WO2003031609A1 - Esterase esta aus rhodococcus sp. - Google Patents

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WO2003031609A1
WO2003031609A1 PCT/EP2002/011211 EP0211211W WO03031609A1 WO 2003031609 A1 WO2003031609 A1 WO 2003031609A1 EP 0211211 W EP0211211 W EP 0211211W WO 03031609 A1 WO03031609 A1 WO 03031609A1
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nucleic acid
esterase
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Helmut Schwab
Marinka Gudelj-Wyletal
Anton Glieder
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    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value

Definitions

  • the present invention relates to an esterase from Rhodococcus sp., Proteins homologous to it, nucleic acids coding for these proteins, antibodies against these proteins and the production and use of these proteins, nucleic acids and antibodies.
  • Hydrolases are a large and diverse group of enzymes that can hydrolyze peptides, amides and halides in addition to esters.
  • the lipolytic and esterolytic enzymes represent a special class, whereby it is difficult to differentiate the esterases (EC 3.1.1) from the lipases, since the definition of these enzymes is not based on the structure of their substrates, but rather on their physical state.
  • the classification of the esterases as opposed to the lipases is usually based on the length of the acyl chain of their ester substrates. Esterases preferably show activity in relation to water-soluble, short-chain fatty acid esters, while lipases show higher activity in relation to water-insoluble, emulsified long-chain fatty acid substrates [1, 2].
  • the family of alpha / beta hydrolase-folded enzymes includes a group of proteins that share a three-dimensional core structure, although no significant similarity was found in the primary structure. While the catalytic specificities of the members of the alpha / beta hydrolase-folded enzymes are completely different from one another, their enzymatic mechanism appears to be similar [12]. All have a catalytic triad with the nucleophilic acid histidine configuration consecutive in the amino acid sequence. These three amino acids are located at similar topological locations in the correctly folded protein, although they are separated by a variable number of amino acids in the primary structure of each enzyme.
  • nucleophile In all known family members of these hydrolases, the nucleophile, usually a serine residue, is localized in a conserved sequence, the “nucleophilic elbow”, with a proposed consensus region Sm-X-Nu-X-Sm-Sm, where Sm is a small amino acid , usually glycine, X stands for any amino acid and Nu for the nucleophile, which is a structural commonality of the alpha / beta hydrolase-folded enzymes [12].
  • Esterases have become increasingly important in biotechnology [13] and in organic chemistry [14, 15]. Their characteristic properties, such as substrate specificity, regioselectivity and enantioselectivity, allow a wide range of applications for these enzymes. They are very common in nature and can be found in animals, plants and microorganisms. Because of their industrial applications, intensive research interest has recently focused on microbial esterases.
  • the esterified alcohol, linalool is one of the most important terpene alcohols in the taste and smell industry and is available in different enantiomeric forms.
  • the (R) - (-) - enantiomer, licareol is the main component of extracts from Cinnamonium camphora and Cayenne linaloe, while the (S) - (+) - enantiomer, coriandrol, is found primarily in coriander oil. Since the two enantiomers differ in their smell [28], it is desirable to obtain the optically pure enantiomers for the production of taste and smell compositions.
  • the object of the present invention was to provide a new hydrolytic enzyme, in particular a new esterase and / or lipase, for which there is an urgent need in view of the possible uses of such enzymes, in particular in biotechnology and organic chemistry, and / or To provide methods by which new hydrolytic enzymes, in particular esterases and / or lipases, can be obtained.
  • the object of the present invention was in particular to provide a hydrolytic enzyme, in particular an esterase and / or lipase, which has a different substrate specificity and / or a distinguishable degree of selectivity and / or a distinguishable reaction rate and / or compared to the enzymes described so far has a distinguishable structure and / or a distinguishable reaction mechanism.
  • Another object of the present invention was to provide esterases and / or lipases which are able to cleave bulky esters and / or sterically difficult to access ester linkages, in particular the sterically difficult to access ester bond in linaloyl acetate.
  • polypeptides and antibodies according to the invention, in particular by a polynucleotide according to SEQ ID No. 1, a polypeptide according to SEQ ID No. 2 and one against a polypeptide according to SEQ ID No. 2 directed antibodies.
  • nucleic acid according to SEQ ID No. 1 or a polypeptide according to SEQ ID No. 2 nucleic acids and polypeptides of similar structure and the same or similar function can be obtained.
  • enzymes with improved properties can also be obtained, for example through evolution experiments.
  • the present invention therefore relates to a polynucleotide selected from the group consisting of: a) polynucleotide with a nucleic acid sequence from positions 195 to 1115 according to SEQ ID No. 1, b) Polynucleotides coding for a polypeptide with an amino acid sequence according to SEQ ID No.
  • the nucleic acids according to the invention comprise one or more non-coding sequences, the non-coding sequences being, for example, naturally occurring intron sequences or regulatory sequences such as promoter or enhancer sequences, in particular those for controlling expression esterases or lipases.
  • the nucleic acids according to the invention are preferably ribonucleic acid (RNAs) or deoxyribonucleic acids (DNAs), the nucleic acids preferably being double-stranded nucleic acids.
  • RNAs ribonucleic acid
  • DNAs deoxyribonucleic acids
  • the nucleic acids according to the invention are preferably nucleic acids which code for a protein with hydrolase activity or parts thereof.
  • the protein with hydrolase activity is preferably a lipase or esterase and / or an enzyme which is capable of ester, Cleave thioester, amide, halide or peptide bonds, particularly preferably bulky and / or sterically difficult to access ester, thioester, amide, peptide or halide bonds.
  • the compounds can be, for example, esters, thioesters, peptides, amides or halides with a short acyl chain, with a short acyl chain preferably referring to the acyl radical of acetic acid, propionic acid, butyric acid or valeric acid. It can very particularly preferably be an ester of a tertiary alcohol, especially an allylic tertiary alcohol, in particular an ester of linalool or licareol or coriandrol, particularly preferably linaloyl acetate.
  • cleavage means above all hydrolytic cleavage, that is to say cleavage with liberation of the carboxylic acid and the corresponding alcohol, thiol, amine or hydrogen halide.
  • cleavage can also take place with the formation of a new ester, thioester, amide, peptide or halide bond, in particular if, for example, an ester bond is converted into a new ester bond, it can be a transesterification reaction act.
  • the esterase is very particularly preferably a serine esterase and / or an enzyme which is capable of cleaving regioselective or enantioselective bonds, the value for the enantiomeric excess (ee) preferably being greater than or equal to 20% is particularly preferably greater than or equal to 40%, especially greater than or equal to 60%, in particular greater than or equal to 80%.
  • the esterase is very particularly preferably a hydrolase with an ⁇ / ⁇ -hydrolase fold and / or a serine esterase and / or a carboxylesterase, in particular one which belongs to the GDXG family of lipolytic enzymes or is homologous to these enzymes.
  • the nucleic acids according to the invention are preferably nucleic acids which are here for an esterase, particularly preferably for a microbial esterase, particularly preferably bacterial esterase, in particular for an esterase from Rhodococcus, especially for an esterase from Rhodococcus sp especially for the esterase EstA according to SEQ ID No. 2 and / or one of the polypeptides according to the invention described below.
  • the present invention furthermore relates to the use of the nucleic acids according to the invention, on the one hand for the production or isolation of nucleic acids according to the invention, on the other hand for the production or isolation of new nucleic acids which are homologous to the nucleic acids according to the invention, in particular those having structural and the same in relation to the nucleic acids according to the invention , similar and / or improved functional properties, with functional properties in particular hydrolytic activity, especially lipase and / or esterase activity, and with improved functional properties, for example, higher specificity and / or higher conversion and / or higher regio- or enantioselectivity understand is.
  • nucleic acids according to the invention can thus be used, for example, as probes for identifying and / or isolating homologous nucleic acids from an artificial, a cDNA or genomic gene bank, preferably for identifying nucleic acids that are used for esterases, lipases and / or for one of the polypeptides or parts according to the invention encode thereof, or as antisense nucleic acids or as primers in the polymerase chain reaction (PCR), in particular for the amplification of nucleic acids comprising nucleic acids coding for enzymes with hydrolytic activity, in particular esterases and / or lipases, or parts thereof.
  • PCR polymerase chain reaction
  • nucleic acids according to the invention or homologous to the nucleic acids according to the invention can also be obtained by random mutagenesis or targeted mutagenesis in a manner known to the person skilled in the art.
  • the nucleic acids according to the invention can be used, for example, for the targeted production of individual domains or epitopes of the protein according to the invention or of fusion proteins which comprise the polypeptides according to the invention.
  • the present invention therefore also relates to a method for obtaining a nucleic acid which codes for a protein with hydrolytic activity, in particular for an esterase and / or lipase, comprising the following steps: a) a nucleic acid library is contacted with a nucleic acid according to the invention, b ) a nucleic acid that hybridizes with a nucleic acid according to the invention is identified, c) the nucleic acid identified in step (b) is sequenced.
  • the present invention therefore also relates to a method for isolating a nucleic acid coding for an enzyme with hydrolytic activity, in particular for an esterase and / or lipase, comprising the following steps: a) primers are prepared starting from a nucleic acid according to the invention, b) the Primers according to (a) are used to amplify nucleic acids, especially cDNAs, of unknown nucleic acid sequences in the PCR, c) the nucleic acids obtained according to (b) are sequenced.
  • the present invention therefore also further relates to a method for isolating a nucleic acid coding for a hydrolytic enzyme, in particular an esterase and / or lipase, comprising the following steps: a) Nucleic acids from a library are incorporated into suitable vectors and these are preferably incorporated into suitable host organisms Bacteria, in particular E.
  • nucleic acids from the clones identified in step (d) are sequenced.
  • the present invention also relates to a method for isolating a nucleic acid coding for an enzyme with hydrolytic activity, in particular an esterase and / or lipase, comprising the following steps: a) a nucleic acid according to the invention is subjected to mutagenesis experiments, b) the mutants obtained are incorporated and expressed in a suitable vector, c) the expression products are examined for hydrolytic activity, in particular esterase and / or lipase activity, d) the nucleic acids, the expression products of which in step (c) showed hydrolytic activity, are sequenced.
  • the polymerase chain reaction can be used to carry out the mutagenesis experiments.
  • the mutagenesis experiments can be carried out, for example, in particular when using a Ta ⁇ f polymerase, in such a way that reaction parameters such as the Mg 2+ concentration, the pH, the reaction temperature or the substrate concentrations are varied, or error can be used -prone- PCR techniques come from, for example, the addition of Mn 2+ or the addition of unequal nucleotide concentrations.
  • the nucleic acid library is preferably a cDNA, genomic or artificial library, particularly preferably a microbial, especially bacterial library, in particular one from Rhodococcus, particularly preferably from Rhodococcus sp.
  • the invention further relates to a nucleic acid which can be obtained by one of the aforementioned methods.
  • Another object of the present invention is a method for producing a nucleic acid according to the invention, characterized in that the nucleic acid is chemically synthesized.
  • the nucleic acids according to the invention can be chemically described, for example, in 1 specified nucleic acid sequence or using the in SEQ ID No. 2 given amino acid sequence can be synthesized based on the genetic code, for example according to the phosphotriester method.
  • the present invention furthermore relates to a vector, in particular a cloning and / or expression vector, comprising one of the aforementioned nucleic acids.
  • the expression vector can be, for example, a prokaryotic or eukaryotic expression vector.
  • the prokaryotic vectors for incorporating the nucleic acids according to the invention are, for example, the plasmids pBSII, pGEM-5Zf (+/-) or pMS470 ⁇ 8 or another high copy number plasmid.
  • the available expression vectors for expression in E. coli are, for example, the vectors pBSII-RR1, pGEM-RR1 and pMS-RR1 for expressing a protein according to SEQ ID No. Second
  • the expression vectors for expression in E. coli can, for example, also be other commercially available vectors, such as the T7 expression vector pGM10 or pGEX-4T-1 GST (Pharmacia Biotech), which are used for an N-terminal Met- Coding Ala-His6-Tag, which enables the purification of the expressed protein on a Ni 2+ -NTA column.
  • suitable eukaryotic expression vectors for expression in Saccharomyces cerevisiae are vectors p426Met25 or p426GAL1, for expression in insect cells, for example baculovirus vectors as disclosed in EP-B1-0127839 or EP-B1-0549721, and for expression in mammalian cells, for example SV40 vectors ,
  • the nucleic acids according to the invention can be incorporated into a vector with flanking nucleic acids such that when the vector is expressed, the polypeptides encoded by the nucleic acids according to the invention are present as fusion proteins or are provided with a tag, a labeling amino acid sequence, which, for example, purifies or Detection of the polypeptides can facilitate.
  • the day can be, for example, the strep, flag, myc or his day.
  • the expression vectors preferably contain the regulatory sequences suitable for the host cell, in this case preferably the lac or tac promoter for expression in E coli, the ADH-2, GAL1 or AOX promoter for expression in yeasts, the baculovirus Polyhedrin promoter for expression in insect cells or the early SV40 promoter or LTR promoters for expression in mammalian cells.
  • the regulatory sequences suitable for the host cell in this case preferably the lac or tac promoter for expression in E coli, the ADH-2, GAL1 or AOX promoter for expression in yeasts, the baculovirus Polyhedrin promoter for expression in insect cells or the early SV40 promoter or LTR promoters for expression in mammalian cells.
  • the present invention furthermore relates to a host cell comprising a vector according to the invention, the host cell preferably being Rhodococcus, in particular Rhodococcus sp., Or E. coli, in particular the E. co // strain BL21 (DE3).
  • the host cell preferably being Rhodococcus, in particular Rhodococcus sp., Or E. coli, in particular the E. co // strain BL21 (DE3).
  • nucleic acids according to the invention are preferably introduced into the host cells after incorporation into a suitable vector by the methods of transfection, transformation or electroporation known to the person skilled in the art.
  • the present invention furthermore relates to a polypeptide selected from the group consisting of: a) polypeptide with an amino acid sequence according to SEQ ID No. 2, b) naturally occurring mutants, polymorphic forms or alleles of a polypeptide according to (a), in particular those which have up to ten or up to five, especially exactly one, two or three, point mutations with respect to a polypeptide according to (a) , c) polypeptides which have a sequence homology or identity of at least 50%, preferably at least 60% or 70%, very particularly preferably at least 80 or 90%, in particular at least 95% or 98% in relation to a polypeptide according to (a) or (b) possess, d) polypeptides which are encoded by the aforementioned nucleic acids according to the invention, e) polypeptides consisting of at least 5 or 6, preferably at least 10 or 15, particularly preferably at least 20 or 30, in particular at least 40, 50 or 60 consecutive amino acids of a polypeptide according to (a) or (
  • polypeptides which catalyze a hydrolysis reaction, in particular the hydrolysis of ester, thioester, amide, peptide or halide bonds, or parts, in particular epitopes or domains, of such polypeptides.
  • enzymes which have a catalytic triad comprising a nucleophile, an aspartate or glutamate and a histidine, or a catalytic diad in their reactive center.
  • esterases or lipases are preferably esterases or lipases, particularly preferably a serine esterase and / or a carboxylesterase which belongs to the GDXG family of lipolytic enzymes or has strong homology to the enzymes of this family, the serine in the active center ( S * ) can preferably be found in the amino acid sequence IVLAGDS * AGGNLA (SEQ ID NO. 9), and / or it is an enzyme which has alpha / beta hydrolase folding.
  • the compounds which can be cleaved by the polypeptides according to the invention are, for example, esters, thioesters, peptides, amides or halides, preferably those with a short acyl chain, the acyl radical in particular having a short acyl chain Acetic acid, propionic acid, butyric acid or valeric acid is meant.
  • the cleavable compound is very particularly preferably the ester of a tertiary alcohol, especially an allylic tertiary alcohol and / or a tertiary alcohol, the tertiary carbon atom of which carries an aromatic or unsaturated hydrocarbon group, especially a phenyl radical.
  • ester of linalool or licareol or coriandrol in particular linaloylacetate, or an ester of 2-phenyl-2-butanol, 2-phenyl-2-hexanol or 2-phenyl-2-octanol, especially 2-phenyl-2-butyl acetate, 2-phenyl-2-hexyl acetate or 2-phenyl-2-octyl acetate.
  • the polypeptides according to the invention are particularly preferably esterases, preferably microbial, in particular bacterial, esterases. It is very particularly preferably an esterase from Rhodococcus sp., In particular the esterase EstA according to SEQ ID No. Second
  • the polypeptide according to the invention is a water-soluble esterase.
  • the present invention furthermore relates to mixtures and preparations, in particular bacterial preparations, which can be carried out in a manner known to the person skilled in the art, comprising a polypeptide according to the invention.
  • Another object of the invention is the use of a polypeptide according to the invention for hydrolytic cleavage and / or for the formation of ester, thioester, amide, peptide or halide bonds.
  • the compounds to be cleaved or prepared are those with a short acyl chain, very particularly preferably the ester of a tertiary alcohol, especially an allylic tertiary alcohol and / or a tertiary alcohol, the tertiary carbon atom of which is one unsaturated or aromatic hydrocarbon group, especially a phenyl group.
  • ester of linalool or licareol or coriandrol in particular linaloylacetate, or an ester of 2-phenyl-2-butanol, 2-phenyl-2-hexanol or 2-phenyl-2-octanol, especially 2-phenyl-2-butyl acetate, 2-phenyl-2-hexyl acetate or 2-phenyl-2-octyl acetate.
  • short acyl chain is preferably a carboxylic acid residue with no more than 6 carbon atoms, particularly preferably with no more than 4 carbon atoms, in particular an acetate, propionate, butyrate or valerate residue
  • the Hydrogen atoms of the rest can also be substituted, in particular by organic groups or halogen atoms.
  • the alcohol residue of the ester is, for example, naphthol, glycerol, p- and o-nitrophenol or a naphthol AS substrate.
  • Substrates or compounds to be prepared according to the invention are generally compounds of the formula R 1 -C (0) -R 2 , where R 2 for one of the halogens F, Cl, Br, I, for an amino group NR 3 R 4 , for a thiol SR 3 or stands for an alcohol OR 3 and R 1 is preferably a hydrocarbon chain, which can preferably have up to 5, particularly preferably up to 3 carbon atoms, especially exactly 1 carbon atom, the hydrocarbon chain preferably being unbranched, however can also be branched or unsaturated, and wherein at least one of the hydrogen atoms can also be substituted by other groups, such as, for example, halogens, hydrocarbon radicals or ether groups.
  • the alcohol, thiol or amine is preferably a bulky group.
  • R 3 can thus be, for example, a group CR 5 R 6 R 7 , at least one, in particular exactly one, of the radicals R 5 , R 6 and R 7 being a bulky hydrocarbon skeleton, for example an aromatic group, which also can be substituted.
  • the aromatic group can also be a heterocycle.
  • the remaining radicals, which are not a bulky group and / or aromatics, are preferably a hydrogen atom or a short-chain hydrocarbon chain with up to 8, particularly preferably up to 6, carbon atoms, at least one the C atoms can also carry a substituent, for example a halogen atom.
  • the hydrocarbon chain can be unbranched, branched, saturated or unsaturated.
  • R 3 itself can also be an aromatic, in particular also a heterocyclic aromatic, the hydrogens of which can also be substituted.
  • Substrates or compounds to be produced according to the invention are furthermore compounds of the formula R 1 -C (0) -R 2 , where R 1 is a sterically demanding group, especially a quaternary carbon atom, which is preferably a center of chroma.
  • This can be, for example, the alpha-C atom of an alpha-substituted alpha-amino acid or a carbon atom as part of a hexane ring, the hexane ring preferably carrying at least one further substituent, for example in the form of a hydrocarbon chain or a halogen atom.
  • the quaternary carbon atom can carry, for example, a hydrocarbon chain, in particular a methyl or an ethyl group, as further substituents.
  • R 2 is preferably a simple group, for example an amine or an alcohol residue, which comprises up to 6, especially up to 4, carbon atoms, the alcohol residue preferably being unbranched and unsaturated , but can also be branched or unsaturated.
  • the substrate or the compound to be produced is a glycerol derivative, in a preferred embodiment all three hydroxyl groups, preferably with short-chain acids, are esterified.
  • the substrate is triacetin.
  • the substrates to be cleaved or prepared by means of the polypeptides according to the invention are those of the general formula R 1 -C (0) -R 2 , where R 1 is for (C 1 -C 6 ) -alkyl, in particular ( -C-C 3 ) alkyl, which may be mono- or polysubstituted, in particular by radicals from the group consisting of (dC 6 ) -alkyl, in particular (-C-C 3 ) -alkyl, (C ⁇ -C 6 ) Alkoxy, in particular (CrC 3 ) alkoxy, halogen, in particular fluorine, chlorine, bromine or iodine, and where R 2 is halogen, in particular fluorine, chlorine, bromine or iodine, or for a radical selected from the group OR 3 , SR 3 and NR 3 , where R 3 is (C 6 -C 4 ) aryl, especially phenyl or nap
  • R 3 is particularly preferably an alkyl or alkenyl radical which bears two substituents in the 1 position or one substituent in the 1 position and one substituent in the 2 position, at least one of the substituents preferably being one Alkenyl radical or an aryl radical and the other substituent is preferably an alkyl radical.
  • the hydrolysis can be carried out, for example, in the presence of BSA and / or in the presence of a detergent, in particular a nonionic, such as e.g. Octyl glucoside.
  • a detergent in particular a nonionic, such as e.g. Octyl glucoside.
  • the enzymes according to the invention are used to cleave or form enantioselectively bonds, the enantiomeric excess (ee) of the reaction in question preferably being greater than or equal to 20%, particularly preferably greater than or equal to 40%, especially greater than or equal to 60%, is in particular greater than or equal to 80%.
  • polypeptides according to the invention can also be used to isolate or enrich one of the two enantiomers starting from racemic mixtures.
  • the knotting reaction can be, for example, a transesterification reaction.
  • polypeptides according to the invention are, for example, the production or selective enrichment of Flavor components in the food industry, detergents in the detergent industry, fine chemicals in the chemical industry or therapeutically or diagnostically usable substances in the pharmaceutical industry.
  • the present invention also relates to a method for cleaving the aforementioned ester, thioester, amide, peptide or halide bonds, characterized in that molecules comprising the corresponding bonds are incubated with at least one polypeptide according to the invention.
  • the present invention furthermore also relates to a process for forming the aforementioned ester, thioester, amide, peptide or halide bonds, characterized in that carboxylic acids and / or carboxylic acid esters, thioesters, amides or halides with a Alcohol, thiol, amine or hydrogen halide can be incubated in the presence of a polypeptide according to the invention.
  • polypeptides according to the invention can furthermore be used, for example, as epitopes for the production of mono- or polyclonal antibodies by coupling them to a carrier, for example bovine serum albumin, and then using a mammal, preferably a mouse, rabbit or rabbit Epitope, preferably using adjuvants, is immunized.
  • a carrier for example bovine serum albumin
  • Polypeptides with a length of 6-12, in particular 8, amino acids are preferably suitable for this.
  • Polypeptides with a length of more than 60, in particular more than 75, amino acids can also be used without a carrier for the production of antibodies.
  • the resulting antibodies can then optionally be isolated, and antibody fragments, for example Fab or scFv fragments, can optionally be prepared starting from the antibodies or the nucleic acids coding for them.
  • Peptides which bind to a polypeptide according to the invention can alternatively also be prepared by an in vitro method known to the person skilled in the art, such as, for example, phage display, yeast display, bacterial display or, for example, the so-called fusagen Technology are obtained in which the nucleic acid and the polypeptide encoded by it are covalently linked to one another via a puromycin.
  • the antisera, antibodies and antibody fragments obtainable by immunization with the polypeptides according to the invention and the peptides obtainable by one of the in vitro methods mentioned are suitable, for example, for examining gene expression banks in order to make proteins homologous to the polypeptides according to the invention, especially those with hydrolytic activity, especially esterolytic and / or lipolytic activity.
  • the present invention therefore also relates to antisera, antibodies and antibody fragments against a polypeptide according to the invention and other peptides which bind to a peptide according to the invention, in particular obtainable by one of the aforementioned methods.
  • Antiserum, antibodies and antibody fragments as well as other peptides that bind to a peptide according to the invention are called “antibodies” below for the sake of simplicity.
  • the present invention furthermore relates to a method for producing a polypeptide according to the invention, characterized in that a nucleic acid according to the invention in a suitable host cell, in particular in E. coli, in particular E. coli BL21 (DE3), or in Rhodococcus, in particular Rhodococcus sp ., is expressed. This can then be followed by purification, especially chromatographic purification of the protein.
  • the method can be carried out, for example, in the following manner: a) a nucleic acid according to the invention is incorporated into a suitable vector and E. coli is transformed with the vector, b) after the expression of the protein, the cells are harvested and disrupted, c) the protein becomes optionally purified from the supernatant thus obtained.
  • E. coli is preferably cultivated between 15 and 40 ° C., preferably between 25 and 37 ° C., particularly preferably at about 30 ° C. If the expression of the nucleic acid according to the invention is induced, for example by IPTG or lactose, the cells are preferably grown for between 3 and 15 hours after induction of the expression, particularly preferably for between 5 and 10 hours. Alternatively, induction of expression can also be dispensed with.
  • the harvested cells are disrupted by a method known to the person skilled in the art, for example French press, ultrasound, ball mill, but particularly preferably by using a sonifier.
  • the cells can also be chemically permeabilized, for example by EDTA or polymyxin B.
  • the protein to be purified is preferably chromatographically. Chromatographic purification of the protein can include, for example, cation and / or anion exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography and / or gel filtration.
  • the chromatographic purification preferably comprises, in particular for purifying the protein according to SEQ ID NO. 2, the following steps: a) the supernatant is placed on an anion exchange column, b) after the elution the active fractions are optionally combined and c) placed on a gel filtration column, then d) the active fractions are again combined if necessary and then concentrated.
  • the anion exchange column is preferably a Q-Sepharose column, in particular a Q-Sepharose column FF from Pharmacia.
  • the gel filtration column is preferably a Superdex column, in particular a Superdex 75 column from Pharmacia.
  • Application to and elution from the anion exchange column is preferably carried out between pH 5.0 and 7.5, particularly preferably between pH 6.0 and 7.0, especially around pH 6.5.
  • a salt gradient is preferably applied for elution.
  • the polynucleotides according to the invention are eluted, for example, at a concentration between 0.4 and 0.5 M NaCl or using another salt with a corresponding ionic strength.
  • Application to and elution from the gel filtration column is also preferably carried out at the same pH as for the anion exchange column.
  • 0.2 M NaCl is preferably added to the buffer or a corresponding ionic strength is set using another salt.
  • the short-chain polypeptides according to the invention can also be synthesized using classic peptide synthesis (Merrifield technique).
  • the invention further relates to a test system for identifying substrates or functional interactors containing at least one nucleic acid according to the invention and / or at least one polypeptide according to the invention and / or at least one antibody according to the invention and, if appropriate, suitable auxiliaries and additives.
  • one or more nucleotides of the nucleic acids according to the invention or one or more amino acids of the polypeptides according to the invention or the antibodies according to the invention can also be modified.
  • the modification can be a radioactive, fluorogenic or chromogenic group or a post-translational modification.
  • FIG. 1 schematically shows the production of the plasmid pMS-RR1 starting from the genomic DNA.
  • FIG. 2 shows the nucleotide sequence of the Sa ⁇ y3AI / Smal fragment, which comprises the esterase gene EstA and its flanking regions (SEQ ID NO. 1). The underlined region in the 5 'direction from the start codon is the putative ribosomal binding region (S / D).
  • the hydrolase motif of the GDXG family of lipolytic enzymes is identified by a gray bar in the amino acid sequence (SEQ ID NO. 2).
  • the positions and sequences of the forward and reverse PCR primers used for sequencing are indicated by arrows. Start and stop codons are printed in bold.
  • the numbering on the left refers to the nucleic acid sequence, that on the right relates to the amino acid sequence.
  • FIG. 4 shows a sequence comparison of the esterase EstA with a lipase from Geotrichum candidum (GCL).
  • GCL Geotrichum candidum
  • the letters stand for: h - helix, e - sheet, f - turn. These include the secondary structural elements of the Geotrichum candidum ⁇ ase [54]. Dotted bars stand for ⁇ -helices, striped bars for ⁇ -sheet structures. Type B carboxylesterases are identified by a gray bar and the serine of the active site is marked in black.
  • FIG. 7 shows the naphthyl and naphthol AS substrates, the hydrolysis of which was investigated using EstA (see Table 2).
  • Figure 8 shows the activity of EstA in relation to the hydrolysis of o- and p-nitrophenyl esters. The activity was determined spectrophotometrically using supernatant fractions from E coli BL21 (DE3) / pMS-RR1.
  • C2-C12 stands for the length of the carbon chain of the carboxylic acid residue of the nitrophenyl ester.
  • FIG. 10 shows the activity of EstA in relation to short- and long-chain fatty acid esters (FIG. 9A) with the addition of bovine serum albumin (BSA) or octylglucoside (OG).
  • FIG. 11 shows the activity of EstA in relation to typical lipolytic substrates (short-chain and long-chain TG) with the addition of bovine serum albumin (BSA) or octylglucoside (OG) (see FIGS. 9B and 9C).
  • E coli SURE (e14 " (McrA) A (mcrCB-hsdSMR- mrr) 171 endA1 supE44 thi-1 gyrA96 relA1 lac recB recJ sbcC umuC :: Tr ⁇ 5 (Kan r ) uvrC [F ' proAB lacPZ ⁇ MI ⁇ (Tet r )]) and E.
  • coli HB101 F thi-1 hsdS20 (r B - m B -) supE44 recA13 ara14 leuB6 proA2 lacY1 galK2 rps 20 (str r ) xyl-5 mtl-1 ⁇ -) were the host cells for the recombinant DNA.
  • Heterologous enzyme expression in E. coli BL21 (DE3) F " the ompT hsdS (r B ' m B “ ) gal ⁇ (DE3) was carried out with the high copy number plasmid pMS470 ⁇ 8 [33].
  • This vector is based on the highly regulated fac promoter and allows insertion of the gene at the start ATG downwards from the highly efficient Shine-Dalgarno sequence, which is derived from gene 10 of the bacteriophage T7.
  • pMS470 ⁇ 8 contains a 1.4 kb stuffer insert between the interfaces Nde ⁇ and Sph ⁇ .
  • pMS4K the form without insert (Grohmann et al. (1997), Microbiology 143, 3889-3898), was used as a control.
  • Sequencing of double-stranded DNA was carried out according to the dideoxy chain termination method [36] using an ABI 373A DNA sequencer, the dye-deoxy terminator sequencing kit (Applied Biosystems, Inc., Faster City, CA, USA) and Amply Tao; DNA polymerase (Perkin-Elmer Corporation, Norwalk, USA). Some gene-specific primers were synthesized using the ABI 392 DNA / RNA synthesizer.
  • the protein concentration was determined using the Bradford method [40] (Bio-Rad, USA). BSA was used as the standard.
  • the nucleic acid sequence of the insert contained in the plasmid pBSII-RR1 was determined (FIG. 2). Sequence analysis showed a G + C content of 65.1%, which is typical for Rhodococcus genes [48,49].
  • An open reading frame (ORF) coding for a protein with 306 amino acids could be identified, the start codon ATG being at position 195 and the stop codon TGA being at position 1113 (FIG. 2, left side).
  • the calculated molecular weight is 33.5 kDa.
  • a putative ribosome binding sequence [50], GAGGA, is found 8 bp before the suspected ATG start codon.
  • Example 2 Construction of the plasmid pMS-RR1 for overexpression of the Rhodococcus esterase gene
  • the gene coding for the esterase was cloned into an E co // expression vector based on the tac promoter.
  • the 1.2 kb Spel-Smal insert from the plasmid pBSII-RR1 was cloned into the plasmid pGEM-5Zf (+/-), whereby the plasmid pGEM-RR1 was obtained.
  • the id / del / EcoO109l fragment which still contains 5'-untranslated sequences, was replaced in this plasmid by the following synthetic Nde l / EcoO109 I adapter:
  • This adapter introduced a ⁇ / del interface at the start ATG and contains the first 36 nucleotides of the esterase structural gene up to the EcoO109l interface.
  • the plasmid obtained was named pGEM-RR1 / adapter.
  • the DNA fragment coding for esterase EstA was taken as a ⁇ / ctel-Sp / il fragment from this plasmid and cloned into the expression vector pMS470 ⁇ 8.
  • pMS-RR1 After transformation into E. coli BL21 (DE3), the construct pMS-RR1 could be shown to confer good esterase activity, which can be demonstrated, for example, by hydrolysis of -naphthyl acetate in an agar plate screening test (Schlacher et al. (1998) J. Biotechnol. 62: 47-54) can be shown.
  • the production of the plasmid pMS-RR1 is shown schematically in FIG. 1.
  • a culture of E. coli BL21 (DE3) pMS-RR1, which was in the exponential growth phase, was diluted 10-fold with fresh amp medium containing LB and incubated at 30 ° C. and 200 rpm. Gene expression was induced by adding IPTG at an OD 595 of 1.3. The cells were incubated for a further 6 hours (OD 595 5.0), then harvested by centrifugation (6000 rpm, 10 min), resuspended in 10 ml Tris-HCl (100 mM, pH 7.0) and frozen at -20 ° C. , After thawing, the cells were disrupted on ice by ⁇ - treatment with a sonifier (Braun Labsonic 2000, Branson Sonifier 250) for 20 seconds each and with a pulse of 70% s "1 .
  • a sonifier Braun Labsonic 2000, Branson Sonifier 250
  • the esterase activity in the supernatant and in the resuspended pellet (100 mM Tris-HCl, pH 7.0) after ultracentrifugation at 4 ° C. (32000 rpm (approx. 80,000 g), 60 min) was determined.
  • the active enzyme EstA was found mainly in the supernatant found, from which the recombinant esterase was used for further experiments.
  • E. coli BL21 (DE3) / pMS4K was used as a negative control.
  • EstA was achieved by culturing E. coli BL21 (DE3) / pMS-RR1 in LB / Amp medium at 30 ° C. for about 10 h. Induction of the tec promoter with 0.1 mM IPTG resulted in specific activity values of 25 U / mg when p-nitrophenylacetate was used as the substrate. A strong protein band at about 33 kDa for the supernatant of the lysate could be found by SDS-PAGE (FIG. 5). The size of this product corresponded very well to the molecular weight calculated based on the amino acid sequence of the esterase EstA.
  • EstA is a water-soluble, intracellular protein. No significant activity could be measured in E. coli BL21 (DE3) with the control plasmid pMS4K without the esM gene.
  • the supernatant of the E coli BL21 (DE3) / pMS-RR1 cell lysate was applied to an anion exchange column (Q-Sepharose FF, Pharmacia), which had been pre-equilibrated with Tris-HCl buffer (0.01 M, pH 6.5). applied. After adsorption, the proteins were eluted with a linear concentration gradient from 0 to 1 M NaCl in equilibration buffer; the esterase EstA was eluted at about 0.45 M NaCl.
  • the fractions with esterase activity were pooled, concentrated (Omegacell, Filtron Technology) and loaded onto a gel filtration column (Superdex 75, Pharmacia), previously containing Tris-HCl buffer (0.01 M, pH 6.5) containing 0.2 M NaCI, had been equilibrated.
  • the protein was eluted with the same buffer.
  • the fractions containing the EstA enzyme were collected, desalted and concentrated by ultracentrifugation as previously described.
  • the chromatographic purification steps were carried out with a Pharmacia FPLC system. The outflow was observed with a UV detector at 280 nm.
  • the protein samples obtained were examined by application to 12% SDS polyacrylamide gels. Homogeneously clean protein could thus be obtained in two steps, by anion exchange chromatography and subsequent size exclusion chromatography.
  • the purification steps and yields are summarized in Table 1.
  • a 3.2-fold enriched esterase could be detected as the only band on an SDS gel (FIG. 6). Due to the running distance, the molecular weight should be about 33 kDa.
  • esterase activity was measured in situ on a 15% native polyacrylamide gel.
  • the samples were incubated at room temperature in 2x dissociation buffer (50 ml Tris (20 mM, pH 7.4), 50 ml glycerol, 1 g Triton X-100 and 0.1 g bromophenol blue) and then applied to the gel.
  • 2x dissociation buffer 50 ml Tris (20 mM, pH 7.4
  • 50 ml glycerol 1 g Triton X-100 and 0.1 g bromophenol blue
  • the gels were dissolved in a solution of 20 ml sodium phosphate (0.1 M, pH 7.0), 2 ml substrate stock solution ( ⁇ - and ⁇ -naphthyl ester, 1% (w / v) in acetone) and 500 ⁇ l Fast Blue B (o-dianisidine, tetrazoded by Sigma) stock solution (2% (w / v) in water) incubated. Ester hydrolysis became visible as a dark red band. E. coli BL21 (DE3) pMS4K was used as a negative control.
  • esterase EstA showed activity only with the substrate triacetin (7.2 U / mg).
  • the triglyceride agar diffusion assay was performed to test the E. coli transformants for lipolytic activity.
  • Ampicillin-containing agar plates were added to various triglycides emulsified by sonification as the substrate, with a final concentration of 7 g / l.
  • the size of the cleared zone around the grown colonies allowed a semi-quantitative estimate of the enzyme activity.
  • Lipases from different species (Geotrichum candidum, Rhizopus orryzae, Candida Cylindracea and Pseudomonas fluorescence), which were added to the plates, were used as positive controls.
  • the esterase activity was analyzed with various o- and p-nitrophenyl esters (o-NPE and p-NPE) as substrates.
  • the photometric measurements were carried out at room temperature in phosphate buffer (100 mM, pH 7.0) containing 4 mM substrate (dissolved in DMSO). The calculation was based on absorption coefficients of 2.42 ml ⁇ mol "1 cm “ 1 for o-NPE and 9.6 ml ⁇ mol "1 cm “ 1 for p-NPE at 405 nm. If the activity of E. coli cell extracts containing a control plasmid pMS4K was measured, the low background activity was subtracted from the activity values obtained for the samples.
  • the purified esterase EstA was tested with two different fluorogenic substrates (material and methods), which are specific for esterases on the one hand, and specific for esterases and lipases on the other. Both substrates contained pyrene as a fluorescence reporter and the trinitrophenylamino group as a fluorescence quencher (FIG. 9). The fluorescence of the intact substrate molecule was very low. Enzymatic release of the fatty acid chains led to the abolition of fluorescence quenching. The rate of hydrolysis could be measured due to the time-dependent increase in fluorescence intensity. Two different systems were used to disperse the labeled substrates, namely complexation with albumin and solubilization with the non-ionic detergent octylglucoside.
  • esterase EstA When using esterase substrates, the esterase EstA showed, as expected, greater activity with short-chain compounds (C4 and C6 carboxylic acids). Little activity was encountered when the acyl chain comprised 12 carbon atoms. Addition of the detergent octylglucoside increased the enzyme activity with respect to C4 and C6 fatty acid esters (Fig. 10).
  • the esterase EstA When using alkyldiacylglycerols, the esterase EstA showed a preference for short-chain lipids. A remarkable stereoselectivity was found for the sn-3 acyl isomer (FIG. 11). In the presence of detergent, the esterase EstA was able to hydrolyze a long chain alkyl diacyl glycerol, a typical substrate for a lipase (Fig. 11). This is in line with the better accessibility and mobility of the substrate in this system [46]. The solubilization of the lipid by the albumin presumably leads to a complex consisting of albumin and alkyldiacylglycerol [47,60]. In such a complex, the substrate is probably not easily accessible due to steric hindrance from the protein. The reaction rates in the presence of albumin are always slower than those in the presence of detergent [46].
  • the reactions for the GC / HPLC screening were carried out in 5 ml of 0.1 M NaH 2 PO 4 (pH 7.3). 250 ⁇ l enzyme and then 100 ⁇ l substrate were added to the buffer. 2-phenyl-2-hexyl acetate and 2- Phenyl-2-butyl acetate used. Buffer with substrate and buffer with enzyme were used as a negative control. The reaction batches were incubated at 25 ° C. at 150 rpm. Samples were taken after 24 hours.
  • a ChiraCel OJ column was used for the HPLC. A flow rate of 1 ml / min was chosen. The absorption was measured at 254 nm, a temperature of 25 ° C. was specified. A mixture of heptane and isopropanol was used as the eluent. First, heptane: isopropanol was given in a ratio of 95: 5. After 5 minutes a ratio of heptane: isopropanol 85:15 was specified, this was kept constant for 20 minutes and then a ratio of 95: 5 was set again.
  • the trinitrophenylaminobutanoyl and trinitrophenylaminododecanoyl pyrenmethyl esters were prepared by the same procedure. 1 (3) -0-hexadecyl-2-pyrendecanoyl-3 (1) -trinitro-phenylaminododecanoyl-sn-glycerol and 1 (3) -0-octyl-2-pyrenebutanoyl-3 (1) trinitro-phenylaminohexanoyl-sn-glycerol , fluorogenic alkyldiacylglycerols, were prepared as described in [47].
  • Example 7 GLC analysis with linaloyl acetate as substrate
  • the purified enzyme (1 mg) was mixed with 2 ml of Tris buffer (10 mM, pH 7.5) and 10 ⁇ l of racemic linalyl acetate (Fluka, Switzerland). The mixture was incubated for 14 hours at room temperature with gentle rolling. The sample was then extracted with diethyl ether (4 ⁇ 4 ml) and the organic phase was dried with Na 2 SO 4 . After adding an internal standard (100 ⁇ l 0.1 M menthol), the organic solvent was concentrated by evaporation and analyzed by GLC.
  • the progress of the reaction was monitored by GLC analysis on a permethylsiloxane column (Biorad RSL 1701).
  • the program 110 / 0-10-160 / 0-20-220 / 2 was used at a bar N 2 .
  • the optical purity of the (s) - (+) - linalool was determined on a permethyl-ß-cyclodextrin column (Chrompack Chirasil-Dex CB) with (R) -linalool (Fluka, Switzerland) determined as the reference standard. The program was used: 87 ° C isothermal, 0.5 bar H 2 .
  • the (S) -enantiomer of the linalyl acetate was preferentially cleaved, the (S) - (+) - linalool being formed in a 40% excess with a conversion of 24%.
  • the remaining (R) acetate showed a low optical purity of e.e. 13%.
  • the selectivity of the reaction expressed as an enantiomeric ratio, was calculated to be approximately equal to 3. Although the selectivity does not appear to be particularly high, the ability of the esfA gene product to cleave sterically hindered esters of tertiary alcohols is remarkable, especially given the large number of lipases, proteases and whole cells that have now been tested, and not so were able to [29,30].
  • Ser-156 was found to be very highly conserved for all enzymes (FIG. 3), which indicates that it is a catalytically important amino acid residue, possibly a member of the catalytic triad Ser-Asp- His, who is involved in the charge transfer mechanism of serine hydrolase esterases.
  • This putative amino acid residue of the active center is located in the middle of a conserved region, which can be seen as a typical signature pattern for the GDXG family of lipolytic enzymes [11].
  • the 624 bp fragment at the 3 'end of the esM gene (64.9% GC portion) was used for the mutagenesis experiments.
  • the 6 different mutagenesis conditions specified in Table 5 were specified in the PCR (A to F).
  • the test conditions A to C differ only in terms of the Mn 2+ concentration.
  • the high Mg 2+ and dNTP concentrations were chosen to further promote incorrect installation. Since the increased Mg 2+ concentration usually favors the formation of AT pairs at the expense of GC pairs, an excess of dCTP and dTTP over dATP and dGTP was specified for test conditions D to F in order to overcome this problem.
  • the plasmid pMS-RR1 which contains the estA gene, and the primers given in Table 6 were used to carry out the PCR.
  • the amount of plasmid (30 ng) and primer (200 ng) was kept constant under all seven PCR conditions (addition of 100 ⁇ l in each case).
  • the desired DNA fragments were purified and ligated into the vector pGEM-T (Promega Corporation, Madison, Wl, USA).
  • the resulting plasmid was transformed into competent Eco // SURE cells using the SEM method. The cells were grown on Amp / IPTG / X-Gal plates. Approximately 30% of the clones were religious vectors. Inserts from several different plasmids from each experiment that were of the desired size after linearization with Apa I were used of the primer SP6 sequenced. The sequences and chromatograms of the mutated
  • Tables 7 and 8 provide an overview of the number and type of
  • the 1, 2 kb fragments obtained under reaction conditions B and C were purified and digested with Nde I and Sph I to obtain collections of mutant esfcA genes 918 base pairs in length.
  • the vector pMS470 ⁇ 8 was digested with the same restriction enzymes, and after the linearized vector (3.9 kb) was purified, the es / ⁇ 4 mutants were ligated with the vector.
  • 2 ⁇ l of the 50 ⁇ l ligation mixture were transformed into SEM-competent E. co // - XL1-blue cells. Approximately
  • McKay AM Microbial carboxylic ester hydrolases (EC 3.1.1.) In food biotechnology. Lett AppI Microbiol 1993; 16: 1-6.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Esterase aus Rhodococcus sp., zu dieser homologe Proteine, Nukleinsäuren kodierend für diese Proteine, Antikörper gegen diese Proteine sowie die Herstellung und Verwendung dieser Proteine, Nukleinsäuren und Antikörper.

Description

Esterase EstA aus Rhodococcus sp.
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Esterase aus Rhodococcus sp., zu dieser homologe Proteine, Nukleinsäuren kodierend für diese Proteine, Antikörper gegen diese Proteine sowie die Herstellung und Verwendung dieser Proteine, Nukleinsäuren und Antikörper.
Hydrolasen sind eine große und vielfältige Gruppe von Enzymen, die neben Ester auch Peptide, Amide und Halide hydrolysieren können. Eine besondere Klasse stellen hierbei die lipolytischen und esterolytischen Enzyme dar, wobei die Abgrenzung der Esterasen (EC 3.1.1) gegenüber den Lipasen schwierig ist, da die Definition dieser Enzyme nicht auf der Struktur ihrer Substrate basiert, sondern eher auf ihrem physikalischen Zustand. Die Klassifikation der Esterasen in Abgrenzung zu den Lipasen erfolgt gewöhnlich aufgrund der Länge der Acylkette ihrer Ester- Substrate. Esterasen zeigen vorzugsweise Aktivität in Bezug auf wasserlösliche, kurzkettige Fettsäureester, während Lipasen höhere Aktivität zeigen in Bezug auf wasserunlösliche, emulsifizierte langkettige Fettsäuresubstrate [1 ,2].
Der Vergleich der Aminosäuresequenzen und Strukturen von Serinhydrolasen macht deutlich, dass ihr aktives Zentrum aus einer katalytischen Triade besteht, die aus einem Serin-, einem Aspartat- oder Glutamat- und einem Histidin-Rest zusammengesetzt ist [3-10]. Für die meisten Esterasen und Lipasen kann ein konserviertes Muster in der Umgebung des Serin des aktiven Zentrums gefunden werden. In der Prosite-Datenbank sind folgende Motive definiert und zwar für die Carboxylesterase-Familien vom Typ-B, „G-D-X-G" und „G-D-S-L" jeweils das Konsensus-Muster F-[GR]-G-x(4)-[LIVM]-x-[LIV]-x-G-x-S-[STAG]-G, [LIVM]-x- [LIVMF]-[SA]-G-D-S-[CA]-G-[GA]-x-L-[CA] bzw. [LIVMFYAG](4)-G-D-S-[LIVM]- x(1 ,2)-[TAG]-G [11]. Desweiteren kann noch das Klasse A ß-Laktamase-Motiv ([F,Y]- X-[L,IN,M,FN]-X-S-[TN]-X-K-X-X-X-X-[A,G,L]-X-X-[L,C]) in einer spezifischen
BESTÄTIGUΝGSKOPIE Klasse von Esterasen gefunden werden (Petersen, E. I., Valinger, G., Sölkner, B. Stubenrauch, G., Schwab H. (2001): A novel esterase from Burkholderia gladioli which shows high deacetylation activity on cephalosporins is related to ß-lactamases and DD-peptidases. J. Biotechnol. 89:11-25).
Darüberhinaus umfasst die Familie der alpha/beta-Hydrolase-gefalteten Enzyme eine Gruppe von Proteinen, die eine dreidimensionale Kernstruktur gemeinsam haben, obwohl keine signifikante Ähnlichkeit in der Primärstruktur festgestellt werden konnte. Während die katalytischen Spezifitäten der Mitglieder der alpha/beta- Hydrolase-gefalteten Enzyme völlig unterschiedlich voneinander sind, scheint ihr enzymatischer Mechanismus ähnlich zu sein [12]. Alle besitzen eine katalytische Triade mit der in der Aminosäuresequenz aufeinanderfolgenden Konfiguration Nukleophil-Säure-Histidin. Diese drei Aminosäuren, befinden sich an ähnlichen topologischen Orten im korrekt gefalteten Protein, obwohl sie durch eine variable Anzahl von Aminosäuren in der Primärstruktur jedes Enzyms voneinander getrennt sind. Bei allen bekannten Familienmitgliedern dieser Hydrolasen ist das Nukleophil, meistens ein Serin-Rest, in einer konservierten Sequenz lokalisiert, dem „nukleophilen Ellbogen", mit einer vorgeschlagenen Konsensusregion Sm-X-Nu-X- Sm-Sm, wobei Sm für eine kleine Aminosäure, in der Regel Glycin, X für eine beliebige Aminosäure und Nu für das Nukleophil steht, welche eine strukturelle Gemeinsamkeit der alpha/beta-Hydrolase-gefalteten Enzyme darstellt [12].
Esterasen haben zunehmend an Bedeutung in der Biotechnologie [13] und in der organischen Chemie [14, 15] gewonnen. Ihre charakteristischen Eigenschaften, wie Substratspezifität, Regioselektiviät und Enantioselektivität, erlauben eine breite Anwendungsmöglichkeit dieser Enzyme. Sie sind in der Natur sehr weit verbreitet und in Tieren, Pflanzen wie auch in Mikroorganismen vorzufinden. Aufgrund ihrer industriellen Anwendungsmöglichkeiten hat sich vor kurzem intensives Forschungsinteresse auf die mikrobiellen Esterasen gerichtet. Hierbei handelt es sich beispielsweise um die Enzyme von Bacillus stearothermophilus [16], Bacillus subtilis [17], Burkholderia gladioli [18] Arthrobacter Globiformis [19], Aspergillus niger [20,21], Aspergillus awamori [22,23], Pseudomonas cepacia [24], Pseudomonas fluorescens [25, 26] and Ochrobactrum anthropi [27]. Ein schwerwiegender Nachteil der bisher verwendeten Enzyme ist jedoch, dass sie nicht dazu in der Lage sind hochsubstituierte Substrate zu spalten. Ein Beispiel eines solchen sperrigen Substrates ist Linalylacetat, ein Ester eines allylischen Tertiäralkohols. Der veresterte Alkohol, Linalool, stellt einer der wichtigsten Terpen- Alkohole der Geschmacks- und Geruchsindustrie dar und liegt in unterschiedlichen enantiomeren Formen vor. Das (R)-(-)-Enantiomer, Licareol, ist der Hauptbestandteil von Extrakten aus Cinnamonium camphora und Cayenne linaloe, während das (S)- (+)-Enantiomer, Coriandrol, in erster Linie im Corianderöl anzutreffen ist. Da sich die beiden Enantiomere in ihrem Geruch unterscheiden [28], ist es wünschenswert die optisch reinen Enantiomere zur Herstellung von Geschmacks- und Geruchskompositionen zu erhalten.
Außerdem wurde in Bezug auf Linalool bereits für etliche mikrobielle Lipasen berichtet, dass es von diesen nicht als Substrat in einer Esterifikations-Reaktion verwendet werden kann [29, 30]. Das korrespondierende Acetat hingegen konnte mit unterschiedlichem Erfolg hydrolysiert werden, wenn ganze mikrobielle Zellen verwendet wurden [31].
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, ein neues hydrolytisches Enzym, insbesondere eine neue Esterase und/oder Lipase, zur Verfügung zu stellen, wozu angesichts der Anwendungsmöglichkeiten solcher Enzyme, insbesondere in der Biotechnologie und organischen Chemie, ein dringender Bedarf besteht, und/oder ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, womit neue hydrolytische Enzyme, insbesondere Esterasen und/oder Lipasen, erhalten werden können.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es insbesondere ein hydrolytisches Enzym, insbesondere eine Esterase und/oder Lipase, zur Verfügung zu stellen, die eine gegenüber den bisher beschriebenen Enzymen verschiedene Substratspezifität und/oder einen unterscheidbaren Grad an Selektivität und/oder eine unterscheidbare Reaktionsgeschwindigkeit und/oder eine unterscheidbare Struktur und/oder einen unterscheidbaren Reaktionsmechanismus besitzt. Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es ferner, Esterasen und/oder Lipasen zur Verfügung zu stellen, die dazu in der Lage sind, sperrige Ester und/oder sterisch schwer zugängliche Ester-Verknüpfungen, insbesondere die sterisch schwer zugängliche Esterbindung im Linaloylacetat zu spalten.
Gelöst wird diese Aufgabe durch die erfindungsgemäßen Polynukleotide, Polypeptide und Antikörper, insbesondere durch ein Polynukleotid gemäß SEQ ID No. 1 , ein Polypeptid gemäß SEQ ID No. 2 und einen gegen ein Polypeptid gemäß SEQ ID No. 2 gerichteten Antikörper.
Für den Fachmann ist naheliegend, wie er ausgehend von einer Nukleinsäure gemäß SEQ ID No. 1 oder einem Polypeptid gemäß SEQ ID No. 2 Nukleinsäuren und Polypeptide ähnlicher Struktur und gleicher oder ähnlicher Funktion erhalten kann. Insbesondere können, beispielsweise durch Evolutionsexperimente, auch Enzyme mit verbesserten Eigenschaften erhalten werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Polynukleotid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: a) Polynukleotid mit einer Nukleinsäuresequenz von Position 195 bis 1115 gemäß SEQ ID No. 1 , b) Polynukleotide kodierend für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 2, c) natürlicherweise vorkommende Mutanten oder polymorphe Formen oder Allele eines Polynukleotids gemäß (a) oder (b), insbesondere solche, die bis zu zehn oder bis zu fünf, vor allem genau ein, zwei oder drei Punktmutationen in Bezug auf ein Polynukleotid gemäß (a) oder (b) besitzen, d) zu einem Polynukleotid gemäß (a), (b) oder (c) komplementäre Polynukleotide, e) unter stringenten Bedingungen mit einem Polynukleotid gemäß (a), (b), (c) oder (d) hybridisierende Polynukleotide, wobei unter stringenten Bedingungen vorzugsweise zu verstehen ist Inkubation bei 60°C in einer Lösung, enthaltend 0,1xSSC und 0,1 % Natriumdodecylsulfat (SDS), wobei 20xSSC eine Lösung enthaltend 3 M Natriumchlorid und 0,3 M Natriumeitrat (pH 7,0) bedeutet, f) Polynukleotide mit einer Sequenzhomologie oder -identität von mindestens 50 %, bevorzugt mindestens 60 % oder 70 %, besonders bevorzugt mindestens 80 %, ganz besonders bevorzugt mindestens 90 %, insbesondere mindestens 95 % oder 98 % in Bezug auf ein Polynukleotid gemäß (a), (b), (c) oder (d), g) Polynukleotide, bestehend aus mindestens 10 oder 15, bevorzugt mindestens 20 oder 25, besonders bevorzugt mindestens 30 oder 40, ganz besonders bevorzugt 50 oder 80, insbesondere mindestens 100 oder 120 aufeinanderfolgenden Nukleotiden eines Polynukleotids gemäß (a), (b), (c), (d) oder (e), h) Polynukleotide mit Deletionen oder Insertionen von bis zu 50 oder 40, insbesondere bis zu 30, 20 oder 10 Nukleotiden gegenüber einem Polynukleotid gemäß (a), (b), (c), (d) oder (e), i) Polynukleotide, die mindestens eines der unter Punkt (a) bis (h) genannten Polynukleotide umfassen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfassen die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren eine oder mehrere nicht-kodierende Sequenzen, wobei es sich bei den nicht-kodierenden Sequenzen beispielsweise um natürlicherweise vorkommende Intronsequenzen oder regulatorische Sequenzen, wie Promotor- oder Enhancer-Sequenzen, insbesondere um solche zur Kontrolle der Expression von Esterasen oder Lipasen, handelt.
Bei den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren handelt es sich bevorzugt um Ribonukleinsäure (RNAs) oder Desoxyribonukleinsäuren (DNAs), wobei die Nukleinsäuren vorzugsweise als doppelsträngige Nukleinsäuren vorliegen.
Vorzugsweise handelt es sich bei den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren um Nukleinsäuren, die für ein Protein mit Hydrolase-Aktivität oder Teile davon kodieren. Bei dem Protein mit Hydrolase-Aktivität handelt es sich vorzugsweise um eine Lipase oder Esterase und/oder um ein Enzym, das dazu in der Lage ist, Ester-, Thioester-, Amid-, Halid- oder Peptid-Bindungen zu spalten, besonders bevorzugt sperrige und/oder sterisch schwer zugängliche Ester-, Thioester-, Amid-, Peptid- oder Halidbindungen. Bei den Verbindungen kann es sich beispielsweise um Ester, Thioester, Peptide, Amide oder Halide mit einer kurzen Acyl-Kette handeln, wobei mit kurzer Acyl-Kette vorzugsweise der Acylrest der Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure oder Valeriansäure gemeint ist. Ganz besonders bevorzugt kann es sich um einen Ester eines Tertiäralkohols, vor allem eines allylischen Tertiäralkohols, insbesondere um einen Ester des Linalools bzw. Licareols oder Coriandrols, besonders bevorzugt um Linaloylacetat, handeln.
Mit Spaltung ist erfindungsgemäß vor allem hydrolytische Spaltung, also Spaltung unter Freisetzung der Carbonsäure und des entsprechenden Alkohols, Thiols, Amins oder Hydrogenhalogenids gemeint. Spaltung kann jedoch in besonderen Ausführungsformen auch unter Ausbildung einer neuen Ester-, Thioester-, Amid-, Peptid- oder Halogenidbindung erfolgen, insbesondere kann es sich hierbei beispielsweise, falls eine Ester-Bindung in eine neue Ester-Bindung umgewandelt wird, um eine Transesterifikationsreaktion handeln.
Ganz besonders bevorzugt handelt es sich bei der Esterase um eine Serin-Esterase und/oder um ein Enzym, das dazu in der Lage ist, regioselektiv oder enantioselektiv Bindungen zu spalten, wobei der Wert für den enantiomeren Überschuß (e.e.) vorzugsweise größer gleich 20 %, besonders bevorzugt größer gleich 40 %, vor allem größer gleich 60 %, inbesondere größer gleich 80 % ist.
Ganz besonders bevorzugt handelt es sich bei der Esterase um eine Hydrolase mit α/ß-Hydrolase-Faltung und/oder um eine Serin-Esterase und/oder um eine Carboxylesterase, insbesondere um eine solche, die zur GDXG-Familie der lipolytischen Enzyme gehört oder zu diesen Enzymen homolog ist.
Bei den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren handelt es sich bevorzugt um Nukleinsäuren, die für eine Esterase, besonders bevorzugt für eine mikrobielle Esterase, besonders bevorzugt bakterielle Esterase, insbesondere für eine Esterase aus Rhodococcus, vor allem für eine Esterase aus Rhodococcus sp., hierbei insbesondere für die Esterase EstA gemäß SEQ ID No. 2 und/oder eines der weiter unten beschriebenen erfindungsgemäßen Polypeptide kodieren.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner die Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, zum einen zur Herstellung oder Isolierung von erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, zum anderen zur Herstellung oder Isolierung neuer, zu den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren homologen Nukleinsäuren, insbesondere solchen mit in Bezug auf die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren ähnlichen strukturellen und gleichen, ähnlichen und/oder verbesserten funktioneilen Eigenschaften, wobei unter funktionellen Eigenschaften insbesondere hydrolytische Aktivität, vor allem Lipase- und/oder Esterase-Aktivität, und unter verbesserten funktioneilen Eigenschaften beispielsweise höhere Spezifität und/oder höherer Umsatz und/oder höherer Regio- oder Enantioselektivität zu verstehen ist.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können so beispielsweise als Sonden zur Identifzierung und/oder Isolierung von homologen Nukleinsäuren aus einer artifiziellen, einer cDNA- oder genomischen Genbank, hierbei vorzugsweise zur Identifizierung von Nukleinsäuren, die für Esterasen, Lipasen und/oder für eines der erfindungsgemäßen Polypeptide oder Teile davon kodieren, oder als Antisense- Nukleinsäuren oder als Primer in der Polymerasekettenreaktion (PCR), hierbei insbesondere zur Amplifikation von Nukleinsäuren umfassend Nukleinsäuren kodierend für Enzyme mit hydrolytischer Aktivität, insbesondere Esterasen und/oder Lipasen, oder Teile davon, verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen oder zu den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren homologe Nukleinsäuren können aber auch durch Zufallsmutagenese oder zielgerichtete Mutagenese, in einer dem Fachmann bekannten Weise, erhalten werden.
Nach Einbau in einen Expressionsvektor können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren beispielsweise zur gezielten Herstellung einzelner Domänen oder Epitope des erfindungsgemäßen Proteins oder von Fusionsproteinen, die die erfindungsgemäßen Polypeptide umfassen, verwendet werden. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher auch ein Verfahren, um eine Nukleinäure zu erhalten, die für ein Protein mit hydrolytischer Aktivität, insbesondere für eine Esterase und/oder Lipase kodiert, folgende Schritte umfassend: a) eine Nukleinsäurebibliothek wird mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure kontaktiert, b) eine Nukleinsäure, die mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure hybridisiert, wird identifiziert, c) die in Schritt (b) identifizierte Nukleinsäure wird sequenziert.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ebenso ein Verfahren zur Isolierung einer für ein Enzym mit hydrolytischer Aktivität, insbesondere für eine Esterase und/oder Lipase, kodierenden Nukleinsäure, folgende Schritte umfassend: a) ausgehend von einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure werden Primer hergestellt, b) die Primer gemäß (a) werden verwendet, um in der PCR Nukleinsäuren, vor allem cDNAs, unbekannter Nukleinsäuresequenz zu amplifizieren, c) die gemäß (b) erhaltenen Nukleinsäuren werden sequenziert.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ebenfalls ein Verfahren zur Isolierung einer für ein hydrolytisches Enzym, insbesondere eine Esterase und/oder Lipase, kodierenden Nukleinsäure, folgende Schritte umfassend: a) Nukleinsäuren einer Bibliothek werden in geeignete Vektoren eingebaut und diese in passende Wirtsorganismen, vorzugsweise Bakterien, insbesondere E. coli, eingebracht, so daß die Expression der Nukleinsäuren erfolgen kann, b) die gemäß (a) erhaltenen Wirtsorganismen werden auf einem festen Träger, vorzugsweise einer Agar-Platte, ausplattiert und inkubiert, c) auf dem festen Träger wird ein Assay, beispielsweise eine Farbreaktion, durchgeführt, der die Umsetzung eines Hydrolase-Substrats, beispielsweise Naphthylacetat, involviert, d) Hydrolase-positive Klone werden identifiziert, beispielsweise durch visuelle Beobachtung, durch automatisierte Imageanalyse oder mittels photometrischer Messung, und gereinigt, e) die Nukleinsäuren aus den in Schritt (d) identifizierten Klonen werden sequenziert.
Schließlich ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung ebenfalls ein Verfahren zur Isolierung einer für ein Enzym mit hydrolytischer Aktivität, insbesondere eine Esterase und/oder Lipase, kodierenden Nukleinsäure, folgende Schritte umfassend: a) eine erfindungsgemäße Nukleinsäure wird Mutagenese-Experimenten unterworfen, b) die erhaltenen Mutanten werden in einen geeigneten Vektor eingebaut und exprimiert, c) die Expressionsprodukte werden auf hydrolytische Aktivität, insbesondere Esterase- und/oder Lipase-Aktivität, hin untersucht, d) die Nukleinsäuren, deren Expressionsprodukte in Schritt (c) hydrolytische Aktivität zeigten, werden sequenziert.
Zur Durchführung der Mutagenese-Experimente kann beispielsweise die Polymerasekettenreaktion (PCR) eingesetzt werden. Die Mutagenese-Experimente können hierbei beispielsweise, insbesondere bei Verwendung einer Taςf- Polymerase, so durchgeführt werden, dass Reaktionsparameter wie die Mg2+- Konzentration, der pH-Wert, die Reaktionstemperatur oder die Substratkonzentrationen variiert werden, oder es kann zum Einsatz von Error-prone- PCR-Techniken kommen, die beispielsweise auf der Zugabe von Mn2+ oder auf der Zugabe ungleicher Nukleotidkonzentrationen beruhen.
Bei der Nukleinsäurebibliothek handelt es sich hierbei vorzugsweise um eine cDNA-, genomische oder artifizielle Bibliothek, besonders bevorzugt um eine mikrobielle, vor allem bakterielle Bibliothek, insbesondere um eine solche aus Rhodococcus, besonders bevorzugt aus Rhodococcus sp.
Gegenstand der Erfindung ist ferner eine Nukleinsäure, die nach einem der vorher genannten Verfahren erhältlich ist. Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure chemisch synthetisiert wird. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können beispielsweise chemisch anhand der in SEQ ID No. 1 angegebenen Nukleinsäuresequenz oder anhand der in SEQ ID No. 2 angegebenen Aminosäuresequenz auf Grundlage des genetischen Codes z.B. nach der Phosphotriester-Methode synthetisiert werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein Vektor, insbesondere ein Klonierungs- und/oder Expressionsvektor, umfassend eine der vorher genannten Nukleinsäuren. Der Expressionsvektor kann beispielsweise ein prokaryotischer oder eukaryotischer Expressionsvektor sein. Bei den prokaryotischen Vektoren zum Einbau der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren handelt es sich beispielsweise um die Plasmide pBSII, pGEM-5Zf(+/-) oder pMS470Δ8 oder um ein anderes high copy number-Plasmid. Bei den erhältlichen Expressionsvekoren für die Expression in E. coli handelt es sich entsprechend beispielsweise um die Vektoren pBSII-RR1 , pGEM-RR1 und pMS-RR1 zur Expression eines Proteins gemäß SEQ ID No. 2.
Bei den Expressionsvektoren für die Expression in E. coli kann es sich beispielsweise aber auch um andere kommerziell erhältliche Vektoren handeln, wie etwa den T7-Expressionsvektor pGM10 oder pGEX-4T-1 GST (Pharmacia Biotech), welche für einen N-terminalen Met-Ala-His6-Tag kodieren, der die Reinigung des exprimierten Proteins über ein Ni2+-NTA-Säule ermöglicht. Als eukaryotische Expressionsvektoren für die Expression in Saccharomyces cerevisiae eignen sich z.B. die Vektoren p426Met25 oder p426GAL1 , für die Expression in Insektenzellen z.B. Baculovirusvektoren wie in EP-B1-0127839 oder EP-B1-0549721 offenbart, und für die Expression in Säugerzellen z.B. SV40-Vektoren.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können in einer Ausführungsform so mit flankierenden Nukleinsäuren in einen Vektor eingebaut werden, dass bei Expression des Vektors die von den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren kodierten Polypeptide als Fusionsproteine vorliegen oder mit einem Tag, einer markierenden Aminosäuresequenz, versehen werden, der beispielsweise die Reinigung oder Detektion der Polypeptide erleichtern kann. Bei dem Tag kann es sich besipielsweise um das strep-, flag-, myc- oder his-Tag handeln.
Die Expressionsvektoren enthalten bevorzugt die für die Wirtszelle geeigneten regulatorischen Sequenzen, hierbei vorzugsweise den lac- oder den tac-Promotor für die Expression in E coli, den ADH-2-, GAL1- oder AOX-Promotor für die Expression in Hefen, den Baculovirus-Polyhedrin-Promotor für die Expression in Insektenzellen oder den frühen SV40-Promotor oder LTR-Promotoren für die Expression in Säugerzellen.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Wirtszelle umfassend einen erfindungsgemäßen Vektor, wobei es sich bei der Wirtszelle bevorzugt um Rhodococcus, insbesondere Rhodococcus sp., oder E. coli, insbesondere um den E. co//-Stamm BL21(DE3), handelt.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren werden bevorzugt nach Einbau in einen geeigneten Vektor durch die dem Fachmann bekannten Methoden der Transfektion, Transformation oder Elektroporation in die Wirtszellen eingebracht.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist des weiteren ein Polypeptid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: a) Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 2, b) natürlicherweise vorkommende Mutanten, polymorphe Formen oder Allele eines Polypeptids gemäß (a), insbesondere solche, die bis zu zehn oder bis zu fünf, vor allem genau ein, zwei oder drei Punktmutationen in Bezug auf ein Polypeptid gemäß (a) besitzen, c) Polypeptide, die eine Sequenzhomologie oder -Identität von mindestens 50 %, bevorzugt mindestens 60 % oder 70 %, ganz besonders bevorzugt mindestens 80 oder 90 %, insbesondere mindestens 95 % oder 98 % in Bezug auf ein Polypeptid gemäß (a) oder (b) besitzen, d) Polypeptide, die von den zuvor genannten erfindungsgemäßen Nukleinsäuren kodiert werden, e) Polypeptide bestehend aus mindestens 5 oder 6, bevorzugt mindestens 10 oder 15, besonders bevorzugt mindestens 20 oder 30, insbesondere mindestens 40, 50 oder 60 aufeinanderfolgenden Aminosäuren eines Polypeptids gemäß (a) oder (b), f) Polypeptide mit Insertionen und/oder Deletionen von bis zu 60, 50 oder 40, insbesondere bis zu 30, 20 oder 10 Aminosäuren in Bezug auf ein Polypeptid gemäß (a), (b) oder (c) g) Polypeptide, die mindestens eines der unter (a) bis (f) genannten Polypeptide umfassen.
Bevorzugt handelt es sich hierbei um Polypeptide, die eine Hydrolyse-Reaktion katalysieren, insbesondere die Hydrolyse von Ester-, Thioester-, Amid-, Peptid- oder Halidbindungen, oder Teile, insbesondere Epitope oder Domänen, von solchen Polypeptiden. Vorzugsweise handelt es sich hierbei um Enzyme, die eine katalytische Triade, umfassend ein Nukleophil, ein Aspartat oder Glutamat und ein Histidin, oder eine katalytische Diade in ihrem reaktiven Zentrum haben. Bevorzugt handelt es sich hierbei um Esterasen oder Lipasen, besonders bevorzugt um eine Serin-Esterase und/oder um eine Carboxylesterase, die zur GDXG-Familie der lipolytischen Enzyme gehört oder starke Homologie zu den Enzymen dieser Familie aufweist, wobei das Serin im aktiven Zentrum (S*) vorzugsweise in der Aminosäuresequenz IVLAGDS*AGGNLA (SEQ ID NO. 9) anzutreffen ist, und/oder es handelt sich um ein Enzym, das alpha/beta-Hydrolase-Faltung aufweist. Bei den Verbindungen, die durch die erfindungsgemäßen Polypeptide gespalten werden können, handelt es sich beispielsweise um Ester, Thioester, Peptide, Amide oder Halide, bevorzugt um solche mit einer kurzen Acyl-Kette, wobei mit kurzer Acyl-Kette insbesondere der Acyl-Rest der Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure oder Valeriansäure gemeint ist. Ganz besonders bevorzugt handelt es sich bei der spaltbaren Verbindung um den Ester eines Tertiäralkohols, vor allem eines allylischen Tertiäralkohols und/oder eines Tertiäralkohols, dessen tertiäres C-Atom eine aromatische oder ungesättigte Kohlenwasserstoffgruppe, vor allem einen Phenylrest, trägt. Hierbei handelt es sich vor allem um einen Ester des Linalools bzw. Licareols oder Coriandrols, insbesondere um Linaloylacetat, oder um einen Ester des 2-Phenyl-2-Butanols, 2-Phenyl-2-Hexanols oder 2-Phenyl-2-Oktanols, insbesondere um 2-Phenyl-2-butyl-acetat, 2-Phenyl-2-hexyl-acetat oder 2-Phenyl-2- oktyl-acetat.
Besonders bevorzugt handelt es sich bei den erfindungsgemäßen Polypeptiden um Esterasen, bevorzugt um mikrobielle, insbesondere bakterielle Esterasen. Ganz besonders bevorzugt handelt es sich um eine Esterase aus Rhodococcus sp., insbesondere um die Esterase EstA gemäß SEQ ID No. 2.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem erfindungsgemäßen Polypeptid um eine wasserlösliche Esterase.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind ferner Mischungen und Präparationen, vor allem bakterielle Präparationen, die in einer dem Fachmann bekannten Weise durchgeführt werden können, enthaltend ein erfindungsgemäßes Polypeptid.
Weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung eines erfindungsgemäßen Polypeptids zur hydrolytischen Spaltung und/oder zur Knüpfung von Ester-, Thioester-, Amid-, Peptid- oder Halid-Bindungen.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich hierbei bei den zu spaltenden oder herzustellenden Verbindungen um solche mit einer kurzen Acyl-Kette, ganz besonders bevorzugt um den Ester eines Tertiäralkohols, vor allem eines allylischen Tertiäralkohols und/oder eines Tertiäralkohols, dessen tertiäres C-Atom eine ungesättigte oder aromatische Kohlenwasserstoffgruppe, vor allem einen Phenylrest, trägt. Hierbei handelt es sich vor allem um einen Ester des Linalools bzw. Licareols oder Coriandrols, insbesondere um Linaloylacetat, oder um einen Ester des 2-Phenyl-2-Butanols, 2-Phenyl-2-Hexanols oder 2-Phenyl-2-Oktanols, insbesondere um 2-Phenyl-2-butyl-acetat, 2-Phenyl-2-hexyl-acetat oder 2-Phenyl-2- octyl-acetat.
Mit „kurzer Acyl-Kette" ist hierbei vorzugsweise ein Carbonsäurerest mit nicht mehr als 6 C-Atomen, besonders bevorzugt mit nicht mehr als 4 C-Atomen, insbesondere ein Acetat-, Propionat-, Butyrat- oder Valeratrest gemeint, wobei die Wasserstoffatome des Restes auch substituiert sein können, insbesondere durch organische Gruppen oder Halogenatome. Bei dem Alkohol-Rest des Esters handelt es sich erfindungsgemäß bspw. um Naphthol, Glycerin, p- und o-Nitrophenol oder um ein Naphthol AS-Substrat.
Erfindungsgemäß verwendbare Substrate oder herzustellende Verbindungen sind im allgemeinen Verbindungen der Formel R1-C(0)-R2, wobei R2 für eines der Halogene F, Cl, Br, I, für eine Aminogruppe NR3R4, für ein Thiol SR3 oder für einen Alkohol OR3 steht und es sich bei R1 vorzugsweise um eine Kohlenwasserstoffkette, die bevorzugt bis zu 5, besonders bevorzugt bis zu 3 Kohlenstoffatome, vor allem genau 1 Kohlenstoffatom umfassen kann, handelt, wobei die Kohlenwasserstoffkette vorzugsweise unverzweigt ist, jedoch auch verzweigt oder ungesättigt sein kann, und wobei mindestens eines der Wasserstoffatome auch durch andere Gruppen substituiert sein kann, wie beispielsweise durch Halogene, Kohlenwasserstoffreste oder Ethergruppen.
Bei dem Alkohol, Thiol oder Amin handelt es sich vorzugsweise um eine sperrige Gruppe. Bei R3 kann es sich so beispielsweise um eine Gruppe CR5R6R7 handeln, wobei mindestens einer, insbesondere genau einer, der Reste R5, R6 und R7 ein sperriges Kohlenwasserstoffgerüst, beispielsweise eine aromatische Gruppe, darstellt, das auch substituiert sein kann. Bei der aromatischen Gruppe kann es sich hierbei auch um einen Heterozyklus handeln. Bei den übrigen Resten, bei denen es sich um keine sperrige Gruppe und/oder um keinen Aromaten handelt, handelt es sich vorzugsweise um ein Wasserstoffatom oder um eine kurzkettige Kohlenwasserstoffkette mit bis zu 8, besonders bevorzugt bis zu 6 C-Atomen, wobei mindestens eines der C-Atome auch einen Substituenten tragen kann, beispielsweise ein Halogenatom. Die Kohlenwasserstoffkette kann hierbei unverzweigt, verzweigt, gesättigt oder ungesättigt sein. Andererseits kann es sich aber auch bei R3 selbst um einen Aromaten, insbesondere auch um einen heterozyklischen Aromaten, handeln, dessen Wasserstoffe auch substituiert sein können. Erfindungsgemäß verwendbare Substrate oder herzustellende Verbindungen sind desweiteren Verbindungen der Formel R1-C(0)-R2, wobei es sich bei R1 um eine sterisch anspruchsvolle Gruppe, vor allem um ein quatemäres Kohlenstoffatom, handelt, das vorzugsweise ein Chrialitätszentrum darstellt. Es kann sich hierbei beispielsweise um das alpha-C-Atom einer alpha-substituierten alpha-Aminosäure handeln oder um ein Kohlenstoffatom als Teil eines Hexanringes, wobei der Hexanring vorzugsweise mindestens einen weiteren Substituenten trägt, beispielsweise in Form einer Kohlenwasserstoffkette oder eines Halogenatoms. Als weiteren Substituenten kann das quaternäre Kohlenstoffatom beispielsweise eine Kohlenwasserstoffkette, insbesondere eine Methyl- oder eine Ethylgruppe tragen. In dieser Ausführungsform handelt es sich bei R2 vorzugsweise um eine einfach aufgebaute Gruppe, beispielsweise um einen Amin- oder einen Alkohol-Rest, der bis zu 6, vor allem bis zu 4 C-Atome umfasst, wobei der Alkoholrest vorzugsweise unverzweigt und ungesättigt ist, jedoch auch verzweigt oder ungesättigt sein kann.
In einer besonderen Ausführungsform handelt es sich bei dem Substrat oder der herzustellenden Verbindung um ein Glycerinderivat, wobei in einer bevorzugten Ausführungsform alle drei Hydroxygruppen, vorzugsweise mit kurzkettigen Säuren, verestert sind. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Substrat um Triacetin.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den mittels der erfindungsgemäßen Polypeptide zu spaltenden oder herzustellenden Substrate um solche der allgemeinen Formel R1-C(0)-R2, wobei R1 für (Cι-C6)-Alkyl, insbesondere (Cι-C3)-Alkyl, steht, das gegebenenfalls ein- oder mehrfach substituiert sein kann, insbesondere durch Reste aus der Gruppe bestehend aus (d-C6)-Alkyl, insbesondere (Cι-C3)-Alkyl, (Cι-C6)-Alkoxy, insbesondere (CrC3)-Alkoxy, Halogen, insbesondere Fluor, Chlor, Brom oder lod, und wobei R2 für Halogen, insbesondere Fluor, Chlor, Brom oder lod, oder für einen Rest ausgewählt aus der Gruppe OR3, SR3 und NR3 steht, wobei R3 für (C6-Cι4)-Aryl, insbesondere Phenyl oder Naphthyl, (Cι-C20)-Alkyl, insbesondere (Cι-C8)-Alkyl, oder (Cι-C-2o)-Alkenyl, insbesondere (C-ι-C8)-Alkenyl, vor allem Hexenyl, steht, wobei die genannten Reste gegebenenfalls ein- oder mehrfach substituiert sein können, insbesondere durch Reste aus der Gruppe bestehend aus (CT-CeJ-Alkyl, insbesondere (CrC3)-Alkyl, (C C6)-Alkoxy, insbesondere (C C3)- Alkoxy, Halogen, insbesondere Fluor, Chlor, Brom oder lod, (d-C6)-Alkenyl, insbesondere (CrC3)-Alkenyl, Hydroxycarbonyl, (Cι-C18)-Alkoxycarbonyl, insbesondere (Cι-Cιo)-Alkoxycarbonyl, (C6-Cι )-Aryl, insbesondere Phenyl, Nitro und Hydroxy, wobei der Arylrest selbst auch ein- oder mehrfach durch die genannten Substituenten substituiert sein kann.
Besonders bevorzugt handelt es sich in dieser Ausführungsform bei R3 um einen Alkyl- oder Alkenyl-Rest, der zwei Substituenten in 1 -Position oder einen Substituenten in 1 -Position und einen Substituenten in 2-Position trägt, wobei vorzugsweise mindestens einer der Substituenten ein Alkenyl-Rest oder ein Aryl- Rest und der andere Substituent vorzugsweise ein Alkyl-Rest ist.
Die Hydrolyse kann erfindungsgemäß beispielsweise in Gegenwart von BSA und/oder in Gegenwart eines Detergens, insbesondere eines nicht-ionischen, wie z.B. Octylglucosid, durchgeführt werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden die erfindungsgemäßen Enzyme verwendet, um enantioselektiv Bindungen zu spalten oder zu knüpfen, wobei der enantiomere Überschuß (e.e.) der betreffenden Reaktion vorzugsweise größer gleich 20 %, besonders bevorzugt größer gleich 40 %, vor allem größer gleich 60 %, insbesondere größer gleich 80 % ist.
Beispielsweise können die erfindungsgemäßen Polypeptide auch verwendet werden, um ausgehend von racemischen Mischungen eine Isolierung oder Anreicherung eines der beiden Enantiomere zu erreichen.
Bei der Knüpfungsreaktion kann es sich beispielsweise um eine Transesterifikationsreaktion handeln.
Mögliche industrielle Anwendungen der erfindungsgemäßen Polypeptide sind beispielsweise die Herstellung oder selektive Anreicherung von Geschmackskomponenten in der Lebensmittelindustrie, von Detergentien in der Waschmittelindustrie, von Feinchemikalien in der chemischen Industrie oder von therapeutisch oder diagnostisch einsetzbaren Substanzen in der Pharmaindustrie.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur Spaltung der zuvor erwähnten Ester-, Thioester-, Amid-, Peptid- oder Halid-Bindungen, dadurch gekennzeichnet, dass Moleküle, die die entsprechenden Bindungen umfassen, mit mindestens einem erfindungsgemäßen Polypeptid inkubiert werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ebenso ein Verfahren zur Knüpfung der zuvor erwähnten Ester-, Thioester-, Amid-, Peptid- oder Halid- Bindungen, dadurch gekennzeichnet, dass Carbonsäuren und/oder Carbonsäureester, -thioester, -amide oder -halide mit einem Alkohol, Thiol, Amin oder Hydrogenhalogenid in Gegenwart eines erfindungsgemäßen Polypeptids inkubiert werden.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide können desweiteren beispielsweise als Epitope zur Herstellung von mono- oder polyklonalen Antikörpern verwendet werden, indem sie an einen Träger, bspw. Rinder-Serumalbumin, gekoppelt werden und anschließend ein Säuger, bevorzugt eine Maus, ein Hase oder ein Kaninchen, mit dem Epitop, bevorzugt unter Verwendung von Adjuvantien, immunisiert wird. Hierzu eignen sich bevorzugt Polypeptide mit einer Länge von 6-12, insbesondere 8, Aminosäuren. Polypeptide mit einer Länge von mehr als 60, insbesondere mehr als 75 Aminosäuren können auch ohne Träger zur Herstellung von Antikörpern verwendet werden. Die entstandenen Antikörper können anschließend gegebenenfalls isoliert werden, und ausgehend von den Antikörpern oder der für sie kodierenden Nukleinsäuren können gegebenenfalls Antikörperfragmente, beispielsweise Fab- oder scFv-Fragmente hergestellt werden.
An ein erfindungsgemäßes Polypeptid bindende Peptide können alternativ auch durch ein dem Fachmann bekanntes in vitro-Verfahren, wie beispielsweise Phage Display, Yeast Display, Bacterial Display oder etwa die sogenannte Fusagen- Technologie erhalten werden, bei der die Nukleinsäure und das von dieser kodierten Polypeptid über ein Puromycin kovalent miteinander verknüpft sind.
Die durch Immunisierung mit den erfindungsgemäßen Polypeptiden erhältlichen Antiseren, Antikörper und Antikörperfragmente sowie die durch eines der genannten in vitro-Verfahren erhältlichen Peptide eignen sich beispielsweise zur Untersuchung von Genexpressionsbanken, um zu den erfindungsgemäßen Polypeptiden homologe Proteine, insbesondere solche mit hydrolytischer Aktivität, vor allem esterolytischer und/oder lipolytischer Aktivität, ausfindig zu machen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher auch Antiseren, Antikörper und Antikörperfragmente gegen ein erfindungsgemäßes Polypeptid sowie andere an ein erfindungsgemäßes Peptid bindende Peptide, insbesondere erhältich durch eines der zuvor genannten Verfahren. Antiserum, Antikörper und Antikörperfragment sowie sonstige an ein erfindungsgemäßes Peptid bindende Peptide werden im folgenden der Einfachheit halber „Antikörper" genannt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Polypeptids, dadurch gekennzeichnet, dass eine erfindungsgemäße Nukleinsäure in einer geeigneten Wirtszelle, insbesondere in E. coli, vor allem E. coli BL21(DE3), oder in Rhodococcus, vor allem Rhodococcus sp., exprimiert wird. Anschließend kann gegebenenfalls Reinigung, vor allem chromatographische Reinigung des Proteins erfolgen.
Das Verfahren kann beispielsweise auf folgende Weise durchgeführt werden: a) eine erfindungsgemäße Nukleinsäure wird in einen geeigneten Vektor eingebaut und E. coli wird mit dem Vektor transformiert, b) nach der Expression des Proteins werden die Zellen geerntet und aufgeschlossen, c) das Protein wird aus dem so erhaltenen Überstand gegebenenfalls aufgereinigt. Kultivierung von E. coli erfolgt hierbei vorzugsweise zwischen 15 und 40°C, bevorzugt zwischen 25 und 37°C, besonders bevorzugt bei etwa 30 °C. Erfolgt Induktion der Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäure beispielsweise durch IPTG oder Laktose, so werden die Zellen nach Induktion der Expression vorzugsweise für zwischen 3 und 15 Stunden wachsen gelassen, besonders bevorzugt für zwischen 5 und 10 Stunden. Alternativ kann auf die Induktion der Expression auch verzichtet werden.
Der Aufschluß der geernteten Zellen erfolgt durch eine dem Fachmann bekannte Methode, beispielsweise French Press, Ultraschall, Kugelmühle, besonders bevorzugt jedoch durch Einsatz eines Sonifikators. Alternativ können die Zellen auch chemisch, beispielsweise durch EDTA oder Polymyxin B, permeabilisiert werden.
Die gegebenenfalls durchzuführende Reinigung des Proteins erfolgt vorzugsweise chromatographisch. Die chromatographische Reinigung des Proteins kann beispielsweise die Kationen- und/oder Anionenaustauschchromatographie, die hydrophobe Wechselwirkungschromatographie und/oder die Gelfiltration umfassen.
Die chromatographische Reinigung umfasst jedoch vorzugsweise, insbesondere zur Reinigung des Proteins gemäß SEQ ID NO. 2, die folgenden Schritte: a) der Überstand wird auf eine Anionenaustauschsäule gegeben, b) nach der Elution werden die aktiven Fraktionen gegebenenfalls vereint und c) auf eine Gelfiltrationssäule gegeben, anschließend d) werden die aktiven Fraktionen gegebenenfalls wiederum vereint und anschließend eingeengt.
Bei der Anionenaustauschsäule handelt es sich hierbei bevorzugt um eine Q- Sepharosesäule, insbesondere um eine Q-Sepharosesäule FF von Pharmacia. Bei der Gelfiltrationssäule handelt es sich bevorzugt um eine Superdex-Säule, insbesondere um eine Superdex 75-Säule von Pharmacia.
Auftrag auf und Elution von der Anionenaustauschsäule erfolgt vorzugsweise zwischen pH 5.0 und 7.5, besonders bevorzugt zwischen pH 6.0 und 7.0, insbesondere etwa bei pH 6.5. Zur Elution wird vorzugsweise ein Salzgradient angelegt. Die Elution der erfindungsgemäßen Polynukleotide erfolgt beispielsweise bei einer Konzentration zwischen 0,4 und 0,5 M NaCI oder unter Einsatz eines anderen Salzes bei entsprechender lonenstärke.
Auftrag auf und Elution von der Gelfiltrationssäule erfolgt ebenfalls vorzugsweise bei dem gleichen pH-Wert wie für die Anionenaustauschsäule. In den Puffer wird vorzugsweise 0,2 M NaCI gegeben oder unter Einsatz eines anderen Salzes eine entsprechende lonenstärke eingestellt.
Vor allem die kurzkettigen erfindungsgemäßen Polypeptide können auch mit Hilfe der klassischen Peptidsynthese (Merrifield-Technik) synthetisiert werden. Weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Testsystem zur Identifizierung von Substraten oder funktioneilen Interaktoren enthaltend mindestens eine erfindungsgemäße Nukleinsäure und/oder mindestens ein erfindungsgemäßes Polypeptid und/oder mindestens einen erfindungsgemäßen Antikörper und gegebenenfalls geeignete Hilfs- und Zusatzstoffe.
Erfindungsgemäß kann auch ein Nukleotid oder mehrere Nukleotide der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder eine oder mehrere Aminosäuren der erfindungsgemäßen Polypeptide oder der erfindungsgemäßen Antikörper modifiziert sein. Bei der Modifikation kann es sich etwa handeln um eine radioaktive, fluorogene oder chromogene Gruppe oder um eine posttranslationale Modifikation.
Im folgenden werden bestimmte Ausführungsformen der Erfindung exemplarisch anhand von Abbildungen und Ausführungsbeispielen erläutert.
Abbildungen
In Fig. 1 ist schematisch die Herstellung des Plasmids pMS-RR1 ausgehend von der genomischen DNA dargestellt. In Fig. 2 ist die Nukleotidsequenz des Saιy3AI/Smal-Fragments, das das Esterase- Gen EstA und seine flankierenden Regionen umfasst (SEQ ID NO. 1), dargestellt. Die unterstrichene Region in 5'-Richtung vom Startkodon ist die putative ribosomale Bindungsregion (S/D). Das Hydrolasemotiv der GDXG-Familie der lipolytischen Enzyme ist durch einen grauen Balken in der Aminosäuresequenz (SEQ ID NO. 2) gekennzeichnet. Die Positionen und Sequenzen der Vorwärts- und Rückwärts-PCR- Primer, die für die Sequezierung verwendet wurden, sind durch Pfeile gekennzeichnet. Start- und Stopp-Kodons sind fett gedruckt. Die Numerierung auf der linken Seite bezieht sich auf die Nukleinsäuresequenz, diejenige auf der rechten Seite auf die Aminosäuresequenz.
In Fig. 3 ist ein Aminosäuresequenzvergleich der Esterase EstA mit homologen Enzymen dargestellt. Die Ausrichtung der Sequenzen erfolgte unter Verwendung des Programms Multalin am INRA [52] unter Vorgabe der Parameter: symbol comparison table - blosum 62; gap weight - 12; gap length weight - 2. Folgende Enzyme wurden miteinander verglichen: Esterase EstA aus Rhodococcus sp. NCIMB 11216; eine Lipase aus Pseudomonas sp. B11-1 [57]; eine Carboxylesterase aus Archaeoglobus fulgidus [58]; eine Esterase aus Amycolatopsis mediterranei [59]; eine Heroinesterase aus Rhodococcus sp. [49]; die Lipase 2 aus Moraxella sp. [56]. Die Aminosäuren, die bei zumindest vier dieser sechs Enzyme identisch sind, wurden durch einen grauen Balken gekennzeichnet. Die putativen Aminosäuren des aktiven Zentrums der Esterase EstA sind durch einen Stern gekennzeichnet.
In Fig. 4 ist dargestellt ein Sequenzvergleich der Esterase EstA mit einer Lipase aus Geotrichum candidum (GCL). Die Amionsäurereste sind numeriert. Die Sequenzen wurden unter Verwendug des Programms CLUSTALW am PBIL [51] zunächst unter Vorgabe Parameter: weight matrix - blosum; gap opening penalty - 12; gap extension penalty - 3; aneinander ausgerichtet und anschließend nochmals manuell unter Berücksichtigung der Sekundärstrukturelemente aneinander ausgerichtet. Zur Bezeichnung der Aminosäuren wurde der Einbuchstabencode verwendet. Die Symbole bedeuten folgendes: * - Identität; : - starke Homologie; . - geringe Homologie. Oberhalb und unterhalb der Aminosäuresequenz sind vermutete Sekundärstrukturelemente genannt, die nach der Methode von Garnier (GOR4) [53] ermittelt wurden. Die Buchstaben stehen für: h - helix, e - sheet, f - turn. Darunter sind die Sekundärstrukturelemente der Geotrichum candidum- φase angegeben [54]. Gepunktete Balken stehen für α-Helices, gestreifte für ß-Faltblattstrukturen. Das Erkennungszeichen der Carboxylesterasen vom Typ B ist durch einen grauen Balken gekennzeichnet und das Serin des aktiven Zentrums ist schwarz markiert.
In Fig. 5 ist ein Polyacrylamidgel mit rekombinant exprimierter Esterase EstA dargestellt. In Spur 1 wurde aufgetragen Rohlysat von E coli BS21(DE3) / pMS- RR1 , induziert mit IPTG, in Spur 2 LMW-Standard.
In Fig. 6 ist die Reinigung von EstA anhand eines 12%igen SDS-Polyacrylamid-Gels dargestellt. In Spur 1 wurde aufgetragen LMW-Standard, in Spur 2 Rohlysat, in Spur 3 die isolierte Fraktion nach der IEC (QFF), in Spur 4 die isolierte Fraktion nach der SEC (Superdex 75).
In Fig. 7 sind die Naphthyl und Naphthol AS-Substrate dargestellt, deren Hydrolyse unter Verwendung von EstA untersucht wurde (s. Tab. 2).
In Fig. 8 ist die Aktivität von EstA in Bezug auf die Hydrolyse von o- und p- Nitrophenylester dargestellt. Die Aktivität wurde unter Verwendung von Überstandfraktionen von E coli BL21(DE3) / pMS-RR1 spektrophotometrisch ermittelt. C2-C12 steht für die Länge der Kohlenstoffkette des Carbonsäurerests des Nitrophenylesters.
In Fig. 9 sind Substrate für Esterasen und Lipasen gezeigt, die auf Spaltung durch EstA untersucht wurden.
In Fig. 10 ist die Aktivität von EstA in Bezug auf kurz- und langkettige Fettsäureester (Fig. 9A) unter Zusatz von Rinderserumalbumin (BSA) bzw. Octylglucosid (OG) gezeigt. In Fig. 11 ist die Aktivität von EstA in Bezug auf typische lipolytische Substrate (short-chain und long-chain TG) unter Zusatz von Rinderserumalbumin (BSA) bzw. Octylglucosid (OG) gezeigt (s. Fig. 9B und 9C).
In Fig. 12 ist die Umsetzung von rac-Linalylacetat bzw. rac-Linaloylacetat (die beiden Begriffe werden synonym verwendet) mittels eines erfindungsgemäßen Enzyms dargestellt. Das fSJ-Enantiomere wird unter Freisetzung von fSJ-Linalool umgesetzt, während das (RJ-Enantiomere nicht umgesetzt wird.
Material und Methoden
a) Bakterienstämme und Plasmide zur Klonierung und Expression der Nukleinsäuren
Die Vektoren pBluescript II SK+/- (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA, USA) und pGEM-5Zf(+) (Promega Corporation, Madison, Wl, USA) wurden für die Klonierungsexperimente verwendet. E coli SURE (e14"(McrA ) A(mcrCB-hsdSMR- mrr)171 endA1 supE44 thi-1 gyrA96 relA1 lac recB recJ sbcC umuC::Tr\5 (Kanr) uvrC [F' proAB lacPZΔMIδ
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(Tetr)]) und E. coli HB101 (F thi-1 hsdS20(rB- mB-) supE44 recA13 ara14 leuB6 proA2 lacY1 galK2 rps 20(strr) xyl-5 mtl-1 λ-) waren die Wirtszellen für die rekombinante DNA. Heterologe Enzymexpression in E coli BL21(DE3) (F" dem ompT hsdS(rB ' mB ") gal λ(DE3)) wurde mit dem high copy number plasmid pMS470Δ8 [33] durchgeführt. Dieser Vektor basiert auf dem stark regulierten fac-Promoter und erlaubt die Insertion des Gens am Start ATG abwärts von der hocheffizienten Shine-Dalgarno-Sequenz, die vom Gen 10 des Bakteriophagen T7 abstammt. pMS470Δ8 enthält einen 1.4 kb Platzhalterfragment (stuffer insert) zwischen den Schnittstellen Nde\ und Sph\. pMS4K, die Form ohne Insert (Grohmann et al. (1997), Microbiology 143, 3889-3898), wurde als Kontrolle eingesetzt.
b) Kulturmedien und Wachstumsbedingungen zur Kultivierung der E. coli- Zellen LB Medium [34] wurde normalerweise für das Wachstum von E coli bei 37°C und für die Überproduktion von EstA bei 30°C verwendet. Zur Herstellung von festem Medium wurde Agar bis zu einer Konzentration von 15 g/l hinzugegeben. Mit Ampicillin und IPTG (Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid) wurden, falls erforderlich, finale Konzentrationen von 0.1 g/l bzw. 0.1 mM eingestellt. c) DNA-Modifikation und Transformation zur Herstellung der Expressionsvektoren und Expressionssysteme
Verwendet wurden Restriktionsendonukleasen und modifizierende Enzyme von New England BioLabs (Beverly, USA), Boehringer (Mannheim, FRG), und Promega Corporation (Madison, USA). Alle Restriktionsreaktionen und DNA-Modifikationen wurden ausgeführt wie vom Hersteller empfohlen. Die Transformation von E. coli- Stämmen wurde mit der SEM-Mehode [35] durchgeführt.
d) DNA-Sequenzierung und Analyse
Die Sequenzierung von doppelsträngiger DNA wurde nach dem Dideoxy- Kettenterminations-Verfahren durchgeführt [36] unter Verwendung eines ABI 373A DNA-Sequenziergeräts, des Dye-Deoxy Terminator Sequencing Kits (Applied Biosystems, Inc., Faster City, CA, USA) und der Amply Tao; DNA Polymerase (Perkin-Elmer Corporation, Norwalk, USA). Einige Gen-spezifische Primer wurden mit dem ABI 392 DNA/RNA-Synthesizer synthetisiert.
DNA-Analyse und die Suche nach Homologen wurden durchgeführt unter Verwendung des Wisconsin Sequence Analysis Package (GCG program) [37].
e) Proteinbestimmung, SDS-PAGE und Gelfärbemethoden
Die Proteinkonzentration wurde mit der Bradford-Methode bestimmt [40] (Bio-Rad, USA). BSA wurde als Standard verwendet.
SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese wurde mit 12%igen Polyacrylamid-Gelen durchgeführt [41]. Die Proben wurden für 5 Minuten in 2fachem Ladungspuffer (70 ml Tris (0,125 M, pH 6.75), 20 ml Glycerin, 4 g SDS, 10 ml ß-Mercaptoethanol und 0,002 g Bromphenolblau) gekocht. Als Marker wurde LMW-Marker von Pharmacia Biotech (USA) verwendet. Die Proteine wurden mit Coomassie Brilliant Blue gefärbt. Beispiel 1: Klonierung, Sequenzierung und Sequenzanalyse des Esterase- Gens estA
Eine genomische Bibliothek von Rhodococcus sp. NCIMB 11216 wurde mittels α- Naphthylacetat auf Hydrolyse-Aktivität hin untersucht. Es wurde ein positiver Klon ausfindig gemacht, der das Plasmid pRR1 mit einem 4.5 kb-Fragment enthielt. Er zeigte interessanterweise die Fähigkeit, die sterisch schwer zugängliche Esterbindung des Linalylacetats zu spalten [32]. Unter Verwendung von Sma I wurde das 3*-Ende des Fragments deletiert, um das Fragment in etwa auf die für die Esterase kodierende Region zu reduzieren. Der resultierende Vektor, pBSII-RR1 , der ein 1.2 kb-lnsert enthielt, zeigte nach Transformation in E. coli gute Esterase- Aktivität auf Agarplatten mit dem oben genannten Substrat.
Die Nukleinsäuresequenz des im Plasmid pBSII-RR1 enthaltenen Inserts wurde bestimmt (Fig. 2). Die Sequenzanalyse zeigte einen G+C-Gehalt von 65.1%, was typisch für Rhodococcus-Gene ist [48,49]. Es konnte ein open reading frame (ORF), der für ein Protein mit 306 Aminosäuren kodiert, identifiziert werden, wobei sich das Startkodon ATG an der Position 195 und das Stopkodon TGA sich an der Position 1113 befindet (Fig. 2, linke Seite). Das berechnete Molekulargewicht beträgt 33.5 kDa.
Eine putative Ribosomen-Bindungssequenz [50], GAGGA, ist 8 bp vor dem vermuteten ATG-Startkodon anzutreffen.
Es konnten keine typischen Esche chia co//'-artigen Promoter-Sequenzmotive in der DNA-Sequenz in 5'-Richtung von dem esM-Gen angetroffen werden, auch nicht in 3'-Richtung vom Transkriptions-Terminationsmotiv. Es ist zu vermuten, daß die Transkription des esfcA-Gens ausgelöst wird durch einen RΛo ococcüs-spezifischen Mechanismus, wobei die Sequenzmotive, die darin involviert sind, noch unbekannt sind, wie das etwa auch mit dem her-Gen aus dem Rhodococcus sp. Stamm H1 [49] der Fall ist.
Beispiel 2: Konstruktion des Plasmids pMS-RR1 zur Überexpression des Rhodococcus Esterase-Gens
Da das Expressionsniveau des Proteins eher niedrig war, wurde das für die Esterase kodierende Gen in einen E co//-Expressionsvektor auf Basis des tac-Promotors kloniert. Um Nde I und Sph I-Schnittstellen in die 5'- bzw. 3'-flankierenden Regionen des Gens einzuführen, wurde das 1 ,2 kb große Spel-Smal-Insert aus dem Plasmid pBSII-RR1 in das Plasmid pGEM-5Zf(+/-) kloniert, wodurch das Plasmid pGEM-RR1 erhalten wurde. In diesem Plasmid wurde in einem weiteren Schritt das Λ/del/EcoO109l-Fragment, das noch 5'-nicht translatierte Sequenzen enthält durch den folgenden synthetischen Nde l/EcoO109 I-Adapter ersetzt:
(5'-TATGTCATTGCACCCCGAAGTCGAGTCCATGTTGAAG -3' (SEQ ID NO. 3) 3'- ACAGTAACGTGGGGCTTCAGCTCAGGTACAACTTCCGG -5' (SEQ ID NO. 4))
Dieser Adapter führte eine Λ/del-Schnittstelle beim Start-ATG ein und enthält die ersten 36 Nukleotide des Esterase-Strukturgens bis zur EcoO109l-Schnittstelle. Das erhaltene Plasmid wurde pGEM-RR1/adapter benannt. Aus diesem Plasmid wurde das für Esterase EstA kodierende DNA-Fragment als Λ/ctel-Sp/il-Fragment entnommen und in den Expressionsvektor pMS470Δ8 kloniert.
Nach Transformation in E. coli BL21(DE3) konnte für das Konstrukt pMS-RR1 gezeigt werden, dass es gute Esterase-Aktivität vermittelt, was beispielsweise durch Hydrolyse von -Naphtylacetat in einem Agarplatten-Screeningtest (Schlacher et al. (1998) J. Biotechnol. 62: 47-54) gezeigt werden kann. Die Herstellung des Plasmids pMS-RR1 ist in Fig. 1 schematisch dargestellt.
Beispiel 3: Expression der Esterase EstA und Präparation von Zelllysaten
Eine Kultur von E. coli BL21(DE3) pMS-RR1 , die sich in der exponentiellen Wachstumsphase befand, wurde 10fach mit frischem Amp-haltigen LB-Medium verdünnt und bei 30°C und 200 rpm inkubiert. Die Genexpression wurde induziert durch Zugabe von IPTG bei einer OD595 von 1 ,3. Die Zellen wurden für weitere 6 Stunden inkubiert (OD595=5,0), anschließend durch Zentrifugation geerntet (6000 rpm, 10 min), in 10 ml Tris-HCI (100 mM, pH 7.0) resuspendiert und bei -20°C eingefroren. Nach dem Auftauen erfolgte Aufschluß der Zellen auf Eis durch βfache Behandlung mit einem Sonifikator (Braun Labsonic 2000, Branson Sonifier 250) für jeweils 20 Sekunden und bei einem Puls von 70 % s"1.
Die Esterase-Aktivität im Überstand sowie im resuspendierten Pellet (100 mM Tris- HCI, pH 7.0) nach Ultrazentrifugation bei 4°C (32000 rpm (ca. 80000 g), 60 min) wurde bestimmt. Das aktive Enzym EstA wurde hauptsächlich im Überstand vorgefunden, aus dem die rekombinante Esterase für weitere Experimente verwendet wurde. E coli BL21(DE3)/pMS4K wurde als Negativkontrolle verwendet.
Optimale Expression von EstA wurde erreicht durch Kultivierung von E. coli BL21(DE3) / pMS-RR1 in LB/Amp-Medium bei 30°C für etwa 10 h. Induktion des tec-Promotors mit 0.1 mM IPTG resultierte in spezifischen Aktivitätswerten von 25 U/mg bei Verwendung von p-Nitrophenylacetat als Substrat. Für den Überstand des Lysats konnte eine starke Proteinbande bei etwa 33 kDa durch SDS-PAGE ausfindig gemacht werden (Fig. 5). Die Größe dieses Produkts entsprach sehr gut dem Molekulargewicht, das auf Grundlage der Aminosäuresequenz der Esterase EstA berechnet worden war. Bestimmung der Esteraseaktivität im Pellet und in den Überstand-Fraktionen zeigte, daß sich 95 % der Aktivität im Überstand befand. Daraus konnte man darauf schließen, dass es sich bei EstA um ein wasserlösliches, intrazelluläres Protein handelt. In E. coli BL21 (DE3) mit dem Kontrollplasmid pMS4K ohne dem esM-Gen konnte keine signifikante Aktivität gemessen werden.
Beispiel 4: Reinigung der Esterase EstA
Der Überstand des E coli BL21 (DE3)/pMS-RR1 Zell-Lysats wurde auf eine Anionen- Austauschsäule (Q-Sepharose FF, Pharmacia), die mit Tris-HCI Puffer (0,01 M, pH 6.5) voräquilibriert worden war, aufgetragen. Nach der Adsorption wurden die Proteine mit einem linearen Konzentrationsgradienten von 0 bis 1 M NaCI in Äquilibrationspuffer eluiert; die Esterase EstA wurde bei etwa 0,45 M NaCI eluiert. Die Fraktionen mit Esterase-Aktivität wurden vereint, konzentriert (Omegacell, Filtron Technology) und auf eine Gelfiltrationssäule (Superdex 75, Pharmacia) geladen, die vorher mit Tris-HCI-Puffer (0,01 M, pH 6.5), enthaltend 0,2 M NaCI, äquilibriert worden war. Elution des Proteins erfolgte mit demselben Puffer. Die Fraktionen, die das Enzym EstA enthielten, wurden gesammelt, entsalzt und durch Ultrazentrifugation, wie zuvor beschrieben, konzentriert.
Die chromatographischen Reinigungsschritte wurden mit einem Pharmacia FPLC System ausgeführt. Der Ausfluß wurde mit einem UV-Detektor bei 280 nm beobachtet. Die erhaltenen Proteinproben wurden durch Auftrag auf 12 %-ige SDS- Polyacrylamidgele untersucht. Homogen sauberes Protein konnte so in zwei Schritten erhalten werden, durch Anionen-Austauschchromatographie und anschließende Größenausschluß- Chromatographie. Die Reinigungsschritte und Ausbeuten sind in Tabelle 1 zusammengefaßt. Eine 3,2-fach angereicherte Esterase konnte als einziges Band auf einem SDS-Gel nachgewiesen werden (Fig. 6). Augrund der Laufstrecke sollte das Molekulargewicht etwa 33 kDa betragen.
Tab. 1 : Die Reinigungsschritte und Ausbeuten der Esterase EstA; spektrophotomethscher Assay mit p-Nitrophenylacetat als Substrat
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Beispiel 5: Enzym-Assays zur Bestimmung der Aktivität und Spezifität
Soweit nicht anders angegeben wurden Substrate von Sigma Chemical Co. (St.
Louis, MO, USA) verwendet.
Fünf verschiedene Methoden kamen zur Anwendung, um die Esterase-Aktivität zu ermitteln: a) qualitativer Assay Zur vorläufigen Charakterisierung des esfA-Genprodukts in Hinblick auf eine Präferenz in Bezug auf die Kettenlänge der Fettsäureeinheit des Substrats, wurde der Überstand des rekombinanten E coli BL21 (DE3) / pMS-RR1-Lysats mit verschiedenen Naphthylestern getestet.
Die Esterase-Aktivität wurde hierbei in situ auf einem 15%ιgen nativen Polyacrylamidgel gemessen. Die Proben wurden hierzu bei Raumtemperatur in 2x Dissoziationspuffer (50 ml Tris (20 mM, pH 7.4), 50 ml Glycerin, 1 g Triton X-100 und 0,1 g Bromphenolblau) inkubiert und anschließend auf das Gel aufgetragen. Nach der Elektrophorese und Proteinauftrennung wurden die Gele in einer Lösung von 20 ml Natriumphosphat (0,1 M, pH 7.0), 2 ml Substrat-Stammlösung (α- und ß- Naphthylester, 1 % (w/v) in Aceton) und 500 μl Fast Blue B (o-Dianisidin, tetrazodiert von Sigma)-Stammlösung (2 % (w/v) in Wasser) inkubiert. Die Esterhydrolyse wurde als dunkelrote Bande sichtbar. E. coli BL21(DE3) pMS4K wurde als Negativkontrolle verwendet.
Die in Tabelle 2 dargestellten Ergebnisse zeigten, daß die Esterase EstA Naphthylester mit kurzkettigen Säuren bevorzugt. Fast keine Aktivität wurde angetroffen für Säuren mit mehr als fünf Kohlenstoff-Atomen wie auch mit sperrigen Naphthol AS und Naphthol AS-D Estern.
Tab. 2: Die relativen Aktivitäten der Esterase EstA in Bezug auf verschiedene Naphthyl-ester; qualitativer Assay. E coli BL21(DE3) / pMS-RR1 wurde bei dem Experiment als Enzymquelle verwendet. Die Aktivität wurde aufgrund der Färbung abgeschätzt: +++ intensiv gefärbte breite Bande; ++ stark gefärbte Bande; + schwach gefärbte Bande; +/- kaum wahrnehmbare Bande; - keine Bande wahrnehmbar.
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b) Titrimetrie
1 ml eines rohen Bakterieniysats wurde mit 50 ml Natriumphosphatpuffer (20 mM, pH 7.0) und jeweils 100 μl verschiedener Triacylglyceride (Triacetin, Tributyrin oder Tricaproin) bei Raumtemperatur gemischt. Die Esterase-Aktivität wurde ermittelt, indem die freie Fettsäure mit NaOH (0,1 M, pH 7.0) titriert wurde unter Verwendung von Mettler-Toledo DL21 pH-stat. Eine Einheit enzymatischer Aktivität wird hierbei definiert als die Menge Enzym, die 1 μmol Säure pro Minute unter den Assay- Bedingungen freisetzt. E. coli BL21 (DE3) pMS4K wurde als Negativkontrolle verwendet.
In Titrationsanalyseexperimenten mit verschiedenen Triacylglyceriden zeigte die Esterase EstA Aktivität nur mit dem Substrat Triacetin (7.2 U/mg).
c) Plattenassay
Der Triglycerid-Agar-Diffusions-Assay wurde durchgeführt, um die E. coli- Transformanten auf lipolytische Aktivität hin zu testen. Ampicillin-enthaltenden Agarplatten wurde verschiedene durch Sonifikation emulsifizierte Triglycehde als Substrat zugesetzt unter Einstellung einer finalen Konzentration von 7 g/l. Die Größe der geklärten Zone um die gewachsenen Kolonien herum erlaubte hierbei eine halbquantitative Abschätzung der Enzymaktivität. Lipasen aus verschiedenen Spezies (Geotrichum candidum, Rhizopus orryzae, Candida Cylindracea and Pseudomonas fluoreszenz) , die auf die Platten gegeben wurden, wurden als Positivkontrolle eingesetzt.
Substrate mit einer Säurenkette länger als sechs C-Atome wurden im Plattenassay getestet (Material und Methoden). Verschiedene Lipasen, die als Positivkontrollen verwendet wurden, produzierten ein deutliches Signal (halo) auf Platten, die Tricapryolin, Trilaurin oder Triolein als Substrat enthielten. Eine Halo-Bildung konnte nicht beobachtet werden, wenn rekombinante E coli Zellen mit dem Plasmid pMS- RR1 auf diesen Platten wuchsen, wodurch deutlich wurde, dass das Enzym nicht in der Lage ist wasserunlösliche emulsifizierte langkettige Fettsäuresubstrate zu hydrolisieren.
d) Spektrophotometrie
Die Esterase-Aktivität wurde mit verschiedenen o- und p-Nitrophenylester (o-NPE und p-NPE) als Substraten analysiert. Die photometrischen Messungen wurden bei Raumtemperatur in Phosphatpuffer (100 mM, pH 7.0), der 4 mM Substrat (aufgelöst in DMSO) enthielt, durchgeführt. Absorptionskoeffizienten von 2.42 ml μmol"1 cm"1 für o-NPE und 9,6 ml μmol"1 cm"1 für p-NPE bei 405 nm wurden der Berechnung zugrundegelegt. Falls die Aktivität von Zellextrakten von E. coli, die ein Kontrollplasmid pMS4K enthielten, gemessen wurde, wurde die geringe Hintergrundaktivität von den für die Proben erhaltenen Aktivitätswerten abgezogen. Die Enzymwirkung auf die zuvor beschriebenen o- und p- Nitrophenylsäureester zeigte, daß die rekombinante Rhodococcus sp. Esterase maximale Aktivität aufweist, wenn Nitrophenylacetat als Substrat verwendet wurde, wobei das p- Substrat bevorzugt gespalten wurde (Fig 8). Die Aktivität nahm rapide ab bei Verwendung von Nitrophenylpropionat. Es konnte keine bedeutende Aktivität gefunden werden, wenn die Acylkette länger war als 4 C-Atome war (Fig. 8).
e) Fluoreszenz-Assay
Die Fluoreszenz-Assays für die lipolytischen Enzyme wurden nach den Protokollen von Zandonella et al. durchgeführt. In der Regel wurden Lösungen von 18 nmol Substrat in 25 μl Tetrahydrofuran in 9 ml Tris-HCI-Puffer (0,1 M, pH 7.4) in Anwesenoder Abwesenheit von 2 nmol Fettsäure-freiem Albumin pro ml und 2 mM Octylglucosid (unter der CMC) injiziert. Nach Zugabe der sauberen Esterase EstA (0,5 mg), wurde die Fluoreszenzintensität bei 400 nm (λex = 342 nm) bei 37°C als Funktion der Zeit aufgenommen. Verwendet wurde hierbei ein Perkin-Elmer LS 50B- Fluorometer. Die gereinigte Esterase EstA wurde mit zwei verschiedenen fluorogenen Substraten getestet (Material und Methoden), die einerseits spezifisch für Esterasen, andererseits spezifisch für Esterasen und Lipasen sind. Beide Substrate enthielten Pyren als Fluoreszenz-Reporter und die Trinitrophenylaminogruppe als Fluoreszenz- Quencher (Fig. 9). Die Fluoreszenz des intakten Substratmoleküls war sehr gering. Enzymatische Freisetzung der Fettsäureketten führte zu einer Aufhebung des Fluoreszenz-Quenching. Die Geschwindigkeit der Hydrolyse konnte gemessen werden aufgrund der zeitabhängigen Zunahme der Fluoreszenzintensität. Zwei verschiedene Systeme wurden verwendet, um die markierten Substrate zu dispergieren, nämlich Komplexierung mit Albumin sowie Solubilisierung mit dem nicht-ionischen Detergens Octylglucosid.
Bei Verwendung von Esterase-Substraten zeigte die Esterase EstA wie erwartet größere Aktivität bei kurzkettigen Verbindungen (C4- und C6-Carbonsäuren). Geringe Aktivität wurde angetroffen, wenn die Acylkette 12 C-Atome umfasste. Zugabe des Detergens Octylglucosid steigerte die Enzymaktivität in Bezug auf C4- und C6-Fettsäureestem (Fig. 10).
Bei Verwendung von Alkyldiacyl-Glycerinen zeigte die Esterase EstA eine Präferenz für kurzkettige Lipide. Hierbei wurde eine bemerkenswerte Stereoselektivität für das sn-3 Acyl-Isomer festgestellt (Fig. 11). In der Anwesenheit von Detergens war die Esterase EstA in der Lage, ein langkettiges Alkyldiacyl-Glycerin zu hydrolisieren, ein typisches Substrat für eine Lipase (Fig. 11). Dies steht in Einklang mit der besseren Zugänglichkeit und Mobilität des Substrats in diesem System [46]. Vermutlich führt die Solubilisierung des Lipids durch das Albumin zu einem Komplex, der aus Albumin und Alkyldiacylglycerin besteht [47,60]. Das Substrat ist in einem solchen Komplex aufgrund sterischer Behinderung durch das Protein vermutlich nicht leicht zugänglich. Die Reaktionsgeschwindigkeiten in Anwesenheit des Albumins sind immer geringer als die in Anwesenheit des Detergens [46].
f) Gaschromatographie (GC) und HPLC (high pressure liquid chromatography)
Die Umsetzungen für das GC/HPLC-Screening wurden in 5 ml 0,1 M NaH2P04 (pH 7,3) durchgeführt. Zu dem Puffer wurden 250 μl Enzym und anschließend 100 μl Substrat hinzugegeben. Als Substrat wurden 2-Phenyl-2-hexyl-acetat sowie 2- Phenyl-2-butyl-acetat eingesetzt. Als Negativkontrolle wurde Puffer mit Substrat sowie Puffer mit Enzym eingesetzt. Die Reaktionsansätze wurden bei 25°C mit 150 rpm inkubiert. Nach 24 Stunden wurden Proben entnommen.
Zur Aufarbeitung der Proben wurde 1 ml Probe mit 0,5 ml CH2CI2 extrahiert, die erhaltene Mischung 2 Minuten mit 12000 rpm zentrifugiert und anschließend wurde die organische von der wässrigen Phase getrennt. Zu der organischen Phase wurden weitere 0,5 ml CH2CI2 hinzugegeben und anschließend wurde die organische Phase mittels Na2S04 getrocknet und mittels HPLC-Filter filtriert.
Nachdem das Lösungsmittel abgezogen worden war, fiel im Falle der Probe, bei der 2-Phenyl-2-hexyl-acetat als Substrat eingesetzt worden war, ein weißer Niederschlag aus, der sich im Laufmittel (Heptan : iso-Propanol - 90 : 10) nicht löste. Deshalb wurden zusätzlich zum Laufmittel 400 μl CH2CI2 hinzugegeben, um den Niederschlag in Lösung zu bringen.
Für die HPLC wurde eine ChiraCel OJ-Säule eingesetzt. Es wurde eine Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min gewählt. Die Absorption wurde bei 254 nm gemessen, es wurde eine Temperatur von 25 °C vorgegeben. Als Fließmittel wurde eine Mischung aus Heptan und Isopropanol eingesetzt. Zunächst wurde Heptan : Isopropanol im Verhältnis 95 : 5 vorgegeben. Nach 5 Minuten wurde ein Verhältnis Heptan : Isopropanol 85 : 15 vorgegeben, dieses wurde 20 Minuten konstant gehalten und anschließend wurde wieder ein Verhältnis von 95 : 5 eingestellt.
Die Ergebnisse sind in Tab. 3 zusammengestellt. Die angegebenen ee%-Werte beziehen sich zum einen auf den gebildeten Alkohol, zum anderen auf das verbliebene Substrat. Für den freigesetzten Alkohol konnte hierbei eine signifikante Enantioselektivität beobachtet werden.
Tabelle 3: Ergebnisse der GC/HPLC-Untersuchungen
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Beispiel 6: Herstellung des Trinitrophenylaminohexanoyl-pyrenmethylesters
Eine Lösung von Trinitrophenylamino-Hexansäure (260 μmol) und Pyrenmethanol (43 μmol), Dicyclohexylcarbodiimid (170 μmol) und Dimethylaminopyridin (130 μmol) in 1 ml wasserfreiem Methylenchlorid wurde bei Raumtemperatur über Nacht inkubiert. Nach Zugabe von 9 ml Methylenchlorid wurde die organische Lösung mit 9 ml 0,1 N HCI und anschließend mit Wasser gewaschen. Anschließend erfolgte Trocknung über Na2S04. Die reine Verbindung wurde erhalten durch präparative TLC auf Silica Gel 60 unter Verwendung von Chloroform-Methanol 95/5 (v/v) als Lösungsmittel (Rf = 0,4). Spuren von Unreinheit wurden durch Titration des isolierten Peptids mit Diethylether entfernt.
Die Trinitrophenylaminobutanoyl- und Trinitrophenylaminododecanoyl-Pyrenmethyl- Ester wurden nach demselben Verfahren hergestellt. 1 (3)-0-Hexadecyl-2- pyrendecanoyl-3(1 )-trinitro-phenylaminododecanoyl-sn-GIycerol und 1 (3)-0-Octyl-2- Pyrenbutanoyl-3(1 )trinitro-phenylaminohexanoyl-sn-Glycerol, fluorogene Alkyldiacyl- glycerole, wurden hergestellt wie in [47] beschrieben.
Beispiel 7: GLC Analyse mit Linaloylacetat als Substrat
Das gereinigte Enzym (1 mg) wurde mit 2 ml Tris-Puffer (10 mM, pH 7.5) und 10 μl racemischem Linalylacetat (Fluka, Schweiz) gemischt. Die Mischung wurde für 14 Stunden bei Raumtemperatur unter sanftem Rollen inkubiert. Anschließend wurde die Probe mit Diethylether extrahiert (4 x 4 ml) und die organische Phase wurde mit Na2S04 getrocknet. Nach Zugabe eines internen Standards (100 μl 0,1 M Menthol) wurde das organische Lösungsmittel durch Verdampfung konzentriert und mittels GLC analysiert.
Der Fortschritt der Reaktion wurde durch GLC-Analyse auf einer Permethylsiloxan- Säule (Biorad RSL 1701) beobachtet. Verwendet wurde das Programm 110/0-10- 160/0-20-220/2 bei einem bar N2.
Die optische Reinheit des (s)-(+)-Linalools wurde auf einer Permethyl-ß- Cyclodextrin-Säule (Chrompack Chirasil-Dex CB) mit (R)-Linalool (Fluka, Schweiz) als Bezugsstandard bestimmt. Verwendet wurde das Programm: 87°C isotherm, 0,5 bar H2.
Das (S)-Enantiomer des Linalylacetats wurde bevorzugt gespalten, wobei das (S)- (+)-Linalool in 40 %igem Überschuß bei einer Konversion von 24 % entstand. Das verbleibende (R)-Acetat zeigte eine geringe optische Reinheit von e.e. 13 %. Die Selektivität der Reaktion, ausgedrückt als enantiomeres Verhältnis, wurde mit in etwa gleich 3 berechnet. Obwohl die Selektivität nicht besonders hoch erscheint, ist die Fähigkeit des esfA-Genproduktes, sterisch behinderte Ester tertiärer Alkohole zu spalten, bemerkenswert, vor allem bei der großen Anzahl an Lipasen, Proteasen und ganzen Zellen, die mittlerweile getestet worden sind, und die nicht dazu in der Lage waren [29,30].
Beispiel 8: Vergleich der Sequenz von EstA mit Sequenzen anderer Serinhydrolasen
Tab. 4: Identität und Homologie in Bezug auf die gesamte Proteinsequenz von EstA aus Rhodococcus sp. NCIMB 11216 in Vergleich zu Lipasen und Esterasen aus verschiedenen Organismen. Der Vergleich wurde ausgeführt unter Verwendung von CLUSTALW von PBIL [51] mit den folgenden Parametern: weight matnx - blosum; gap opening penalty - 10.0; gap extension penalty - 0.05.
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Es zeigte sich, dass die Sequenz um das Ser-156 bei allen Enzymen sehr stark konserviert ist (Fig. 3), was darauf hinweist, daß es sich um einen katalytisch wichtigen Aminosäurerest handelt, möglicherweise um ein Mitglied der katalytischen Triade Ser-Asp-His, die beteiligt ist am Charge transfer-Mechanismus der Serinhydrolase-Esterasen. Dieser putative Aminosäurerest des aktiven Zentrums befindet sich inmitten einer konservierten Region, die als typisches „signature pattern" für die GDXG-Familie der lipolytischen Enzyme [11] angesehen werden kann.
Bei EstA handelt es sich bei der entsprechenden Sequence um die Sequenz: I V L A G D S156 A G G N L A (SEQ ID NO. 9).
Beispiel 9: Mutagenese-Experimente mit dem esfΛ-Gen
Das 624bp-Fragment am 3'-Ende des esM-Gens (64,9 % GC-Anteil) wurde für die Mutagenese-Experimente verwendet. Neben einer PCR-Reaktion unter Standard- Reaktionsbedingungen wurden die in der Tabelle 5 angegebenen 6 verschiedenen Mutagenese-Bedingungen in der PCR vorgegebenen (A bis F). Die Versuchsbedingungen A bis C unterscheiden sich nur in Bezug auf die Mn2+- Konzentration. Die hohen Mg2+- und dNTP-Konzentrationen wurden gewählt, um den Fehleinbau weiter zu begünstigen. Da die erhöhte Mg2+-Konzentration gewöhnlich die Bildung von AT-Paarungen auf Kosten von GC-Paarungen begünstigt, wurde für die Versuchsbedingungen D bis F ein Überschuß von dCTP und dTTP gegenüber dATP und dGTP vorgegeben, um dieses Problem zu überwinden.
Da auch eine höhere Enzymkonzentration den Fehleinbau von Nukleotiden begünstigt, wurden in allen Versuchen A bis F 8 anstatt 4 Einheiten (Units) Dynazyme™! I-DNA-Polymerase eingesetzt.
Tab. 5: Unterschiedliche PCR - Bedingungen
Figure imgf000037_0001
7 mM 0,1 mM 1 mM jeweils
7 mM 0,2 mM 1 mM jeweils
7 mM 0,5 mM 1 mM jeweils
1,0 mM dCTP+dTTP jeweils,
7 mM 0,1 mM 0,2 mM dATP+dGTP jeweils
1 ,0 mM dCTP+dTTP jeweils,
7 mM 0,2 mM 0,2 mM dATP+dGTP jeweils
1 ,0 mM dCTP+dTTP jeweils,
7 mM 0,5 mM 0,2 mM dATP+dGTP jeweils
Zur Durchführung der PCR wurde das Plasmid pMS-RR1 eingesetzt, das das estA- Gen enthält, sowie die in der Tabelle 6 angegebenen Primer.
Tab. 6: Primer, die für die Zufallsmutagenese verwendet wurden. * - Positionen nach der Numerierung in Fig. 2
Figure imgf000038_0001
Die Plasmid- (30 ng) und Primermenge (200 ng) wurde bei allen sieben PCR- Bedingungen konstant gehalten (jeweils Zugabe von 100 μl). Das folgende Temperaturprogramm, das gute Amplifikationsergebnisse für das 624bp-Fragment unter „normalen" PCT-Bedingungen lieferte, kam zur Anwendung: 35 Zyklen (1 ' 94°C/1 ' 58°C/1 ' 72°C).
Nach Trennung auf einem Agarose-Gel wurden die gewünschten DNA-Fragmente gereinigt und in den Vektor pGEM-T ligiert (Promega Corporation, Madison, Wl, USA). Das resultierende Plasmid wurde unter Verwendung der SEM-Methode in kompetente E co//-SURE-Zellen transformiert. Die Zellen wurden auf Amp/IPTG/X- Gal-Platten wachsen gelassen. Ungefähr 30 % der Klone waren religierte Vektoren. Insertionen von einigen verschiedenen Plasmiden aus jedem Experiment, die nach Linearisierung mit Apa I die gewünschte Größe hatten, wurden unter Verwendung des Primers SP6 sequenziert. Die Sequenzen und Chromatogramme der mutierten
Insertionen wurden mit der Sequenz und dem Chromatogramm des esM-Gens verglichen.
Die Tabellen 7 und 8 geben einen Überblick über die Anzahl und die Art der
Mutationen, die in den Mutanten angetroffen wurden. Die Mutationsrate war umso höher, umso höher die Mn2+-Konzentration war, mit Ausnahme des Experimentes E.
Da nur etwa 250 Nukleotide des 624bp-Fragments sequenziert wurden, könnte das beobachtete Ergebnis aber auch auf eine statistische Abweichung zurückzuführen sein.
Außerdem wurde festgestellt, dass die beobachteten Mutationen in keiner besonderen Region kumulierten, also offenbar keine sogenannten „hot spots" in der esfcA-Sequenz enthalten sind.
Tab. 7: Mutationen, die im 624 bp-lnsert gefunden wurden, das unter Verwendung der Primer M5test(480) und M5c0 erhalten wurde.
Figure imgf000039_0001
Tab. 8: Mutationsraten und Präferenzen bei verschiedenen Reaktionsbedingungen.
Figure imgf000039_0002
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Beispiel 10: Herstellung von Mutantenbib iotheken
Auf Grundlage der Ergebnisse aus Beispiel 9 wurden die Versuchsbedingungen B,C, E und F zur Herstellung der Mutantenbibliotheken verwendet. Das Plasmid pMS- RR1 und die in der Tabelle angegebenen Primer wurden in der PCR eingesetzt. Die 5'-Enden der Primer pMSStart und pMSEnd sind 125 bzw. 150 bp von der Nde I- bzw. Sph I-Klonierungsregion des Vektors pMS-RR1 entfernt. Die PCR-Parameter waren dieselben wie in Beispiel 9 angegeben. Agarose- Gelelektrophorese führte zu einem 1,2 kb-Produkt in zwei von vier Versuchen. Leider konnte unter den Reaktionsbedingungen E und F keine PCR-Produkte erhalten werden, auch wenn die PCR-Parameter, wie Annealing-Temperatur, Nukleotid-Konzentration oder MgCI2-Konzentration geändert wurden. Wahrscheinlich führt der Überschuß an dCTP und dTTP zu einer verminderten Produkt-Ausbeute in der PCR.
Tab. 9: Primer für die estA -Amplifikation
Figure imgf000040_0002
Die 1 ,2 kb-Fragmente, die uner den Reaktionsbedingungen B und C erhalten wurden, wurden gereinigt und mit Nde I und Sph I verdaut, unter Erhalt von Ansammlungen von mutierten esfcA-Genen mit einer Länge von 918 Basenpaaren. Der Vektor pMS470Δ8 wurde mit den selben Restriktionsenzymen verdaut, und nach der Reinigung des linearisierten Vekors (3,9 kb) erfolgte Ligation der es/τ4-Mutanten mit dem Vektor. Zur Analyse der Mutanten-Bibliotheken wurden 2 μl der 50 μl- Ligationsmischung in SEM-kompetente E. co//-XL1-blue-Zellen transformiert. Etwa
10 000 Klone konnten für jeden Mutagenese-Ansatz erhalten werden, bei einem schwachen Hintergrund von 1 % an religiertem Vektor. Man kann deshalb davon ausgehen, dass die erhaltene Bibliothek etwa 250 000 Mutanten umfasst.
11 Klone aus Ansatz B und 10 Klone aus Ansatz C wurden nach dem Zufallsprinzip zur weiteren Untersuchung ausgewählt. Alle unteruchten Plasmide hatten die korrekte Größe von 4.8 kb. Die Insertionen wurden unter Verwendung der Primer TaqNeu und TaqStop sequenziert.
Die Sequenzen wurden mit der esfA-Sequenz verglichen. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 10 und 11 dargestellt. Die beobachtete Frequenzhäufigkeit war geringer als in Beispiel 9. Jedoch kann von einer Mutationshäufigkeit von 2 bis 3 Substitutionen pro mutiertem esM-Gen ausgegangen werden.
Tab. 10: Substitutionen and Frameshift-Mutationen, die in estA- Fragmenten verschiedener Bibliotheken gefunden wurden.
EGI ÄTJ KTPΓÄ I Ins /Dell
Tab. 11 : Mutationsraten und Präferenzen in der Mutantenbibliothek.
4469 10 60 022%
4050 12 75 030% Literaturverzeichnis
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Claims

Patentansprüche
1. Polynukleotid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: a) Polynukleotid mit einer Nukleinsäuresequenz von Position 195 bis 1115 gemäß SEQ ID No. 1 , b) Polynukleotid kodierend für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 2, c) natürlicherweise vorkommende Mutanten oder polymorphe Formen oder Allele eines Polynukleotids gemäß (a) oder (b), d) zu einem Polynukleotid gemäß (a), (b) oder (c) komplementäre Polynukleotide, e) unter stringenten Bedingungen mit einem Polynukleotid gemäß (a), (b), (c) oder (d) hybridisierende Polynukleotide, f) Polynukleotid mit einer Sequenzhomologie oder -identität von mindestens 50 % in Bezug auf ein Polynukleotid gemäß (a), (b), (c) oder (d), g) Polynukleotid, bestehend aus mindestens 10 aufeinanderfolgenden Nukleotiden eines Polynukleotids gemäß (a), (b), (c) oder (d), h) Polynukleotid mit Deletionen oder Insertionen von bis zu 50 Nukleotiden gegenüber einer Nukleinsäure gemäß (a), (b), (c), (d) oder (e), i) Polynukleotide, die mindestens eine der unter (a) bis (h) genannten Nukleinsäuren umfassen.
2. Polynukleotid gemäß Anspruch 1 kodierend für eine Enzym mit hydrolytischer Aktivität.
3. Polynukleotid gemäß Anspruch 2, wobei es sich bei dem Enzym um eine Esterase oder Lipase handelt.
4. Polynukleotid gemäß Anspruch 3, wobei es sich bei der Esterase um eine Serin-Esterase handelt.
5. Polynukleotid gemäß Anspruch 3 oder 4, wobei es sich bei der Esterase um die Esterase EstA gemäß SEQ ID No. 2 handelt.
6. Polynukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei es sich bei dem Enzym um ein Enzym mit alpha/beta-Hydrolase-Faltung handelt.
7. Polynukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Nukleinsäure eine oder mehrere nicht-kodierende Sequenzen umfasst.
8. Verfahren zur Herstellung und/oder Identifzierung einer Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure chemisch synthetisiert wird und/oder anhand einer Sonde, eines Antikörpers oder eines Hydrolase-Aktivitätstests aus einer Genbank isoliert wird und/oder durch Polymerase-Kettenreaktion und/oder durch Mutagenese-Experimente erhalten wird.
9. Verfahren nach Anspruch 8, folgende Schritte umfassend: a) eine Nukleinsäurebliothek wird mit einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 kontaktiert, b) eine Nukleinsäure, die mit einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 hybridisiert, wird identifiziert, c) die in Schritt (b) identifizierte Nukleinsäure wird sequenziert.
10.Verfahren nach Anspruch 8, folgende Schritte umfassend: a) ausgehend von einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 werden Primer hergestellt, b) die Primer gemäß (a) werden verwendet, um in der PCR Nukleinsäuren unbekannter Nukleinsäuresequenz zu amplifizieren, c) die gemäß (b) erhaltenen Nukleinsäuren werden sequenziert.
11. Verfahren nach Anspruch 8, folgende Schritte umfassend: a) Nukleinsäuren einer Bibliothek werden in geeignete Vektoren eingebaut und diese in passende Wirtsorganismen eingebracht, so daß die Expression der Nukleinsäuren erfolgen kann, b) die gemäß (a) erhaltenen Wirtsorganismen werden auf einem festen Träger ausplattiert und inkubiert, c) auf dem festen Träger wird ein Assay durchgeführt, der die Umsetzung eines Hydrolase-Substrats involviert, d) Hydrolase-positive Klone werden identifiziert und gereinigt, e) die Nukleinsäuren aus den in Schritt (d) identifizierten Klonen werden sequenziert.
12. Verfahren nach Anspruch 8, folgende Schritte umfassend: a) eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 wird Mutagenese-Experimenten unterworfen, b) die erhaltenen Mutanten werden sequenziert, in einen geeigneten Vektor eingebaut und exprimiert, c) die Expressionsprodukte werden auf hydrolytische Aktivität hin untersucht, d) die Nukleinsäuren, deren Expressionsprodukte in Schritt (c) hydrolytische Aktivität zeigen, werden sequenziert.
13. Vektor umfassend eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7.
14. Wirtszelle enthaltend einen Vektor gemäß Anspruch 13.
15. Wirtszelle nach Anspruch 14, wobei es sich bei der Wirtszelle um Rhodococcus oder E. coli handelt.
16. Polypeptid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: a) Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 2, b) natürlicherweise vorkommende Mutanten, polymorphe Formen oder Allele eines Polypeptid gemäß (a), c) Polypeptide, die eine Sequenzhomologie oder -identität von mindestens 50 % in Bezug auf ein Polypeptid gemäß (a) oder (b) besitzen, d) Polypeptide, die von Nukleinsäuren gemäß Anspruch 1 kodiert werden, e) Polypeptide bestehend aus mindestens 5 aufeinanderfolgenden Aminosäuren eines Polypeptids gemäß (a) oder (b), f) Polypeptide mit Insertionen und/oder Deletionen von bis zu 60 Aminosäuren in Bezug auf ein Polypeptid gemäß (a), (b) oder (c), g) Polypeptide, die mindestens eines der unter (a) bis (f) genannten Polypeptide umfassen.
17. Polypeptid gemäß Anspruch 16, wobei es sich bei dem Polypeptid um ein Enzym mit hydrolytischer Aktivität handelt.
18. Polypeptid gemäß Anspruch 17, wobei es sich bei dem Enzym um eine Esterase oder Lipase handelt.
19. Polypeptid nach Anspruch 18, wobei es sich bei dem Polypeptid um eine Serin-Esterase handelt.
20. Polypeptid nach einem der Ansprüche 16 bis 19, wobei es sich bei dem Polypeptid um die Esterase EstA gemäß SEQ ID No. 2 handelt.
21. Polypeptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Polypeptid die Aminosäuresequenz IVLAGDSAGGNLA umfasst.
22. Polypeptid nach einem der Ansprüche 16 bis 21 , wobei es sich um ein wasserlösliches Protein handelt.
23. Präparationen, enthaltend ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 16 bis 22.
24. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids gemäß einem der Ansprüche 16 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 in einer geeigneten Wirtszelle exprimiert wird.
25. Verfahren nach Anspruch 22, wobei es sich bei der Wirtszelle um Rhodococcus oder E. coli handelt.
26. Verfahren nach Anspruch 25, folgende Schritte umfassend: a) eine erfindungsgemäße Nukleinsäure wird in einen geeigneten Vektor eingebaut und E. coli wird mit dem Vektor transformiert, b) nach der Expression des Proteins werden die Zellen geerntet und aufgeschlossen, c) das Protein wird aus dem so erhaltenen Überstand gereinigt.
27. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Reinigung die Schritte Anionenaustauschchromatographie und Gelfiltration umfasst.
28. Antikörper gegen ein Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 16 bis 22.
29. Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers gemäß Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass ein Säugetier mit einem Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 16 bis 22 immunisiert wird und gegebenenfalls die entstandenen Antikörper isoliert werden.
30. Testsystem zur Identifizierung von Substraten oder funktionellen Interaktoren enthaltend eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 , ein Polypeptid gemäß Anspruch 15 oder einen Antikörper gemäß Anspruch 26 und gegebenenfalls geeignete Hilfs- und Zusatzstoffe.
31. Verwendung eines Polypeptids gemäß einem der Ansprüche 16 bis 22 zur hydrolytischen Spaltung oder Knüpfung von Ester-, Thioester-, Amid-, Halid- oder Peptid-Bindungen.
32. Verwendung nach Anspruch 31 , dadurch gekennezeichnet, dass die Reaktion enantioselektiv verläuft.
33. Verwendung nach Anspruch 30 oder 31 , wobei es sich bei den Substraten oder Produkten um Triglyceride und/oder Carbonsäureester kurzkettiger Fettsäuren handelt.
34. Verwendung nach einem der Ansprüche 31 bis 33, wobei die Bindung sterisch schwer zugänglich ist.
35. Verwendung nach Anspruch 34, wobei es sich bei dem Substrat um den Ester eines Tertiäralkohols handelt.
36. Verwendung nach Anspruch 35, wobei es sich bei dem Ester um Linaloylacetat, 2-Phenyl-2-butyl-acetat oder 2-Phenyl-2-hexyl-acetat handelt.
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