimmt, die von Sanger et al. beschrieben ist (Proc. Natl. Acad. Sei. I ISA 75 11977], 5463). Innerhalb der Sequenz konnte nur ein großes offenes Leseraster nachgewiesen werden, das ein 3OkD Protein kodieren kann. Von der Nucleotidsequenz dieses offenen Leserasters ist die Aminosäuresequenz dieser Carboxylesterase abgeleitet worden. Figur 1 zeigt die DNA-Sequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz für diese Carbcxylesterase. Dar Einbuchstabencode für Aminosäuren ist in der folgenden Tabelle erklärt:

A = Alanin L = Leucin

R = Arginin K = Lysin

N = Asparagin M = Methionin

D = Asparaginsäure F = Phenylalanin

C = Cystein P = Prolin

Q = Glutamin S = Serin

E = Glutaminsäure T = Threonin

G = Glycin W = Tryptophan

H = Histidin Y = Tyrosin

I = Isoleucin V = Valin

Beispiel 2

Mutation von Lysinrückständen in Carboxylesterar ι

Das Carboxylesterase kodierende DNA-Fragment in Bacillus subtilisThai 1-8 (CBS 679.85) (Bd I-Hindlll-Fragment von 2,0kb, das von pNAPT-2 stammt; siehe EP-A 233656) wurde in Vektor pTZ18R kloniert. Einzelsträngige DNA wurde gemäß den

Anweisungen des Lieferanten (Pharmacia) hergestellt. Diese einzelsträngige DNA wurde oligonucleotidgerichteter Mutagenese unterzogen, wie von Ausubel et al., ibid., beschrieben ist. Es wurden 11 verschiedene Mutagenesereaktionen durchgeführt, um die 11 Lysinrückstände von Carboxylesterasa (siehe Fig. 1) nacheinander durch einen Glutaminrückstand zu ersetzen. Zudem wurde eine 12. Reaktion durchgeführt, bei der ein Gemisch aus 11 verschiedenen Oligonucleutiden, von denen jedes eine verschiedene Lysin —> Glutaminmutation kodierte, in das Mutageneseprotokoll aufgenommen. Die entstehende mutierte Esterase aus Reaktion 1-11 wurde in E. coll DHI (ATCC 33849) erzeugt, wie in EP-A-233656 beschrieben ist (mit der Abweichung, daß Vektor pTZ18R anstelle von pUN121 verwendet wurde), und in Gegenwart von (S)-Naproxen auf Stabilität geprüft (wie in Beispiel 3 beschrieben ist). Das Gemisch von Mutanten aus Reaktion 12 wurde in Mikrotiterplatten verteilt und in Gegenwart von Naproxen auf Stabilität geprüft, wobei eine Farbbestimmung auf der Grundlage von ß-Naphthol und Echtblau zur Bestimmung der Restwirksamkeit der mutierten Esterasen angewendet wurde. Es wurde ein Pipettierautomat eingesetzt, um 20000 in Frage kommende Mutanten zu screenen. Stabilere mutierte Enzyme aus den 12 verschiedenen Mutagenesereaktionen wurden ausgewählt und zur weiteren Charakterisierung verwendet.

Beispiel 3

Stabilität von mutierten Carboxylestcrasen

Mutierte Carboxylesterasen, die nach der Beschreibung in Beispiel 2 aufgebaut sind, wurden wie folgt auf Stabilität geprüft: Eine Lösung von 9ml mit 0,10g (S)-Naproxen wurde bei 40⁰C15 Minuten lang inkubiert, bevor 1 ml mit 24U Carbo,./Iesteraco hinzugegeben wurde. Die Zusammensetzung des Endgemischs war 10g/l Naproxen, 1 mM MOPS, 2OmM Glycin, 2,4 U/Ml Carboxylesterase, pH = 8,75. Unmittelbar nach der Zugabe der Enzymlösung und Mischen wurde die erste δΟ-μΙ-Probe genommen (Probe bei 0 Minuten). Nach 0,15,30,45,60,90,120,180 und 240 Minuten Inkubation wurden 50^I-Proben genommen und sofort in 10OmM MOPS-Puffer mit einem pH-Wert von 8,75 und 0,2% BSA auf 5ml verdünnt. Die Carboxylesterasewirksamkeit wurde in diesen Proben bestirrr it, wie nachfolgend unter „Analysenmethoden" beschrieben ist. Es wurden verschiedene mutierte Enzyme mit erhöhter Stabilität in Gegenwart von Naproxen gewonnen, z. B. Mutanten, in denen Lysin 34, Lysin 81 oder L/sin 217 durch Glutamin ersetzt wurden.

Die Mehrzahl der konstruierten Mutanten wies erwartungsgemäß eine verringerte Stabilität oder eine verringerte Wirksamkeit auf. Allerdings deutet die Beobachtung, daß von 11 möglichen Lysinen die Mutation einer jeden von drei Positionen eine erhöhte Stabilität unter Beibehaltung der Wirksamkeit des Enzyms bewirken kann, auf die Möglichkeit von ortsspezifischer Mutagenese hin. Darüber hinaus wurden in diesem Beispiel nur Mutationen zu Glutamin konstruiert. Der Ersatz von '.ysinen durch andere Rückstände könnte ebenfalls gute oder sogar bessere Ergebnisse liefern. In dieser Hinsicht würde die Substitution von Lysinen durch Arginine aus den folgenden Gründen bevorzugt werden:

1. Arginin hat die gleiche positive Ladung wie Lysin.

2. Die Arginin-e-Aminogruppe ist weniger empfindlich gegenüber der Modifikation durch Alkyl- oder Carboxylgruppen als die von Lysin.

Auch ist die Konstruktion von besseren Mutanten durch Kombination auf der Basis der nunmehr verfügbaren durchführbar. Die Inaktivierungsprofile, die durch Untersuchung der Enzymwirksamkeit nach Erhöhung der Inkubationszeiträume des Enzyms mit 10g/l Naproxen gemäß der obigen Beschreibung bestimmt wurden, sind für drei Lysin —> Glutaminmutanten und das Wildenzym in Tabelle 1 dargestellt.

Tabelle 1

Zeit (Min.)	Wildtyp	Lys34	Restwirksamkeit (%)	Lys 217 GIu
	100	100	GIu Lys 81 GIu	100
0	79	93	100	87
15	56	81	67	71
30	43	81	63	60
45	34	75	54	53
60	24	68	19	38
90	14	61	42	26
120	6	49	25	15
180	4	38	13	8
240		8

Diese Ergebnisse sind auch in Figur 2 graphisch dargestellt.

Analysenmethoden

Carboxylesterase wird in 0,1 M MOPS (3-[N-Morpholin]propannulfonsäure), pH = 7,5, bei 25°C in Gegenwart von 0,3 mg (S)-Naproxenmethylester pro ml, 2% Tween 80 (TM), 1 mg/ml BSA (Rinderserumalbumin) untersucht. Das angewendete HPLC-System ist eine Umkehrphasensäule (Novapak CN Radial Pak Patrone von Waters), die mit Acetonitril:0,03M Phosphat (34:66), pH-Wert 3,2, bei einem Durchsatz von 1,5ml/min eluiert wird. Die festgestellten Vorweilzeiten lagen bei 6,9 Minuten für Methylester und 4,6 Minuten für Naproxen. 1 Einheit (U) ist definiert als die Enzymmenge, die unter den nachfolgend festgelegten Bedingungen 1 χ 10~^emol (S)-Naproxenmethylester pro Minute hydrolysiert.

Beispiel 4

Herstellung von Carboxylesterase aus Bacillus subtilis 1 -85/pNAPT-7 und Bacillus licheniformis T9 Bacillus subtilis 1-85/pNAPT-7 (CBS 673.86) wurde gemäß der Beschreibung in der Europäischen Patentanmeldung EP-A-233656 vermehrt. Das Enzym wurde isoliert, so wie es in Beispiel 14 dieser Anmeldung beschrieben ist. Das Ultrafiltrationskonzentrat wurde lyophilisiert. Die Wirksamkeit des getrockneten Materials betrug ungefähr 2400U/g.

In einem anderen versuch wurde pNAPT-7 unter Anwendung eines in EP-A-253455 beschriebenen Protokolls in Bacillus licheniformis T9 umgewandelt. Dieser Stamm, der proteasenegativ, a-amylasenegativ und sporulationnegativ ist, ist für die

Fermentation und Gewinnung von Carboxylesterase vorteilhaft. Das Enzym wurde analog zu der Esterase aus Bacillus subtitle 1-85/pNAPT-7 gewönne ι und wies eine ähnliche Wirksamkeit auf. Die Wirksamkeit wird entsprechend den „Analysenmethoden" von Beispiel 3 bestimmt.

Beispiels

Modifikation von Carboxylesterase durch Formaldehyd

Es wurden Carboxylesteraselösungen hergestellt (die Carboxylesterase stammte dabei von Bacillus subtilis 1-35/ρΝΑΡΤ·7 [CBS 673.86]), die40mg/ml lyophilisiertes Enzym, 25OmM MOPS (3-[N-Morpholin)propansulfonsäure) mit einem pH-Wert von 7,5 und zunehmende Konzentrationen von Formaldehyd (0,01-10%) enthielten. Die Konzentrationen des Modifizierungsmittels sind als Voi -%, bezogen auf das Reaktionsgemisch, angegeben. Die Lösungen wurden 1 Stunde lang bei 20"C stehengelassen.

Anschließe id wurde ein Teil der Probe für die direkte Bestimmung der Enzyrnwirksamkeit verwendet, und ein Teil der Probe wurde zuerst mit 15 mg/ml (S)-Naproxenbei40°Cfür.1,5 Stunden inkubiert, bevor die Enzymwirksamkeit bestimmt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 angeführt.

Unter Restwirk&amkeit wird die Wirksamkeit verstanden, die nach einer bestimmten chemischen Behandlung im Verhältnis zu der Wirksamkeit ohne chemische Behandlung zurückbleibt. Die V/irksamke.t wird entsprechend den „Analysenmtlhoden" von Beispiel 3 bestimmt.

Tabelle 2

Formaldehyd	Restwirksamkeit nach	Restwirksamkeit nach
%	Formaldehydbehandlung	Formaldehydbehandlung
	(in%)	und Inkubation mit
		Naproxen(in%)
0	100	2
0,01	105	7
0,025	99	7
0,05	100	8
0,1	95	20
0,25	93	45
0,5	87	60
1,0	64	61
2,5	47	45
5,0	36	41
10,0	11	16

Die Ergebnisse sind ebenfalls in Figur 3 dargestellt. Es wird gezeigt, daß das unbehandelte Enzym bei Inkubation mit Naproxen über 1,5 Stunden bei 4O⁰C vollständig inaktiviert wird. Eine Formaldehydbehandlung der Esterase bewirkt einen teilvveisen Wirksamkoitsverlust. Das modifizierte Enzym jedoch, das mit Formaldehydkonzentrationen von 1 % oder mehr behandelt worden ist, ist bei Inkubation mit Naproxen (15mg/ml) über 1,5 St. inden bei 4O⁰C vollständig stabil.

Beispiele

Modifikation von Carboxylesterase mit Formaldehyd

Carboxylesteraselösung (die Carboxylesterase stammte dabei von Bacillus subtilis 1-85/pNAPT-7 [CBS 673.86]) mit 10mg/ml lyophilisiertem Enzym, 25OmM MOPS, pH-Wert 7,5, und 2% Formaldehyd wurde eine Stunde lang bei 2O⁰C umgerührt. Die Probe wurde gegen 10OmM MOPS, pH-Wert 7,5, dialysiert. Die Esterasewirksamkeit wurde nach den „Analysenmethoden" von Beispiel 3 bestimmt; die Restwirksamkeit betrug 60%.

Beispiel 7

Modifikation von Carboxylesterase mit Glutaraldehyd

Carboxylesteraselösung (die Carboxylesterase stammte dabei von Bacillus subtilfs 1-85/PNAPT-7 [CBS 673.86]) mit 10mg/ml lyophilisiertem Enzym, 25OmM MOPS, pH-Wert 7,5 und 2% Glutaraldehyd wurde eint" Stunde lang bei 20°C umgerührt. Die Probe wurde gegen 10OmM MOPS, pH-Wert 7,5, dialysiert. Die Esterasewirksamkeit wurde nach den „Analysenmethoden" von Beispiel 3 bestimmt; die Restwirksamkeit betrug 68%.

Beispiele

Modifikation von Carboxylesterase mit Glyoxal

Carboxylesteraselösung (die Carboxylesterase stammte dabei von Bacillus subtilis 1 85/pNAPT-7 [CBS 673.86]) mit 20mg/ml lyophilisiertem Enzym, 25OmM Carbonat, pH-Wert 9,2, und 0,8% Glyoxal wurde eine Stunde lang bei 20⁰C umgerührt. Die Probe wurde gegen 25OmM Carbonat, pH-Wert 9,2, dialysiert. Die Esterasewirksamkeit des Stoffs wurde nach den „Analysenmethoden" von Beispiel 3 bestimmt; die Restwirksamkeit betrug 45%.

Beispiels

Modifikation von Carboxylesterase mit Succinanhydrid

Carboxylesteraselösung (die Carboxylesterase stammte dabei von Bacillus subtilis 1-85/pNAPT-7 [CBS 673.86]) mit 10mg/ml lyophilisiertem Enz> m, 0,5M MOPS, pH-Wert 8,0, und 0,3% Succinanhydrid wurde eine Stunde lang bei 20⁰C umgerührt. Die Esterasewirksamkeit wurde nach den „Analysenmethoden" von Beispiel 3 bestimmt; die Restwirksamkeit betrug 62%.

Beispiel 10

Modifikation von Carboxylesterase mit Glutaranhydrld

Carboxylesteraselösung (die Carboxylesterase stammte dabei von Bacillus subtilis 1-85/pNAPT-7 [CBS 673.86]) mit 10 mg/ml lyophilisiertem Enzyr i, 0,5M MOPS, pH-Wert 8,0, und 0,3% Glutaranhydrid wurde eine Stunde lang bei 2O⁰C umgerührt. Die Esterasewirksamkeit wurde nach den „Analysenmethoden" von Beispiel 3 bestimmt; die Restwirksamkeit betrug 72%.

Beispiele

Umwandlung von (R,S)-Naproxenmethylester mit modifizierter Carboxylesterase 300mg (R.S'-Naproxenmethylester wurden zu 10 ml 2% Tvveen 80 (TM) hinzugegeben. Der pH-Wert wurde auf 9,0 eingestellt.

Anschließend wurden 5,5U modifiziertes Enzym, das gemäß der Beschreibung in den Beispielen 6-10 hergestellt wurde, hinzugegeben. Der pH-Wert wurde durch Titration mit 2,5 M Ammoniumhydroxic! bei 9,0 gehalten. Die Reaktion wurde bei 4O⁰C durchneführt. Der Umwandlungsgrad wurde zeitlich durch HPLC verfolgt. Eine Umwandlung mit nichtmodifiziertem Enzym wurde als Bezugsbasis verwendet. Die in Figur 4 graphisch dargestellten Ergebnisse zeigen, daß die modifizierten Enzyme eine viel höhere Umwandlung erreii.hen als das unbehandelte Enzym.

Beispiele

Umwandlung von (R,S)-Diclofopethylester mit glutaraldehydmodifizieiter Carboxylesterase 750mg (R.S)-Diclofopethylester wurden zu 25ml 1 % Tween 80 (TM) hinzugegeben. Der pH-Wert wurde auf 9,0 eingestellt.

Anschlhßund wurden 10U modifiziertes Enzym hinzugegeben. Das modifizierte Enzym wurde gemäß der Beschreibung in Beispiel 7 gewonnen, nur daß lediglich 0,15% Glutaraldehyd hinzugegeben wurden. Der pH-Wert wurde durch Titration mit 0,1 M NaOH bei 9,0 gehalten. Die Temperatur betrug 2O⁰C. Der Umwandlungsgrad wurde zeitlich durch HPLC verfolgt. Eine Umwandlung mit nichtmodifiziertem Enzym wurde als Bezugsbasis verwendet. Die in Figur 5 graphisch dargestellten Ergebnisse zeigen, daß das modifizierte Enzym eine viel höhere Umwandlung erreicht als das unbehandelte Enzym.

Claims

1. Modifizierte Carboxylesterase, dadurch gekennzeichnet, daß sie im Vergleich zur Wildcarboxylestorase unter Anwendungsbedingungen verbesserte Eigenschaften aufweist.

2. Modifizierte Carboxylesterase, dadurch gekennzeichnet, daß sie beim Kontaktieren mit 15 mg/ml (S)-Naproxen über 1,5 Stunden bei 40⁰C im Vergleich zur Wildcarboxylesterase eine erhöhte Stabilität zeigt.

3. Modifizierte Ca. Vxylesterase nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Wildcarboxylesterase durch eine DNA kodiert ist, die mindestens zu 70% der DNA von der Figur 1 homolog ist, oder daß die Wildcarboxylesterase mindestens zu 70% der Bacillus subtilis Thai i-8 Carboxylesterase homolog ist und daß die modifizierte Carboxylesterase sich von der Wildesterase mindestens in einem in der Wildcarboxylesterase vorhandenen basischen Aminosäurerückstand unterscheidet.

4. Modifizierte Carboxylesterase nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß der basische Aminosäurerückstand durch die Behandlung der Wildcarboxylesterase mit einer Verbindung verändert wird, die mindestens eine Aldehyd- oder Anhydridgruppe umfaßt.

5. Modifizierte Carboxylesterase nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung ein Aldehyd oder Anhydrid ist, das vorzugsweise aus der aus Formaldehyd, Glutaraldehyd, Glyoxal, Glutaranhydrid und Succinanhydrid bestehenden Gruppe ausgewählt wird.

6. Modifizierte Carboxylesterase nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß der basische Aminosäurerückstand durch einen anderen Aminosäurerückstand ersetzt wird.

7. Modifizierte Carboxylesterase nach Anspruch 3 ode. >. dadurch gekennzeichnet, daß der basische Aminosäurerückstand ein Lysin-, Arginin- oder Histidinrückstand ist.

8. Modifizierte Carboxylesterase nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der basische Aminosäurerückstand Lys 34, Lys 81 oder Lys 217 ist.

9. Modifizierte Carboxylesterase nach einem der Ansprüche 6-8, dadurch gekennzeichnet, daß der basische Aminosäurerückstand durch Glutamin oder Arginin ersetzt wird.

10. Modifizierte Carboxylesterase nach einem der Ansprüche 1-9, dadurch gekennzeichnet, daß die Wildcarboxylesterase identisch oder im wesentlichen identisch mit der Carboxylesterase ist, die aus einem Bacillus subtilis Stamm, vorzugsweise dem Stamm Bacillus subtilis Thai I-8 (CBS 679.85), gewonnen werden kann.

11. Methode zur Stabilisierung einer Wildcarboxylesterase, dadurch gekennzeichnet, daß sie das Modifizieren oder Substituieren von mindestens einem basischen Aminosäurerückstand der Wildcarboxylesterase einschließt.

12. Methode zur Stabilisierung einer Wildcarboxylesterase, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Behandlung der Wildcarboxylesterase mit einem Stoff umfaßt, der basische Aminosäurerückstände neutralisieren kann.

13. Methode nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Stoff ein Aldehyd oder Anhydrid ist.

14. Methode nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Aldöhyd aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Formaldehyd, Glutaraldehyd und Glyoxal besteht.

15. Methode nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Anhydrid Glutaranhydrid oder Succinanhydrid ist.

16. Modifizierte Carboxylesterase, dadurch gekennzeichnet, daß sie nach der Methode nach einem der Ansprüche 11-15 hergestellt wird.

17. Methode zur Herstellung einer Carboxylesterase, die hinsichtlich der Wildcarboxylesterase modifiziert ist, dadurch gekennzeichnet, daß sie das Modifizieren des die Wildesterase kodierenden Gens zur Substitution des Codons für mindestens einen basischen Aminosäurerückstand durch ein Codon für einen anderen Aminosäurerücksiand zwecks Gewinnung eines modifizierten Gens und die Ausprägung des so entstandenen modifizierten Gens zur Herstellung der modifizierten Carboxylesterase einschließt.

18. Modifizierte Carboxylesterase, dadurch gekennzeichnet, daß sie nach der Methode vom Anspruch 17 hergestellt wird.

19. Methode zur Durchführung der stereospezifischen Hydrolyse einer Carboxylesterase, dadurch gekennzeichnet, daß die Methode das Kontaktieren des Esters mit einer zur Herbeiführung der stereospezifischen Hydrolyse wirksamen Menge der modifizierten Carboxylesterase aus einem der Ansprüche 1-10,16 oder 18 einschließt.

20. Methode nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß ein (R,S)-2-substituierter Propionsäureester, vorzugsweise Naproxon-, Ibuprofen- oder Diclofopester, stereospezifisch hydrolysiert wird, um überwiegend die entsprechende enantiomere (S)-Säure zu liefern.

Hierzu 4 Seiten Zeichnungen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft die Stabilisierung von Carboxylesterase.