DE4221830A1 - Vektor fuer 26,8-kd nadh-gen, wirt und verwendung - Google Patents

Description

In den letzten Jahren wurde die Entwicklung von auf Enzymen basierenden Sensoren (Biosensoren) mit großem Interesse ver­ folgt (Mosbach 1988; Scheller et al. 1989; Cass 1990). Als Applikationsformen werden oft Enzyme verwendet, welche Re­ doxreaktionen katalysieren. Der Ablauf der Reaktion wird durch Messung der Bildungsrate eines Produkts oder des Ver­ schwindens eines Substrats überwacht. Wenn das Produkt oder Substrat elektroaktiv sind, dann kann ihre Konzentration di­ rekt gemessen werden (Cass 1990). Beispielsweise messen viele Biosensoren den Verbrauch von Sauerstoff oder die Bildung von Wasserstoffperoxid (Mosbach 1988).

Amperometrische Biosensoren für Substrate, die enzymatisch an NAD⁺/NADH gekoppelt sind, haben aufgrund ihrer klinischen und biotechnologischen Relevanz eine beträchtliche Aufmerksamkeit erfahren.

Das Flavoenzym NADH-Oxidase (NADH: Sauerstoff-Oxidoreduktase, Wasserstoffperoxidbildend) katalysiert die Oxidation von re­ duziertem Nikotinamidadenindinukleotid (NADH) in einer Zwei- Elektronen-Reduktion von Sauerstoff zu Wasserstoffperoxid:

NADH+H⁺+O₂ → NAD⁺+H₂O₂

Der Grund für die Anwendung dieses Enzyms in einer amperome­ trischen Enzymelektrode liegt nicht nur in seiner Sensitivi­ tät und Spezifität, sondern in einer effizienten Regeneration (Rezyklierung) von enzymatisch aktivem NAD⁺. Ein Problem bei vielen enzymatischen Redoxprozessen ist der Verbrauch von Co­ substrat in äquimolaren Mengen, wobei ein hoher Verbrauch von teurem Cosubstrat einem ökonomischen Betrieb entgegensteht. Es wurden bisher einige bakterielle NADH-Oxidasen isoliert und charakterisiert. Die NADH-Oxidase aus Streptococcus fae­ calis, welcher aerob wächst, ist ein Flavoprotein, das die direkte Vier-Elektronen-Reduktion von O₂ zu 2 H₂O katalysiert (Hoskins 1962; Schmidt et al. 1986; Ahmed et al. 1989; Ahmed et al. 1990a, 1990b). Dolin (1953, 1955) beschrieb eine NADH- Oxidase aus Streptococcus faecalis-Zellen, die man unter anaeroben Bedingungen aufwachsen ließ. Dieses Enzym kataly­ siert die Reduktion von Sauerstoff zu Wasserstoffperoxid. Zwei andere NADH-Oxidasen wurden beschrieben, die ebenfalls in einer Zwei-Elektronen-Reduktion Wasserstoffperoxid unter Verbrauch von Sauerstoff produzieren (Saecki et al. 1985; Cocco et al. 1988; Mc Neil et al. 1989). Eines dieser Enzyme wurde aus Bacillus megaterium (Saecki et al. 1985), das an­ dere aus dem Thermophilen Thermus aquaticus (Cocco et al. 1988; Mc Neil et al. 1989) isoliert. Die Anwendung von Pro­ teinen aus thermophilen Organismen in Biosensoren ist von speziellem Interesse, da diese eine hohe thermische Stabili­ tät und deshalb eine längere Lebensdauer der Enzymelektrode aufweisen.

Ferner wurde Proteinen aus thermophilen Bakterien insbeson­ dere im Hinblick auf deren strukturelle Erforschung und auf biotechnologische Anwendungen besonderes Interesse zugewandt. Die Klasse Thermus beispielsweise wurde zur Quelle einer Reihe von nützlichen Proteinen, wie zum Beispiel der Taq-Po­ lymerase, die in der Polymerasekettenreaktions-Technologie Anwendung fand (Saiki et al., 1988), sowie der Elongations­ faktor Tu aus Thermus thermophilus HB8 als ein Modell eines Guanosinnukleotid-bindenden Proteins (Peter et al., 1990). Wie haben im vorhergehenden über die Isolierung und enzymati­ sche Charakterisierung einer NADH-Oxidase aus Thermus thermo­ philus HB8 berichtet. Dieses Enzym kann möglicherweise als Biosensor in einer amperometrischen Enzymelektrode angewandt werden. Sein Molekulargewicht und seine Eigenschaften unter­ scheiden sich von dem korrespondierenden Enzym aus Thermus aquaticus YT-1 (Cocco et al., 1988). Die Entwicklung eines effizienten Expressionssystems zusammen mit einer detaillier­ ten genetischen Charakterisierung des NADH-Oxidasegens ist aus mehreren Gründen wichtig:

• (1) Physikalische Studien, wie zum Beispiel NMR-Spektroskopie und Kristallographie, erfordern große Mengen an Protein.
• (2) Ein effizientes überproduzierendes System ist eine not­ wendige Vorbedingung für die biotechnologische Anwendung des Enzyms.
• (3) Eine Mutagenese als Werkzeug zur Verbesserung der enzyma­ tischen Eigenschaften kann an einem klonierten Gen durchge­ führt werden.
• (4) Genetische Analysen könnten die zellulären Funktionen des Enzyms aufdecken und die Frage beantworten, warum die beiden nahe verwandten Bakterienspezies T. thermophilus HB8 und T. aquaticus YT-1 so bemerkenswert unterschiedliche NADH-Oxida­ sen besitzen.

In der hier vorliegenden Erfindung berichten wir über die Identifikation, molekulare Klonierung und Sequenzierung des NADH-Oxidasegens aus Thermus thermophilus HB8 und dessen Ex­ pression in E. coli.

Material und Methoden Materialien

β-NADH, β-NADPH, FAD und FMN waren von Serva (Heidelberg, Deutschland). β-NAD⁺ war von Biomol (Hamburg, Deutschland). ABTS (2,2′-Azino-di-[3-Ethylbenzthiazolinsulfonsäure (6)], Peroxidase aus Meerrettich und DNase Grad I aus bovinem Pan­ kreas wurden von Boehringer (Mannheim, Deutschland) gekauft. Alkoholdehydrogenase wurde von Sigma (Deisenhofen, Deutsch­ land) bezogen. Q Sepharose Fast Flow, Blue Sepharose CL-6B und Sephacryl S200 HR wurden von Pharmacia (Freiburg, Deutschland) erworben. Fractogel EMD SO₃^--650 (M) und Lysozym aus Hühnereiweiß (100 kU/mg) waren von Merck (Darmstadt, Deutschland). Alle anderen verwendeten Chemikalien waren von der bestmöglichen Qualität, die bei Merck (Darmstadt, Deutschland) erworben werden konnte.

Zellkultur

Thermus thermophilus HB 8-Zellen ließ man bis zur mittleren logarithmischen Phase in einem modifizierten Castenholz-Me­ dium (Castenholz 1969) bei 37°C wachsen. Die Kulturen wurden 2,5 Stunden nach Inokulation geerntet, wobei man aus 50 Liter Kulturmedium 100-120 g (Feuchtgewicht) erhielt. Die Zellen wurden sofort bei -70°C eingefroren.

Proteinmessung

Die Proteinkonzentration wurde unter Verwendung des Biorad Microassays (Biorad, München, Deutschland) bestimmt.

Gelelektrophorese

Die SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese wurde unter Verwen­ dung eines homogenen Phastgels (12,5%) und der Phastsystem Trenn- und Färbeeinheit (Pharmacia, Freiburg, Deutschland) durchgeführt. Die Enzymproben wurden mit 2% (w/v) SDS in An­ wesenheit von 5% (v/v) 2-Mercaptoethanol behandelt und 2 Mi­ nuten auf 95°C erhitzt.

Enzyme (Empfehlungen der IUB, 1984)

NADH-Oxidase (EC 1.6.99.3); Restriktionsendonukleasen EcoRI, HindIII, SacI, Sau3A (EC 3.1.21.4); T4-Ligase (EC 6.5.1.1); T4-Polynukleotidkinase (EC 2.7.1.78); alkalische Phosphatase aus Kalbsintestinum (EC 3.1.3.1); Ribonuklease A (EC 3.1.27.5); Lysozym (EC 3.2.1.17); DNAse I (EC 3.1.21.1).

Klonierung, Sequenzierung und Expression des NADH-Oxidasegens

Thermus thermophilus HB8 (ATCC 27634: klassifiziert als ein Stamm von Thermus aquaticus) wurde wie bereits beschrieben aufgezogen (Castenholz 1969). Die Escherichia coli-Stämme HB101 (Boyer und Roulland-Dussoix, 1969) und JM109 (Yanisch- Perron et al., 1985) wurden in Luria-Bertani-Nährmedium kul­ tiviert (Miller, 1972). Eine genomische Bibliothek von Ther­ mus thermophilus HB8 in dem Cosmid pHC79 (Hohn und Collins, 1980) war schon konstruiert worden (Weisshaar und Sprinzl, 1989). Die Plasmide pUC18 (Yanisch-Perron et al., 1985) und pKK223-3 mit dem tac-Promotor (Pharmacia, Schweden) wurden zur Klonierung und Sequenzierung beziehungsweise zur Expres­ sion benutzt.

Genomische DNA wurde aus Thermus thermophilus HB8 nach der Methode von Ausubel et al. (1987) isoliert. Restriktionsen­ zyme und andere DNA-modifizierende Enzyme wurden nach den An­ weisungen der Hersteller (Boehringer Mannheim, Deutschland; Stratagene, USA) verwendet. Kolonie- und Southern-Hybridisie­ rung wurden nach Grunstein und Hogness (1975) beziehungsweise Sambrook et al. (1989) in sechsfach konzentrierter Standard- Kochsalz-Citratlösung und 0,1% SDS bei 72°C durchgeführt. Oligonukleotide, die als Probes eingesetzt wurden, markierten wir mit gamma-[³²P]ATP (3000 Ci/mmol; DuPont, UK) am 5′-Ende unter Verwendung von T4-Polynukleotidkinase. Geschachtelte Deletionen der in pUC18 klonierten DNA-Fragmente wurden mit­ tels Exonuklease III/S1-Nuklease-Behandlung (Henikoff 1984) erzeugt. Die Sequenzierung der resultierenden Fragmente in pUC18 wurde nach der Kettenabbruchmethode (Sanger et al., 1977) unter Verwendung von α-[³⁵S]ATP (500 Ci/mmol; DuPont, UK) und dem T7-Sequenasekit von Pharmacia (Pharmacia, Schwe­ den) durchgeführt. Zur Klonierung des Gens in den Expres­ sionsvektor pKK223-3 wurde die oberhalb des 5′-Endes liegende Sequenz durch Insertion einer zusätzlichen EcoRI-Restrik­ tionsschnittstelle unter Verwendung der PCR modifiziert. Zwei synthetische Oligonukleotid-Primer wurden in der PCR in einem Thermocycler (Perkin-Elmer, USA) verwendet.

Es wurden zwei verschiedene Oligodeoxyribonukleotide als Probes zur Kolonie- und Southern-Hybridisierung hergestellt, basierend auf der N-terminalen Aminosäuresequenz der gerei­ nigten NADH-Oxidase aus Thermus thermophilus HB8 und unter Berücksichtigung der bevorzugten Codonbenutzung bei bekannten Genen dieses Organismus (Kagawa et al., 1984; Bowen et al., 1988; Sato et al., 1988, Kojama und Furukawa, 1990). Deoxy­ inosin wurde bei manchen uneindeutigen Codonpositionen einge­ baut (Ohtsuka et al., 1985). Die Oligonukleotide wurden mit­ tels Phosphoramiditchemie an einer Festphase in einem au­ tomatischen Synthesizer (Modell 381B, Applied Biosystems, UK) hergestellt. Zwei weitere Oligonukleotide wurden als Primer für die PCR synthetisiert.

Zur Expression des NADH-Oxidasegens wurde E. coli JM109, das eines der geeigneten Plasmide enthielt, in 20 ml Luria Bertani-Nährmedium mit 100 µg/ml Ampicillin aufgezogen. Der tac-Promotor wurde mit 1 mM IPTG bei einer OD₆₀₀ von 0,7 in­ duziert. Es wurde nochmals Ampicillin (100 µg/ml) hinzuge­ fügt, um das Plasmid zu selektionieren. Zu analytischen Zwecken wurden die Zellen nach verschiedenen Inkubationszeiten geerntet, wogegen sie bei einer präparativen Isolation drei Stunden nach Induktion gewonnen wurden. Zelluläre Rohextrakte wurden nach Leberman et al. (Leberman et al., 1980) herge­ stellt. Die Überstände der Zellysate wurden mittels 30 Minu­ ten langer Zentrifugation bei 12 000 rpm und 4°C in einer Mi­ krozentrifuge gewonnen. Die Rohextrakte wurden 1 Stunde lang auf 72°C erhitzt. Die denaturierten Proteine wurden durch oben beschriebenes Zentrifugationsverfahren entfernt und mit­ tels SDS-PAGE (Laemmli, 1970) analysiert. Der Überstand wurde in der Weise auf eine Blue Sepharose CL-6B-Affinitätssäule (Pharmacia, Schweden) aufgetragen, wie es bei der Reinigung des Enzyms aus Thermus thermophilus HB8 beschrieben wurde. Das gereinigte Protein wurde wiederum mittels SDS-PAGE analy­ siert.

Die Aktivität der NADH-Oxidase wurde spektrophotometrisch bei 340 nm gemessen. Eine Enzymaktivitätseinheit wurde definiert als 1 µmol oxidiertes NADH min^-1 mg^-1. Die Proteinkonzentra­ tion wurde mit dem Biorad-Assay (Biorad, München, Deutsch­ land) bestimmt.

Abkürzungen

PCR: Polymerase chain reaction=Polymerasekettenreaktion
IPTG: Isopropylthio-β-D-galaktopyranosid

Beschreibung der Abbildungen

Abb. 1 Kationenaustauschchromatographie:
Die Proteinlösung aus dem vorhergehenden Schritt wurde auf eine Fractogel EMD SO₃^--650 (M)-Säule (30×1 cm) aufgetra­ gen, die mit 25 mM Natriumacetat, pH 5,5 äquilibriert worden war. Nach Waschen mit dem selben Puffer wurde die NADH-Oxida­ seaktivität in einem gestuften Gradienten (0-1 M NaCl) mit einer Flußrate von 1 ml/min eluiert. Es wurden Fraktionen von je 4 ml gesammelt.

Abb. 2 Gelfiltrationschromatographie:
Die konzentrierten, die NADH-Oxidaseaktivität enthaltenden Fraktionen aus dem letzten Schritt wurden auf eine Sephacryl S200 HR-Säule (1,6×60 cm) aufgebracht, die mit 50 mM Hepes, pH 7,2 äquilibriert worden war. Das Enzym wurde mit dem sel­ ben Puffer eluiert (Flußrate 0,4 ml/min). Es wurden Fraktio­ nen von je 1 ml gesammelt.

Abb. 3 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese.

Abb. 4 Der Einfluß des pH-Wertes auf die Aktivität der gereinigten NADH-Oxidase aus Thermus thermophilus.
pH 3-5, Citratphosphatpuffer, 50 mM; pH 6-8, Kaliumphos­ phatpuffer, 50 mM; pH 10 und 10,7, Karbonat-Bikarbonatpuffer, 50 mM. Die spezifischen Aktivitäten des Enzyms wurden um den spontanen Abfall der Absorption bei 340 nm korrigiert, der bei saurem pH auftritt.

Abb. 5 Gekoppelte Reaktion von NADH-Oxidase mit Alko­ holdehydrogenase.

Abb. 6 Schematische Wiedergabe des Verfahrens der Sub­ klonierung des nox-Gens und der Sequenzierungsstrategie.

• a) Position und Orientierung des nox-Gens (offener Pfeil), korrespondierend zu der darunter wiedergegebenen Restrik­ tionskarte.
• b) Das 2,2 kb-SacI-Fragment wurde in pUC18 (pTNOX22) klo­ niert. Geschachtelte Deletionen des pTNOX22-Inserts wurden durch Exonuklease III/S1-Nukleasebehandlung erhalten. Als ein Beispiel ist eines der resultierenden Plasmide (pTNOX09), welches als Matrize der Polymerasekettenreaktion verwendet wurde, gezeigt. Die offenen Boxen zeigen die Einsätze der Plasmide pTNOX22 beziehungsweise pTNOX09.
• c) Das Ausmaß der Sequenzierungsreaktionen ist durch Pfeile wiedergegeben.

Abb. 7 Sequenz des die NADH-Oxidase aus Thermus thermo­ philus HB8 kodierenden nox-Gens.

Die von dem Gen abgeleitete Aminosäuresequenz ist im Einbuch­ stabencode unter der Nukleotidsequenz angegeben.

Der unterstrichene Abschnitt bedeutet die Aminosäuresequenz, wie sie durch Sequenzierung der N-terminalen Aminosäuren der gereinigten NADH-Oxidase aus Thermus thermophilus HB8 identi­ fiziert wurde.

Abb. 8 Konstruktion des nox-Expressionsplasmids pTNADOX.
Das subklonierte Plasmid pTNOX09, welches als Matrize für die Polymerasekettenreaktion verwendet wurde, ist im oberen Teil der Abbildung gezeigt. Die Boxen bedeuten die Thermus thermophilus HB8-DNA, wobei die gepunktete Region den Umfang des nox-Gens zeigt. Die Linie repräsentiert den pUC18- Abschnitt von pTHNOX09. Die Lokalisation der zur PCR verwende­ ten Primer ist durch gestreifte Pfeile wiedergegeben, und de­ ren Sequenzen sind darunter angegeben. Die unterstrichenen Basen spezifizieren die EcoRI-Restriktionsschnittstelle, die durch PCR eingefügt wurde. Das amplifizierte Produkt und der Expressionsvektor pKK223-3 wurden mit EcoRI und HindIII hydrolysiert und nachfolgend ligiert. Das resultierende Plas­ mid pTNADOX ist im unteren Teil der Abbildung gezeigt, wobei der gepunktete Pfeil, die ausgefüllte Box und der offene Pfeil das nox-Gen, den tac-Promotor beziehungsweise das β- Lactamasegen repräsentieren.

Abb. 9 SDS-PAGE der gereinigten NADH-Oxidase aus E. coli.

• a) Molekulargewichtsmarkerproteine (Pharmacia, Schweden)
• b) Zellulärer Rohextrakt aus E. coli JM109 [pTNADOX]
• c) Überstand nach einstündiger Behandlung des Rohextrakts bei 75°C
• d) Nach Reinigung des hitzebehandelten Überstands mittels Blue Sepharose CL-6B-Affinitätschromatographie

Eingehende Beschreibung der Erfindung Reinigung der NADH-Oxidase aus Thermus thermophilus Herstellung eines groben Extrakts

90 g Zellen (Feuchtgewicht) wurden zweimal mit 50 mM Tris/HCl, pH 7,5 (20°C), das 5 mM EDTA, 1 mM 2-Mercaptoethanol, 100 µM Phenylmethansulfonylfluorid und 5% (v/v) Glycerol enthielt, gewaschen und in 350 ml des selben Puffers suspendiert. 30 mg Lysozym wurden hinzugefügt und die Suspension wurde zwei Stunden bei 4°C gerührt. Die resultie­ rende, Sphäroblasten enthaltende Lösung wurde auf 25 mM MgCl₂ eingestellt, 2,5 mg DNase I zugefügt und 20 Minuten lang bei 4°C gerührt. Ein vollständiger Zellaufschluß wurde mittels Stickstoff-Dekompression unter Verwendung einer Zellzerklei­ nerungsbombe (Parr, Instrument Co., Moline, USA) erreicht. Um Zelltrümmer zu entfernen, wurde das Homogenat mit 20 000×g 30 Minuten lang bei 4°C und anschließend mit 100 000×g 3 Stunden zentrifugiert.

Anionenaustauschchromatographie

Nach der Zentrifugation wurde der klare Überstand auf eine Q Sepharose Fast Flow-Säule (XK 50/100, Volumen 1000 ml, Phar­ macia) gegeben, die mit 50 mM Tris/HCl, pH 7,5 (20°C), 10 mM MgCl₂, 1 mM 2-Mercaptoethanol, 20 µM Phenylmethansulfonyl­ fluorid und 5% (v/v) Glycerol äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit dem selben Puffer bei einer Flußrate von 170 ml/h gewaschen. Eine große Menge Protein wurde von der Q Se­ pharose Fast Flow-Säule zurückgehalten, während das Enzym nicht an die Säule band.

Bestimmung der Enzymaktivität

Zur Bestimmung der spezifischen Aktivität wurde eine geeignete Menge NADH-Oxidase in 50 µl Volumen, in dem 1 mM FAD oder FMN enthalten waren, 5 Minuten lang bei Raumtemperatur vorinku­ biert. 0,9 ml 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,2) wurden zu der Vorinkubationsmischung gegeben und die Reaktion durch Hinzufügen von 50 µl 3,6 mM β-NADH-Lösung gestartet. Die Oxi­ dation von NADH wurde durch Messung der initialen Abnahmerate der Absorption bei 340 nm unter Verwendung eines Absorptions­ koeffizienten von 6,22×10⁶ M^-1 cm^-1 (Shimadzu Spektrophoto­ meter UV-160, Japan) bestimmt. Eine Enzymaktivitätseinheit ist definiert als 1 µmol oxidiertes NADH×min^-1/mg Protein (Cocco et al. 1988). Die Bildung von Wasserstoffperoxid wurde durch Zugabe von 100 µl 20 mM ABTS und 20 U Meerrettichpero­ xidase zu 1 ml der Enzymassaymischung bestimmt. Der Sauer­ stoffverbrauch wurde mittels einer Clark-Sauerstoffelektrode gemessen.

Affinitätschromatographie

Der Durchbruch der Anionenaustauschchromatographie wurde di­ rekt auf eine Blue Sepharose CL-6B-Säule (18×2 cm) gegeben. Die Säule wurde mit 50 mM Hepes pH 7,2 gewaschen und das En­ zym wurde mit dem selben Puffer, der 1 mM NADH enthielt, bei einer Flußrate von 40 ml/h eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden vereinigt und gegen 25 mM Natriumacetat pH 5,5 dialy­ siert.

Kationenaustauschchromatographie

Nach einer kurzen Zentrifugation der dialysierten Proteinlö­ sung aus dem vorhergehenden Schritt wurde der Überstand auf eine Fractogel EMD SO₃^--650 (M)-Säule (30×1 cm) aufgetra­ gen, die in das FPLC-System von Pharmacia (Freiburg, Deutsch­ land) eingebaut worden war. Die Säule wurde mit 25 mM Natri­ umacetat, pH 5,5 bei einer Flußrate von 1 ml/min gewaschen und das Enzym wurde in einem gestuften Gradienten bei 350 mM NaCl eluiert (Abb. 1).

Gelfiltrationschromatographie

Zur endgültigen Reinigung (Abb. 2) wurden die konzen­ trierten aktiven Fraktionen aus dem letzten Schritt auf eine Sephacryl S200 HR-Säule (1,6×60 cm) aufgebracht, die mit 50 mM Hepes, pH 7,2 äquilibriert worden war, und das Enzym wurde mit dem selben Puffer eluiert (Flußrate 0,4 ml/min).

Die fortschreitende Reinigung der NADH-Oxidase ist in Tabelle 1 zusammengefaßt. Eine SDS-PAGE-Analyse der einzelnen Reini­ gungsschritte ist in Abb. 3 gezeigt. Die elektrophoreti­ sche Reinheit des Enzyms wurde durch Silberfärbung des SDS- Polyacrylamidgels überprüft (Abb. 3, Spur 6).

Die isokratische Elution der NADH-Oxidaseaktivität von der Anionenaustauschsäule und die direkte Auftragung des Durch­ bruchs auf die Blue Sepharose CL-6B-Affinitätssäule in einem Schritt erlaubten uns, das Prozedere zu vereinfachen und die Reinigungszeit zu verkürzen. Triazinfarbstoffe haben sich als sehr nützlich insbesondere für die Isolierung von NAD⁺-abhän­ gigen Enzymen erwiesen. Ebenso wurden zur Isolierung von NADH-Oxidasen Farbmatrices verwendet (Schmidt et al. 1986, Ahmed et al. 1990). Unsere NADH-Oxidaseaktivität war voll­ ständig an die Blue Sepharose-Affinitätssäule gebunden und konnte quantitativ mit 1 mM NADH, das dem Puffer zugefügt worden war, eluiert werden (Tabelle 1). Es gelang uns nicht, das Enzym mit 1 mM FAD zu rechromatographieren und zu eluie­ ren (Daten nicht gezeigt), was im Fall der NADH-Oxidase aus Streptococcus faecalis (Schmidt et al. 1986) möglich gewesen war. Jedoch gelang die Isolierung der NADH-Oxidase mittels Affinitätschromatographie auf einer 5′AMP-Sepharose 4B (Pharmacia, Freiburg, Deutschland), und die enzymatische Ak­ tivität konnte mit 10 mM AMP eluiert werden (Daten nicht ge­ zeigt), was auch bei der Isolierung von NADH-Oxidase aus Ba­ cillus megaterium (Saeki et al. 1985) und Thermus aquaticus (Cocco et al. 1988) möglich gewesen war. Im Anschluß an die nachfolgenden Kationenaustauschchromatographie- und Gelfil­ trationsschritte war die NADH-Oxidase homogen, wie Abb. 3 zeigt. Diese Enzympräparation wurde für die nachfolgenden Experimente verwendet.

Eigenschaften der isolierten NADH-Oxidase aus Thermus thermophilus Molekulargewicht des Enzyms

Das scheinbare Molekulargewicht des gereinigten Enzyms, das mittels SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese bestimmt wurde, betrug 25 kD. Eine Gelchromatographie auf Sephacryl S200 HR, kalibriert mit globulären Proteinen bekannten Molekularge­ wichts, wies auf ein scheinbares Molekulargewicht von 15 kD hin. Das Enzym scheint also ein Monomer zu sein.

Eine Sequenzanalyse der 30 N-terminalen Aminosäuren des gereinigten Enzyms (Daten nicht gezeigt) ergab keine signi­ fikante Homologie mit einer der Proteinsequenzen aus der Gen­ mon Data Base (Braunschweig, Deutschland).

Katalytische Eigenschaften der NADH-Oxidase Cofaktoranalyse und Substratspezifität

β-NADH konnte mit dem Enzym unter Verbrauch von Sauerstoff und der Bildung von H₂O₂ oxidiert werden. Allerdings zeigte die NADH-Oxidase keinerlei meßbare Aktivität mit β-NADPH (Tabelle 2). In Abwesenheit von FAD oder FMN wurde weder die Oxidation von NADH noch die Bildung von H₂O₂ beobachtet. Es ergaben sich keine bemerkenswerten Unterschiede im Hinblick auf die Enzymaktivität, wenn FAD durch FMN ersetzt wurde (Tabelle 2).

Abhängigkeit der Enzymaktivität vom pH

Die pH-Aktivitätskurve des gereinigten Enzyms (Abb. 4) zeigte die Abhängigkeit der spezifischen Aktivität vom pH- Wert, mit einem Optimum bei etwa pH 5. Die enzymatische Akti­ vität wuchs mit steigender Temperatur. Dies wurde bis zu 50°C gemessen (Daten nicht gezeigt). Bei 4°C war das Enzym für mindestens 3 Monate vollständig stabil.

Gekoppelte Reaktion der gereinigten NADH-Oxidase mit Alkohol­ dehydrogenase

Um eine mögliche Wiedergewinnung des Cofaktors NAD⁺ zu zeigen (Abb. 5), haben wir eine gekoppelte Reaktion der NADH- Oxidase mit Alkoholdehydrogenase nach Mc Neil et al. (1989) durchgeführt. Es wurde die Bildung von H₂O₂ in der gekoppel­ ten Enzymreaktion gemessen, nachdem β-NADH in einer Konzen­ tration von 3,15 mM und 8 U Alkoholdehydrogenase aus Hefe zu einer vorinkubierten NADH-Oxidasemischung ohne zugesetztes β- NADH zugegeben worden waren. Es zeigte sich, daß NADH, wel­ ches während der Reaktion der Alkoholdehydrogenase gebildet worden war, als ein Substrat der NADH-Oxidase wiederverwendet werden konnte.

Klonierung des NADH-Oxidasegens und Bestimmung der Nukleotid­ sequenz

Nach der N-terminalen Aminosäuresequenz der gereinigten NADH- Oxidase wurden zwei verschiedene synthetische Oligonukleotide hergestellt

(26-mer, 5′-CICTT(GC)AI(GC)GC(GC)GC(GC)GTCTT(GC)GCGTC-3′;
35-mer, 5′-GTCTT(GC)GCGTC(GC)AI(GC)AC(GC)GG(GC)AI(GC)GT(GC)GCCTCCAT -3′:
Die unterstrichenen Nukleotide bezeichnen eine ge­ mischte Position).

Diese wurden als Probes zur Koloniehybri­ disierung beim Screening einer genomischen Bibliothek verwen­ det, die 256 rekombinante Cosmidklone umfaßte. Ein 2,2 kb- SacI-Fragment aus einem der Cosmidklone, welches mit beiden Sonden hybridisierte, wurde mit dem Klonierungs- und Sequenzierungsvektor pUC18 in E. coli JM109 kloniert und pTNOX22 erhalten (Abb. 6). Weiter wurde gesichert, daß ein 2,2 kb-SacI-Fragment aus der genomischen DNA aus Thermus thermophilus HB8 mit denselben Probes in einem Southern- Hybridisierungsexperiment hybridisierte (Ergebnisse nicht ge­ zeigt). Zur Sequenzierung des Fragments wurden geschachtelte Deletionen in beiden Richtungen des Fragments durch Exonu­ lease III/S1-Nuklease-Behandlung erzeugt. Nochmals wurde eine Southern-Hybridisierung mit diesen deletierten Klonen durchgeführt, um das 5′-Ende des Gens auf dem 2,2 kb-SacI- Fragment zu lokalisieren (Ergebnisse nicht gezeigt). Insge­ samt wurde eine 1125 bp lange Nukleotid-sequenz auf beiden Strängen bestimmt. Die N-terminale Sequenz der 32 Aminosäu­ ren, die von dem gereinigten Enzym durch Sequenzierung erhal­ ten worden war, korrelierte mit einem 747 bp langen offenen Leserahmen, der ein Protein von 248 Aminosäuren (M_r=26 870; Abb. 7) innerhalb der bestimmten Sequenz kodierte. Wie später festgestellt wurde, repräsentiert dieser offene Le­ serahmen das NADH-Oxidasegen, welches als nox bezeichnet wurde. Die Aminosäurezusammensetzung der NADH-Oxidase wurde von dem nox-Gen abgeleitet und ist in Tabelle 3 wiedergege­ ben. Das Molekulargewicht von etwa 27 kD stimmt mit dem Wert überein, der durch SDS-PAGE des gereinigten Enzyms aus Ther­ mus thermophilus HB8 bestimmt wurde (M_r=25 000), aber er un­ terscheidet sich von dem Molekulargewicht von 110 kD, welches für die dimere NADH-Oxidase aus Thermus aquaticus YT-1 ange­ geben wurde (Cocco et al., 1988). Es wurde keine signifikante Homologie der NADH-Oxidasesequenz mit bekannten Sequenzen von Proteinen in der GenEMBL und NBRF-Datenbank gefunden. Ta­ belle 4 zeigt die Codonbenutzung des nox-Gens. Man findet insgesamt einen hohen G+C-Gehalt (70,4%) mit einer extremen Bevorzugung von G oder C im dritten Buchstaben des Codons (94,4%), verglichen mit 76,2% beziehungsweise 52,0% in den ersten und zweiten Basenpositionen. Diese Eigenschaften re­ flektieren die extrem thermostabile Natur dieses Organismus. Diese Beobachtung wurde auch für mehrere andere Gene von Thermus thermophilus HB8 wiedergegeben, zum Beispiel für die Gene der Isopropylmalatdehydrogenase (Kagawa et al., 1984), der Phosphoglyceratkinase (Bowen et al., 1988) und der Tryp­ tophansynthetase (Koyama und Furukawa, 1990). Diese Art der Codonverwendung ist allerdings in dem tuf1-Gen, welches den Elongationsfaktor Tu kodiert (Seidler et al., 1987) weniger ausgeprägt, was mit der höheren Expressionsrate dieses Gens zu tun haben könnte. Später wurde gezeigt, daß die zwei zum Screening der genomischen Bibliothek mittels DNA-DNA-Hybridi­ sierung (siehe oben) verwendeten Oligonukleotidprobes mehrere Mismatches enthielten. Dessenungeachtet wurde das nox-Gen so­ gar bei hohen Temperaturen (72°C beziehungsweise 75°C) detek­ tiert, was wiederum auf die bemerkenswerte Thermostabilität der DNA hinweist. Es konnte kein augenscheinliches Promotor­ motiv innerhalb der untersuchten Sequenz gefunden werden, ob­ wohl in einigen anderen Genen von Thermus thermophilus HB8 die Sequenz dieser Elemente dem korrespondierenden Konsensus­ motiv in E. coli ähnlich schien. Man kann deswegen guten Ge­ wissens schlußfolgern, daß das nox-Gen Teil eines Operons ist, wobei ein Promotor weiter oberhalb des 5′-Endes lokali­ siert ist. Weiter zeigte sich keine signifikante Shine-Dal­ garno-Sequenz in der Upstream-Region des nox-Gens, was darauf hinweist, daß Thermus thermophilus HB8 entweder Ribosombin­ dungsstellen verwendet, die sich von der Shine-Dalgarno-Se­ quenz unterscheiden, oder daß das nox-Gen nur schwach expri­ miert wird, was durch den niedrigen zellulären Gehalt an NADH-Oxidase in Thermus thermophilus HB8 wiedergegeben wird. Diese Vermutung wird auch unterstützt durch die Beobachtung, daß keine signifikante Aktivität des Enzyms in dem oben er­ wähnten E. coli-Subklon pTNOX22, der das nox-Gen und dessen Upstreamsequenz trägt, bestimmt werden konnte. Um größere Mengen des Enzyms zu erhalten, stellten wird das nox-Gen unter die Kontrolle eines regulatorischen Elements in E. coli, näm­ lich P_tac, und der ribosomalen Bindungsstelle des Expressionsvektors pKK223-3.

Expression und Reinigung der T. thermophilus HB8-NADH-Oxidase aus E. coli

Die Sequenz unmittelbar vor dem Startcodon (ATG) des NADH- Oxidasegens wurde durch Einfügen einer EcoRI-Restriktions­ schnittstelle (5′-GAATTC-3′) modifiziert. Dies wurde durch Verwendung der Polymerasekettenreaktion erreicht, wie in Abb. 8 dargestellt. Eines der als PCR-Primer verwendeten Oligonukleotide war identisch mit der 5′-Region des Gens, enthielt aber eine zusätzliche EcoRI-Erkennungssequenz

(5′- GTTAGACTCCCGAATTCATGGAGGCGACCCTTCCCG-3′; EcoRI-Stelle unter­ strichen).

Der andere Primer war komplementär zur pUC18-Se­ quenz

(Universalprimer, 5′-GTAAAACGACGGCCAGTGCCA-3′).

Es wurde ein Fragment von etwa 780 bp amplifiziert, wobei der Subklon pTNOX09, der ein 900 bp-Stück in pUC18 enthielt, als Matrize verwendet wurde. Das amplifizierte Produkt wurde mit EcoRI und HindIII hydrolysiert und mit dem größeren EcoRI- HindIII-Fragment des Expressionsvektors pKK223-3 ligiert. Auf diese Weise wurde das inserierte Gen unter die Kontrolle von sowohl dem tac-Promotor als auch der Shine-Dalgarno-Sequenz von pKK223-3 gestellt. Letztere befand sich in einem Abstand von 10 bp von dem Startcodon des nox-Gens. E. coli JM109 wurde mit dem als pTNADOX bezeichneten rekombinanten Plasmid transformiert. Rohextrakte des erhaltenen rekombinanten Stam­ mes JM109 (pTNADOX), den man wie im Material- und Methodenteil beschrieben aufzog und induzierte, wurden hergestellt und auf NADH-Oxidase-Aktivität getestet. Die Rohextrakte wurden einer thermischen Behandlung unterworfen, um die meisten E. coli- Proteine wie auch thermolabile NADH-oxidierende Proteine zu entfernen. Die spezifische Enzymaktivität der NADH-Oxidase nach der Hitzebehandlung war etwa zehnmal größer als die in den Rohextrakten gefundene, was auf die Präzipitation von thermolabilen Proteinen zurückzuführen ist (Abb. 9). Ei­ nige thermostabile E. coli-Proteine, welche nach der Hitzebe­ handlung noch vorhanden waren, wurden durch Auftragen des Überstandes auf eine Blue Sepharose CL-6B-Affinitätssäule entfernt, welche spezifisch nukleotidbindende Proteine bin­ det. Die aus dem rekombinanten E. coli isolierte thermosta­ bile NADH-Oxidase konnte so bis zur Homogenität gereinigt werden. Verglichen mit der Ausbeute aus T. thermophilus HB8 wurde etwa 100mal mehr Enzym aus einer entsprechenden Zell­ masse von rekombinantem E. coli gewonnen. Es wurde kein Un­ terschied im katalytischen Verhalten der NADH-Oxidasen, die aus den beiden Organismen isoliert worden waren, festge­ stellt. In beiden Fällen betrug die spezifische Aktivität bei Raumtemperatur 5 U/mg, was von den 0,6 U/mg abweicht, die für die NADH-Oxidase aus Thermus aquaticus YT-1 berichtet worden waren (Cocco et al., 1988). Dieses zweistufige Verfahren, das eine thermische Behandlung und eine Affinitätschromatographie umfaßt, stellt eine immense Vereinfachung der Reinigung des Enzyms dar.

Wenig ist über die zelluläre Funktion der NADH-Oxidase be­ kannt. Die Verfügbarkeit des klonierten nox-Gens und seiner Nukleotidsequenz wird physiologische und genetische Studien der funktionellen Rolle dieses Enzyms ermöglichen. Verbesse­ rungen der NADH-Oxidase durch Mutagenisierung im Hinblick auf deren enzymatische Eigenschaften und die Immobilisierung des Enzyms auf einer Enzymelektrode sind nun ebenfalls möglich. Des weiteren erleichtern es die Überexpression des Enzyms in E. coli und die hohe Effizienz der Reinigung, große Mengen des Enzyms verfügbar zu machen. Diese sind sowohl für eine Kristallisation erforderlich, um Struktur-Funktionsbeziehun­ gen zu erforschen, als auch für die Entwicklung der Anwend­ barkeit als Biosensor.

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Tabelle 1

Reinigung von Thermus thermophilus-NADH-Oxidase

Tabelle 2

Substrat- und Cofaktorspezifität von NADH-Oxidase aus Thermus thermophilus¹)

Tabelle 3

Aminosäurezusammensetzung der NADH-Oxidase aus Thermus thermophilus HB8, abgeleitet aus dem klonierten Gen

Tabelle 4

Codonbenutzung des NADH-Oxidasegens aus Thermus thermophilus HB8

Claims (9)

1. Vektor zur Expression eines Strukturgens in Escherichia coli, dadurch gekennzeichnet, daß der Vektor einen DNA-Bereich des Gens der 26,8-kd-NADH-Oxidase von Thermus thermophilus um­ faßt, wobei der DNA-Bereich die folgende Aminosäuresequenz kodiert:

2. Vektor zur Expression eines Strukturgens in Escherichia coli, dadurch gekennzeichnet, daß er eine mit dem DNA-Bereich gemäß Anspruch 1 hybridisierbare DNA-Sequenz umfaßt, die ein Enzym mit 26,8-kD-NADH-Oxidase-Aktivität kodiert.

3. Vektor nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die hybridisierbare DNA-Sequenz bei einer Salzkonzentration von 6×SSC bei 62 bis 66°C und nachfolgender 1stündiger Wäsche mit 0,6×SSC und 0,1% SDS bei 62 bis 66°C und insbesondere bei einer Salzkonzentration von 4×SSC bei 62 bis 66°C mit nachfolgender 1stündiger Wäsche mit 0,1% SDS und 0,1% SSC bei 62 bis 66°C hybridisierbar ist.

4. Vektor zur Expression eines Strukturgens in Escherichia coli, dadurch gekennzeichnet, daß er einen DNA-Bereich umfaßt, der ein Enzym mit 26,8-kD-NADH-Oxidase-Aktivität kodiert, bei dem im Vergleich zur Aminosäuresequenz gemäß Anspruch 1

• - 1 bis 10 Aminosäuren fehlen
• - 1 bis 10 Aminosäuren hinzugefügt sind oder
• - 1 bis 10 Aminosäuren gegen jeweils eine andere Aminosäure ausgetauscht sind.

5. Vektor nach Anspruch 1, dadurch konstruierbar,

• (a) daß man pKK232-3 mit EcoRI und HindIII schneidet,
• (b) aus DNA von Thermus thermophilus, die das Strukturgen der 26,8-kD-NADH-Oxidase umfaßt, einen mindestens 744 Basenpaare umfassenden Bereich mit dem Strukturgen mit Hilfe von EcoRI und HindIII herausschneidet und
• (c) den gemäß (b) herausgeschnittenen Bereich in das größere Fragment des gemäß (a) geschnittenen Vektors ligiert.

6. Vektor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch ge­ kennzeichnet, daß sich das Startkodon zur Expression der 26,8- kD-NADH-Oxidase bzw. des Enzyms mit 26,8-kD-NADH-Oxidase- Aktivität in Leserichtung 6 bis 20, insbesondere etwa 10 Basenpaare hinter der Shine-Dalgarno-Sequenz des Vektors befindet.

7. Vektor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch ge­ kennzeichnet, daß die Positionen +1 bis +3 der Aminosäure­ sequenz gemäß Anspruch 1 durch ATG GAA GCA (als cDNA) kodiert werden.

8. Escherichia coli als Wirt für einen Vektor gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche.

9. Verwendung eines Vektors oder von Escherichia coli gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche zur Expression der 26,8-kD- NADH-Oxidase von Thermus thermophilus oder eines Enzyms mit 26,8-kD-NADH-Oxidase-Aktivität.