DE10149715B4

DE10149715B4 - Esterase EstA aus Rhodococcus ruber

Info

Publication number: DE10149715B4
Application number: DE10149715A
Authority: DE
Inventors: Prof. Schwab Helmut; Dipl.-Ing. Lidauer Andreas; Dr. Gudelj-Wyletal Marinka; Michaela Pressnig; Kurt Faber; Mateja Pogorevc; Dr. Trauthwein Harald
Original assignee: Evonik Degussa GmbH
Current assignee: Schwab Helmut Prof Graz At; Evonik Operations GmbH
Priority date: 2001-10-09
Filing date: 2001-10-09
Publication date: 2013-04-18
Anticipated expiration: 2021-10-10
Also published as: WO2003031625A1; DE10149715A1

Abstract

Polynukleotid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Polynukleotid mit einer Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID No. 1 oder gemäß SEQ ID No. 3.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Esterase aus Rhodococcus ruber, zu dieser homologe Proteine, Nukleinsäuren kodierend für diese Proteine, Antikörper gegen diese Proteine sowie die Herstellung und Verwendung dieser Proteine, Nukleinsäuren und Antikörper.
Hydrolasen sind eine große und vielfältige Gruppe von Enzymen, die neben Ester auch Peptide, Amide und Halide hydrolysieren können. Eine besondere Klasse stellen hierbei die lipolytischen und esterolytischen Enzyme dar, wobei die Abgrenzung der Esterasen (EC 3.1.1) gegenüber den Lipasen schwierig ist, da die Definition dieser Enzyme nicht auf der Struktur ihrer Substrate basiert, sondern eher auf ihrem physikalischen Zustand. Die Klassifikation der Esterasen in Abgrenzung zu den Lipasen erfolgt gewöhnlich aufgrund der Länge der Acylkette ihrer Ester-Substrate. Esterasen zeigen vorzugsweise Aktivität in Bezug auf wasserlösliche, kurzkettige Fettsäureester, während Lipasen höhere Aktivität zeigen in Bezug auf wasserunlösliche, emulsifizierte langkettige Fettsäuresubstrate [1,2].
Der Vergleich der Aminosäuresequenzen und Strukturen von Serinhydrolasen macht deutlich, dass ihr aktives Zentrum aus einer katalytischen Triade besteht, die aus einem Serin-, einem Aspartat- oder Glutamat- und einem Histidin-Rest zusammengesetzt ist [3–10]. Für die meisten Esterasen und Lipasen kann ein konserviertes Muster in der Umgebung des Serin des aktiven Zentrums gefunden werden. In der Prosite-Datenbank sind folgende Motive definiert und zwar für die Carboxylesterase-Familien vom Typ-B, „G-D-X-G” und „G-D-S-L” jeweils das Konsensus-Muster F-[GR]-G-x(4)-[LIVM]-x-[LIV]-x-G-x-S-[STAG]-G, [LIVM]-x-[LIVMF]-[SA]-G-D-S-[CA]-G-[GA]-x-L-[CA] bzw. [LIVMFYAG](4)-G-D-S-[LIVM]-x(1,2)-[TAG]-G [11]. Desweiteren kann noch das Klasse A β-Laktamase-Motiv ([F,Y]-X-[L,I,V,M,F,Y]-X-S-[T,V]-X-K-X-X-X-X-[A,G,L]-X-X-[L,C]) in einer spezifischen Klasse von Esterasen gefunden werden (Petersen, E. I., Valinger, G., Sölkner, B. Stubenrauch, G., Schwab H. (2001): A novel esterase from Burkholderia gladioli which shows high deacetylation activity an cephalosporins is related to β-lactamases and DD-peptidases. J. Biotechnol. 89: 11–25).
Darüberhinaus umfasst die Familie der alpha/beta-Hydrolase-gefalteten Enzyme eine Gruppe von Proteinen, die eine dreidimensionale Kernstruktur gemeinsam haben, obwohl keine signifikante Ähnlichkeit in der Primärstruktur festgestellt werden konnte. Während die katalytischen Spezifitäten der Mitglieder der alpha/beta-Hydrolase-gefalteten Enzyme völlig unterschiedlich voneinander sind, scheint ihr enzymatischer Mechanismus ähnlich zu sein [12]. Alle besitzen eine katalytische Triade mit der in der Aminosäuresequenz aufeinanderfolgenden Konfiguration Nukleophil-Säure-Histidin. Diese drei Aminosäuren, befinden sich an ähnlichen topologischen Orten im korrekt gefalteten Protein, obwohl sie durch eine variable Anzahl von Aminosäuren in der Primärstruktur jedes Enzyms voneinander getrennt sind. Bei allen bekannten Familienmitgliedern dieser Hydrolasen ist das Nukleophil, meistens ein Serin-Rest, in einer konservierten Sequenz lokalisiert, dem „nukleophilen Ellbogen”, mit einer vorgeschlagenen Konsensusregion Sm-X-Nu-X-Sm-Sm, wobei Sm für eine kleine Aminosäure, in der Regel Glycin, X für eine beliebige Aminosäure und Nu für das Nukleophil steht, welche eine strukturelle Gemeinsamkeit der alpha/beta-Hydrolase-gefalteten Enzyme darstellt [12].
Esterasen haben zunehmend an Bedeutung in der Biotechnologie [13] und in der organischen Chemie [14,15] gewonnen. Ihre charakteristischen Eigenschaften, wie Substratspezifität, Regioselektiviät und Enantioselektivität, erlauben eine breite Anwendungsmöglichkeit dieser Enzyme. Sie sind in der Natur sehr weit verbreitet und in Tieren, Pflanzen wie auch in Mikroorganismen vorzufinden. Aufgrund ihrer industrieller Anwendungsmöglichkeiten hat sich vor kurzem intensives Forschungsinteresse auf die mikrobiellen Esterasen gerichtet. Hierbei handelt es sich beispielsweise um die Enzyme von Bacillus stearothermophilus [16], Bacillus subtilis [17], Burkholderia gladioli [18] Arthrobacter Globiformis [19], Aspergillus niger [20,21], Aspergillus awamori [22,23], Pseudomonas cepacia [24], Pseudomonas fluorescens [25,26] und Ochrobactrum anthropi [27].
Ein schwerwiegender Nachteil der bisher verwendeten Enzyme ist jedoch, dass sie nicht dazu in der Lage sind, hochsubstituierte Substrate zu spalten. Ein Beispiel eines solchen sperrigen Substrates ist Linaloylacetat bzw. Linalylacetat, ein Ester eines allylischen Tertiäralkohols. Der veresterte Alkohol, Linalool, stellt einer der wichtigsten Terpen-Alkohole der Geschmacks- und Geruchsindustrie dar und liegt in unterschiedlichen enantiomeren Formen vor. Das (R)-(–)-Enantiomer, Licareol, ist der Hauptbestandteil von Extrakten aus Cinnamonium camphora und Cayenne linaloe, während das (S)-(+)-Enantiomer, Coriandrol, in erster Linie im Corianderöl anzutreffen ist. Da sich die beiden Enantiomere in ihrem Geruch unterscheiden [28], ist es wünschenswert die optisch reinen Enantiomere zur Herstellung von Geschmacks- und Geruchskompositionen zu erhalten.
Außerdem wurde in Bezug auf Linalool bereits für etliche mikrobielle Lipasen berichtet, dass es von diesen nicht als Substrat in einer Esterifikations-Reaktion verwendet werden kann [29,30]. Das korrespondierende Acetat hingegen konnte mit unterschiedlichem Erfolg hydrolysiert werden, wenn ganze mikrobielle Zellen verwendet wurden [31].
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, ein neues Enzym mit hydrolytischer Aktivität, insbesondere eine neue Esterase und/oder Lipase, zur Verfügung zu stellen, wozu angesichts der Anwendungsmöglichkeiten dieser Enzyme, insbesondere in der Biotechnologie und organischen Chemie, ein dringender Bedarf besteht, und/oder ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, womit neue hydrolytische Enzyme, vor allem Esterasen und/oder Lipasen, erhalten werden können.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es insbesondere, ein hydrolytisches Enzym, insbesondere eine Esterase und/oder Lipase zur Verfügung zu stellen, die eine gegenüber den bisher beschriebenen Esterasen und Lipasen verschiedene Substratspezifität und/oder einen unterscheidbaren Grad an Selektivität und/oder eine unterscheidbare Reaktionsgeschwindigkeit und/oder eine unterscheidbare Struktur und/oder einen unterscheidbaren Reaktionsmechanismus besitzt.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es ferner, Esterasen und/oder Lipasen zur Verfügung zu stellen, die dazu in der Lage sind, sperrige Ester und/oder sterisch schwer zugängliche Ester-Verknüpfungen, insbesondere die sterisch schwer zugängliche Esterbindung im Linaloylacetat zu spalten.
Gelöst wird diese Aufgabe durch die erfindungsgemäßen Polynukleotide, Polypeptide und Antikörper, insbesondere durch Polynukleotide gemäß SEQ ID No. 1 und SEQ ID No. 3, Polypeptide gemäß SEQ ID No. 2 und SEQ ID No. 4 und durch gegen Polypeptide gemäß SEQ ID No. 2 und SEQ ID No. 4 gerichtete Antikörper.
Für den Fachmann ist naheliegend, wie er ausgehend von Nukleinsäuren gemäß SEQ ID No. 1 und SEQ ID No. 3 oder ausgehend von Polypeptiden gemäß SEQ ID No. 2 und SEQ ID No. 4 Nukleinsäuren und Polypeptide ähnlicher Struktur und gleicher oder ähnlicher Funktion erhalten kann. Insbesondere können auch, beispielsweise durch Evolutionsexperimente, Enzyme mit verbesserten Eigenschaften erhalten werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Polynukleotid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

a) Polynukleotid mit einer Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 1 oder gemäß SEQ ID NO. 3,
b) Polynukleotide kodierend für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 2 oder gemäß SEQ ID NO. 4,
c) natürlicherweise vorkommende Mutanten oder polymorphe Formen oder Allele eines Polynukleotids gemäß (a) oder (b), insbesondere solche, die genau ein, zwei oder drei Punktmutationen in Bezug auf ein Polynukleotid gemäß (a) oder (b) besitzen,
d) zu einem Polynukleotid gemäß (a), (b) oder (c) komplementäre Polynukleotide,
e) unter stringenten Bedingungen mit einem Polynukleotid gemäß (a), (b), (c) oder (d) hybridisierende Polynukleotide, wobei unter stringenten Bedingungen vorzugsweise zu verstehen ist Inkubation bei 60°C in einer Lösung, enthaltend 0,1 × SSC und 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS), wobei 20 × SSC eine Lösung enthaltend 3 M Natriumchlorid und 0,3 M Natriumcitrat (pH 7,0) bedeutet,
f) Polynukleotide mit einer Sequenzhomologie oder -identität von mindestens 50%, bevorzugt mindestens 60% oder 70%, besonders bevorzugt mindestens 80%, ganz besonders bevorzugt mindestens 90%, insbesondere mindestens 95% in Bezug auf ein Polynukleotid gemäß (a), (b), (c) oder (d),
g) Polynukleotide, bestehend aus mindestens 10 oder 15, bevorzugt mindestens 20 oder 25, besonders bevorzugt mindestens 30 oder 40, ganz besonders bevorzugt 50 oder 80, insbesondere mindestens 100 oder 120 -aufeinanderfolgenden Nukleotiden eines Polynukleotids gemäß (a), (b), (c), (d) oder (e),
h) Polynukleotide mit Deletionen oder Insertionen von bis zu 50 oder 40, insbesondere bis zu 30, 20 oder 10 Nukleotiden gegenüber einem Polynukleotid gemäß (a), (b), (c), (d) oder (e),
i) Polynukleotide, umfassend mindestens eines der unter (a) bis (h) genannten Polynukleotide.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfassen die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren eine oder mehrere nicht-kodierende Sequenzen, wobei es sich bei den nicht-kodierenden Sequenzen beispielsweise um natürlicherweise vorkommende Intronsequenzen oder regulatorische Sequenzen, wie Promotor- oder Enhancer-Sequenzen, insbesondere um solche zur Kontrolle der Expression von hydrolytischen Enzymen, vor allem Esterasen oder Lipasen, handelt.
Bei den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren handelt es sich bevorzugt um Ribonukleinsäuren (RNAs) oder Desoxyribonukleinsäuren (DNAs), wobei die Nukleinsäuren vorzugsweise als doppelsträngige Nukleinsäuren vorliegen.
Vorzugsweise handelt es sich bei den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren um Nukleinsäuren, die für ein Protein mit Hydrolase-Aktivität oder Teilen davon kodieren. Bei dem Protein mit Hydrolase-Aktivität handelt es sich vorzugsweise um eine Lipase oder Esterase und/oder um ein Enzym, das dazu in der Lage ist, Ester-, Thioester-, Amid-, Halid- oder Peptid-Bindungen zu spalten, besonders bevorzugt sperrige und/oder sterisch schwer zugängliche Ester-, Thioester-, Amid-, Peptid- oder Halid-Bindungen. Bei den Verbindungen handelt es sich beispielsweise um Ester, Thioester, Peptide, Amide oder Halide mit einer kurzen Acyl-Kette, wobei mit kurzer Acyl-Kette vorzugsweise der Acylrest der Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure oder Valeriansäure gemeint ist. Ganz besonders bevorzugt kann es sich um einen Ester eines Tertiäralkohols, vor allem eines allylischen Tertiäralkohols, insbesondere um den Ester des Linalools bzw. Licareols oder Coriandrols, vor allem um Linaloylacetat, handeln.
Mit Spaltung ist erfindungsgemäß vor allem hydrolytische Spaltung, also Spaltung unter Freisetzung der Carbonsäure und des entsprechenden Alkohols, Thiols, Amins oder Hydrogenhalogenids gemeint. Spaltung kann jedoch in besonderen Ausführungsformen auch unter Ausbildung einer neuen Ester-, Thioester-, Amid-, Peptid- oder Halogenidbindung erfolgen, insbesondere kann es sich hierbei beispielsweise, falls eine Ester-Bindung in eine neue Ester-Bindung umgewandelt wird, um eine Transesterifikationsreaktion handeln.
Ganz besonders bevorzugt handelt es sich bei der Esterase um eine Serin-Esterase und/oder um ein Enzym, das dazu in der Lage ist, regioselektiv oder enantioselektiv Bindungen zu spalten, wobei der Wert für den enantiomeren Überschuß (e. e.) vorzugsweise größer gleich 20%, besonders bevorzugt größer gleich 40%, vor allem größer gleich 60%, ist.
Ganz besonders bevorzugt handelt es sich bei der Esterase um eine Hydrolase mit α/β-Hydrolase-Faltung und/oder um eine Serin-Esterase und/oder um eine Carboxylesterase, insbesondere um eine solche, die zur GDXG-Familie der lipolytischen Enzyme gehört oder zu diesen Enzymen homolog ist.
Bei den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren handelt es sich bevorzugt um Nukleinsäuren, die für eine Esterase, besonders bevorzugt für eine mikrobielle Esterase, besonders bevorzugt bakterielle Esterase, insbesondere für eine Esterase aus Rhodococcus, vor allem für eine Esterase aus Rhodococcus ruber, hierbei insbesondere für die Esterase EstA gemäß SEQ ID NO. 2, für die Esterase gemäß SEQ ID NO. 4 und/oder eines der weiter unten beschriebenen erfindungsgemäßen Polypeptide kodieren.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner die Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, zum einen zur Herstellung oder Isolierung von erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, zum anderen zur Herstellung oder Isolierung neuer, zu den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren homologen Nukleinsäuren, insbesondere solchen mit in Bezug auf die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren ähnlichen strukturellen und gleichen, ähnlichen und/oder verbesserten funktionellen Eigenschaften, wobei unter funktionellen Eigenschaften insbesondere hydrolytische Aktivität, vor allem Lipase- und/oder Esterase-Aktivität, und unter verbesserten funktionellen Eigenschaften beispielsweise höhere Spezifität und/oder höherer Umsatz und/oder höhere Regio- oder Enantioselektivität zu verstehen ist.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können so beispielsweise als Sonden zur Identifizierung und/oder Isolierung von homologen Nukleinsäuren aus einer artifiziellen, einer cDNA- oder genomischen Genbank, hierbei vorzugsweise zur Identifizierung von Nukleinsäuren, die für Hydrolasen, vor allem Esterasen oder Lipasen, und/oder Teilen davon kodieren, oder als Antisense-Nukleinsäuren oder als Primer in der Polymerasekettenreaktion (PCR), hierbei insbesondere zur Amplifikation von Nukleinsäuren umfassend Nukleinsäuren kodierend für Enzyme mit hydrolytischer Aktivität, insbesondere Esterasen und/oder Lipasen, oder Teile davon, verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen oder zu den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren homologe Nukleinsäuren können aber auch durch Zufallsmutagenese oder zielgerichtete Mutagenese, in einer dem Fachmann bekannten Weise, erhalten werden.
Nach Einbau in einen Expressionsvektor können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren beispielsweise zur gezielten Herstellung einzelner Domänen oder Epitope des erfindungsgemäßen Proteins oder von Fusionsproteinen, die die erfindungsgemäßen Polypeptide umfassen, verwendet werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher auch ein Verfahren, um eine Nukleinsäure zu erhalten, die für ein hydrolytisches Enzym, insbesondere eine Esterase und/oder Lipase, kodiert, folgende Schritte umfassend:

a) eine Nukleinsäurebliothek wird mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure kontaktiert,
b) eine Nukleinsäure, die mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure hybridisiert, wird identifiziert,
c) die in Schritt (b) identifizierte Nukleinsäure wird sequenziert.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ebenso ein Verfahren zur Isolierung einer für ein hydrolytisches Enzym, insbesondere für eine Esterase und/oder Lipase, kodierenden Nukleinsäure, folgende Schritte umfassend:

a) ausgehend von einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure werden Primer hergestellt,
b) die Primer gemäß(a) werden verwendet, um in der PCR Nukleinsäuren, vor allem cDNAs, unbekannter Nukleinsäuresequenz zu amplifizieren,
c) die gemäß (b) erhaltenen Nukleinsäuren werden sequenziert.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ebenfalls ein Verfahren zur Isolierung einer für ein hydrolytisches Enzym, insbesondere eine Esterase und/oder Lipase, kodierenden Nukleinsäure, folgende Schritte umfassend:

a) eine Nukleinsäure-Bibliothek wird mit einem Assay, beispielsweise einer Farbreaktion, der die Identifikation von Hydrolase-kodierenden Gensequenzen erlaubt, untersucht,
b) Hydrolase-positive Klone werden identifiziert, beispielsweise durch visuelle Beobachtung, durch automatisierte Imageanalyse oder mittels photometrischer Messung, und gereinigt,
c) die Nukleinsäuren aus den in Schritt (b) identifizierten Klonen werden sequenziert.

a) eine erfindungsgemäße Nukleinsäure wird Mutagenese-Experimenten unterworfen,
b) die erhaltenen Mutanten werden in einen geeigneten Vektor eingebaut und exprimiert,
c) die Expressionsprodukte werden auf hydrolytische Aktivität, insbesondere Esterase- und/oder Lipase-Aktivität, hin untersucht,
d) die Nukleinsäuren, deren Expressionsprodukte in Schritt (c) hydrolytische Aktivität zeigen, werden sequenziert.

Zur Durchführung der Mutagenese-Experimenten kann beispielsweise die Polymerasekettenreaktion (PCR) eingesetzt werden. Die PCR-Experimente können hierbei beispielsweise, insbesondere bei Verwendung einer Taq-Polymerase, so durchgeführt werden, dass Reaktionsparameter wie die Mg² ⁺-Konzentration, der pH-Wert, die Reaktionstemperatur oder die Substratkonzentrationen variiert werden, oder es kann zum Einsatz von Error-prone-PCR-Techniken kommen, die beispielsweise auf der Zugabe von Mn²⁺ oder auf der Zugabe ungleicher Nukleotidkonzentrationen beruhen.
Bei der Nukleinsäurebibliothek handelt es sich hierbei vorzugsweise um eine cDNA-, genomische oder artifizielle Bibliothek, besonders bevorzugt um eine mikrobielle, vor allem bakterielle Bibliothek, insbesondere um eine solche aus Rhodococcus, besonders bevorzugt aus Rhodococcus ruber.
Gegenstand der Erfindung ist ferner eine Nukleinsäure, die nach einem der vorher genannten Verfahren erhältlich ist.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure chemisch synthetisiert wird. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können beispielsweise chemisch anhand der in SEQ ID No. 1 oder SEQ ID No. 3 angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder anhand der in SEQ ID No. 2 oder SEQ ID No 4 angegebenen Aminosäuresequenzen auf Grundlage des genetischen Codes z. B. nach der Phosphotriester-Methode synthetisiert werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein Vektor, insbesondere Klonierungs- und/oder Expressionsvektor, umfassend eine der vorher genannten Nukleinsäuren. Der Expressionsvektor kann beispielsweise ein prokaryotischer oder eukaryotischer Expressionsvektor sein. Bei den prokaryotischen Vektoren zum Einbau der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren handelt es sich beispielsweise um die Plasmide pBSII pGEM-5Zf(+/–), pSK, pBluescript SKII(–) oder pMS470Δ8 oder um ein anderes high copy number-Plasmid. Bei den erhältlichen Expressionsvekoren für die Expression in E. coli handelt es sich entsprechend beispielsweise um die Vektoren pBSG25, pBSS12 oder pMSRu1 zur Expression eines Proteins gemäß SEQ ID No. 2.
Bei den Expressionsvektoren für die Expression in E. coli kann es sich beispielsweise aber auch um andere kommerziell erhältliche Vektoren handeln, wie etwa den T7-Expressionsvektor pGM10 oder pGEX-4T-1 GST (Pharmacia Biotech), welche für einen N-terminalen Met-Ala-His6-Tag kodieren, der die Reinigung des exprimierten Proteins über ein Ni²⁺-NTA-Säule ermöglicht. Als eukaryotische Expressionsvektoren für die Expression in Saccharomyces cerevisiae eignen sich z. B. die Vektoren p426Met25 oder p426GAL1 für die Expression in Insektenzellen z. B. Baculovirusvektoren wie in EP-B1-0127839 oder EP-B1-0549721 offenbart, und für die Expression in Säugerzellen z. B. SV40-Vektoren.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können in einer Ausführungsform so mit flankierenden Nukleinsäuren in einen Vektor eingebaut werden, dass bei Expression des Vektors die von den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren kodierten Polypeptide als Fusionsproteine vorliegen oder einen Tag, eine markierende Aminosäuresequenz, tragen, die beispielsweise die Reinigung oder Detektion der Polypeptide erleichtern kann. Bei dem Tag kann es sich beispielsweise um das strep-, flag-, myc- oder his-Tag handeln.
Die Expressionsvektoren enthalten bevorzugt die für die Wirtszelle geeigneten regulatorischen Sequenzen, hierbei vorzugsweise den lac- oder den tac-Promotor für die Expression in E. coli, den ADH-2-, GAL1- oder AOX-Promotor für die Expression in Hefen, den Baculovirus-Polyhedrin-Promotor für die Expression in Insektenzellen oder den frühen SV40-Promotor oder LTR-Promotoren für die Expression in Säugerzellen.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Wirtszelle umfassend einen erfindungsgemäßen Vektor, wobei es sich bei der Wirtszelle bevorzugt um Rhodococcus, insbesondere Rhodococcus ruber, oder E. coli, insbesondere um den E. coli-Stamm BL21(DE3), handelt.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren werden bevorzugt nach Einbau in einen geeigneten Vektor durch die dem Fachmann bekannten Methoden der Transfektion, Transformation oder Elektroporation in die Wirtszellen eingebracht.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist des weiteren ein Polypeptid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

a) Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 2 oder gemäß SEQ ID NO. 4,
b) natürlicherweise vorkommende Mutanten, polymorphe Formen oder Allele eines Polypeptids gemäß (a), insbesondere solche, die genau ein, zwei oder drei Punktmutationen in Bezug auf ein Polypeptid gemäß (a) besitzen,
c) Polypeptide, die eine Sequenzhomologie oder -identität von mindestens 50%, bevorzugt mindestens 60% oder 70%, ganz besonders bevorzugt mindestens 80 oder 90%, insbesondere mindestens 95% in Bezug auf ein Polypeptid gemäß (a) oder (b) besitzen,
d) Polypeptide, die von den zuvor genannten erfindungsgemäßen Nukleinsäuren kodiert werden,
e) Polypeptide bestehend aus mindestens 5 oder 6, bevorzugt mindestens 10 oder 15, besonders bevorzugt mindestens 20 oder 30, insbesondere mindestens 40, 50 oder 60 aufeinanderfolgenden Aminosäuren eines Polypeptids gemäß (a) oder (b),
f) Polypeptide mit Insertionen und/oder Deletionen von bis zu 60, 50 oder 40, insbesondere bis zu 30, 20 oder 10 Aminosäuren in Bezug auf ein Polypeptid gemäß (a), (b) oder (c),
g) Polypeptide, umfassend mindestens eines der unter (a) bis (f) genannten Polypeptide.

Bevorzugt handelt es sich hierbei um Polypeptide, die eine Hydrolyse-Reaktion katalysieren, insbesondere die Hydrolyse von Ester-, Thioester-, Amid-, Peptid- oder Halidbindungen, oder Teile, insbesondere Epitope oder Domänen, von solchen Polypeptiden. Vorzugsweise handelt es sich hierbei um Enzyme, die eine katalytische Triade, umfassend ein Nukleophil, ein Aspartat oder Glutamat und ein Histidin, oder eine katalytische Diode in ihrem reaktiven Zentrum haben. Bevorzugt handelt es sich hierbei um Esterasen oder Lipasen, besonders bevorzugt um eine Serin-Esterase und/oder um eine Carboxyl-Esterase, die zur GDXG-Familie der lipolytischen Enzyme gehört oder starke Homologie zu den Enzymen dieser Familie aufweist, wobei das Serin im aktiven Zentrum (S*) vorzugsweise in der Aminosäuresequenz IVLGGDS*AGGNLA (SEQ ID NO 5) anzutreffen ist, und/oder es handelt sich um ein Enzym, das alpha/beta-Hydrolase-Faltung aufweist. Bei den Verbindungen, die durch die erfindungsgemäßen Polypeptide gespalten werden können, handelt es sich beispielsweise um Ester, Thioester, Peptide, Amide oder Halide, bevorzugt um solche mit einer kurzen Acyl-Kette, wobei mit kurzer Acyl-Kette insbesondere der Acyl-Rest der Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure oder Valeriansäure gemeint ist. Ganz besonders bevorzugt handelt es sich bei der spaltbaren Verbindung um den Ester eines Tertiäralkohols, vor allem eines allylischen Tertiäralkohols und/oder eines Tertiäralkohols, dessen tertiäres C-Atom eine aromatische oder ungesättigte Kohlenwasserstoffgruppe, vor allem einen Phenylrest, trägt. Hierbei handelt es sich vor allem um einen Ester des Linalools bzw. Licareols oder Coriandrols, insbesondere um Linaloylacetat, oder um einen Ester des 2-Phenyl-2-Butanols, 2-Phenyl-2-Hexanols oder 2-Phenyl-2-Oktanols, insbesondere um 2-Phenyl-2-butyl-acetat, 2-Phenyl-2-hexyl-acetat oder 2-Phenyl-2-oktyl-acetat.
Besonders bevorzugt handelt es sich bei den erfindungsgemäßen Polypeptiden um Esterasen, bevorzugt um mikrobielle, insbesondere bakterielle Esterasen. Ganz besonders bevorzugt handelt es sich um eine Esterase aus Rhodococcus ruber, insbesondere um die Esterase EstA gemäß SEQ ID No. 2 oder um eine Mutante dieser Esterase gemäß SEQ ID No. 4.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem erfindungsgemäßen Polypeptid um eine wasserlösliche Esterase.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind ferner Mischungen und Präparationen, vor allem bakterielle Präparationen, die in einer dem Fachmann bekannten Weise durchgeführt werden können, enthaltend ein erfindungsgemäßes Polypeptid.
Weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung eines erfindungsgemäßen Polypeptids zur hydrolytischen Spaltung und/oder zur Knüpfung von Ester-, Thioester-, Amid-, Peptid- oder Halid-Bindungen.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich hierbei bei den zu spaltenden oder herzustellenden Verbindungen um solche mit einer kurzen Acyl-Kette, ganz besonders bevorzugt um den Ester eines Tertiäralkohols, vor allem eines allylischen Tertiäralkohols und/oder eines Tertiäralkohols, dessen tertiäres C-Atom eine ungesättigte oder aromatische Kohlenwasserstoffgruppe, vor allem einen Phenylrest, trägt. Hierbei handelt es sich vor allem um einen Ester des Linalools bzw. Licareols oder Coriandrols, insbesondere um Linaloylacetat, oder um einen Ester des 2-Phenyl-2-Butanols, 2-Phenyl-2-Hexanols oder 2-Phenyl-2-Oktanols, insbesondere um 2-Phenyl-2-butyl-acetat, 2-Phenyl-2-hexyl-acetat oder 2-Phenyl-2-octyl-acetat.
Mit „kurzer Acyl-Kette” ist erfindungsgemäß vorzugsweise ein Carbonsäurerest mit nicht mehr als 6 C-Atomen, besonders bevorzugt mit nicht mehr als 4 C-Atomen, insbesondere ein Acetat-, Propionat-, Butyrat- oder Valeratrest gemeint, wobei die Wasserstoffatome des Restes auch substituiert sein können, insbesondere durch organische Gruppen oder Halogenatome. Bei dem Alkohol-Rest des Esters handelt es sich erfindungsgemäß bspw. um Naphthol, Glycerin, p- und o-Nitrophenol oder um ein Naphthol AS-Substrat.
Erfindungsgemäß verwendbare Substrate oder herzustellende Verbindungen sind im allgemeinen Verbindungen der Formel R¹-C(O)-R², wobei R² für eines der Halogene F, Cl, Br, I, für eine Aminogruppe NR³R⁴, für ein Thiol SR³ oder für einen Alkohol OR³ steht und es sich bei R¹ vorzugsweise um eine Kohlenwasserstoffkette, die bevorzugt bis zu 5, besonders bevorzugt bis zu 3 Kohlenstoffatome, vor allem genau 1 Kohlenstoffatom umfassen kann, handelt, wobei die Kohlenwasserstoffkette vorzugsweise unverzweigt ist, jedoch auch verzweigt oder ungesättigt sein kann und wobei mindestens eines der Wasserstoffatome auch durch andere Gruppen substituiert sein kann, wie beispielsweise durch Halogene, Kohlenwasserstoffreste oder Ethergruppen.
Bei dem Alkohol, Thiol oder Amin handelt es sich vorzugsweise um eine sperrige Gruppe. Bei R³ kann es sich so beispielsweise um eine Gruppe CR⁵R⁶R⁷ handeln, wobei mindestens einer, insbesondere genau einer, der Reste R⁵, R⁶ und R⁷ ein sperriges Kohlenwasserstoffgerüst, beispielsweise eine aromatische Gruppe, darstellt, das auch substituiert sein kann. Bei der aromatischen Gruppe kann es sich hierbei auch um einen Heterozyklus handeln. Bei den übrigen Resten, bei denen es sich um keine sperrige Gruppe und/oder um keinen Aromaten handelt, handelt es sich vorzugsweise um ein Wasserstoffatom oder um eine kurzkettige Kohlenwasserstoffkette mit bis zu 8, besonders bevorzugt bis zu 6 C-Atomen, wobei mindestens eines der C-Atome auch einen Substituenten tragen kann, beispielsweise ein Halogenatom. Die Kohlenwasserstoffkette kann hierbei unverzweigt, verzweigt, gesättigt oder ungesättigt sein. Andererseits kann es sich aber auch bei R³ selbst um einen Aromaten, insbesondere auch um einen heterozyklischen Aromaten, handeln, dessen Wasserstoffe auch substituiert sein können.
Erfindungsgemäß verwendbare Substrate oder herzustellende Verbindungen sind desweiteren Verbindungen der Formel R¹-C(O)-R², wobei es sich bei R¹ um eine sterisch anspruchsvolle Gruppe, vor allem um ein quaternäres Kohlenstoffatom, handelt, das vorzugsweise ein Chrialitätszentrum darstellt. Es kann sich hierbei beispielsweise um das alpha-C-Atom einer substituierten alpha-Aminosäure handeln oder um ein Kohlenstoffatom als Teil eines Hexanringes, wobei der Hexanring vorzugsweise mindestens einen weiteren Substituenten trägt, beispielsweise in Form einer Kohlenwasserstoffkette oder eines Halogenatoms. Als weiteren Substituenten kann das quaternäre Kohlenstoffatom beispielsweise eine Kohlenwasserstoffkette, insbesondere eine Methyl- oder eine Ethylgruppe tragen. In dieser Ausführungsform handelt es sich bei R² vorzugsweise um eine einfach aufgebaute Gruppe, beispielsweise um einen Amin- oder einen Alkohol-Rest, der bis zu 6, vor allem bis zu 4 C-Atome umfasst, wobei der Alkoholrest vorzugsweise unverzweigt und ungesättigt ist, jedoch auch verzweigt oder ungesättigt sein kann.
In einer besonderen Ausführungsform handelt es sich bei dem Substrat oder der herzustellenden Verbindung um ein Glycerinderivat, wobei in einer bevorzugten Ausführungsform alle drei Hydroxygruppen, vorzugsweise mit kurzkettigen Säuren, verestert sind. in einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Substrat um Triacetin.
Die Hydrolyse und/oder Bindungsknüpfung kann erfindungsgemäß beispielsweise in Gegenwart von BSA und/oder in Gegenwart eines Detergens, insbesondere eines nicht-ionischen, wie z. B. Octylglucosid, durchgeführt werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden die erfindungsgemäßen Enzyme verwendet, um enantioselektiv Bindungen zu spalten oder zu knüpfen, wobei der enantiomere Überschuß (e. e.) der betreffenden Reaktion vorzugsweise größer gleich 20%, besonders bevorzugt größer gleich 40%, vor allem größer gleich 60% ist. Beispielsweise können die erfindungsgemäßen Polypeptide auch verwendet werden, um ausgehend von racemischen Mischungen eine Isolierung oder Anreicherung eines der beiden Enantiomere zu erreichen.
Bei der Knüpfungsreaktion kann es sich beispielsweise um eine Transesterifikationsreaktion handeln.
Mögliche industrielle Anwendungen der erfindungsgemäßen Polypeptide sind beispielsweise die Herstellung oder selektive Anreicherung von Geschmackskomponenten in der Lebensmittelindustrie, von Detergentien in der Waschmittelindustrie, von Feinchemikalien in der chemischen Industrie oder von therapeutisch oder diagnostisch einsetzbaren Substanzen in der Pharmaindustrie.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher auch ein Verfahren zur Spaltung der zuvor erwähnten Ester-, Thioester-, Amid-, Peptid- oder Halid-Bindungen, dadurch gekennzeichnet, dass Moleküle, die die entsprechenden Bindungen umfassen, mit mindestens einem erfindungsgemäßen Polypeptid inkubiert werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ferner ebenso ein Verfahren zur Knüpfung der zuvor erwähnten Ester-, Thioester-, Amid-, Peptid- oder Halid-Bindungen, dadurch gekennzeichnet, dass Carbonsäuren und/oder Carbonsäureester, -thioester, -amide oder -halide mit einem Alkohol, Thiol, Amin oder Hydrogenhalogenid in Gegenwart eines erfindungsgemäßen Polypeptids inkubiert werden.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide können desweiteren beispielsweise als Epitope zur Herstellung von mono- oder polyklonalen Antikörpern verwendet werden, indem sie an einen Träger, bspw. Rinder-Serumalbumin, gekoppelt werden und anschließend ein Säuger, bevorzugt eine Maus, ein Hase oder ein Kaninchen, mit dem Epitop, bevorzugt unter Verwendung von Adjuvantien, immunisiert wird. Hierzu eignen sich bevorzugt Polypeptide mit einer Länge von 6–12, insbesondere 8, Aminosäuren. Polypeptide mit einer Länge von mehr als 60, insbesondere mehr als 75 Aminosäuren können auch ohne Träger zur Herstellung von Antikörpern verwendet werden. Die entstandenen Antikörper können anschließend gegebenenfalls isoliert werden, und ausgehend von den Antikörpern oder der für sie kodierenden Nukleinsäuren können gegebenenfalls Antikörperfragmente, beispielsweise Fab- oder scFv-Fragmente hergestellt werden.
An ein erfindungsgemäßes Polypeptid bindende Peptide können alternativ auch durch ein dem Fachmann bekanntes in vitro-Verfahren, wie beispielsweise Phage Display, Yeast Display, Bacterial Display oder etwa die sogenannte Fusagen-Technologie erhalten werden, bei der die Nukleinsäure und das von dieser kodierten Polypeptid über ein Puromycin kovalent miteinander verknüpft sind.
Die durch Immunisierung mit den erfindungsgemäßen Polypeptiden erhältlichen Antiseren, Antikörper und Antikörperfragmente sowie die durch eines der genannten in vitro-Verfahren erhältlichen Peptide eignen sich beispielsweise zur Untersuchung von Genexpressionsbanken, um zu den erfindungsgemäßen Polypeptiden homologe Proteine, insbesondere solche mit hydrolytischer Aktivität, vor allem esterolytischer und/oder lipolytischer Aktivität, ausfindig zu machen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher auch Antiseren, Antikörper und Antikörperfragmente gegen ein erfindungsgemäßes Polypeptid sowie andere an ein erfindungsgemäßes Peptid bindende Peptide, insbesondere erhältich durch eines der zuvor genannten Verfahren. Antiserum, Antikörper und Antikörperfragment sowie sonstige an ein erfindungsgemäßes Peptid bindende Peptide werden im folgenden der Einfachheit halber „Antikörper” genannt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Polypeptids, dadurch gekennzeichnet, dass eine erfindungsgemäße Nukleinsäure in einer geeigneten Wirtszelle, insbesondere in E. coli, vor allem in E. coli BL21(DE3), oder in Rhodococcus, vor allem Rhodococcus ruber, exprimiert wird. Anschließend kann gegebenenfalls Reinigung, vor allem chromatographische Reinigung des Proteins erfolgen.
Das Verfahren kann beispielsweise auf folgende Weise durchgeführt werden:

a) eine erfindungsgemäße Nukleinsäure wird in einen geeigneten Vektor eingebaut und E. coli wird mit dem Vektor transformiert,
b) nach der Expression des Proteins werden die Zellen geerntet und aufgeschlossen,
c) das Protein wird aus dem so erhaltenen Überstand gegebenenfalls aufgereinigt.

Kultivierung von E. coli erfolgt hierbei vorzugsweise zwischen 15 und 40°C, besonders bevorzugt zwischen 20 und 37°C, vor allem bei etwa 30 oder etwa 37°C. Erfolgt Induktion der Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren beispielsweise durch Zugabe von IPTG oder Laktose, so werden die Zellen nach Induktion der Expression vorzugsweise für zwischen 3 und 15 Stunden, besonders bevorzugt für zwischen 5 und 10 Stunden, wachsen gelassen. Alternativ kann auf die Induktion der Expression auch verzichtet werden.
Der Aufschluß der geernteten Zellen erfolgt durch eine dem Fachmann bekannte Methode, beispielsweise French Press, Ultraschall, Kugelmühle, besonders bevorzugt jedoch durch Einsatz eines Sonifikators. Alternativ können die Zellen auch chemisch, beispielsweise durch EDTA oder Polymyxin B, permeabilisiert werden.
Die gegebenenfalls durchzuführende Reinigung des Proteins erfolgt vorzugsweise chromatographisch. Die chromatographische Reinigung des Proteins kann beispielsweise die Kationen- und/oder Anionenaustauschchromatographie, die hydrophobe Wechselwirkungschromatographie und/oder die Gelfiltration umfassen.
Vor allem die kurzkettigen erfindungsgemäßen Polypeptide können auch mit Hilfe der klassischen Peptidsynthese (Merrifield-Technik) synthetisiert werden.
Weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Testsystem zur Identifizierung von Substraten oder funktionellen Interaktoren enthaltend mindestens eine erfindungsgemäße Nukleinsäure und/oder mindestens ein erfindungsgemäßes Polypeptid und/oder mindestens einen erfindungsgemäßen Antikörper und gegebenenfalls geeignete Hilfs- und/oder Zusatzstoffe.
Erfindungsgemäß kann auch ein Nukleotid oder mehrere Nukleotide der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder eine oder mehrere Aminosäuren der erfindungsgemäßen Polypeptide oder der erfindungsgemäßen Antikörper modifiziert sein. Bei der Modifikation kann es sich etwa handeln um eine radioaktive, fluorogene oder chromogene Gruppe oder um eine posttranslationale Modifikation.
Im folgenden werden bestimmte Ausführungsformen der Erfindung exemplarisch anhand von Abbildungen und Ausführungsbeispielen erläutert.
Abbildungen
In 1 sind schematisch Substrattypen für Lipasen und Esterasen dargestellt. Mit dem Stern ist das Chiralitätszentrum gekennzeichnet.
In 2 ist die Spaltung des racemischen Gemisches des rac-Linaloylacetats bzw. rac-Linalylacetats (die beiden Begriffe werden synonym verwendet) dargestellt. Während das (S)-(+)-Linaloylacetat unter Freisetzung von (S)-(+)-Linalool gespalten wird, wird das das (R)-(–)-Enantiomere nicht umgesetzt.
In 3 ist das high copy number-Plasmid pMS470Δ8 abgebildet.
In 4 wird ein schematischer Überblick über die Subklonierungsexperimente gegeben.
In 5 wird ein schematischer Überblick über die Herstellung des Plasmids pMSRu1 gegeben.
In 6 wird anhand eines Agarosegels ein Überblick über die Ergebnisse zum partiellen Verdau der genomischen DNA von Rhodococcus ruber gegeben. Partieller Verdau der chromosomalen DNA erfolgte mit Sau3AI bei 30°C für eine Stunde. Folgende Enzymmengen kamen zum Einsatz: Spur 1: 2 U/μg DNA; Spur 2: 1 U/μg DNA; Spur 3: 0,5 U/μg DNA; Spur 4: 0,25 U/μg DNA; Spur 5: 0,125 U/μg DNA; Spur 6: 0,063 U/μg DNA; Spur 7: 0,03 U/μg DNA; Spur 8: kein Enzym. Durch präparativen Verdau mit Sau3AI konnten DNA-Fragmente mit einer Größe von 3–5 kb (Spur L) bzw. 2–3 kb (Spur S) erhalten werden.
In 7 ist ein Agarosegel mit einer Restriktionsanalyse der Esterase-positiven Klone gezeigt. Die Klone wurden mit BamHI verdaut. In den Spuren 1 und 21 wurde HindIII-Standard aufgetragen, in den Spuren 2–20 bzw. 22–27 die Klone der genomischen Bibliothek (G2–G20, G22–G27).
In 8 ist ein natives Polyacrylamidgel von Esterase-positiven Klonen abgebildet. In Spur 1 wurde aufgetragen Überstand der Rhodococcus ruber-Präparation (RR1), in Spur 2 und 3 Überstand (XL1_S) und Pellet (XL1_P) von E. coli XL1 Blue-Zellen mit dem Plasmid pBS SKII als Negativkontrolle, in den übrigen Spuren wurden Überstände der Klone der genomischen Bibliothek aufgetragen. Färbung des nativen Gels erfolgte mittels alpha-Naphthylacetat/Fast Blue.
In 9 ist die Restriktionsanalyse der Subklone des Klons G 25 dargestellt. Die Subklone sind durchnumeriert (S1–S20).
In 10 ist ein natives Polyacrylamidgel zum Nachweis von Esterase-Aktivität in den Subklonen dargestellt. Aufgetragen wurden jeweils Rohlysate von E. coli XL1 Blue, der Subklone sowie von Rhodococcus ruber. Linalylacetat wurde als Substrat verwendet.
In 11 sind die Ergebnisse der Sequenzanalyse des Inserts des Subklons S12 (pBSS12) schematisch dargestellt.
In 12 ist ein Teil der Sequenz des Inserts pMSS12 (angrenzend an die T3-Region des Vektors; SEQ ID NO. 6) und des von diesem kodierten Proteins dargestellt (SEQ ID NO. 7/8). Position 1–244 kodiert für den C-Terminus einer Aldehyd-Dehydrogenase (SEQ ID NO. 7), das Stoppkodon befindet sich an Position 245. An Position 325 befindet sich ein Startkodon ATG mit einer vorgelagerten Shine-Dalgarno-Sequenz (AGGA), an Position 760 folgt ein Stoppkodon.
In 13 ist ein Teil der Sequenz des Inserts pMSS12 (angrenzend an die T7-Region des Vektors; SEQ ID NO. 9) und des von diesem kodierten Proteins (SEQ ID NO. 2) dargestellt. Start- und Stopp-Kodon des estA-Gens sowie die Shine-Dalgarno-Sequenz sind gekennzeichnet.
In 14 ist die Sequenz des ORF des Gens estA sowie die dazugehörige Aminosäuresequenz der Esterase EstA (SEQ ID NO. 2) dargestellt.
In 15 ist das Plasmid pMSRu1, das das Gen estA umfasst, schematisch dargestellt.
In 16 ist ein mit Coomassie Brilliant Blue gefärbtes Polyacrylamidgel dargestellt. Aufgetragen wurde in Spur 2 und 3 Überstände von XL1 Blue-Zellen enthaltend den Vektor pMSRu1, wobei zum einen Induktion der Proteinexpression mittels 0,1 mM IPTG erfolgte (Spur 1), zum anderen keine Induktion erfolgte (Spur 2).
In 17 sind Wachstumskurven von XL1 Blue-Zellen enthaltend den Vektor pMSRu1 bei 37°C dargestellt, wobei einmal Induktion mittels 0,1 mM IPTG erfolgte (Quadrate), das andere mal keine Induktion erfolgte (Kreise).
In 18 ist ein SDS-Polyacrylamidgel, in 19 ein natives Gel von Überstand-(S) und Pellet-(P) Fraktionen von XL1 Blue-Zellen, enthaltend das Plasmid pMSRu1, gezeigt. Fermentation erfolgte bei 37°C. „1” bedeutet, dass Induktion erfolgte, „2”, dass keine Induktion erfolgte. Als Negativ-Kontrolle „n. c.” wurde Gesamtlysat von XL1 Blue-Zellen mit dem Vektor pBluescript ohne Insert verwendet. Färbung des nativen Gels erfolgte mittels alpha-Naphthylacetat/Fast Blue.
In den 20, 21 und 22 sind die Ergebnisse zur Untersuchung eines möglichen Einflusses der Sonifikation auf den Zustand des Proteins dargestellt, wobei die Untersuchung in 21 mittels eines SDS-Gels, in 22 mittels eines nativen Gels erfolgte. In dem in 22 dargestellten Gel erfolgte Renaturierung des Proteins und anschließende Färbung mittels α-Naphthylacetat und Coomassie Brilliant Blue. Für diese Untersuchungen erfolgte Fermentation der Bakterien bei 30°C (LMW: low molecular weight standard, S: Überstand, P: Pellet; 1: pMS470Δ8 E. coli XL1 Blue, 2: pMS470Δ8 induziert, 3: pMSRu1 E. coli XL1 Blue, induziert und Standard-Sonifikation, 4: induziert und zweifache Sonifikationszeit, 5: keine Induktion und Standard-Sonifikation, 6: nicht induziert und zweifache Sonifikationszeit).
In 23 sind die Ergebnisse zur Untersuchung von Temperatureinflüssen auf das Zellwachstum dargestellt: Verwendet wurde der Klon pMSRu1 in E. coli BL21, Induktion erfolgte nach 180 Minuten.
In 24 sind die Ergebnisse zur Untersuchung des Temperatureinflusses anhand eines SDS-(links) und anhand eines nativen (rechts) Gels dargestellt. (LMW: low molecular weight standard, S: Überstand, 1: 30°C keine Induktion, 2: 30°C induziert, 3: 37°C keine Induktion, 4: 37°C induziert; n. c.: Negativkontrolle pMS470Δ8 E. coli BL21 Rohlysat)
In 25 sind die verschiedenen Expressionsniveaux des Klons pMSRu1 bei unterschiedlichen Wachstumszeiten mittels eines SDS-Gels dargestellt: (LMW: low molecular weight standard, S: Überstand, P: Pellet; Induktionszeiten: 1: 4.5 h, 2: 8.5 h, 3: 19.5 h, 4: keine Induktion)
In 26 sind die Ergebnisse zur PCR-Zufallsmutagenese dargestellt (HindIII und PstI Standard, A-F: PCR-Bedingungen gemäß Tab. 2)
In 27 ist ein SDS-Gel von Überstandfraktionen gezeigt. Die Fermentation der Mutanten erfolgte bei 30°C. WT steht für pMSRu1. + zeigt an, dass es sich um Kulturen handelt, bei denen Induktion der Expression mittels IPTG erfolgte.
In 28 sind die Ergebnisse zur Untersuchung der spezifischen Aktivität von Überstand-(S), Pellet-(P) und Lysat-(L) Fraktionen von Fermentationen des Klons pMSRu1 dargestellt. o-Nitrophenylacetat wurde als Substrat verwendet.
In 29 sind die Ergebnisse zur Untersuchung der spezifischen Aktivität des Klons pMSRu1 im Vergleich zur Aktivität der Mutante F3 dargestellt, wobei Fraktionen verwendet wurden, bei denen die Expression durch IPTG induziert worden war (induced) oder bei denen keine Zugabe von IPTG erfolgte. Analysiert wurden die Überstände von ultrazentrifugierten Lysaten.
In 30 sind die Ergenbisse zur Untersuchung der spezifischen Aktivität der Esterase EstA, die bei 25°C, 700 rpm produziert worden war, dargestellt. S steht für Substrat, LA für Linaloylacetat, ind. bedeutet, dass die Proteinexpression durch Zugabe von IPTG induziert worden war.
In 31 sind die Ergebnisse zur Untersuchung der spezifischen Aktivität zum einen von aufgeschlossenen, zum anderen von nicht aufgeschlossenen Zellen dargestellt. rac-Linalacetat (LA) wurde als Substrat verwendet.
Material
a) Laborausstattung
UV-Lampe: 254 nm für analytische Agarose-Gele, 302 nm für präparative Gele; Perkin Elmer Lambda Bio UV/VIS Spektrometer; Beckman DU-50 Spektrophotometer; Branson Sonifier 250; Perkin Elmer Thermal Cycler, Gene Amp PCR System 2400; BIO-RAD Mini Protean II^TM Cell; MWG-BIOTECH Elektrophoresekammer; HT INFORS AG Inkubator; Eppendorf Thermomixer comfort, 1.5 ml; gekühlte Zentrifugen: Hettich MIKRO RAPID/K und JOUAN BR4; gekühlte Super Speed-Zentrifuge: Sorvall^®RC-5B (GSA-rotor); Sorvall^®Ultrazentrifuge, Combi; BIO-RAD SLAB DRIER MODEL 483; Applied Biosystems 392 DNA/RNA Synthesizer und 373A DNA Sequencer
b) Bakterienstämme

– E. coli SURE^®: Stratagene (La Jolla, CA, USA) e14-(mcrA), Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)171, sbcC, recB, recJ, umuC::Tn5 (kan^r, uvrC, supE44, lac, gyrA96, relA1, thi-1, endA1, [F' proAB, lac^qZΔM15, Tn10, (tet^r)]
– E. coli XL1 Blue: Stratagene (La Jolla, CA, USA) recA1, endA1, gyrA96, thi-1, hsdR17, supE44, relA1, lac, [F' proAB, lac^qZΔM15, Tn10, (tet^r)]
– E. coli BL21 (DE3): Promega (Madison, WI, USA) F^–, ompT, hsdS_B(r_B ^– m_B ^–), gal, dcm
– Rhodococcus ruber DSM 43338 (Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen)

c) Plasmide

– pBluescript^®II SK (–): 2.9 kb, Stratagene, La Jolla, CA, USA
– pMS470Δ8: 3992 bp + 1360 bp Platzhalterfragment (stuffer insert) (Balzer et al., 1992): Die Expression ist regulierbar durch einen induzierbaren tac-Promoter. Außerdem enthält dieses Plasmid ein Ampicillin-Resistenz verleihendes Gen und die Shine-Dalgarno Sequenz des Gens 10 des Bakteriophagen T7. NdeI- und SphI-Restriktionsschnittstellen erlauben die Klonierung eines Zielgens in dieses Vektorsystem (3).

d) Puffer und Lösungen
Agarose-Gelelektrophorese
Folgenden Reagentien wurden verwendet (Sambrook et al., 1989):
TAE-Puffer (0,04 M Tris-acetat, 0,001 M EDTA, pH 8,0); Stopplösung/Probenpuffer, verdünnt aus 5×-Lösung (5×: 4 M Harnstoff, 50% (w/v) Saccharose in Wasser, 0,1% Bromphenolblau, 50 mM EDTA, pH 7,0); Ethidiumbromid (0.5 μg/ml); SeaKem^® LE Agarose (FMC BioProducts).
DNA-Isolations-Kits
Folgende Kits wurden für die DNA-Isolation verwendet:

– Wizard^® Plus SV Minipreps DNA Purification System (2/97) (Promega, Madison, WI, USA): Die Zellen wurden mit einem Zahnstocher auf einer halben Platte ausplattiert, über Nacht wachsen gelassen, von der Platte gekratzt und in 250 μl Zell-Resuspensions-Lösung resuspendiert (DNA-Ausbeute: ~10 μg);
– NUCLEOBOND^® AX100 (Macherey-Nagel GmbH, Düren, Deutschland): 100 ml-Ansatz in LB-Amp über Nacht;
– Jetstar Midi Prep Kit (Genomed Inc., NC, USA).

Für die Isolierung genomischer DNA wurde das Genomic-tip 500/G Bacterial DNA Isolation Protocol (7195) von QIAGEN GmbH (Hilden, Deutschland) verwendet, für die Gel-Extraktion das QIAEX II Agarose Gel Extraction Protocol (9/97).
e) Enzyme
Restriktionsenzyme, modifizierende Enzyme und die entsprechenden Puffer wurden von Boehringer Mannheim GmbH (Deutschland), New England Biolabs Inc. (Beverly, MA, USA), MBI Fermentas (Vilnius, Litauen) oder Promega (Madison, WI, USA) bezogen.
f) Wachstumsmedien

– LB (Luria-Bertani) (10 g/l Trypton (Biolife); 5 g/l Hefeextrakt (Biolife); 5 g/l NaCl; für Agar-Platten: 15 g/l Agar (OXOID))
– SOC (20 g/l Trypton; 0.58 g/l NaCl; 5 g/l Hefeextrakt; 2 g/l MgCl₂; 0.18 g/l KCl; 2.46 g/l MgSO₄; 3.46 g/l Glukose) Zugabe von Ampicillin, IPTG und X-gal erfolgte ausgehend von folgenden Stammlösungen:
– 1000× Ampicillin-Stammlösung: 100 mg/ml, sterilflitriert (nach dem Autoklavieren zu den Medien hinzugegeben),
– IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid): 100 mM (BTS-Bio Tech Trades GmbH),
– X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside): 2% in DMF (LAMBDA)

g) Puffer und Lösungen für die Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) denaturierende SDS-Gele

– 12% Trenngel (0,375 M Tris, pH 8,8): 3,35 ml Wasser; 2,5 ml 1,5 M Tris-HCl, pH 8,8; 0,1 ml 10% [w/v] SDS; 4 ml 30% Acrylamid/Bis (BIO-RAD); 0,05 ml 10% Ammoniumpersulfat; 0,01 ml TEMED
– 5% Sammelgel (0,125 M Tris, pH 6,8): 6,1 ml Wasser; 2,5 ml 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8; 0,1 ml 10% [w/v] SDS; 1,625 ml 30% Acrylamid/Bis; 0,05 ml 10% Ammoniumpersulfat; 0,01 ml TEMED

native Gele

– 12% Trenngel (0,083 M Tris, pH 7,8): 3,35 ml Wasser; 2,5 ml 0,33 M Tris-HCl, pH 7,8; 4 ml 30% Acrylamid/Bis (BIO-RAD); 0,05 ml 10% Ammoniumpersulfat; 0,01 ml TEMED
– 5% Sammelgel (0,016 M Tris, pH 6,8): 6,1 ml Wasser; 2,5 ml 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8; 1,625 ml 30% Acrylamid/Bis; 0,05 ml 10% Ammoniumpersulfat; 0,01 ml TEMED

Puffer und Lösungen

– 1× Tris-Glycin Elektrophorese-Puffer (25 mM Tris; 250 mM Glycin (pH 8.3); 0.1% SDS)
– 1× SDS Gel-Ladungs-Puffer (50 mM Tris-HCl (pH 6.8); 100 mM Dithiothreitol; 2% SDS; 0.1% Bromophenolblau; 10% Glycerin)
– Färbelösung für die SDS-Gele (0.25% Coomassie Brilliant Blue R250; 7.5% Essigsäure; 50% Methanol)
– Entfärbelösung (7,5% Essigsäure; 20% Methanol)
– 1× Elektrophorese-Puffer für native Gele (0.049 M Tris; 0.038 M Glycin (pH 8.0))
– 2× nativer Probenpuffer (50 ml 20 mM Tris-HCl pH 7.4; 50 ml Glycerin; 1 g Triton X-100; 0.1 g Bromophenolblau)
– Färbelösung für native Gele (5 ml 100 mM Na₂HPO₄ (pH 7.0); 500 μl 12% (w/v) α-Naphthylacetat (SIGMA^®), gelöst in Aceton; 150 μl 20 mg/ml Fast-Blue B (SIGMA^®, o-Dianisidin, tetrazotized), gelöst in Wasser)

h) Reagenzien für die Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

– Gene Craft Germany: DNA Polymerization Mix; 20 mM von jedem dNTP
– Appligene^® Oncor (France) Taq DNA Polymerase: 5 U/μl
– Appligene^® 10 × Incubation Mix
– Fresenius bidest. H₂O; 50 mM MnCl₂; 50 mM MgCl₂

Methoden
a) Sterilisierung
Alle Materialien, Lösungen und Medien, die für molekularbiologische und mikrobiologische Experimente verwendet wurden, wurden für 20 Minuten bei 121°C autoklaviert. Hitzeempfindliche Substanzen wurden sterilfiltriert (0.20 μm, Minisart^®, Sartorius). Steriles bidestilliertes Wasser wurde von Fresenius Pharma (Österreich) bezogen.
b) Kultivierung von E. coli und Rhodococcus ruber
E. coli-Wachstumsexperimente wurden vorzugsweise in 300 ml- und 1 l-Erlenmeyer-Kolben durchgeführt (baffled flasks), die 100 ml bzw. 250 ml LB-Medium mit 100 μg/ml Ampicillin enthielten.
Die Zunahme der optischen Dichte (OD) wurde bei 595 nm mit gegebenenfalls verdünnten Proben gemessen (Beckman Spektrophotometer).
Vorkulturen (100 ml LB-Amp) wurden für die Fermentation mit einer einzigen Kolonie aus einer frischen Agar-Platte angeimpft und über Nacht wachsen gelassen (OD ~2). 250 ml-Kulturen wurden mit 25 ml der Vorkultur angeimpft.
Alle flüssigen Kulturen wurden in der Regel zwischen 10 und 18 Stunden auf einem Drehschüttler mit 120–150 rpm inkubiert. Für die Platten-Kultivierung wurden die Zellen über Nacht auf LB-Amp-Agar-Platten wachsen gelassen. Die Standard-Wachstumstemperatur für E. coli-Stämme war 37°C.
Rhodococcus ruber (DSM 43338) zeigte gutes Wachstum auf LB-Platten und in LB-Flüssigkultur bei einer Temperatur von 30°C. Kulturen, die mit einzelnen Kolonien (auf frischen LB-Platten über Nacht gewachsen) angeimpft worden waren, wurden für 24 Stunden wachsen gelassen (250 ml LB, 120 rpm, 30°C).
c) Zellaufschluß
Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 4°C geerntet (GSA-rotor, 6000 rpm, 15 min), in 2–8 ml 0,1 M Tris (pH 7.0) resuspendiert und bei –20°C eingefroren. Zum Zellaufschluß wurde das resuspendierte Pellet der Ultrasonifikation unterworfen (6 × 20 Sekunden, auf Eis, Branson Sonifier: output: micro tip limit, duty cycle: 60). Dieser schloß sich die Ultrazentrifugation an (30000 rpm (ca. 78.000 g), 30 min, 4°C). Die resultierenden Überstand-Fraktionen und die resuspendierten Pellet-Fraktionen (3 ml 0,1 M Tris-HCl, pH 7.0) wurden bei –20°C gelagert.
d) Gelelektrophorese
Agarose-Gelelelektrophorese
Die Konzentration der Agarose-Gele wurde in Abhängigkeit von der Größe des Fragments zwischen 0.7 und 1.5% variiert. Das normalerweise verwendete 1% Agarosegel war für die meisten Anwendungen ausreichend. Die erforderliche Agarose-Menge wurde in 1 × TAE-Puffer durch Erwärmung der Lösung in der Mikrowelle gelöst. Nach Abkühlung auf 60°C wurde Ethidiumbromid (1–3 μl) hinzugegeben und das Gel wurde in das vorgesehene Behältnis gegossen. Zu allen DNA-Proben, die auf das Gel gegeben wurden, musste zwischen 1/3 und ¼ Volumen DNA-Gel-Ladepuffer hinzugegeben werden. Die Spannung, die für die Elektrophorese angelegt wurde, betrug 60 V für präparative Gele und 80 V für Kontrollgele. Nach der Elektrophorese wurden die Banden im UV-Licht sichtbar gemacht.
Polyacrlyamid-Gelelektrohorese (PAGE)
Polyacrylamidgele wurden hergestellt wie unter Material, Punkt (g) angegeben. Für SDS-Gele wurden die Proben (10 μl von 1:10 verdünnten Zelllysaten) mit einem halben Volumen Ladepuffer gemischt und bei 95°C für 5 min denaturiert. Es wurde eine Spannung von 180 V angelegt. Als Referenz wurden 3 μl eines Low Molecular Weight-Standards verwendet (Größe in kDa: 94, 67, 43, 30, 21, 14).
Die Proben für die nativen Gele wurden nach dem Vermischen mit dem Ladepuffer direkt in die Geltaschen gegeben. Die Elektrophorese wurde mit 150 V durchgeführt. Die Proteinbanden wurden durch 30-minutige Inkubation mit entweder Coomassie Brilliant Blue (SDS-Gele) oder mit Naphthylacetat/Fast-Blue (native Gele) sichtbar gemacht.
Die nativen Gele konnten nach der Färbung direkt mit Wasser gespült und auf einem Vakuumtrockner getrocknet werden (80°C, 45 min). Die SDS-Gele hingegen wurden vor dem Spülen und Trocknen zunächst entfärbt, bis der Hintergrund farblos wurde. Zur Renaturierung des Proteins auf den SDS-Gelen wurden diese zunächst mit bidest. H₂O für 15 Minuten gespült, dann mit α-Naphthylacetat/Fast-Blue und schließlich mit Coomassie Brilliant Blue gefärbt. Anschließend erfolgte Entfärben und Trocknen wie zuvor beschrieben.
e) DNA-Präzipitation
Zur Einengung der DNA kamen zwei Methoden zur Anwendung: Ethanol- und Isopropanol-Fällung. Isopropariol-Fällung wurde bei Raumtemperatur durchgefüht, wodurch geringere Mengen an Salz mit ausfällten. Der Vorteil der Isopropanol-Fällung war, dass das zu zentrifugierende Flüssigkeits-Volumen geringer war. Jedoch war es dafür schwieriger, dieses zu entfernen. Ethanol-Fällung wurde bei –20°C oder –70°C durchgeführt. Diese Methoden sind den Standard-Methodensammlungen der Molekularbiologie (beispielsweise Current Protocols in Molecular Biology) zu entnehmen.
f) Restriktionsanalyse
Durch Wizard-Minipräparationen isolierte Plasmid-DNA wurde für 2 Stunden bei 37°C verdaut unter Verwendung von allgemein erhältlichen Enzymen wie BamHI, HincII und EcoRI.
Ein Reaktionsvolumen von 10 μl setzte sich aus den folgenden Komponenten zusammen: 2 μl DNA, 1 μl Enzym (10 U/μl), 1 μl 10× Puffer, 6 μl bidest. H₂O. Bevor die Proben auf ein 0.7–1% Agarosegel gegeben wurden, wurde die Reaktion durch Zugabe von 5 μl Ladepuffer gestoppt.
g) SEM-Transformations-Protokoll
Die kompetenten Zellen wurden auf Eis aufgetaut, die zu transformierende DNA wurde zu 200 μl der kompetente Zellen hinzugegeben und die Zellen wurden anschließend für 30 Minuten auf dem Eis gelassen. Es erfolgte Hitzeschock bei 42°C für 30 sec. Danach wurde das Röhrchen wieder für 2 min auf das Eis gestellt. Nach Zugabe von 800 μl SOC-Medium wurde für eine Stunde bei 37°C geschüttelt und anschließend wurden 100–200 μl der so erhaltenen Suspension auf LB-Amp-Platten ausplattiert.
h) DNA-Sequenzierung
In der Regel war die Reinheit der DNA aus den Wizard-Minipräps ausreichend für die Sequenzierung. Die Sequenzierungsreaktion wurde durchgeführt gemäß der Dideoxy-vermittelten Kettenterminationsmethode (Sauger et al., 1977) mit dem DNA Sequencing Kit (Big Dye^TM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction mit AmpliTaq^® DNA Polymerase, FS von PE Applied Biosystems). Die Sequenzen wurden analysiert mit der Applied Biosystems Sequence Editor Software (SeqEd^TM Version 1.0.3).
Die Primer wurden entworfen unter Verwendung des Primer Designer Program (Version 2.0, Scientific & Educational Software). Alle Oligonukleotide, die synthetisiert wurden, sind in Tabelle 4 zusammengestellt.
i) Konstruktion einer genomischen Bibliothek von Rh. ruber
Plasmid-Präparation
Eine Übernacht-Kultur (100 ml) von E. coli XL1 Blue-Zellen, die den pBluescript SKII(–) Vektor tragen, wurde zentrifugiert um die Zellen zu ernten. Die Plasmid-DNA wurde isoliert mit dem JETSTAR Plasmid Isolation Kit. Nach dem Elutionsschritt wurde die DNA mit 0.7 Volumen Isopropanol gefällt, mit 70% Ethanol gewaschen und in 80 μl bidest. Wasser gelöst.
Durch Messung der Absorption E der verdünnten Proben bei 260 nm (PE Spektrometer) konnte die Konzentration der Plasmid-DNA berechnet werden (c [μg/μl] = E₂₆₀·Verdünnung·50/1000).
Vektorverdau und -dephosphorylierung
10 μg Vektor-DNA (pBluescript SKII(–)) wurde mit BamHI linearisiert, einem Restriktionsenzym, das innerhalb der MCS (multiple cloning site) schneidet. Zur Durchführung des Verdaus wurden folgende Komponenten miteinander vermischt: 10 μg Vektor-DNA, 10 μl Puffer B (Boehringer Mannheim, Deutschland), 3 μl BamHI (10 U/μl; Boehringer), mit bidest. H₂O wurde auf 100 μl aufgefüllt.
Das Plasmid wurde bei 37°C für 2 Stunden verdaut. Anschließend wurden weitere 0.5 μl BamHI hinzugegeben und es erfolgte Inkubation für 3 weitere Stunden. Zur Durchführung der Dephosphorylierung wurden folgende Komponenten miteinander vermischt: 95 μl linearisierter Vektor, 10 μl 10× Phosphatase-Puffer, 2 μl Alkalische Phosphatase (1 U/μl; Boehringer). Anschließend erfolgte Inkubation für 30 min bei 37°C. Danach wurden weitere 2 μl alkalische Phosphatase hinzugegeben und nach weiterer Inkubation für 30 Minuten bei 37°C erfolgte Inaktivierung des Enzyms durch 10 Minuten Inkubation bei 68°C und anschließende Zugabe von 15 μl Stopp-Lösung.
Die Probe wurde auf ein 1% präparatives Agarose-Gel geladen. Nach der Elektrophorese bei 60 V wurde die 3 kb-Bande aus dem Gel herausgeschnitten. DNA-Extraktion erfolgte unter Verwendung des Qiaex Agarose Gel Extraction Kit von Qiagen. Zur Abschätzung der DNA-Konzentration wurde 1 μl der verdünnten Probe auf ein Agarosegel aufgetragen.
Isolierung der chromosomalen DNA aus Rh. ruber
Chromosomale DNA wurde aus Zellen isoliert, die in 250 ml LB-Medium (34°C, 120 rpm, 24 h) gewachsen waren. Dieses Experiment wurde gemäß dem Qiagen Isolation Protocol durchgeführt. Es schloß sich eine Isopropanol-Fällung (bei –20°C, über Nacht) an. Für den folgenden partiellen Verdau wurden die DNA-Konzentrationen auf Grundlage der Bandenstärke im Agarosegel abgeschätzt.
Partieller Verdau der chromosomalen DNA
Zunächst mußten die optimalen Bedingungen für den teilweise Verdau mit Sau3AI ermittelt werden. Die gewünschte Größe der zu klonierenden Fragmente war 2–5 kb. Das Verfahren wurde auf folgende Weise durchgeführt (Sambrook et al., 1989):
Eine Reaktionsmischung mit 10 μg chromosomaler DNA und Puffer für den Restriktionsverdau mit einem finalen Volumen von 150 μl wurde vorgelegt (Röhrchen 9). Es erfolgte Mischung durch mehrfaches Invertieren. 30 μl der Mischung wurden in ein Eppendorf-Röhrchen gegeben (Röhrchen 1) und jeweils 15 μl in die Röhrchen 2–8, so dass 15 μl in Röhrchen 9 verblieben. Anschließend wurde auf Eis gekühlt. Jetzt wurden 4 Einheiten Restriktionsenzym (Sau3AI) in Röhrchen 1 gegeben und gut gemischt. Die Konzentration des Enzyms betrug somit 2 Einheiten pro μg DNA. 15 μl dieser Reaktionsmischung wurden in das Röhrchen 2 gegeben, so dass sich die Enzymkonzentration in Röhrchen 2 auf eine Einheit Enzym pro μg DNA verringert. Nach erneutem Mischen wurde die Verdünnung auf entsprechende Weise bis zum Röhrchen 8 fortgesetzt. Anschließend wurden die Röhrchen 1 bis 8 bei 37°C für eine Stunde inkubiert. Danach wurden 5 μl Probenpuffer zu jeder Probe hinzugegeben und zur Probenanalyse eine Gelelektrophorese durchgeführt. Zur Durchführung einer Präparation im großen Maßstab (750 μl Gesamtvolumen) wurden 50 μg DNA mit einer entsprechend größeren Menge an Restriktionsenzym eingesetzt.
Der Verlauf der Reaktion wurde durch Elekrophorese nach einer Stunde überprüft. Um die Reaktion zu unterbrechen wurden die Reaktionsröhrchen in flüssigem N₂ eingefroren und bei –70°C gelagert.
Um die Proben-DNA zu konzentrieren erfolgte Präzipitation mit 0,7 Volumen Isopropanol und anschließendes Lösen der DNA in 100 μl bidest. H₂O. Anchließend wurden 20 μl Probenpuffer hinzugegeben und die Probe auf ein präparatives 1% Low Melting Agarose-Gel aufgetragen.
Die DNA-Fragmente, die eine Größe von 3–5 kb hatten, wurden herausgeschnitten und die DNA mittels des Qiaex II Agarose Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) extrahiert.
Ligation und Transformation
Die so erhaltenen Fragmente mit einer Größe von 3–5 kb wurden zur Ligation mit dem dephosphorylierten, mit BamHI linearisierten Vektor unter Vorgabe eines Verhältnisses Vektor:Fragment von 1:1 inkubiert. Hierzu wurden 500 ng Vektor, 667 ng der Fragmente und 5 μl Ligasepuffer zusammengegeben und mit bidest. H₂O auf 50 μl aufgefüllt. Nach Zugabe von 1 μl T4 DNA-Ligase (Promega) erfolgte Inkubation über Nacht bei 16°C oder für 3 Stunden bei Raumtemperatur. Um den Religations-Anteil zu ermitteln, erfolgte als Kontrolle Inkubation aller Komponenten mit Ausnahme der Fragment-DNA.
E. coli SURE^® und XL1 Blue-Zellen wurden nach dem SEM-Protokoll transformiert. Hierzu wurden 2–10 μl Ligations-Mischung auf 200 μl kompetente Zellen gegeben. LB-Amp-Platten mit IPTG (50 μl/Platte, 100 mM) und X-gal (100 μl/Platte, 2%) wurden verwendet, um die Menge an religiertem Vektor durch Blau/Weiß-Selektion zu bestimmen.
Vor der Durchsuchung der Bibliothek nach aktiven Klonen wurden alle erhaltenen Kolonien in flüssigem LB-Amp-Medium (2–3 ml) suspendiert und in ein Röhrchen gegeben. Das Röhrchen mit den Bibliotheksklonen wurde bei 37°C für 1 Stunde auf einem Schüttler inkubiert. Mit einem Drittel des Gesamtvolumens wurde dann eine Plasmid-DNA-Isolation durchgeführt (Nucleobond AX-100).
Die restlichen zwei Drittel wurden nach Zugabe von 1/5 Volumen sterilfiltriertem 80% Glycerin als Aliquots zu je 500 μl in flüssigem N₂ eingefroren und bei –70°C gelagert.
j) Screening der genomischen Bibliothek von Rhodococcus ruber
Zuerst wurde die optimale Verdünnung (400–500 Kolonien pro Platte) für das Screening ermittelt. Zur Durchführung eines repräsentativen Screenings muß eine genügende Anzahl an Klonen gescreent werden, um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, das gesuchte Gen zu finden.
Zur Durchführung des Screenings wurden zunächst Filterpapiere (Whatman, ø 70 mm) mit α-Naphthylacetat-Färbelösung vollgesaugt (s. Material: Färbelösung für native Gele), anschließend wurden die Filterpapiere auf die Kolonien gelegt, um festzustellen, ob sofortige Farbbildung auftritt (Esterase-positive Klone zeigen rote Farbbildung, der Hintergrund ist rosa). Die positiven Klone werden nun ausgewählt und zur Durchführung eines weiteren Screenings ausplattiert. Es wurde jeweils eine einzelne Kolonie auf LB-Amp-Platten ausgestrichen nach Inkubation über Nacht mit diesem Zellmaterial eine Mini-Plasmid-DNA-Präparation durchgeführt. Anschließend erfolgt Restriktionsanalyse (BamHI and HincII), um anhand des Restriktionsmusters identische Klone zu eliminieren.
Die Klone, die Esterase-Aktivität zeigen, werden nun in 100 ml LB-Amp-Übernacht-Kulturen wachsen gelassen. Nach dem Zellaufschluß wird der Überstand des Zelllysats in Selektivitätstests mit (S)-Linalylacetat eingesetzt. Anschließend erfolgt Analyse der Zelllysate auf SDS- und nativen Polyacrylamid-Gelen.
(S)-Linalylacetat-Selektivitätstests
Zunächst wurde die Aktivität in Hinblick auf rac-Linalylacetat durch TLC (Thin Layer Chromatography) untersucht. Proben, die hier Aktivität zeigten, wurden durch chirale GC-Analyse (Gas Chromatography) untersucht:
rac-Linalylacetat (10 μl) wurde zu 1 ml Zelllysat hinzugegeben und die Mischung wurde bei Raumtemperatur für 16 Stunden mit 180 rpm inkubiert. Die Reaktion wurde mit 1 ml Ethylacetat gestoppt und die organische Phase wurde mit 16 ml Ethylacetat extrahiert. Nach Trocknen des Extraktes mit Na₂SO₄ wurde die organsiche Phase durch einen Rotationsverdampfer abgetrennt. Der verbliebene Rest wurde in Ethylacetat gelost und die Enantiomerenverteilung des gebildeten Linalools wurde durch GC analysiert (Varian Instruments, CHROMPACK CHIRASILDEX-Säule, isotherm bei 87°C, 0.5 bar H₂) mit ^®-Linalool (Fluka) als Referenz.
k) Subklonierung
Der Zweck der Subklonierung war die Reduktion der Insert-Größe der Klone der genomischen Bibliothek (durchschnittliche Insert-Größe 6 kb) auf 3 kb.
4 zeigt den experimentellen Ansatz zur Durchführung dieses Experimentes. Ein (S)-Linalylacetat-selektiver Klon aus der Bibliothek (der Klon pBSG25) wurde teilweise mit Sau3AI verdaut, wie zuvor beschrieben. DNA-Fragmente mit einer Größe von 1 bis 3 kb wurden aus dem präparativen Gel herausgeschnitten und die DNA wurde mit dem QIAEX II Kit von Qiagen extrahiert.
Die erhaltenen Fragmente wurden anschließend in den Vektor pBluescript SKII(–) kloniert bei einem Vektor:Fragment-Verhältnis von 1:1. Nach der Ligation bei Raumtemperatur für 3 Stunden wurden 10 μl der Liagtionsmischung in E. coli XL1 Blue-Zellen transformiert (SEM-Transformation).
Klone mit Esterase-Aktivität wurden durch ein Screening mit α-Naphthylacetat (wie zuvor beschrieben) selektiert und identische Klone wurden durch Restriktionsanalyse eliminiert (BamHI, EcoRI, HincII).
Schließlich wurden 8 selektierte Klone über Nacht in 100 ml LB-Amp-Medium kultiviert. Die Zellen wurden durch Sonifikation aufgeschlossen und die erhaltenen Lysate wurden ultrazentrifugiert. Die Überstand-Fraktionen wurden auf (S)-Enantioselektivität hin untersucht. Die selektierten Klone wurden als Glycerin-Stocks bei –70°C gelagert.
l) Sequenzierung des Inserts der Subklons pBSS12
Das 3.5 kb-Insert des Subklons pBSS12 wurde mit den in der Tabelle 1 angegebenen Primern sequenziert. Die Sequenzen wurden unter Verwendung der Seq Ed^TM-Software (Applied Biosystems, Version 1.0.3) auf einem Macintosh-Computer editiert. Tabelle 1: Primer für die Sequenzierung

*: Sequenzierung mit diesem Primer führte zu keiner lesbaren Sequenz
m) Konstruktion und Expression des Überexpressionsklons pMSRu1
Wie 5 zu entnehmen wurde das Esterase-Gen (estA) aus dem pBSS12-Konstrukt auf folgende Weise durch PCR amplifiziert:
Template-DNA (30 ng, isoliert mit dem Nucleobond Plasmid-Midiprep-Kit), Primer 1 (93 ng), Primer 2 (87 ng), dNTPs (10 mM; 1 μl), Incubation Mix (10×; 5 μl) sowie bidest. H₂O wurden miteinander vermischt unter Einstellen eines Gesamtvolumens von 50 μl. „Hot start” erfolgte durch Zugabe von 0,5 μl Taq Polymerase (5 U/μl). Folgendes Thermocycler-Programm kam zur Anwendung: 98°C 3 min//30×: 98°C 45 sec/62°C 45 sec/72°C 1 min//72°C 2 min.
Das gesamte Reaktionsvolumen von 50 μl wurde auf ein präparatives Agarosegel geladen. Nach der Gelelektrophorese bei 60 V wurde die DNA-Bande ausgeschnitten (1 kb) und die DNA unter Verwendung des Qiaex Gel Extraction-Kit isoliert und gereinigt.
Durch Verdau der Fragment-Enden mit NdeI und SphI wurden sticky ends für die Ligation in den Überexpressionsvektor pMS470Δ8 generiert. Danach wurde die DNA mit Ethanol gefällt und in Wasser gelöst.
Zur Vorbereitung des Vektors wurde das Plasmid pMS470Δ8 mit NdeI und SphI verdaut und das Platzhalterfragment (stuffer fragment) wurde durch Trennung auf einem Agarosegel und nachfolgender Isolierung und Reinigung mit dem Qiaex Gel Extraction-Kit entfernt.
Das wie oben beschrieben vorbereitete PCR-Fragment wurde bei Raumtemperatur in den wie oben beschrieben vorbereiteten Vektor ligiert. Die Reaktion wurde für drei Stunden ausgeführt. Das Verhältnis Vektor:Fragment betrug 1:1 (100 ng Vector 4 kb, 25 ng Fragment 1 kb). Zur Transformation von kompententen E. coli XL1 Blue-Zellen wurden diese mit 10 μl der Ligationsmischung inkubiert. 100 μl dieser Zellen wurden anschließend auf 2 Agar-Platten ausplattiert. Eine Serie von Transformanten wurde auf Esterase-Aktivität hin untersucht. Positive Klone wurden durch Restriktionsanalyse untersucht und ein passender Klon ausgesucht.
Der auf diese Weise erhaltene Klon wurde pMSRu1 genannt. Um die Sequenz des estA-Gens des Plasmids pMSRu1 mit der Originalsequenz des Subklons pBSS12 zu vergleichen, wurde das Insert des Plasmids pMSRu1 sequenziert. Hierzu wurde zunächst die Plasmid-DNA unter Verwendung des Nucleobond AX-100-Kit isoliert. Die Primer Tac stop, S12b1, S12b2, S12b4 und pMSRu1b4a wurden für die Sequenzierung verwendet (Tabelle 1).
Das Plasmid pMSRu1 wurde anschließend auch in E. coli BL21-Zellen transformiert. Beide pMSRu1-Klone (XL1 Blue und BL21) wurden vorzugsweise über Nacht in 3 ml LB-Amp-Medium kultiviert, mit flüssigem Stickstoff eingefroren (300 μl Kultur + 100 μl 80% Glycerin) und bei –70°C aufbewahrt.
n) Expressionsstudien mit dem Klon pMS Ru1
Mit den E. coli XL1 Blue (pMSRu1)- und BL21 (pMSRu1)-Klonen wurden Fermentationen bei verschiedenen Temperaturen, mit und ohne Induktion der Expression (IPTG: 0,1 mM finale Konzentration) und bei unterschiedlichen Induktionszeiten durchgeführt.
Die Zellen wurden geerntet und wie zuvor beschrieben aufgeschlossen. Die Zelllysate wurden auf SDS- und nativen Gelen analysiert und auf (S)-Linalyl-acetat aktivität hin untersucht.
Zelllysate von E. coli XL1 Blue mit dem Plasmid pMS470Δ8 wurden als Negativ-Kontrolle für alle Aktivitätstests und bei der Polyacrylamid-Gelelektrophorese verwendet.
o) Linaloylacetat-Mikrotiter-Platten-Test
Um über einen schnellen Reaktivitätstest für das Substrat rac-Linaloyl-acetat zu verfügen, wurden ein Microtiter-Platten- und ein Filterpapier-Test entwickelt. Diese Tests basieren auf der Detektion einer mit der Ester-Hydrolyse verbundenen Verschiebung des pH-Werts mittels eines pH-Indikators (Schlacher et al., 1998). Als Indikator wurde Lackmus (Aldrich) verwendet. Die optimale Zusammensetzung für die Lackmus-Substrat-Lösung wurde eingestellt, indem 5 ml 10 g/l Lackmus-Lösung in H₂O, 3 ml rac-Linaloyl-acetat (Aldrich, 5% (v/v) in 70% Ethanol) und 0,8 ml 10% Triton X-100 (Amresco) miteinander gemischt wurden.
Im Mikrotiter-Platten-Assay wurden 50 μl der Substrat-Indikator-Lösung mit 10–50 μl Zelllysat oder Zellsuspension gemischt. Die Farbänderung konnte bei Raumtemperatur nach 10–15 Minuten beobachtet werden. Für das Screening von Kolonien auf Agar-Platten wurde ein Whatman-Filterpapier auf die Platten gegeben und für 15 Minuten getrocknet. Danach wurde es mit der Substrat-Lackmus-Lösung vollgesaugt und die Farbe änderte sich in Anwesenheit eines positiven Klons innerhalb von 10–15 Minuten von blau nach rot.
Durch Vergleich der Enzymaktivität zum einen mit reinem (R)-Linalyl-acetat, zum anderen mit dem Racemat konnten Informationen über die Enantioselektivität des Enzyms erhalten werden.
p) o-Nitrophenylacetat-Aktivitätstest
Enzymaktivitäten und spezifische Aktivitäten wurden durch Hydrolyse von o-Nitrophenylacetat (SIGMA^®) ermittelt. Die Bildung von Nitrophenol konnte mit einem Spektrophotometer bei 405 nm gemessen werden.
Zur Durchführung des Aktivitätstests wurden Substrat-Stammlösung (84 μg o-Nitrophenyl-acetat, gelost in 916 μl DMSO), 980 μl 0,1 M Tris-HCl-Puffer (pH 7.0), 10 μl Substrat sowie 10 μl Enzym (verdünnt in 0.1 M Tris-Puffer pH 7.0) zunächst in einem Eppendorf-Gefäß gemischt und dann in eine Küvette gegeben. Der Nullpunkt (Autozero) wurde mit einer Lösung aus 10 μl Substrat und 990 μl Puffer festgelegt. Die Reaktionskurven wurden bei 25°C für 10 Minuten aufgenommen (in 30 sec-Intervallen). Die Steigung (ΔE/min) wurde mit der Spektrophotometer-Software (Perkin Elmer, Lambda Bio) berechnet. Die Absorptionskurve der Referenz-Lösung wurde von der Steigung der Absorptionskurven der Reaktions-Lösungen abgezogen. Die Enzym-Aktivität wurde mit der folgenden Formel berechnet:
Der Extinktionskoeffizient ε (selbst ermittelt) für o-Nitrophenol beträgt 2.4 [I·mmol^–1·cm^–1]. Zur Berechnung der spezifischen Aktivität [U/mg Gesamtprotein] des Enzyms wurde der Wert für die Aktivität [U/ml] durch die Proteinkonzentration [mg/ml] geteilt.
q) Gaschromatographie (GC) und HPLC
Die Umsetzungen für das GC/HPLC-Screening wurden in 5 ml 0,1 M NaH₂PO₄ (pH 7,3) durchgeführt. Zu dem Puffer wurden 250 μl Enzym und anschließend 100 μl Substrat hinzugegeben. Als Substrat wurden 2-Phenyl-2-hexyl-acetat (Essigsäure-(2-Phenyl-2-butyl-ester)) sowie 2-Phenyl-2-butyl-acetat (Essigsäure-(2-Phenyl-2-hexyl-ester)) eingesetzt. Als Negativkontrolle wurde Puffer mit Substrat sowie Puffer mit Enzym eingesetzt. Die Reaktionsansätze wurden bei 25°C mit 150 rpm inkubiert. Nach 2, 5 und ca. 24 Stunden wurden Proben entnommen.
Zur Aufarbeitung der Proben wurde 1 ml Probe mit 0,5 ml CH₂Cl₂ extrahiert, die erhaltene Mischung 2 Minuten mit 12000 rpm zentrifugiert und anschließend wurde die organische von der wässrigen Phase getrennt. Zu der organischen Phase wurden weitere 0,5 ml CH₂Cl₂ hinzugegeben und anschließend wurde die organische Phase mittels Na₂SO₄ getrocknet und mittels HPLC-Filter filtriert. Nachdem das Lösungsmittel abgezogen worden war, fiel im Falle der Probe, bei der 2-Phenyl-2-hexyl-acetat als Substrat eingesetzt worden war, ein weißer Niederschlag aus, der sich im Laufmittel (Heptan:iso-Propanol – 90:10) nicht löste. Deshalb wurden zusätzlich zum Laufmittel 400 μl CH₂Cl₂ hinzugegeben, um den Niederschlag in Lösung zu bringen.
Für die HPLC wurde eine ChiraCel OJ-Säule eingesetzt. Es wurde eine Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min gewählt. Die Absorption wurde bei 254 nm gemessen, es wurde eine Temperatur von 25°C vorgegeben. Als Fließmittel wurde eine Mischung aus Heptan und Isopropanol eingesetzt. Zunächst wurde Heptan:Isopropanol im Verhältnis 95:5 vorgegeben. Nach 5 Minuten wurde ein Verhältnis Heptan:Isopropanol 85:15 vorgegeben, dieses wurde 20 Minuten konstant gehalten und anschließend wurde wieder ein Verhältnis von 95:5 eingestellt.
r) Bestimmung der Proteinkonzentration
Die Konzentration an Gesamtprotein wurde mit der Methode nach Bradford (1976) bestimmt, unter Verwendung des Bio-Rad Protein Assay.
Hierzu wurden 600 μl verdünntes Enzym (Verdünnungs-Faktor F) und 150 μl Bio-Rad-Reagens miteinander gemischt und für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend erfolgte Absorptionsmessung (E) bei 595 nm (Beckman Spektrometer).
Als Referenz (Autozero) wurde eine Mischung aus 600 μl Puffer und 150 μl Bio-Rad-Reagens verwendet. Die Enzymkonzentration wurde wie folgt berechnet.
s) Zufallsmutagenese durch modifizierte PCR
Aufgabe des Mutagenese-Experimentes war die Verbesserung der Enantioselektivität und der Stabilität des Enzyms EstA, das durch den Klon pMSRu1 produziert wurde. Der theoretische Hintergrund dieser Methode wurde von Leung et al., 1989, beschrieben. Die Standard-PCR-Bedingungen für die Gen-Amplifikation wurden unter (m) beschrieben. Tabelle 2 zeigt die Bedingungen für die modifizierte PCR. Es wurde dasselbe Temperaturprogramm wie zuvor verwendet. Tabelle 2: PCR-Bedingungen für die Zufallsmutagenese

Bedingung A B C D E F

MnCl₂ [mM] 0 0.2 0.5 1.0 2.0 3.0

MgCl₂ [mM] MgCl₂ [mM] MgCl₂ [mM] MgCl₂ [mM] MgCl₂ [mM] MgCl₂ [mM]

3 3 3 3 - -

5 5 5 5 5 5

7 7 7 7 - -
In der PCR wurden 79 ng Template-DNA (pMSRu1), die Primer 1 (93 ng) und 2 (87 ng) (siehe (m)), 5 μl dNTP (10 mM; 1 mM finale Konzentration), 5 μl Inkubationsmix (10× ; 1× enthält 1,5 mM MgCl₂), MgCl₂ und MnCl₂ wie in Tabelle 2 angegeben sowie 0,7 μl Taq-Polymerase (5 U/μl; hot start) verwendet.
Die in Tabelle 2 aufgeführten PCR-Bedingungen wurden getestet, um das Mutagenese-Experiment zu optimieren. Die präparative PCR wurde durchgeführt mit 5 mM MgCl₂ sowie mit MnCl₂-Konzentrationen wie für A bis F angegeben (Tabelle 5). Die auf diese Weise erhaltenen DNA-Fragmente wurden auf einem 1%-igen Agarose-Gel gereinigt und anschließed wie zuvor beschrieben extrahiert. Nach dem Verdau der Fragment-DNA mit NdeI (NEB) und SphI (MBI Fermentas) in Puffer 2 (NEB) wurden die Nukleinsäuren mit Ethanol gefällt.
Ligation über Nacht wurde bei 16°C durchgeführt bei einem Fragment:Vektor-Verhältnis von 1:1 (100 ng Vektor, 25 ng Fragment; der Vektor pMS470Δ8 wurde zuvor mit NdeI and SphI geschnitten). 2 μl des Ligationsmixes wurden zur Transformation der E. coli XL1 Blue-Zellen nach der SEM-Methode eingesetzt (10 LB-Amp Platten, 100 μl Transformationsmix pro Platte).
Die Mutanten-Bibliotheken wurden erhalten wie zuvor beschrieben. In einem ersten Ansatz wurden die Bibliotheken auf rac-Linalylacetat-Aktivität mittels des zuvor beschriebenen Filtertests untersucht.
Pro PCR-Bedingung wurden 10 Klone ausgewählt und nochmals ausplattiert, um einzelne Kolonien zu erhalten. Anschließend wurde die Plasmid-DNA von 5 positiven Klonen mit der Wizard-Miniprep-Methode isoliert, um die Mutationsrate durch Gensequenzierung zu ermitteln. Der genspezifische Primer 1 wurde hierbei zur partiellen Sequenzierung der Gene verwendet.
Insgesamt wurden 23 ausgewählte Klone in einem weiteren Schritt auf Aktivität in Hiblick auf rac-Linalylacetat und (R)-Linalylacetat untersucht, indem die Zellen in 5 ml LB-Amp-Medium über Nacht bei 37°C wachsen gelassen wurden. 200 μl dieser Kultur wurden in einer Mikrotiterplatte bei 2500 rpm für 10 Minuten zentrifugiert, um die Zellen zu sedimentieren. Nach Dekantieren des Mediums wurden 50 μl Lackmus-Substrat-Lösung hinzugegeben. Die Farbänderung von blau nach rot wurde jede 10 Minuten beobachtet und auf einem Foto festgehalten.
Zur weiteren Untersuchung wurden ausgewählte Mutanten (B2, D1, D4, F3, F5; entsprechend den PCR-Bedingungen B, D oder F) in 250 ml LB-Amp-Kulturen für 11 Stunden (30°C, 120 rpm) entweder unter Induktion oder ohne Induktion der Expression (Induktion mit IPTG nach 5 Stunden) wachsen gelassen. Die Zellen wurden geerntet, aufgeschlossen und wie zuvor beschrieben ultrazentrifugiert. Aliquots (1 ml) jeder Fraktion wurden bei –20°C für weitere Aktivitätstests gelagert. Die Überstand-Fraktionen aller fünf Klone wurden durch SDS-PAGE analysiert. Ganze Zellen, Lysate, Überstand- und Pellet-Fraktionen nach der Ultrazentrifugation wurden in Mikrotiter-Platten-Assays auf Aktivität und Selektivität hin untersucht, indem die Proben (jeweils 50 μl) mit jeweils 50 μl Lackmus-Substrat-Lösung gemischt wurden.
t) Aktivitätstests mit dem Klon pMSRu1 und der Mutante F3
Lysate des Klons E. coli XL1 Blue (pMSRu1)
Überstand-, Pellet- und Lysat-Fraktionen aus einer Fermentation (250 ml LB-Amp-Kulturen, induziert und nicht induziert) wurden auf ihre Aktivität in Hinblick auf o-Nitrophenylacetat hin überprüft, wie zuvor beschrieben. In einem ersten Schritt mussten hierzu die geeigneten Verdünnungen der Fraktionen ermittelt werden.
Vergleich der spezifischen Aktivitäten des Wildtyp-Klons pMSRu1 und derjenigen der Mutante F3
Das Ziel dieses Experimentes war es, herauszufinden, ob die Mutante F3 eine höhere spezifische Aktivität zeigt als der Wildtyp. Hierzu wurden die Überstand-Fraktionen der Fermentationen (250 ml LB-Amp-Kulturen induziert oder nicht induziert) in dem Test auf enzymatische Aktivität verwendet.
Enzymstabilität im Verlaufe der Zeit bei verschiedenen Reaktionsbedingungen
Die Enzymreaktion der rac-Linalylacetat-Hydrolyse-Reaktion wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt, indem 1 ml Überstand-Fraktionen, Rohlysat und nicht aufgeschlossenen Zellen (induziert oder nicht induziert) von pMSRu1 (E. coli XL1 Blue) und Überstand-Fraktionen der Mutante F3 (induziert) mit 10 μl rac-Linalylacetat gemischt und bei 25°C auf einem Eppendorf-Thermomixer mit 700 rpm für 24 Stunden inkubiert wurden. Als Kontrolle wurden Überstand-Fraktionen ohne Substrat unter denselben Bedingungen inkubiert, um Einflüsse des Substrats auf die Enzymstabilität zu beobachten. 10 μl-Proben wurden aus jedem Röhrchen nach 0, 3, 5, 10, 15 und 24 Stunden entnommen, verdünnt und mittels o-Nitrophenylacetat-Aktivitätstests analysiert.
Beeinflussung der Enzymaktivität durch Sonifikation
Frisch kultivierte Zellen (250 mL LB-Amp-Kulturen, induziert) des Klons pMSRu1 (E. coli XL1 Blue) wurden geerntet, in 8 ml 0,1 M Tris-Puffer pH 7.0 resuspendiert und die Suspension zwei gleiche Teile aufgetrennt. Eine Hälfte wurde zum Zellsaufschluß der normalerweise angewendeten Sonifikation unterworfen. Die aufgeschlossenen und nicht aufgeschlossenen Zellen wurden anschließend auf Enzymaktivität hin untersucht.
Beispiel 1: Herstellung einer genomischen Bibliothek von Rhodococcus ruber
Die folgenden DNA-Konzentrationen wurden abgeschätzt:

– pBluescript SKII(–): 3.8 μg/μl
– BamHI-verdauter und dephosphorylierter Vektor: 0.1 μg/μl
– chromosomale DNA: 0.5 μg/μl
– teilweise verdaute chromosomale DNA (Sau3AI): 3–5 kb Fragment (verwendet für die Ligation): ~20 ng/μl, 2–3 kb Fragmente: ~25 ng/μl

Wie im Material und Methoden-Teil beschrieben mußten die optimalen Bedingungen für den teilweisen Verdau der chromosomalen DNA herausgefunden werden. Es wurde vermutet, dass die optimale Enzymkonzentration, um 3–5 kb-Fragmente zu erhalten, bei 0.03 U/μg DNA liegt (6). Für die Präparation im großen Maßstab wurden 1.56 U Sau3AI zu 50 μg DNA hinzugegeben.
Die Transformation von 10 μl Ligationsmix resultierte in einer Anzahl von mehr als 20000 Kolonien (5 Platten, 200 μl Ligationsmix pro Platte, ~6500 Kolonien pro Platte) bei einer Vektor-Religations-Häufigkeit von ~1.4%.
Die gefundene Insert-Größe variierte von 2.5 bis 8 kb. Die benötigte Anzahl an Klonen zum Erhalt einer repräsentativen Gen-Bibliothek wurde mit der unten angegebenen Formel berechnet. Für ein Insert mit einer Größe von 5 kb und einer Genomgröße von ~4000 kb für Rh. ruber (DOGS-Database of Genome Sizes) ergab sich hierbei ein N-Wert von ~3700 Klonen (99% Wahrscheinlichkeit).
Beispiel 2: Screening der genomischen Bibliothek von Rhodococcus ruber
Insgesamt wurden 15000 Klone mit α-Naphthyl-acetat auf Esterase-Aktivität hin untersucht, wobei 25 positive Klone ermittelt werden konnten. Nach der Restriktionsanalyse (7) konnten identische Klone (3/23, 7/8, 10/26, 13/15/19; 14 und 20: linearisiertes Plasmid) eliminiert werden, so dass 18 Klone übrigblieben.
Wie in 8 dargestellt wurden Zelllysate (Überstände) von verschiedenen positiven Klonen durch native PAGE analysiert. Die beiden Banden in der Mitte des Gels repräsentieren unspezifische Esterase-Aktivität, wie sie auch in der E. coli XL1 Blue-Fraktion zu beobachten war.
Der Klon G16 zeigte jedoch eine sehr starke Bande an der Position von einer der E. coli-Banden, wobei die spezifische Linaloylacetat-Esterase-Bande im unteren Bereich des Gels nicht anzutreffen war. Durch Aktivitätsfärbung von nativen Gelen mit α-Naphthylacetat konnten Esterasen, die im Lysat enthalten waren, sichtbar gemacht werden.
Durch einen GC-Selektivitäts-Assay wurde herausgefunden, daß die starke Bande im unteren Bereich des Gels auf die selektive Linalylacetat-Esterase zurückzuführen ist.
Interessanterweise zeigten alle Proben (einschließlich G16) Aktivität in Bezug auf rac-Linalyl-acetat, wie durch Dünnschichtchromatographie (TLC) herausgefunden werden konnte, jedoch zeigten nur zwei der Klone (G11 und G25) Selektivität für das (S)-Enantiomer. Aus diesem Grund wurde die Esterase des Klons G16 nicht weiter untersucht.
Das Bandenmuster der beiden gefundenen selektiven Klone zeigte keinen Unterschied zum Bandenmuster nicht-selektiver Klone. Die stärkeren Banden sowie die Schmier-Banden, wie bspw. in der Spur für den Klon G3, sind auf sehr hohe Proteinkonzentrationen zurückzuführen (8).
Die selektiven Klone G11 und G25 produzierten vergleichsweise niedrige Mengen an Protein. Die Enzymmenge, die von den Klonen produziert wird, könnte die Selektivität der Linalylacetat-Hydrolyse beeinflussen. Der Klon G25 wurde für weitere Untersuchungen ausgewählt.
Beispiel 3: Subklonierung
Plasmid-DNA des genomischen Klons G25 (pBSG25) wurde isoliert (Nucleobond Kit, c = 200 ng/μl) und partiell mit Sau3AI verdaut. Die optimale Enzymkonzentration, um 1–3 kb Fragmente zu erhalten, war 0.03 U Sau3AI/μg DNA.
Nach der Gelextraktion betrugen die DNA-Konzentrationen der Fragmente etwa 20 ng/μl. Der Ligation der Fragmente in den Vektor pBluescript SKII(–) (500 ng Vektor-DNA, 350 ng Fragment-DNA) folgte die Transformation. 20 Esterase-aktive Klone (α-Naphthylacetat) wurden durch Restriktionsanalyse weiter untersucht (9). Die Subklone S1, S6, S7, S9, S12, S16, S17, S19 wurden ausgesucht, da sich die Größe ihrer Inserts zwischen ca. 1 und 2 kb bewegte.
Zelllysate (Überstände) dieser Subklone wurden auf (S)-Selektivität hin untersucht sowie durch native PAGE analysiert (10). Die sehr starke Bande im unteren Bereich des nativen Gels, die in allen Spuren anzutreffen ist, repräsentiert die spezifische Esterase-Aktivität. Der Subklon S17 zeigte zwei Banden, die durch α-Naphthylacetat gefärbt werden konnten.
Dieser Klan könnte zwei Esterasen produzieren, die beide durch das ~6 kb Insert des Klons G25 kodiert werden. Da für die anderen Subklone jeweils nur eine starke Esterase-Bande auf dem nativen Gel beobachtet werden konnte, konnte man davon ausgehen, dass diese jeweils nur ein Gen umfassen, das für eine Esterase kodiert. Ergebnisse von GC-Experimenten sind in Tabelle 3 dargestellt. Alle Klone waren aktiv in Bezug auf Linalylacetat und vier davon zeigten (S)-Selektivität. Die e. e.-Werte (enantiomerer Überschuß) wurden mit der unten angegebenen Gleichung berechnet (Chen, 1982). Wie zuvor erwähnt könnte die Enzymmenge direkt mit den beobachteten e. e.-Werten in Zusammenhang stehen. Die Klone mit den höchsten e. e.-Werten (Subklone S1, S7, S12 und S16) zeigten die schwächsten Esterase-Banden im nativen Gel (10). Die Subklone S6 und S19 produzierten höhere Mengen an Enzym, was jedoch nicht zu einer besseren (S)-Selektivität führte. Tabelle 3: GC-Analyse der enantioselektiven Linalylacetat-Hydrolyse (4 Subklone, Überstandfraktionen)

Subklon e. e [%S]

S1 67

S7 84

S12 84

S16 74
Beispiel 4: Sequenzierung des Klons S12 und Sequenzanalyse
Der sehr selektive Subklon S12 (pBSS12) wurde für die weiteren Untersuchungen ausgesucht. Um Informationen über das Insert und insbesondere über das Esterase-Gen zu erhalten, wurde das 3,5 kb-Insert sequenziert. Die Primer, die für die Sequenzierung verwendet wurden, sind in Tabelle 1 aufgeführt. Die Ergebnisse der Sequenzierung sind in 12–14 dargestellt.
Die erhaltenen Nukleotidsequenzen und die davon abgeleiteten Peptidsequenzen wurden mittels des GCG Softwarepakets (Genetics Computer Group, Wisconsin, USA) analysiert. Es stellte sich heraus, dass die zum T3-Bereich gelegene Region des Inserts eine Teilsequenz eines Aldehyd-Dehydrogenase-Gens enthielt. In 12 ist die 773 Baseneinheiten lange DNA-Sequenz dieser Region dargestellt. Die Sau3AI Restriktionsschnittstelle, an welcher das Insert in den Vektor eingebaut wurde, ist im vorderen Sequenzbereich besonders hervorgehoben.
Durch Homologie-Suche mit dem BLAST-Algorithmus (Vergleich von Aminosäuresequenzen) wurde der Leserahmen 2 dieser Region als C-Terminus eines Aldehyd-Dehydrogenase-Gens identifiziert (s. Tabelle 4). Die abgeleitete Aminosäuresequenz mit dem putativen TGA-Stopp-Codon an der Basenpaar-Position 245 ist in 12 hervorgehoben. Das Insert enthielt nicht den gesamten Open Reading Frame (ORF) des für die Aldehyd-Dehydrogenase kodierenden Gens.
Ein open reading frame (ORF) von 438 Baseneinheiten konnte in 3'-Richtung des Aldehyd-Dehydrogenase-Gens ausfindig gemacht werden mit einer Shine-Dalgarno Sequenz an bp-Position 315, gefolgt von einem Start-ATG an bp-Position 325. Diese Region kodierte für ein Protein mit 145 Aminosäuren, das in einer BLAST-Suche unter Verwendung der default-Parameter sehr geringe Homologie zu einem hypothetischen 24 kDa-Protein YAVH (25% Identität) und einer Malonyl-CoA-Acyl-Carrier-Protein-Transacetylase (29% Identität) zeigte.
Das Gen der Esterase EstA (estA) wurde in dem der T7-Region des Vektors angrenzenden Bereich des 3,5 kb-Inserts lokalisiert (11). Sequenz-Informationen über diesen Bereich sind in 13 dargestellt. Der Leserahmen 2 dieser Sequenz wurde in die Aminosäuresequenz übersetzt. Eine Shine-Dalgarno-Sequenz an bp-Position 529, der ein Start-ATG an bp-Position 530 und ein Stopp-Codon an bp-Position 1475 folgte (in 13 markiert) ergab einen open reading frame (ORF) von 948 bp. Die Sau3AI-Klonierungsstelle, die in 3'-Richtung von TGA (1475 bp) vorliegen sollte, konnte hier nicht gefunden werden, da die Sequenz, die unter Verwendung des Primers T7 erhalten wurde, erst von bp-Position 1494 an lesbar war. Dieser Bereich wurde jedoch nicht weiter bearbeitet, da er von keinem weiteren Interesse war.
Die estA-Gensequenz, die vom 3'5'-Strang des Inserts erhalten wurde, wurde durch Sequenzierung des Komplementärstrangs bestätigt und danach in der Datenbank zur Homologiesuche verwendet (Vergleich von Aminosäuresequenzen). Alle verwendeten reversen Primer sind in Tabelle 1 aufgelistet.

Es konnten Homologien zu anderen bakteriellen und eukaryotischen Esterasesequenzen gefunden werden (Tab. 5). Die 1.2 kb-Lücke zwischen dem Aldehyd-Dehydrogenase-Gen und dem estA-Gen konnte nicht vollständig sequenziert werden, obwohl verschiedene Primer und Annealing-Temperaturen ausprobiert wurden. Eine mögliche Erklärung hierfür könnte die Sekundärstruktur des Inserts in dieser Region sein. Tab. 4: BLAST-Suchergebnisse (NCBI, database: SwissProt; default parameter settings) Aminosäuresequenz der T3 insert side (Leserahmen 2)

Database Similarity Search	% Identität mit der Sequenz des Insert
AldA Mycobacterium tuberculosis	59
hypothetical protein Rv0223c Mycobacterium tuberculosis	48
hypothetical aldehyde dehydrogenase precursor Rhodococcus rhodochrous	50
Putative aldehyde dehydrogenase Streptomyces coelicolor	44
Aldehyde dehydrogenase (NAD(P)+) Saccharomyces cerevisiae	39
Aldehyde dehydrogenase Pichia angusta	34

Tab. 5: BLAST-Suchergebnisse (embnet, database: SwissProt; default parameter settings) EstA-Aminosäuresequenz

Database Similarity Search	% Identität mit der EstA-Sequenz
Lipase 2 Moraxella sp.	25
Arylacetamide Deacetylase Homo sapiens	27
Esterase Acinetobacter calcoaceticus	25
Acetyl esterase Escherichia coli	26
Acetyl hydrolase Streptomyces hygroscopicus	26
Mouse Liver Carboxylesterase Precursor Esterase-31	41

Für den theoretischen isoelektrischen Punkt (pI) der Est4 wurde ein Wert von 4,36 und für das Molekulargewicht (MW) ein Wert von 33596.90 Dalton ermittelt. Die Anzahl der Aminosäuren beträgt 315.
Eine Suche nach Motiven ergab, dass das in der Prosite-Datenbank erfasste „Esterase/Lipase/Thioesterase Active Site Serin Motiv (PS50187) vorhanden ist.
Beispiel 5: Überexpression des Klons pMSRu1
PCR-Amplifikation des Esterasegens (estA) mit dem Konstrukt pBSS12 als Template-DNA und den Primern 1 und 2 (s. Methoden (m)) führte zu einem 1 kb PCR-Fragment. Der Vektor pMS470Δ8 wurde mit NdeI und SphI verdaut, um das 1.4 kb Stuffer-Insert herauszuschneiden. Das resultierende 4 kb-Vektor-Fragment wurde aus dem Gel herausgeschnitten und mit dem Qiaex-Kit (Qiagen, Hilden) extrahiert. Die DNA-Konzentrationen betrugen 10 ng/μl für das PCR-Fragment und 100 ng/μl für den Vektor. Nach der Vektor-Fragment-Ligation und der Transformation in E. coli XL1 Blue, führte das Ausplattieren von 100 μl Zellen zu ~20 Kolonien pro Platte. Fünf Kolonien wurden auf Esterase-Aktivität hin untersucht. Einer von fünf Klonen zeigte hierbei Aktivität mit α-Naphthyl-acetat. Dieser Klon, pMSRu1 genannt (15), wurde in flüssigem LB-Amp-Medium kultiviert (unter induzierenden Bedingungen mit 0.1 mM IPTG), um zu sehen, ob das Expressionssystem funktioniert. Durch Analyse des Überstandes des Lysats der Kultur aus der 10-stündigen Fermentation mittels eines SDS-Gels konnte eine sehr starke Überexpression einer 33 kDa-Bande beobachtet werden (16). Durch Induktion des starken tac-Promoters mittels IPTG (37°C) während der exponentiellen Wachstumsphase konnte eine sehr starke Expression des Esterase-Gens erreicht werden. Die Sequenzierung des kompletten 1 kb-Fragments des Klons pMSRu1 und anschließender Vergleich der Sequenz mit der estA-Sequenz des pBSS12-Inserts bestätigte, dass bei der PCR-Amplifikation des Gens keine Mutationen aufgetreten sind. Die Gen- und Aminosäuresequenz der Esterase EstA sind in 13 und SEQ ID NO. 1 und 2 wiedergegeben.
Beispiel 6: Expressionsstudien mit dem Klon pMSRu1
Expression in E. coli Blue Host Cells bei 30 und 37°C
Der E. coli XL1 Blue-Klon pMSRu1 wurde in 250 ml LB-Amp-Medium wachsen gelassen. In einem Fall wurde IPTG 3 Stunden nach der Animpfung (in der logarithmischen Phase) hinzugegeben. Im zweiten Kolben erfolgte keine Induktion der Expression. Das führte zu unterschiedlicher Expression des Proteins, wie der Abbildung der SDS- sowie nativen Gele zu entnehmen ist. IPTG hatte nicht nur Einfluß auf die Menge des produzierten Enzyms (aufgrund der Induktion des tac-Promotors), sondern hatte ebenso Einfluß auf das Wachstum der Zellen.
Die nicht induzierte Kultur wuchs bis zu einer optischen Dichte (CD) von 2,9, während es bei Zugabe von IPTG zu einer Abnahme der Steigung in der Wachstumskurve kam (17) und sich eine finale CD von 2,7 einstellte.
Die SDS- und nativen Gele der Überstand- und Pellet-Fraktionen sind in den 18 und 19 dargestellt. Eine starke 33 kDa-Überexpressionsbande ist in der ersten Spur des SDS-Gels zu beobachten. Die größte Menge an Enzym wurde in der löslichen Fraktion gefunden. Die Pellet-Fraktionen enthielten keine vergleichbar hohen Mengen an dem 33 kDa-Protein.
Aktivitäts-Gele zeigten Banden im unteren Bereich des Gels, die auf das Enzym zurückzuführen waren. Die Banden traten nicht in der Negativ-Kontrolle auf (E. coli XL1 Blue mit dem Vektor pBluescript ohne Insert). Tab. 6: Ergebnisse des Selektivitätstest mit (S)-Linalylacetat als Substrat (Fermentation bei 37°C; Überstände und Präzipitate des sedimentierten Rohlysats)

Fraktion e. e. [%S]

Überstand (nicht induziert) 43.3

Präzipitat (nicht induziert) 80.9

Überstand (induziert) 25.7

Präzipitat (induziert) 47.7
Selektivitätstest-Ergebnisse der Überstand- und Pellet-Fraktionen sind in Tabelle 9 zusammengestellt. Es wurde hierbei überraschenderweise eine höhere Selektivität in den Pellet-Fraktionen gefunden, obwohl vermutet worden war, dass es sich um eine lösliches Protein handelt.
Gründe hierfür könnten Enzym-stabilisierende Komponenten in der Pellet-Fraktion sein, aber ebenso unvollständiger Zellaufschluß. Aktivität in der Pellet-Fraktion könnte ebenso von nicht aufgeschlossenen Zellen herrühren. Um diese Annahme zu überprüfen, wurden intakte Zellen (37°C, 10 h Fermentation) auf Enantioselektivität hin überprüft.
Für Zellen aus nicht induzierten Kulturen konnte ein e. e.-Wert von 50% gefunden werden, während der Wert für induzierte Zellen viel geringer war (9.8%). Deshalb muß die bessere Selektivität der Pellet-Fraktionen durch andere Faktoren beeinflußt werden, wie etwa Zell-Reste oder Membran-Komponenten, die in die Pellet-Fraktion gekommen waren.
Abgesehen davon war die Selektivität des Enzyms aus nicht-induzierten Zellen bedeutend größer im Vergleich zu Zellen, bei denen Induktion durch Zugabe von IPTG erfolgt war. Eine große Überexpression könnte die korrekte Faltung des Enzyms behindern und hierdurch zu geringerer Enantioselektivität geführt haben. Im folgenden wurde die Fermentation des Klons pMSRu1 in E. coli XL1 Blue-Zellen und Sonifikationseffekte auf die Selektivität des Enzyms untersucht, weil angenommen wurde, daß diese Form des Zellaufschlusses schädlich für das Enzym sein könnte, außer aufgrund der Sonifikation selbst auch aufgrund der hier erfolgenden Erwärmung der Probe. E. coli XL1 Blue-Zellen (mit dem Plasmid pMS470Δ8) wurden als Negativkontrolle verwendet. Diese Zellen zeigten keine Esterase-Aktivität auf mit alpha-Naphthylacetat inkubierten nativen Gelen. Die normale Sonifikationszeit (6 × 20 sec) wurde um bis auf das Zweifache erhöht. Die Muster der SDS-Gel- und der nativen Gel-Banden waren ähnlich für beide Sonifikationbedingungen. Die Pellet-Fraktionen waren inhomogene Suspensionen von Zellresten. Die Menge an Protein, die auf die Gele gegeben wurde, war deshalb nicht in allen Spuren dieselbe.

Wie den Ergebnissen von Selektivitätstests entnommen werden kann (Tabelle 7) führten die für die Sonifikationsexperimente gewählten Bedingungen weder zu einer bedeutenden Zunahme noch zu einer bedeutenden Abnahme der Enantioselektivität der Linalylacetat-Hydrolyse. Die e. e.-Werte waren höher, wenn keine Induktion erfolgte, wie bereits zuvor ausgeführt. Tab. 7: Selektivitätstests mit (S)-Linalylacetat (Fermentation bei 30°C)

Fraktion	e. e. [%S]
S1 Negativkontrolle (nicht induziert)	-
S2 Negativkontrolle (induziert)	-
S3 Standard-Sonifikation (induziert)	14
S4 zweifache Sonifikation (induziert)	6
S5 Standard-Sonifikation (nicht induziert)	55
36 zweifache Sonifikation (nicht induziert)	67

Das Ergebnis der Renaturierung eines SDS-Gels, gefolgt von Aktivitäts-Färbung ist in 22 dargestellt. Die Denaturierung des Proteins war reversibel.
Das renaturierte, Aktivitäts-Coomassie-gefärbte Gel zeigte eine starke Esterase-Überexpressionsbande (33 kDa). Sehr schwache Banden (die oberen beiden Banden) zeigten ebenfalls Aktivität in den Spuren P3 und P4 bei der Aktivitätsfärbung. Diese Banden rühren wahrscheinlich von Protein her, das in der Pellet-Fraktion verblieben war.
E. coli BL 21-Wirtszellen bei 30 und 37°C
Im Vergleich zu E. coli XL1 Blue-Zellen wuchs der BL21-Typ bis zu einer größeren optischen Dichte in derselben vorgegebenen Zeit von 10 Stunden. Es konnten hierbei Temperatureffekte auf das Zellwachstum beobachtet werden (23) Zellen, die bei 37°C heranwuchsen, wuchsen viel schneller in der exponentiellen Phase, die finale OD war aber um eine Einheit geringer als bei 30°C-Kulturen. Höhere Temperaturen erhöhten den Grad der Überexpression der Esterase, was mit einer negativen Auswirkung auf das Zellwachstum verbunden sein könnte. E. coli BL21 erlaubte eine effiziente Überexpression des EstA-Proteins (24) bei 30°C wie auch bei 37°C. Einflüsse der Temperatur auf die Esterase-Expression konnten anhand des Bandenmusters des SDS-Gels nicht festgestellt werden. Die Gesamtaktivität mit alpha-Naphthylacetat (native Gele) und mit Linalylacetat war gut, die Selektivität war jedoch sehr gering (Tabelle 8). Insgesamt waren die e. e.-Werte höher, wenn die Fermentation bei 30°C erfolgte als wenn sie bei 37°C erfolgte.
Größere Überexpression bei 37°C schien negativen Einfluß auf die Selektivität zu haben. Die Temperaturdifferenz zwischen 30°C und 37°C war nicht hoch genung, um den Grad der Induktion in größerem Maße zu beeinflussen.

Deshalb konzentrierten sich die folgenden Experimente auf eine verringerte Expression, um Enzyme mit größerer Substratselektivität zu erhalten. Dies wurde einfach dadurch erreicht, indem bei einer niedrigeren Temperatur (20–22°C) induziert wurde. Tab. 8: Selektivitätstest mit (S)-Linalylacetat

Fraktion	e. e. [%S]
30°C nicht induziert (Überstand)	33
30°C induziert (Überstand)	22
30°C nicht induziert (Pellet)	63
30°C induziert (Pellet)	34
37°C nicht induziert (Überstand)	21
37°C induziert (Überstand)	16
37°C nicht induziert (Pellet)	41
37°C induziert (Pellet)	25

(* die Gesamtkonversionsrate lag unter 50%)

Expression der Esterase bei 22°C
Zellkulturen (250 ml) von E. coli XL1 Blue (pMSRu1)-Zellen wurden mit 25 ml einer Übernacht-Vorkultur (O. D. 1.7) angeimpft und bei 30°C bis zu einer optischen Dichte (595 nm) von ~0.7 wachsen gelassen (ca. 5,5 Stunden). Nach anschließender Induktion mit IPTG wurde die Temperatur auf 22°C gesenkt. Die Zellen wurden zu unterschiedlichen Zeitpunkten, gerechnet ab der Induktion, geerntet, und zwar nach 4,5 Stunden (Kolben 1), 8,5 Stunden (Kolben 2) oder 19,5 Stunden (Kolben 3). Bei Kolben 4 erfolgte keine Induktion, Zell-Ernte erfolgte hier zum selben Zeitpunkt wie bei Kolben 2.

Der Zeitpunkt der Ernte hatte Einfluß auf die Menge an exprimiertem Protein (25), jedoch war die Selektivität des Enzyms davon unbeeinflusst (Tab. 9). Die Aktivität mit dem Substrat rac-Linalylacetat, die in einem Mikrotiter-Platten-Assay gemessen wurde, war für alle vier Proben gut. Die Probe aus dem Kolben 3 zeigte die größte Aktivität, weil die größte Menge an Protein produziert worden war. Die Selektivität der Pellet-Fraktion (P3) war größer als die der korrespondierenden Überstand-Fraktion (S3). Das bestätigte die vorherigen Ergebnisse. Tab. 9: Selektivitätstests mit (S)-Linalylacetat (Zellwachstum nach der Induktion: 1: 4.5 h, 2: 8.5 h, 3: 19.5 h, 4: keine Induktion, Erntezeitpunkt wie 2)

Fraktion	e. e. [%S]
Kolben 1 Überstand	32
Kolben 1 Pellet	sehr geringe Aktivität
Kolben 2 Überstand	18
Kolben 2 Pellet	sehr geringe Aktivität
Kolben 3 Überstand	22
Kolben 3 Pellet	59
Kolben 4 Überstand	28
Kolben 4 Pellet	sehr geringe Aktivität

(* die Gesamtkonversionsrate lag unter 50%)

Im Endeffekt führten die Ergebnisse dieser Experimente zu der Schlußfolgerung, daß die Überexpression der Esterase EstA in hohem Maße bei verschiedenen Wachstumstemperaturen, Induktionszeiten und mit verschiedenen Wirtszellen möglich ist. Sonifikation hatte keinen negativen Einfluß auf die Enzym-Stabilität und zeigte auch keinen Einfluß auf die Selektivität. Eine Zunahme der Selektivität konnte durch Variation der Wachstums- und Aufschlussbedingungen nicht erreicht werden.
Beispiel 7: Ergebnisse der GC/HPLC

Die Ergebnisse zu den GC/HPLC-Untersuchungen mit den Substraten 2-Phenyl-2-hexylacetat und 2-Phenyl-2-butyl-acetat sind in Tab. 10 zusammengestellt. Die angegebenen ee%-Werte beziehen sich zum einen auf den gebildeten Alkohol, zum anderen auf das verbliebene Substrat. Die Ergebnisse zeigen, dass die beiden Substrate sehr gut und mit hoher Selektivität umgesetzt werden. Tabelle 10: Ergebnisse der GC/HPLC-Untersuchungen

Substrat/Probenahme	Umsatz (%)	ee% Alkohol	ee% Substrat
2-Phenyl-2-hexylacetat nach 2, 5 und 24 h	15 (2 h); 42 (5 h); 73 (24 h)	28 (2 h); 47 (5 h); 26 (24 h)	17 (2 h); 46 (5 h); 79 (24 h)
2-Phenyl-butyl-acetat nach 2, 5 und 24 h	23 (2 h); 45 (5 h); 56 (24 h)	63 (2 h); 65 (5 h); 49 (24 h)	19 (2 h); 52 (5 h); 57 (24 h)

Beispiel 8: Zufallsmutagenese
Die Strategie, die gewählt wurde, um die Selektivität und Stabilität der Esterase EstA zu verbessern war Zufallsmutagenese durch modifizierte PCR (Arnold et al., 1999). Die PCR-Amplifikation des estA-Gens wurde bei Konzentrationen von 5 mM MgCl₂ und 0 bis 3,0 mM MnCl₂ durchgeführt.
Die Ergebnisse sind in 26 dargestellt. Aufgrund dieser Ergebnisse wurden die PCR-Bedingungen B, C, D und F (Tabelle 2) für die weiteren Experimente gewählt. Die Anzahl der nach Transformation der Ligationsansätze in E. coli XL1 Blue erhaltenen Transformanten war > 20 000 bei allen vier PCR-Bedingungen. Die Religationsrate lag bei etwa 10%. Für ein Screening nach Klonen mit verbesserter Aktivität auf Linalylacetat wurde die jeweilige Mutantenbibliothek-Zellsuspension geeignet verdünnt und jeweils 100 μl wurden auf LB-Amp-Platten ausplattiert (~300 Kolonien pro Platte).
Etwa 10 positive Klone konnten pro PCR-Bedingung durch das Filterpapier-Screening identifiziert werden. Die Aktivität der positiven Klone wurde in einem weiteren Schritt mittels eines Mikrotiter-Platten-Assays nochmals überprüft, wobei letztlich noch 23 positive Klone übrig blieben.

Sequenzierung von 200 bis 300 Basen der estA-Mutanten mit dem Primer 1 zeigten, dass die ausgewählten PCR-Bedingungen geeignet waren, um Mutationen einzuführen. Die Anzahl an Mutationen, die in den ersten 200 bis 300 Basenpaaren des Gens ausfindig gemacht werden konnten, sind in Tabelle 11 dargestellt. Die Klone B3 und C3 konnten nicht sequenziert werden, möglicherweise aufgrund von Mutationen in der Bindungsregion für den Primer. Tab. 11: Mutationsraten bei den PCR-Bedingungen B, C, D und F (gemäß Tab. 2)

PCR-Bedingung	Anzahl sequenz. Basen	der Mutationen	Basenaustausch
B2	286	0	-
B3	-	-	-
B5	330	1	GΠC
B6	248	0	-
B9	267	1	GΠA
C1	306	0	-
C3	-	-	-
C4	296	1	AΠG
C5	296	0	-
C6	287	0	-
D1	286	2	CΠA (2×)
D2	290	0	-
D3	300	0	-
D5	298	1	GΠA
D6	286	1	AΠG
F1	288	3	CΠT
			AΠG
			T Deletion
F2	300	2	AΠG
			GΠA

Mikrotiter-Platten-Test zur Überprüfung der Selektivität der Mutanten
Im Mikrotiter-Platten-Test wurden zur Bestimmung der Selektivität rac- sowie (R)-Linalylacetat als Substrate eingesetzt. Die 23 selektierten Mutanten wurden bei diesem Test in Form von ganzen Zellen eingesetzt, wobei pMS470Δ8 als Negativkontrolle verwendet wurde. Fast alle der untersuchten Mutanten zeigten hierbei einen dem Wildtyp vergleichbaren Substratumsatz.
Der Vergleich der Aktivität hinsichtlich der beiden eingesetzten Substrate zeigte hierbei, dass die Aktivität mit dem rac-Linalyl-acetat größer war als die mit dem (R)-Substrat. Dies beweist, dass das Enzym das (S)-Enantiomere bevorzugt umsetzt, wie auch bereits in allen vorhergehenden Experimenten beobachtet worden war. Mit der Negativkontrolle konnte keine Aktivität festgestellt werden. Der Wildtyp (pMSRu1) zeigte geringere Aktivität als einige der Mutanten. Allerdings wurden bei diesem Assay die Proteinkonzentrationen außer Acht gelassen, so dass ein Vergleich der spezifischen Aktivitäten nicht durchgeführt werden konnte. Was bei diesem Test deutlich festgestellt werden konnte, war, dass einige Mutanten eine schnellere Farbänderung von blau nach rot mit dem Racemat bewirkten, während das (R)-Substrat sehr viel langsamer zu reagieren schien. Der Klon F3 zeigte eine sehr hohe Aktivität und ebenso bessere Selektivität. Jedoch spalteten die meisten Klone nach 2 Stunden auch das (R)-Substrat, wie am Farbumschlag nach Rot zu erkennen war. Dies ist darauf zurückzuführen, dass das Enzym keine 100%ige Selektivität besitzt. Das (S)-Substrat wurde viel schneller als das enantiomere (R)-Substrat hydrolysiert. Nach 2 Stunden war jedoch auch eine ausreichende Menge an (R)-Substrat hydrolysiert worden, um die Farbe des Indikators zu verändern.
Mutanten mit Mutationen in den Positionen 8 (D4), 10 (F3), 12 (F5), 13 (B2) und 19 (D1) wurden für die weiteren Untersuchungen herangezogen. Die Ergebnisse zur Fermentation dieser Mutanten sind dem in 27 dargestellten SDS-Gel zu entnehmen. Es zeigte sich, dass die Mutanten in vergleichbarer Ausbeute produziert wurden wie der Wildtyp-Klon. Zur Überprüfung der Aktivität und Selektivität wurden erneut Selektivitätstests mit rac- sowie (R)-Linalylacetat als Substrate durchgeführt. Neben ganzen Zellen wurden hierbei auch nach Durchführung eines Zellaufschlusses Überstand- und Pelletfraktionen im Mikrotiter-Platten-Selektivitätstest eingesetzt. Alle 5 Mutanten zeigten hier ein positives Ergebnis, wobei das Ergebnis deutlich besser war, wenn die Proteinexpression mittels IPTG induziert worden war.
Die Mutante F3 zeigte bei den Tests eine vergleichsweise hohe Gesamtaktivität und hohe (S)-Präferenz und wurde daher für weitere Studien ausgewählt. Bei diesem Klon konnte die Farbänderung von blau nach rot nur wenige Sekunden nach der Zugabe der Lackmus-Substrat-Lösung zu den Zellen beobachtet werden. Das 1 kb-Insert dieses Klons F3 wurde unter Verwendung der Primer pMSRu1b4a, S12b1 und Tac stop (Tab. 1) sequenziert. Es enthielt insgesamt 3 Mutationen, eine davon war eine stille Mutation (Tabelle 12). Tab. 12: Sequenzierungsergebnisse der Mutante F3 (mutierte Position: grau unterlegt)

Klon bp-Position Kodon Aminosäure

pMSRu1 Mutante F3 121 121 TGC TAC Cystein Tyrosin

pMSRu1 Mutante F3 475 475 GGC GGT Glycin Glycin

pMSRu1 Mutante F3 634 634 TGG CGG Tryptophan Arginin
Beispiel 9: Aktivitätstests mit dem Klon pMSRu1 und der Mutante F3
Esterase-Aktivität wurde in Lysaten des Klons pMSRu1 (in E. coli XL1 Blue) mit dem Substrat o-Nitrophenylacetat mittels des photometrischen Assays bestimmt. Wie in 28 dargestellt, zeigten die Fraktionen der induzierten Fermentationen eine um ein Vielfaches höhere spezifische Aktivität als die nicht induzierten Proben. Die Induktion führte zu einer Erhöhung der Enzymausbeute um mindestens den Faktor zehn. Es konnte mit diesen quantitativen Analysen somit bestätigt werden, dass die Überstand-Fraktionen den Hauptteil des Enzyms enthielten, jedoch war auch in der Pellet-Fraktion Enzym-Aktivität nachweisbar. Die Aktivität betrug hierbei allerdings nur etwa ein Fünftel der Aktivität der Überstand-Fraktion.
Vergleich der spezifischen Aktivität von Wildtyp-Klon pMSRu1 und Mutante F3
Die Mutante F3 zeigte eine etwa zehnfach höhere spezifische Aktivität im Vergleich zu dem Wildtyp, und zwar sowohl bei der induzierten wie auch bei der nicht-induzierten Fermentation. Die vorher beschriebenen Expressionsstudien zeigten jedoch, dass der Wildtyp-Klon pMSRu1 bei dieser Fermentation geringere Mengen an Enzym produzierte, was einen Vergleich der Enzymaktivitäten erschwert. Die in 29 dargestellten Ergebnisse bestätigten, dass die Induktion auch bei der Mutante F3 zu einer Steigerung der Enzymaktivität in etwa in der gleichen Größenordnung wie beim Wildtyp-Klon führt.
Enzymstabilität im Verlaufe der Zeit bei verschiedenen Reaktionsbedingungen
In den folgenden Experimenten wurde die Enzymstabilität in Gegenwart von rac-Linalylacetat untersucht. Die in 30 dargestellten Ergebnisse führten hierbei zu einer wesentlichen Schlußfolgerung: Inkubation der Enzympräparation mit dem Substrat während eines längeren Zeitraums führte innerhalb der ersten 5 Stunden zu einer Inaktivierung des Enzyms. Da die Aktivität des Enzyms, das unter denselben Bedingungen ohne die Zugabe von Substrat inkubiert worden war, nicht durch die lange Inkubation beeinflusst zu worden schien, scheinen entweder das Substrat (Linalylacetat) oder das Reaktionsprodukt (Linalool) die Enzym-Inaktivierung verursacht zu haben. Die schnellere Aktivitätsabnahme der Proben aus der induzierten Fermentation (30(b)) könnte seine Ursache daher in der Inhibition des Enzyms durch Linalool haben, das hier in sehr viel größeren Mengen gebildet wird als in den Proben aus der nicht-induzierten Fermentation.
Ein Vergleich der Ergebnisse der Überstand-Fraktionen von ganzen und aufgeschlossenen Zellen (Rohlysat, 31) zeigt sehr klar, dass das Enzym stärker stabilisiert wird, wenn Komponenten wie Membranstrukturen und Zellreste aus dem Zellaufschluß anwesend sind. Der nach Ultrazentrifugation erhaltene Überstand war jedoch frei von solchen stabilisierenden Faktoren, was eine mögliche Ursache für die schnellere Inaktivierung darstellt.
Einflluß der Sonifikation auf die enzymatische Aktivität
Der Zellaufschluß zeigte keinen signifikanten Einfluß auf die spezifische Aktivität des Enzyms. In beiden Fällen lag die beobachtete Aktivität des Enzyms zwischen 50 und 60 U/mg Protein. Obwohl die Lysat-Proben während des Sonifikations-Prozesses warm wurden, schien diese Behandlung keine nachweisbare schädliche Wirkung auf das Enzym zu haben.
Literaturverzeichnis

[1] Walker CH, Mackness M. I. Esterases: problems of identification and classification. Biochem Pharma 1983; 32: 3265–9.
[2] Tsujita T, Shirai K, Saito Y, Okuda H. Relationship between lipase and esterase. In Progress in clinical and biological research. 344. Isozymes: structure, function, and use in biology and medicine. 1990; 915–33.
[3] Derewenda ZS, Derewenda U. Relationships among serine hydrolases: evidence for a common structural motif in triacylglyceride lipases and esterases. Biochem Cell Biol 1991; 69: 842–51.
[4] Cygler M, Schrag JD, Sussman JL, Harel M, Silman I, Gentry M, Doctor BP. Relationship between sequence conservation and three-dimensional structure in a large family of esterases, lipases, and related proteins. Protein Sci 1993; 2: 366–82.
[5] Derewenda ZS. Structure and function of lipases. Adv Protein Chem 1994; 45: 1–52.
[6] Brady L, Brzozowski AM, Derewenda ZS, Dodson E, Dodson G, Tolley S, Turkenburg JP, Christiansen L, Huge-Jensen B, Norskov L, Thim L, Menge U. A serine protease triad forms the catalytic center of a triacylglycerol lipase. Nature 1990; 343: 767–70.
[7] Schrag JD, Li Y, Wu S, Cygler M. Ser-His-Glu triad forms the catalytic site of the lipase from Geotrichum candidum. Nature 1991; 351: 761–4.
[8] Hemilä H, Koivula TT, Palva I. Hormone-sensitive lipase is closely related to several bacterial proteins, and distantly related to acetylcholinesterase and lipoprotein lipase: identification of a superfamily of esterases and lipases. Biochim Biophys Acta 1994; 1210: 249–53.
[9] Ward VK, Bonning BC, Huang T, Shiotsuki T, Griffeth VN, Hammock BD. Analysis of the catalytic mechanism of Juvenile hormone esterase by site-directed mutagenesis. Int J Biochem 1992; 24: 1933–41.
[10] Petersen SB, Drablos F. A sequence analysis of lipases, esterases and related proteins. In Wooley P, Petersen SB (eds.) Lipases: Their Structure, Biochemistry and Application. Cambridge University Press, 1994; 23–48.
[11] Hofmann K. Bucher P, Falquet L, Bairoch A. The PROSITE database, its status in 1999 Nucleic Acids Res 1999; 27: 215–9.
[12] Ollis DL, Cheah E, Cygler M, Dijkstra B, Frolow F, Franken SM, Harel M, Remington SJ, Silman I, Schrag J, Sussman JL, Verschueren KHG, Goldman A. The ☐/☐ hydrolase fold. Protein Eng 1992; 5: 197–211.
[13] McKay AM. Microbial carboxylic ester hydrolases (EC 3.1.1.) in food biotechnology. Lett Appl Microbiol 1993; 16: 1–6.
[14] Turner NJ. Recent advances in the use of enzyme-catalyzed reactions in organic synthesis. Natural Product Reports 1994; 11: 1–15.
[15] Azerad R. Application of biocatalysts in organic-synthesis. Bulletin de la Societe Chimique de France 1995; 132: 17–51.
[16] Matsunaga A, Koyama N, Nosoh Y. Purification and properties of esterase from Bacillus stearothermophilus. Arch Biochem Biophys 1974; 160: 504–13.
[17] Meghji K, Ward OP, Araujo A. Production, purification and properties of extracellular carboxyl esterases from Bacillus subtilis NRRL-365. Appl Environ Microbiol 1990; 56: 3735–40.
[18] Schlacher A, Stanzer T, Osprian I, Mischitz M, Klingsbichel F, Faber K, Schwab H. Detection of a new enzyme for stereoselective hydrolysis of linalyl acetate using simple plate assays for the characterization of cloned esterases from Burkholderia gladioli. J Biotechnol 1998; 62: 47–54.
[19] Nishizawa M, Gomi H, Kishimoto F. Purification and some properties of carboxylesterase from Arthrobacter globiformis – stereoselective hydrolysis of ethyl chrysanthemate. Biosci Biotechnol Biochem 1993; 57: 594–8.
[20] Okumura S, Iwai M, Tsujisaka Y. Studies on microbial esterases. 2. Properties and substrate specificities of four esterases from Aspergillus niger NRRL-337. Agric Biol Chem 1983; 47: 1869–72.
[21] Khanh NQ, Ruttkowski E, Leidinger K, Albrecht H, Gottschalk M. Characterization and expression of a genomic pectin methyl esterases – encoding gene in Aspergillus niger. Gene 1991; 106: 71–7.
[22] Sundberg M, Poutanen K, Markkanen P, Linko M. An extracellular esterase of Asperillus awamori. Biotech App Biochem 1990; 12: 670–80.
[23] Koseki T, Furuse S, Iwano K, Sakai H, Matsuzawa H. An Asperillus awamori acetylesterase. Purification of the enzyme, and cloning and sequencing of the gene. J Biochem 1997; 326: 485–90.
[24] Shum AC, Markovetz AJ Specificity and induction of undecyl acetate esterase from Pseudomonas cepacia grown on 2-tridecanone. J Bacteriol 1974; 118: 890–97.
[25] Nakagawa A, Tsujita T, Okuda H. Purification and some properties of intracellular esterse from Pseudomonas fluorescens. J Biochem 1984; 95: 1047–54.
[26] Hong KH, Jang WH, Choi KD, Yoo OJ. Characterization of Pseudomonas fluorescens carboxylesterase: cloning and expression of the esterase gene in Escherichia coli. Agric Biol Chem 1991; 55: 2839–45.
[27] Murase H, Sugihara A, Muro T, Shimada Y, Tominaga Y. Purification and properties of carboxylesterase from Ochrobactrum anthropi. Agric Biol Chem 1991; 55: 2579–84.
[28] Ohloff G, Klein E. Die absolute Konfiguration des Linalools durch Verknüpfung mit dem Pinansystem. Tetrahedron 1962; 18: 37–42.
[29] Okumura S, Iwai M, Tsujisaka Y. Synthesis of various kinds of esters by four microbial lipases. Biochim Biophys Acta 1979; 575: 156–65.
[30] Iwai M, Okumura S, Tsujisaka, Y. Synthesis of terpene alcohol esters by lipase. Agric Biol Chem 1980; 44: 2731–2.
[31] Osprian I, Steinreiber A, Mischitz M, Faber K. Novel bacterial isolates for the resolution of esters of tertiary akohols. Biotech Letters 1996; 18: 1331–4.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Polynukleotid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Polynukleotid mit einer Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID No. 1 oder gemäß SEQ ID No. 3.
Polynukleotid gemäß Anspruch 1, kodierend für ein Enzym mit hydrolytischer Aktivität.
Polynukleotid gemäß Anspruch 2, wobei es sich bei dem Enzym um eine Esterase oder Lipase handelt.
Polynukleotid gemäß Anspruch 3, wobei es sich bei der Esterase um eine Serin-Esterase handelt.
Polynukleotid gemäß Anspruch 3 oder 4, wobei es sich bei der Esterase um die Esterase EstA gemäß SEQ ID No. 2 oder um die Esterase gemäß SEQ ID No. 4 handelt.
Polynukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei es sich bei dem Enzym um ein Enzym mit alpha/beta-Hydrolase-Faltung handelt.
Polynukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Nukleinsäure eine oder mehrere nicht-kodierende Sequenzen umfasst.
Verfahren zur Herstellung und/oder Identifizierung einer Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure chemisch synthetisiert wird und/oder anhand einer Sonde, eines Antikörpers oder eines Hydrolase-Aktivitätstests aus einer Genbank isoliert wird und/oder durch Polymerase-Kettenreaktion und/oder durch Mutagenese-Experimente erhalten wird.
Verfahren nach Anspruch 8, folgende Schritte umfassend: a) eine Nukleinsäure-Bibliothek wird mit einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 kontaktiert, b) eine Nukleinsäure, die mit einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 hybridisiert, wird identifiziert, c) die in Schritt (b) identifizierte Nukleinsäure wird sequenziert.
Verfahren nach Anspruch 8, folgende Schritte umfassend: a) ausgehend von einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 werden Primer hergestellt, b) die Primer gemäß (a) werden verwendet, um in der PCR Nukleinsäuren unbekannter Nukleinsäuresequenz zu amplifizieren, c) die gemäß (b) erhaltenen Nukleinsäuren werden sequenziert.
Verfahren nach Anspruch 8, folgende Schritte umfassend: a) eine Nukleinsäure-Bibliothek wird mit einem Assay, der die Identifikation von Hydrolase-kodierenden Gensequenzen erlaubt, untersucht, b) Hydrolase-positive Klone werden identifiziert und gereinigt, c) die Nukleinsäuren aus den in Schritt (b) identifizierten Klonen werden sequenziert.
Verfahren nach Anspruch 8, folgende Schritte umfassend: a) eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 wird Mutagenese-Experimenten unterworfen, b) die erhaltenen Mutanten werden in einen geeigneten Vektor eingebaut und exprimiert, c) die Expressionsprodukte gemäß (b) werden auf hydrolytische Aktivität hin untersucht, d) die Nukleinsäuren, deren Expressionsprodukte in Schritt (c) hydrolytische Aktivität zeigten, werden sequenziert.
Vektor umfassend eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7.
Wirtszelle, mit Ausnahme embryonaler Stammzellen, enthaltend einen Vektor gemäß Anspruch 13.
Wirtszelle nach Anspruch 14, wobei es sich bei der Wirtszelle um Rhodococcus oder E. coli handelt.