FR2887258A1 - Souches de levures saccharomyces transformees presentant une production d'ethanol reduite par fermentation - Google Patents
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Abstract
La présente invention est relative à des souches de levure transformées appartenant au genre Saccharomyces qui comprennent un acide nucléique hétérologue codant une NADH oxydase produisant de l'eau, à un procédé pour les préparer, et à leur utilisation dans des procédés de fermentation pour transformer les sucres avec un rendement de production d'éthanol réduit par rapport aux souches Saccharomyces sauvages, non transformées.
Description
La présente invention est relative à des souches de levure transformées
appartenant au genre Saccharomyces qui comprennent un acide nucléique hétérologue codant une NADH oxydase produisant de l'eau, et à leur utilisation dans des procédés de fermentation pour transformer les sucres avec un rendement de
production d'éthanol réduit par rapport aux souches Saccharomyces sauvages, non transformées.
Depuis une quinzaine d'année, les connaissances scientifiques et savoirfaire en viticulture et en oenologie ont conduit à une amélioration très significative des qualités organoleptiques des vins. Les pratiques viticoles actuelles favorisent la production de vins à potentiel qualitatif élevé en retardant le moment de la vendange. Une conséquence majeure est l'augmentation de la teneur en sucre des moûts, et donc de la teneur en alcool des vins (fréquemment supérieure à 14 ). Cette dérive, rencontrée dans la plupart des zones de production, pose ouvertement de nombreux problèmes à la filière viticole mondiale. Des teneurs en alcool excessives sont en effet difficilement compatibles avec les préoccupations santé et de bien-être des consommateurs, et font par ailleurs l'objet de taxes dans certains pays.
Il existe de ce fait une demande croissante pour des méthodes et outils permettant de réduire la teneur en alcool des vins. Les approches physiques (par exemple distillation sous vide) sont de plus en plus utilisées mais sont difficilement compatibles avec le maintien d'une qualité organoleptique satisfaisante.
Une solution biologique reposerait sur l'utilisation de souches de levures à faible rendement en alcool.
Par exemple les levures S. cerevisiae, notamment les levures S. cerevisiae oenologiques, transforment les sucres en alcool avec un rendement de 0,47 g/g, qui varie peu suivant la souche utilisée. De ce fait, l'obtention d'une levure S. cerevisiae à faible rendement en alcool nécessite la mise en oeuvre de stratégies génétiques visant à dévier une partie des sucres vers la formation d'autres sous produits.
Plusieurs approches d'ingénierie génétique ont été mises en oeuvres, dont certaines par les inventeurs, pour dévier une partie des sucres vers la production d'autres sous-produits que l'éthanol (Dequin, 2001; Dequin et al., 2003). Ces approches ont été basées sur la modification de l'activité d'enzymes impliquées dans la synthèse de glycérol ou dans l'utilisation du pyruvate. Par exemple, la surproduction de glycérol, obtenue par surexpression de GPD1 ou GPD2 codant pour la glycérol 3- phosphate déshydrogénase (Nevoigt and Stahl 1996; demande de brevet internationale WO 96/41888; Michnick et al., 1997; Remize et al., 1999; Remize et al., 2000; Remize et al., 2001; de Barros Lopez et al., 2000; Eglinton et al., 2002), a ainsi permis de diminuer la teneur en éthanol de 1 à 2 . Elle s'accompagne toutefois de modifications majeures du niveau de production d'autres métabolites, dont certains indésirables dans le vin. De même, il est possible de dévier une partie des sucres vers la production d'acide lactique en exprimant une lacticodéshydrogénase bactérienne. Cependant la teneur en alcool ne peut pas être abaissée de manière significative compte tenu des teneurs d'acide lactique acceptables dans le vin (demande de brevet internationale WO 94/00554; Dequin and Barre, 1994). Une autre stratégie a été développée, basée sur l'expression d'une glucose oxydase, qui permettrait l'oxydation d'une partie des sucres en acide gluconique en présence d'oxygène (Malherbe et al., 2003). II est cependant probable que le niveau de production en acide gluconique requis pour un abaissement significatif de la teneur en éthanol soit incompatible avec le maintien des qualités organoleptiques du vin.
Il existe donc toujours un besoin de souches de levures à faible rendement en alcool qui soient utilisables en pratique dans le domaine de l'oenologie.
Les approches d'ingénierie génétique se heurtent cependant à la difficulté de réussir à identifier la ou les activités enzymatiques à modifier pour parvenir aux changements métaboliques escomptés.
La possibilité d'induire une modification des flux métaboliques par modification du niveau d'oxydation du NADH a précédemment été démontrée chez la bactérie Lactococcus lactis. II a ainsi été observé que la surexpression de la NADH oxydase de Streptococcus mutans chez Lactococcus lactis réoriente le métabolisme vers la formation d'acétoïne ou de diacétyl aux dépends de l'acide lactique (Lopez de Felipe and Hugenholtz, 1999; Lopez de Felipe et al., 1998).
Toutefois, contrairement aux bactéries, les levures ne possèdent pas de NADH oxydase. Les inventeurs ont mis en évidence que l'introduction chez une levure Saccharomyces d'un gène hétérologue codant une NADH oxydase produisant de l'eau induit une modification du métabolisme de l'éthanol.
L'invention concerne donc une levure Saccharomyces transformée avec un gène hétérologue codant une NADH oxydase produisant de l'eau, et ses utilisations, notamment en oenologie.
Définitions Dans le contexte de la présente invention, par levure , on désigne une levure du genre Saccharomyces. Ladite levure peut par exemple être choisie parmi l'une des espèces suivantes: Saccharomyces bayanus, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces paradoxus, Saccharomyces pastorianus, ou Saccharomyces uvarum. De préférence la levure Saccharomyces selon l'invention est Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Par souche oenologique , on entend une souche S. cerevisiae. De très nombreuses souches S. cerevisiae oenologiques sont commercialisées ou ont été décrites dans l'art antérieur. Certaines souches oenologiques commercialisées sont des S. bayanus var. uvarum. Une séquence codante ou séquence codant un produit d'expression, tel qu'un ARN, un polypeptide, une protéine, ou une enzyme, est une séquence nucléotidique qui, lorsqu'elle est exprimée, conduit à la production de cet ARN, polypeptide, protéine, ou enzyme. Une séquence codant une protéine peut inclure un codon d'initiation et un codon stop.
Le mot hétérologue se réfère à une combinaison d'éléments ne survenant pas naturellement. Dans le contexte de la présente invention, une séquence d'acide nucléique hétérologue renvoie à une séquence d'acide nucléique (gène, ADNc ou ARN) qui n'est pas naturellement contenue par la cellule, c'est-à-dire une séquence étrangère ou exogène à la cellule.
Par NADH oxydase produisant de l'eau , ou Nox, H2O , on entend une enzyme qui catalyse la réaction: 2NADH + 2H+ + 02 * 2NAD+ + 2H2O. Il peut s'agir en particulier d'une enzyme bactérienne. En effet, un certain nombre de NADH oxydases produisant de l'eau ont été identifiées chez des bactéries, et ont notamment été répertoriées dans le Tableau 1 de l'article Riebel et al., 2002.
Un acide nucléique hétérologue codant une NADH oxydase produisant de l'eau peut par exemple être constituée par, ou comprendre, une séquence codante sélectionnée dans le groupe constitué par les gènes des enzymes Nox, H2O identifiées chez Lactococcus lactis (Hoefnagel et al., 2002; numéro d'accès Genbank AY046926; SEQ ID No.1), Enterococcus faecalis (Ross et Clairbone, 1992; numéro d'accès Genbank X68847; SEQ ID No.2), Mycoplasma genitalis (Peterson et al., 1993; numéro d'accès Genbank U39707; SEQ ID No.3), Streptococcus mutans (Matsumoto et al., 1996; numéro d'accès Embl 815515; SEQ ID No.4), Mycoplasme pneumoniae (Himmelreich et al., 1996; numéro d'accès Embl MPAE44, SEQ ID No.5), Methanococcus japanicus (Buit et al., 1996; numéro d'accès Embl MJU67512, SEQ ID No.6), et L.euconostoc mesenteroides (Koike et al., 1985).
Outre la séquence codant l'enzyme Nox, H2O proprement dite, l'acide nucléique hétérologue codant une NADH oxydase produisant de l'eau peut comprendre des séquences de régulation ou de contrôle, telles qu'un codon d'initiation, un codon stop, une séquence promotrice, signal, de sécrétion ou d'autres séquences utilisées par la machinerie génétique des levures.
L'expression fermentation alcoolique désigne la séquence de réactions de transformation du pyruvate en éthanol, et par extension l'ensemble des réactions de transformation de sucres en éthanol.
Levures Saccharomyces transformées et procédé de préparation L'introduction chez une levure Saccharomyces d'un gène hétérologue codant une NADH oxydase produisant de l'eau induit une modification du métabolisme de l'éthanol.
En effet, les inventeurs ont exprimé dans une souche S. cerevisiae le gène noxE qui code pour une NADH oxydase formant de l'eau chez Lactococcus lactis (Hoefnagel et al., 2002; Lopez de Felipe and Hugenholtz, 2001). Des fermentations ont été réalisées dans un milieu synthétique mimant la composition d'un moût de raisins, avec un apport d'oxygène afin de permettre le fonctionnement de la NADH oxydase.
L'analyse des souches obtenues montre que l'expression de la NADH oxydase induit une réduction significative du rendement de production d'éthanol.
Cette réduction s'accompagne d'autres changements métaboliques, à savoir une réduction de la production de glycérol, d'a-cétoglutarate et d'hydroxyglutarate, et une accumulation d'acétaldéhyde, ainsi que d'acétate et d'acétoïne.
L'invention concerne donc une souche de levure transformée appartenant au genre Saccharomyces qui comprend un acide nucléique hétérologue codant une 30 NADH oxydase produisant de l'eau.
L'invention concerne également un procédé de préparation d'une souche de levure transformée appartenant au genre Saccharomyces qui présente, en fermentation alcoolique, un rendement de production d'éthanol réduit par rapport à la souche Saccharomyces sauvage, non transformée.
Ledit procédé comprend l'étape consistant à transformer une souche de levure du genre Saccharomyces, dite sauvage , en introduisant au moins un acide nucléique hétérologue codant une NADH oxydase produisant de l'eau.
L'expression transformer ou transformation signifie l'introduction d'un gène ou d'une séquence ARN ou ADN étrangère (c'est-à- dire exogène) dans une levure Saccharomyces hôte, de manière à ce que la levure hôte exprime le gène ou la séquence introduite pour produire la substance désirée, dans le cas présent une enzyme NADH oxydase produisant de l'eau. La souche de levure qui a reçu et exprime l'acide nucléique codant une NADH oxydase produisant de l'eau a été transformée .
La séquence codant la NADH oxydase produisant de l'eau peut être sous le contrôle de ou associée de manière fonctionnelle avec des séquences de contrôle de la transcription et/ou de la traduction de manière à permettre la régulation de l'expression de ladite séquence codante dans la levure. Il peut s'agir de séquences de type promoteur et terminateur actives dans la levure, par exemple les promoteurs et terminateurs des gènes alcool-déshydrogénase 1 (ADH1), phosphoglycérate kinase (PGK), ou glyceraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH).
L'association de la séquence codant la NADH oxydase produisant de l'eau 20 et des séquences permettant la régulation de son expression constitue une cassette d'expression .
L'invention concerne donc également une cassette d'expression comprenant un acide nucléique codant une NADH oxydase produisant de l'eau, de préférence d'origine bactérienne, associé à des séquences de régulation de l'expression de ladite séquence codant une NADH oxydase produisant de l'eau dans la levure.
L'acide nucléique codant la NADH oxydase produisant de l'eau, ou une cassette le contenant, peut être porté par un vecteur ou intégré dans le génome (l'ADN chromosomique) de la levure transformée.
Un vecteur peut être utilisé pour véhiculer la séquence d'acide nucléique codant la NADH oxydase produisant de l'eau dans la levure hôte, ou la cassette la contenant, de manière à transformer la levure et à faciliter l'expression de la séquence introduite. II peut s'agir par exemple d'un vecteur d'ADN de type plasmide. La transformation des levures utilise généralement des vecteurs navettes dans lesquels la séquence d'acide nucléique codant la NADH oxydase produisant de l'eau peut être combinée à une séquence permettant son expression dans la levure, telle qu'un promoteur de levure. Ces vecteurs navettes comprennent d'autres séquences additionnelles pour permettre l'expression dans des bactéries, comme E. coli, ou dans d'autres microorganismes. Ces séquences additionnelles qui ne proviennent pas de levures servent uniquement à la construction des vecteurs.
L'invention concerne donc en outre un vecteur comprenant une cassette d'expression comprenant un acide nucléique codant une NADH oxydase produisant de l'eau, de préférence d'origine bactérienne, associé à des séquences de régulation de l'expression de ladite séquence codant une NADH oxydase produisant de l'eau dans la levure.
Le vecteur d'ADN peut être introduit par toute technique connue de l'homme du métier, notamment par transformation à l'acétate de lithium, par électroporation ou à l'aide de protoplastes. Par exemple la méthode de transformation à l'acétate de lithium décrite par Schiestl et Gietz, (1989) peut être utilisée.
De préférence, ladite souche de levure du genre Saccharomyces est une souche industrielle utilisée en oenologie, en brasserie, en boulangerie ou en cidrerie.
Selon un mode de réalisation préféré, ladite souche de levure du genre Saccharomyces est une souche Saccharomyces cerevisiae, de préférence la souche oenologique S. cerevisiae V5 (aussi appelée ScV5M, déposée le 18 juin 1992 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, tenue par l'Institut Pasteur, sous le numéro l-1222).
De préférence ladite NADH oxydase produisant de l'eau est une NADH oxydase bactérienne. Ledit acide nucléique codant une NADH oxydase produisant de l'eau peut comprendre une séquence sélectionnée dans le groupe constitué des séquences SEQ ID No.1, SEQ ID No.2, SEQ ID No.3, SEQ ID No.4, SEQ ID No.5 et SEQ ID No.6.
Selon un mode de réalisation préférée, préférence ledit acide nucléique codant une NADH oxydase produisant de l'eau comprend le gène de l'enzyme Nox, H2O identifiée chez Lactococcus lactis (SEQ ID No.1).
Avantageusement, le rendement de production d'éthanol, en fermentation alcoolique, de la souche genre Saccharomyces transformée par rapport à la souche du genre Saccharomyces sauvage peut être réduit de 10 à 20 %, de préférence d'environ 15 %, ce qui représente une réduction d'au moins 0, 5 , de préférence d'au moins 1 , de préférence encore d'au moins 2 , en fonction de la teneur initiale en sucres dans le milieu de fermentation.
Le degré d'alcool représente le nombre de ml d'alcool éthylique pur contenu(s) dans 100 ml d'un liquide, mesuré à 20 C. 1 d'alcool correspond à 7,80 g/I d'éthanol.
Utilisation des levures Saccharomyces transformées Les souches de levures Saccharomyces selon l'invention sont capables de transformer le sucre de leur milieu de culture en produisant une quantité moindre d'éthanol par rapport aux levures Saccharomyces sauvages correspondantes.
Ces souches de levures sont donc notamment utiles dans des procédés de préparation de boissons fermentées pour permettre l'obtention de boissons ayant une teneur réduite en éthanol par rapport à des boissons préparées par fermentation alcoolique à l'aide de levures Saccharomyces non transformées. Ces levures peuvent également être utilisées en boulangerie dans des procédés de panification.
L'invention concerne donc l'utilisation d'une souche de levure Saccharomyces selon l'invention pour mettre en oeuvre une fermentation alcoolique.
Ladite fermentation alcoolique peut être mise en oeuvre dans un procédé de panification, de vinification, de brasserie, de cidrerie ou de distillerie. Une souche de levure selon l'invention est donc plus particulièrement utile pour la préparation d'une boisson fermentée, telle que du vin, du champagne, de la bière, du cidre, ou une eau de vie, ou en panification, notamment pour la préparation de pain.
L'invention a trait également à un procédé de fermentation alcoolique qui permet la transformation des sucres avec un rendement de production d'éthanol réduit. Ledit procédé comprend les étapes consistant à : a) inoculer un milieu contenant une forte teneur en sucres avec au moins une souche de levure Saccharomyces selon l'invention; b) cultiver ladite souche de levure Saccharomyces et laisser la fermentation se dérouler pour transformer les sucres en alcool.
La culture peut être réalisée avec un apport en oxygène (microoxygénation) , qui peut être continu ou discontinu, et où l'oxygène est apporté en conditions limitantes ou non limitantes. De préférence, lorsque la culture est effectuée avec un apport en oxygène continu, la souche de levure selon l'invention est cultivée en conditions d'oxygène non limitantes, c'est-à-dire dans des conditions où il reste de l'oxygène dissous dans le milieu, non consommée par les levures.
Par milieu contenant une forte teneur en sucres , on entend un milieu contenant au moins 30 g/I de sucres, de préférence au moins 50 g/I de sucres, de préférence encore au moins 80 g/1 de sucres.
Le terme sucres désigne les glucides en général, et plus spécifiquement des monosaccharides tels que glucose ou fructose, ou des polysaccharides tels que saccharose ou maltose, par exemple.
Ledit procédé de fermentation alcoolique peut être un procédé de brasserie. Le milieu contenant une forte teneur en sucres est alors un moût de brasserie, préparé à partir d'un mélange d'orge et de houblon.
Ledit procédé de fermentation alcoolique peut également être un procédé de panification. Le milieu contenant une forte teneur en sucres est alors la pâte mise à levée, par exemple une pâte à pain, à brioche, etc...
Selon un mode de réalisation préféré, ledit procédé de fermentation alcoolique est un procédé de vinification. Le milieu contenant une forte teneur en sucre est alors un moût de raisins. La teneur en sucres des moûts de raisins utilisés en vinification est généralement comprise entre 140 et 260 g/l.
Les levures les plus utilisées en vinification sont les levures S. cerevisiae qui présentent généralement un rendement de production d'éthanol de l'ordre de 0,47 g par g de sucres. L'utilisation de ces levures en vinification (dans les conditions traditionnelles, c'est-àdire en anaérobiose) produit ainsi des vins ayant une teneur en alcool comprise entre 8 et 15 .
Les inventeurs ont montré que les levures S. cerevisiae transformées selon l'invention présentent un rendement de conversion des sucres en alcool de 0.39 g par g de sucres, ce qui représente une diminution de l'ordre de 15% par rapport au rendement alcool des souches sauvages. L'utilisation de ces levures peut conduire à des vins ayant une teneur en alcool comprise entre 7 et 13 .
Par exemple, les inventeurs ont montré que l'utilisation d'une souche de levure transformée S. cerevisiae selon l'invention, pour mettre en oeuvre une fermentation dans des conditions d'oxygénation contrôlée, à partir d'un milieu synthétique ayant une teneur en sucres de 200 g/I permet d'obtenir une réduction de 1 de la teneur en éthanol par rapport à la teneur qui aurait été obtenue par fermentation en conditions anaérobies avec la souche S. cerevisiae sauvage (aux alentours de 12 ), ou une réduction de 1 de la teneur en éthanol par rapport à la teneur qui aurait été obtenue par fermentation avec la souche S. cerevisiae sauvage dans les mêmes conditions d'oxygénation contrôlées.
II est préférable de mettre en oeuvre une oxygénation contrôlée au cours du procédé de fermentation. En effet, l'activité de la NADH oxydase à un niveau élevé dès le début de la fermentation peut freiner la croissance des levures, et réduire leur capacité à dégrader de fortes concentrations en sucre (supérieures à 80g/l). Ces effets semblent liés à la diminution d'efficacité du système de détoxication de l'acétaldéhyde via la butanediol déshydrogénase (BDH). Cependant, il est possible de limiter ces effets en pilotant l'apport en oxygène de façon à l'apporter en quantité limitante.
D'autre part, ces effets sont totalement abolis si l'on découple la phase de croissance des levures de la phase d'activité de la NADH oxydase, autrement dit si l'activité de la NADH oxydase ne se manifeste qu'à la fin de la phase de croissance des levures (phase stationnaire). Ainsi, lorsque l'oxygène est apporté de manière discontinue, uniquement en phase stationnaire, phase pendant laquelle au moins 70% des sucres sont consommés, la totalité du glucose est consommée. L'augmentation de l'acétaldéhyde et de l'acétate liée à l'utilisation des levures transformées selon l'invention reste alors très modérée.
Les levures cultivées se multiplient jusqu'à épuisement du milieu de culture en un de leur substrat. Par exemple, lorsque le milieu de culture est un moût de raisins, ou un milieu synthétique mimant le moût de raisins, l'azote est en quantité limitante dans le milieu par rapport aux sucres (environ 300 à 500 mg/I d'azote assimilable contre environ 200 g/I en sucres). La fermentation intervient dès le début de la phase de multiplication des levures et se poursuit une fois les levures en arrêt de croissance. Pour de tels milieux de fermentation, l'arrêt de croissance occasionné par l'épuisement du milieu en azote et en micronutriements se manifeste alors qu'environ 30% des sucres ont été consommés.
L'invention propose plus particulièrement un procédé de vinification comprenant les étapes consistant à : a) inoculer un moût de raisins avec au moins une souche de levure Saccharomyces selon l'invention; b) cultiver ladite souche de levure Saccharomyces et laisser la fermentation se dérouler pour transformer les sucres en alcool; dans lequel ladite souche de levure Saccharomyces est initialement cultivée en conditions anaérobies, puis cultivées en conditions aérobies lorsque la phase de croissance stationnaire des levures est atteinte, notamment lorsque essentiellement la totalité de l'azote assimilable du moût de raisins est consommé.
Par conditions aérobies on entend des conditions de culture en présence d'oxygène, de préférence dans des conditions non limitantes en oxygène pour la souche Saccharomyces cultivée. Pour un milieu et une souche Saccharomyces donnés, l'homme du métier est en mesure de déterminer s'il est en présence de conditions de culture non limitantes en détectant simplement la présence d'oxygène dissous dans le milieu de culture. Par exemple, pour une souche V5 transformée avec le gène noxE de L. lactis, cultivée sur un milieu synthétique mimant un moût de raisin tel que décrit dans les exemples (milieu MS comprenant 180-200 g/I de glucose, 6 g/I d'acide malique, 6 /1 d'acide citrique, 460 mg/I d'azote, sous forme de NH4CI (120 mg/I) et d'acides aminés (340 mg/l)), un transfert d'oxygène de 10 mg/l/h correspond à des conditions de microoxygénation non limitantes.
De préférence ladite souche de levure Saccharomyces est une souche S. 20 cerevisiae, de préférence encore une souche S. cerevisiae oenologique telle que la souche V5.
L'invention concerne également l'utilisation d'une levure Saccharomyces selon l'invention pour régénérer du NAD+ à partir de NADH, par exemple au cours de biotransformations.
La biotransformation consiste en l'utilisation d'organismes vivants pour effectuer des réactions difficiles à mettre en oeuvre par des méthodes chimiques de laboratoire. En général une ou de multiples molécules précurseurs sont fournies à l'organisme vivant, et après une période suffisante pour que le métabolisme ait pu se produire, un produit ou des produits sont isolés à partir du milieu de culture ou de la biomasse, qui diffèrent des molécules précurseurs par une ou un petit nombre de modifications enzymatiques De nombreuses biotransformations, utilisées pour la production d'énantiomères purs (alcools, hydroxy acides, acides aminés...) ou d'autres composés pour la chimie fine (chimie verte) , impliquent des réactions de réduction nécessitant un accepteur d'électron, typiquement un cofacteur de type NADH ou NADPH. Un problème majeur qui limite l'utilisation des biotransformations est la régénération du NAD(P) à partir du NAD(P)H. Le couplage des biotransformations avec une autre réaction enzymatique, par exemple la réaction catalysée par l'alcool déshydrogénase ou par la lactate déshydrogénase, permet une régénération efficace des cofacteurs. Cependant des problèmes restent à résoudre, en termes de mise en oeuvre, de stabilité de l'enzyme et de coût global. Récemment, l'utilisation de NADH oxydases qui catalysent l'oxydation du NADH en réduisant l'oxygène moléculaire en eau, a été proposée (Riebel et al, 2002).
Par rapport à ces approches, l'utilisation de cellules entières avec un système intégré de régénération des cofacteurs permet une mise en oeuvre des biotransformations plus simples et à moindre coût.
Les exemples et figures suivantes illustrent l'invention sans en limiter sa portée.
FIGURES
La Figure 1 montre un schéma réactionnel de la voie métabolique de dégradation du glucose.
La Figure 2 montre la structure des plasmides d'expression utilisés pour exprimer la NADH oxydase NoxE chez la levure S. cerevisiae.
La Figure 3 montre l'intégration de la cassette d'expression TDH3pnoxEPGKt au locus URA3.
La Figure 4 illustre le suivi du glucose résiduel et de l'oxygène dissous pour la souche témoin V5 cultivées sur milieu MS avec un apport de 10 mg/l/h d'oxygène.
La Figure 5 illustre l'impact de l'expression de l'oxydase sur la croissance, la consommation de glucose et les profils métaboliques des souches V5 et V5noxE cultivées sur milieu MS avec un apport constant d'oxygène à 10 mg/I/h.
La Figure 6 montre le suivi du glucose résiduel et de l'oxygène dissous pour les souches V5 et V5noxE en phase stationnaire avec un apport de 10 mg/I/h d'oxygène.
La Fiqure 7 montre la mesure de la croissance, de la consommation en glucose et des profils métaboliques des souches V5 et V5noxE cultivées sur milieu MS lors d'un apport d'oxygène à 10 mg/l/h en phase stationnaire.
EXEMPLES
Exemple 1: Préparation de souches de levures transformées exprimant noxE Afin d'obtenir une expression forte et constitutive de la NADH oxydase de L. lactis dans la levure, la région codante du gène noxE a été amplifiée à partir de l'ADN génomique de L. lactis MG1363 et placée sous le contrôle d'éléments régulateurs de levure, soit dans des vecteurs navette levure / E. coli, soit intégré dans le génome de la levure.
1. Introduction de la NADH oxydase sur le plasmide multicopie pVT100-U 15 ZEO sous contrôle du promoteur ADH 1 Le plasmide d'expression pVT100-U ZEO a été utilisé (Figure 2). Ce plasmide dérive du plasmide pVT100-U décrit par Vernet et al., (1987) qui contient l'origine de réplication de levure 2p, le marqueur de sélection URA3 et les éléments régulateurs forts ADH1 (promoteur et terminateur de l'alcool déshydrogénase I), ainsi que les éléments bactériens (origine de réplication et gène de résistance à l'ampicilline), dans lequel le gène Tn5 ble conférant la résistance à la phléomycine a été inséré, comme décrit par Remize et al., (1999).
Pour exprimer l'oxydase, le vecteur pVTZEO-ADH 1 noxE a été construit en insérant le gène noxE (Hoefnagel et al., 2002) dans le vecteur pVT1000-ZEO. Pour cela, le gène noxE a été amplifié par PCR comme décrit en 5, à partir de l'ADN total isolé de L. lactis MG1363, en utilisant les primers 5'- CGGCGCTCGAGATGAAAATCGTAGTTATCGGT-3' (SEQ ID No. 7) et 5'CGGCGTCTAGATTATTTGGCATTCAAAGCTGC-3' (SEQ ID No.8) dans lesquels les sites Xhol et Xbal (soulignés) ont été introduits.
50 ng de fragment amplifié et digéré par Xhol et Xbal ont été ligués à 100 ng de plasmide pVT100UZEO digéré par Xhol et Xbal et déphosphorylé comme décrit en 6. Après transformation de bactéries et sélection des clones recombinants comme décrit en 6, plusieurs clones recombinants ont été obtenus. La carte du plasmide recombinant obtenu, appelé pVTZEO- ADH1noxE, est représentée Figure 2.
2. Introduction de la NADH oxydase sur le plasmide multicopie pVT100-U 5 ZEO sous contrôle du promoteur TDH3 Le vecteur pVTZEO-TDH3noxE a aussi été construit à partir du plasmide pVT100U-ZEO, par remplacement de la cassette d'expression ADH1p-ADH1t par une cassette constituée du gène noxE sous contrôle du promoteur du gène de levure TDH3 codant pour la glyceraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase et du terminateur du gène PGK codant pour la phosphoglycérate kinase. Le promoteur TDH3 a été décrit comme un promoteur très fort et constitutif (Mumberg et al., 1995).
Le plasmide pVTZEO-TDH3noxE a été obtenu en utilisant le plasmide intermédiaire pFL-TDH3noxE. Ce dernier a été obtenu en clonant la région promotrice de TDH3 dans le vecteur navette levure/coli pFL60 décrit par Minet et al., (1992). La région promotrice de TDH3 a été amplifiée à partir de l'ADN génomique de la souche de levure S. cerevisiae S288C, à l'aide des oligonucléotides 5'-CGGAGCTCCAGTTCGAGTTTATCATTATC-3' (SEQ ID No.9) et 5'-CGGGATCCTCGAAACTAAGTTCTTGGTG-3' (SEQ ID No.10) dans lesquels les sites Sac/ et BamHl (soulignés) ont été introduits comme décrit en 5. La région codante du gène noxE a été amplifiée par PCR, comme décrit en 5, à partir de l'ADN chromosomique de L. lactis MG1363 à l'aide des oligonucléotides 5'-CGGGATCCATGAAAATCGTAGTTATCGGT-3' (SEQ ID No.11) et 5'CGCTCGAGTTATTTGGCATTCAAAGCTGC-3' (SEQ ID No.12) permettant l'introduction des sites BamHl et Xhol (soulignés). Les deux fragments PCR ainsi générés ont été digérés puis ligués dans le plasmide pFL60 digéré par Sac/ et Xhol comme décrit en 6. Le plasmide pFL-TDH3 noxE a été ainsi obtenu. La cassette d'expression TDH3p-noxE-PGKt a été amplifiée, comme décrit en 5, à partir de ce plasmide en utilisant les oligonucléotides 5'GGCGGCATGCGCTCCAGTTCGAGTTTATCA-3' (SEQ ID No.13) et 5'CGGCGGCATGCTTTCACACAGGAAACAGCTA-3' (SEQ ID No.14) dans chacun desquels un site Sphl (souligné) a été introduit. 100 ng de fragment amplifié et digéré par Sphl ont été ligués à 100 ng de plasmide pVT100-U-ZEO digéré par Sphl et déphosphorylé comme décrit en 6. Après transformation de bactéries et sélection des clones recombinants comme décrit en 6, plusieurs clones recombinants ont été obtenus. La carte du plasmide recombinant obtenu, appelé pVTZEO-TDH3noxE, est représentée Figure 2.
Le plasmide vide pVTZEO-TDH3 utilisé comme contrôle a été généré à partir du plasmide pFL-TDH3, qui correspond au plasmide pFL60 dans lequel le promoteur PGK a été remplacé par un multi-site de clonage, à l'aide de l'oligonucléotide double brin (MWG) 5'-ATCCCCCGGGCTGCAGGTCGACC-3' (SEQ ID No.15) , puis dans lequel le promoteur TDH3 a été cloné au site Sac/ et BamHl comme expliqué précedement. La carte du plasmide recombinant obtenu, appelé pVTZEO-TDH3, est représentée Figure 2.
3. Préparation de la cassette d'expression TDH3p-noxE-PGKt en vue de son intégration dans le génome de la levure Une souche exprimant le gène noxE de façon stable a été construite en intégrant la cassette TDH3p-noxE-PGKt au locus URA3 de la souche V5 en utilisant la méthode short flanking homology (SFH) décrite par Guldener et al., (1996). La cassette d'expression TDH3p-noxE-PGKt a été amplifiée, comme décrit en 5, à partir du plasmide pFL-TDH3noxE en utilisant les oligonucléotides 5'CGGCGGATATCGCTCCAGTTCGAGTTTATCA-3' (SEQ ID No.16) et 5'CGGCGACTAGTTTTCACACAGGAAACAGCTA-3' (SEQ ID No.17) dans lesquels les sites EcoRV et Spel ont été introduits. Le fragment d'amplification obtenu a été ligué au plasmide pUG6 (Guldener et al., 1996) digéré par EcoRV et Spel et déphosphorylé comme décrit en 6. Le plasmide pUG6noxE a été obtenu.
Afin de transformer la souche V5 (voir en 4), un fragment PCR portant les modules loxP-kanMX4-loxP et TDH3p noxE-PGKt a été amplifié, comme décrit en 5, à partir du plasmide pUG6noxE, à l'aide des oligonucléotides 5'TGATTCGGTAATCTCCGAGCAGAAGGAAGAACGAAGGAAGGCAGGTCGACAAC CCTTAAT-3' (SEQ ID No.18) qui possède 20 nucléotides complémentaires à pUG6 et une extension de 40 nucléotides (soulignés) correspondant à la région -157 to - 117 en amont de l'ATG de URA3, et 5'-TGAGTTTAGTATACATGCATTTACTTATAATACAG 11 I 1 1 1 1 CACACAGGAAACAG CTA-3' (SEQ ID No.19) qui possède 20 nucléotides complémentaires au terminateur PGK et une extension de 39 nucléotides (soulignés) correspondant à la région + 843 to + 804 en aval du codon stop de URA3.
4. Transformation de la levure La souche de levure Saccharomyces cerevisiae ScV5M (appelée V5) a été transformée par les vecteurs pVTZEOADH1noxE, pVTZEO-TDH3noxE et par les vecteurs pVT100UZEO et pVTZEO-TDH3 (contrôles). Les souches obtenues 5 sont listées dans le Tableau 1.
Tableau 1: Liste des plasmides et des souches utilisés.
Souche Genotype Modification génétique Source
INRA UMR
V5 MA Ta ura3 SPO Ce travail MA Ta ura3 V5noxE Integration URA3 TDH3pnoxE-PGKt Plasmide V5pVTZEO- MA Ta ura3 2p, URA3, ApR, G418R, Ce travail TDH3noxE TDH3p-noxE-PGKt ZEOR Plasmide MA Ta ura3 2p, URA3, ApR, G418R, Ce travail V5pVTZEO-TDH3 TDH3p-PGKt ZEOR Plasmide MA Ta ura3 V5pVTZEO- 2p, URA3, ApR, G418R Ce travail ADH1 p-noxE- ADH 1 noxE ZEOR ADH1t Plasmide MA Ta ura3 Ce travail V5pV1000-ZEO 2p, URA3, ApR, G418R, ADH1 p-ADH1t
ZEOR
Afin d'obtenir une souche exprimant l'oxydase de façon stable, la souche V5 a été transformée par 1,4 pg de fragment d'intégration préparé comme décrit en 3. L'intégration au locus URA3 a été vérifiée par PCR à partir de l'ADN génomique des transformants G418R obtenus, à l'aide d'oligonucléotides situés en amont et en aval du site d'intégration. Une souche appelée V5noxE possédant le fragment intégré au locus URA3 a été obtenue (Figure 3).
La souche SCV5M a été déposée le 18 juin 1992 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, tenue par l'Institut Pasteur, sous le numéro 1-1222. II s'agit d'une souche S. cerevisiae haploide, MA Ta, ura3, dérivée d'une souche oenologique.
La méthode de transformation utilisée est celle de l'acétate de lithium décrite par Schiestl et Gietz, (1989). Le milieu sélectif utilisé pour sélectionner les souches transformées par les plasmides est du YNB (0,67% Yeast nitrogen base, 2% glucose). L'absence d'uracile permet de conserver une pression de sélection pour les plasmides.
Les clones ayant intégré le fragment d'intégration portant les modules kanMX et NADH oxydase ont été sélectionnés sur milieu riche YEPD (1% bacto yeast extract, 2% bactopeptone, 2% glucose) supplémenté avec 200 pg/ml de généticine G418 (Gibco, Angleterre).
5. Amplification par PCR ng de plasmide ou 100 ng d'ADN génomique sont mélangés à 500 nM d'oligonucléotides, 5 pl de tampon 10X Mg2±free DyNazyme EXT buffer (FINNZYMES, Finlande), 1,5 mM de MgCl2, 200 pM de dNTPs, 1 unité de DyNAzyme EXT (FINNZYMES, Finlande) dans un volume total de 50 pl.
Les conditions d'amplification sont les suivantes: 2 minutes à 94 C, 30 cycles de 30 secondes à 94 C, 30 secondes à 50 C, 2 minutes à 72 C, puis 7 minutes à 72 C sur amplification Perkin Elmer Cetus modèle 9600.
6. Techniques de clonage et de transformation des bactéries La digestion de l'ADN par enzymes de restriction est réalisée comme décrit par le fournisseur (Promega Corporation, USA). Après digestion, les plasmides sont déphosphorylés avec 10 unités de la Bacterial Alkaline Phosphatase (Qbiogene, USA) selon le protocole décrit par le fournisseur. La réaction de déphosphorylation est stoppée par une extraction au phénol/chloroforme (Sambrook et al., 1989). 50ng à 100ng d'ADN amplifié et digéré sont ligués à 100 ng de plasmide digéré et déphosphorylé dans un mélange réactionnel final de 10 pl, en présence de 5 unités de T4 DNA Ligase (Biolabs, USA) pendant une nuit à 16 C. Un microlitre de mélange de ligation est utilisé pour transformer les bactéries compétentes E.coli DH5a (Library Efficiency DH5a competent cells, Invitrogen, USA) selon le protocole décrit par le fournisseur. Les colonies obtenues sont sélectionnées sur boîtes LB (1% bactotryptone, 0,5% bacto yeast extract, 1% NaCl) plus ampicilline (100 pg/ml). L'ADN plasmidique des clones obtenus est ensuite extrait par le kit QlAprep Miniprep (Quiagen, USA) et analysé par digestion enzymatique.
Exemple 2: Conséquences de l'expression de la NADH oxydase chez Saccharomyces cerevisiae lors de la fermentation sur milieu MS, en conditions d'apport constant en oxygène 1. Procédures expérimentales a Conditions de culture et de microoxygénation Les fermentations ont été réalisées dans des réacteurs de 2 litres (SGI, France) avec un volume réactionnel de 1 litre. Le milieu MS a été utilisé pour la préculture et la culture. Il s'agit d'un milieu synthétique qui simule un moût standard de raisin (Bely et al., 1990). Le milieu MS contient 18-20% glucose, 6 g/1 d'acide malique, 6 /1 d'acide citrique, 460 mg/1 d'azote, sous forme de NH4C1 (120 mg/I) et d'acides aminés (340 mg/1). Le milieu est supplémenté avec de la méthionine (115 mg/1) et si nécessaire de l'uracile (50 mg/1). Le pH du milieu MS est de 3,3. Des facteurs d'anaérobiose, ergostérol (7,5 mg/1), acide oléique (2,5 mg/1) et Tween 80 (0,21 g/1) sont ajoutés. Les précultures sont réalisées dans des erlenmeyers de 250 ml contenant 50 ml de milieu à 28 C sous agitation (150 rpm) pendant 30h. Les réacteurs sont inoculés à partir de ces précultures, à une densité cellulaire de 1.106 cellules/ml, et maintenus à température constante de 28 C avec agitation permanente (500 rpm). Les conditions de microxygénation sont obtenues en aérant le réacteur avec de l'air à un débit maintenu constant. La mesure de l'oxygène dissous est réalisée à l'aide d'électrodes INGOLD Clark. Le coefficient de transfert (K,a) est mesuré selon la méthode dynamique (Dursun et al, 1999). La solubilité de l'oxygène (C*) dans le moût est déterminée selon Sablayrolles et Barr (1986). La vitesse maximale de transfert d'oxygène (OTR max) est égale à Ka x C* et la vitesse de consommation de l'oxygène (OUR) est calculé comme suit, OUR = Ka x (C* C) avec C, concentration en oxygène dissous dans le milieu. La consommation d'oxygène est obtenue en intégrant la courbe obtenue lors du calcul de l'OUR. Le gaz de sortie passe à travers un condenseur réfrigéré pour éviter l'évaporation des composés volatiles.
Les échantillons de culture ont été collectés à l'aide d'une seringue. Les données de fermentation sont exprimées en fonction du temps ou de l'avancement de réaction, 1-S/SO ou S = concentration en glucose et SO = concentration initiale en glucose.
b - Méthodes analytiques La croissance est suivie par la mesure de la densité optique à 600 nm et par le comptage du nombre de cellules sur un appareil de type Coulter Counter (ZBI) sur un prélèvement d'une fraction aliquote de milieu de culture.
Les métabolites sont dosés dans le surnageant, après centrifugation à 13000 rpm pendant 5 minutes des prélèvements réalisés. La concentration en glucose, glycérol, éthanol, pyruvate, succinate, acétate, acétogluatarate et 2-hydroxygluatarate est déterminées par high-pressure liquid chromatographie (HPLC) en utilisant une colonne de type HPX-87H (Bio-Rad). La concentration en acétaldéhyde est déterminée par la méthode enzymatique décrite par Lundquist, (1974). La concentration en acétoïne et en 2,3-butanediol a été déterminée par chromatographie en phase gazeuse comme précédemment décrit (Michnick et al., 1997).
c - Extraits cellulaires et activité NADH oxydase Les extraits cellulaires de levure ont été préparés à partir 1 x 109 cellules collectées dans le réacteur. Après centrifugation 5 minutes à 3000 rpm, les cellules sont lavées avec un tampon KH2PO4 100 mM, pH 7 puis avec un tampon KH2PO4 10 mM, pH 7. 100 mg de levures (poids humide) sont alors broyées par addition de 1 g de billes de verre (0 = 0,5 mm) et 0,5 ml de tampon KH2PO4 50 mM pH 7 contenant 1 mM DTT et 2 mM MgCl2. Le tube est agité 1 minute au vortex et placé 1 minute dans la glace. L'opération est répétée 5 fois. Après centrifugation 1 minute à 13000 rpm, le surnageant est récupéré et constitue l'extrait cellulaire.
Les activités enzymatiques sont déterminées extemporanément. L'activité spécifique NADH oxydase dans les extraits cellulaires est mesurée au spectrophotomètre à 25 C dans un volume total de 1 ml contenant 50 mM de tampon phosphate de potassium (pH 7), 0,3 mM NADH et 0, 3 mM EDTA. La réaction est initiée par addition de 5 à 50 pl d'extrait cellulaire, et suivie par la diminution d'absorbance à 340 nm. La concentration en protéines est déterminée en utilisant le kit BC Assay (Uptima, Interchim).
d - Extraction et mesure des teneurs intracellulaires en NADH/NAD Les métabolites sont extraits comme décrit par Gonzalez et al., (1997). Cinq millilitres de culture cellulaire sont ajoutés à 26 ml d'une solution glacée contenant 60% (vol/vol) méthanol et 175 mM HEPES (pH 7,5). Le mélange est centrifugé à 5000 g pendant 30 s à -10 C. Les métabolites intracellulaires sont extraits avec 5 ml d'une solution bouillante d'éthanol absolu/1M HEPES (pH 7,5)/H20 (750/70/180 vol/vol/vol) et incubés pendant 5 min à 80 C. Les extraits sont placés dans la glace pendant 5 minutes. Après addition de 2 ml d'éthanol absolu, les extraits sont séchés sous vide pendant 4 min à 70 C dans un rotavapeur (modèle Laborota 4000; Heidolph Instruments LLC, Cinnaminson, N.J.). Le résidu est resuspendu dans un volume final de 1 à 2 ml d'eau distillée et stocké à -80 C pour utilisation ultérieure. Le volume d'extrait est mesuré par pesée.
Les concentrations en cofacteurs sont déterminées à partir de réactions enzymatiques couplées au NAD(H)- comme décrit ci dessous.
La quantité de NADH produit pendant la réaction est déterminée par spectrophotométrie de fluorescence (longueur d'onde d'excitation, 340 nm; longueur d'onde d'émission, 460 nm) en utilisant un spectrophotomètre de fluorescence Perkin Elmer LS 50B. Les réactions enzymatiques sont réalisées à 30 C dans un volume total de 2 ml de tampon de réaction contenant 4,25 mM Tris-NH4CI (pH 7,0), 25 pM dihydroxyacetone phosphate, et 125 pM a-ketoglutarate, comme décrit par Klingenberg (1974). Des fractions aliquotes de 5 à 100 pl d'échantillons sont ajoutées au tampon de réaction. Une ligne de base est obtenue. Un microlitre de glycérol-3phosphate déshydrogénase (170 U.mr1; Roche), puis 1 pl de glutamate déshydrogénase NADPH-dépendante (240 U.ml-l; Roche) sont successivement ajoutés. Chaque addition est réalisée après obtention d'un signal stable.
La concentration en NAD est déterminée comme décrit précédemment (Bergmeyer, 1955). Le tampon de réaction contient 1,8 ml d'un mélange de 0,2 M glycine et 0,4 M hydrazine hydrate (pH 9), 85 mM éthanol et 5 à 200 pl d'extrait dans un volume total de 2,01 ml. Après obtention de la ligne de base, 1 pl d'alcool déshydrogénase (882 U.mr 1; Roche) est ajouté.
Les concentrations en cofacteurs dans les échantillons sont calculées par une méthode de calibration externe, permettant de déterminer le coefficient de 30 réponse de chaque cofacteur. Les mesures sont réalisées en triplicat.
2. Résultats Des fermentations en mode batch, en conditions de microoxygénation (c.f. 5a) ont été réalisées afin d'analyser l'impact de l'expression de l'oxydase sur la croissance, la dégradation du sucre, la production de métabolites et la concentration intracellulaire en cofacteurs NAD, NADH.
Les fermentations ont été réalisées avec les souches exprimant la NADH oxydase V5noxE, V5pVTZEO-TDH3noxE, V5pVTZEO-ADH 1 noxE et les souches témoins V5, V5pVTZEO-TDH3 et V5pVTZEO-ADH1. Le débit d'air utilisé dans cette expérience est maintenu constant tout au long de la fermentation à 17 ml/min ce qui correspond à une vitesse de transfert d'oxygène de 10 mg/I/h. Dans ces conditions, la totalité de l'oxygène est consommé par la souche témoin V5 (Figure 4).
L'activité spécifique de la NADH oxydase a été mesurée dans les différentes souches à 2 stades de la fermentation (Tableau 2) en milieu de phase exponentielle (17h de culture) et en phase stationnaire (40h).
Tableau 2: Activité spécifique de la NADH oxydase des souches V5, V5 pVT100-UZEO, V5noxE, V5 pVTZEO-TDH3noxE, V5 pVT ZEO-ADH1noxE sur 15 milieu MS avec apport constant de 10 mg/I/h d'oxygène.
Activité spécifique de la NADH oxydase en U/mg de protéine Souche Phase exponentielle de Phase stationnaire croissance V5 nd nd V5noxE 0,36 0, 04 0,14 0,01 V5 pVTZEO-TDH3noxE 1,48 0,13 0,51 0,02 V5 pVTZEO-TDH3 nd nd V5 pVTZEO-ADH1noxE 0,28 0,03 0,59 0,07 V5 pVT100-UZEO nd nd nd: non détectée En conditions oenologiques, la phase de croissance est courte.
L'épuisement en azote assimilable du milieu provoque une entrée rapide en phase stationnaire (après environ 30h), alors que environ 30% des sucres initiaux sont consommés. La phase stationnaire représente donc une phase importante pendant laquelle la majorité des sucres (environ 70%) est dégradée.
Comme attendu, aucune activité NADH oxydase n'est détectée dans les extraits cellulaires de la souche témoin et des souches transformées par les plasmides vides, alors qu'une activité significative est mesurée dans les souches exprimant le gène noxE, ce qui indique que l'enzyme codée par le gène bactérien noxE s'exprime bien chez S. cerevisiae. L'activité maximale obtenue (1,48 U/mg protéine) est environ 7 fois supérieure à celle mesurée dans un extrait cellulaire de L. Lactis (Lopez de Felipe et Hugenholtz, 2001).
La NADH oxydase est exprimée pendant toute la durée de fermentation, avec un niveau d'activité spécifique environ 3 fois plus élevé en phase de croissance comparativement à la phase stationnaire lorsque le gène noxE est placé sous contrôle du promoteur TDH3. L'inverse est observé avec le promoteur ADH1, le niveau d'activité spécifique est 2 fois plus élevé en phase stationnaire qu'en phase de croissance. Le niveau d'activité varie considérablement selon le promoteur utilisé et le nombre de copies du gène. Le promoteur TDH3 permet d'obtenir d'une activité 5 fois supérieure à celle obtenue avec le promoteur ADH1 en phase de croissance alors que les niveaux d'activité spécifique sont similaires pour les 2 constructions en phase stationnaire. Lorsque noxE est placé sous contrôle de TDH3, l'activité obtenue en multicopie est environ 3 fois supérieure à celle obtenue dans la souche ayant intégré cette cassette en une copie.
L'impact de l'expression de l'oxydase a été analysé par suivi de la croissance, de la dégradation du glucose, et de la formation d'éthanol, glycérol, acétate, acétaldéhyde, pyruvate, a-cétoglutarate 2hydroxyglutarate, acétoïne, butanediol et biomasse tout au long de la fermentation. Le tableau 3 montre les rendements en biomasse et produits obtenus après arrêt de la fermentation.
Tableau 3: Rendement de production des principaux métabolites fermentaires, biomasse, balance carbone et degré de réduction des souches V5, V5 pVT100-UZEO, V5noxE, V5 pVTZEO-TDH3noxE, V5 pVT ZEO-ADH1noxE sur milieu MS avec apport constant de 10 mg/I/h d'oxygène Rendement (g métabolite produit / g de glucose consommé)b'c Souches Avancement Ethanol CO2a Balance réaction a- 2-carbone Glycerol Acétate Acétaldehyde Pyruvate cétoglu tarate Hydroxyglutarate Acétoïne Butanediol Biomasse (%) 0,5 0, 464 0,232 0,042 0,010 0,004 0,0027 0,025 0,0025 0,025 0,010 V5 (0,009) (0, 005) 0,001) (0,001) (0,001) (0,0001) (0,002) (0,0001) (0,010) (0,002) 0, 064 1 0,460 0,230 0,028 0,013 0,003 0,0007 0,014 0,0015 0,026 0,012 (0, 000) (0,000) (0,000) (0,001) (0,000) (0,0002) (0,001) (0,0001) (0,009) (0, 001) 0,031 104,5 0,463 0,232 0,038 0,009 0,005 0,0024 0,002 0,0017 V5 pVT100- 0,5 ND UZEO (0,004) (0,002) (0,012) (0,000) (0,001) (0,0005) (0, 001) (0,0002) ND 0,059 1 0,457 0,229 0,025 0,012 0,002 0,0006 0,001 0, 0016 (0,003) (0,002) (0,006) (0,000) (0,000) (0,0001) (0,000) (0,0001) ND ND 0,031 96,8 0,5 0,459 0,230 0,035 0,010 0,004 0,0016 0,003 0,0038 V5pVTZEO- (0,003) (0,002) (0,002) (0,000) (0,000) (0,0001) (0,000) (0, 0007) ND ND 0,059 TDH3 1 0,472 0,236 0,021 0,012 0,002 0,0008 0,002 0, 0024 ND ND (0,004) (0,002) (0,000) (0,000) (0,000) (0,0000) (0,000) (0, 0003) 0,025 97,6 V5noxE 0,5 0,398 0,199 0,032 0,034 0,013 0,0041 0,003 0, 0008 0,063 0,011 0,025 101 (0,002) (0,001) (0,001) (0,003) (0,002) (0, 0005) (0,000) (0,0000) (0,005) (0,000) V5pVTZEO- 0,5 0,397 0,199 0,027 0, 027 0,011 0,0037 0,002 0,0022 ADH1noxE (0,002) (0,001) (0,006) (0,001) (0, 004) (0,0005) (0,001) (0,0001) ND ND 0,023 89,5 V5pVTZE00,5 0,393 0,197 0, 030 0,032 0,011 0,0044 0,005 0,0013 TDH3noxE 'S (0,001) (0,000) (0,000) (0,002) (0,002) (0,0002) (0,000) (0,0001) ND ND 0,028 89,7 CO2 estimé à partir production éthanol b Les valeurs entre parenthèses sont les écart types calculés sur 2 expériences ND: non déterminé Dans les conditions de microoxygénation utilisées, les 3 souches exprimant l'oxydase ne consomment que la moitié (soit environ 100 g/I) des sucres présents, contrairement aux souches témoins qui achèvent la fermentation. Les effets de l'oxydase sur le métabolisme central ont donc été analysés en comparant les rendements en biomasse et principaux sous produits fermentaires à mi fermentation (avancement de réaction 0,5). A titre informatif, les rendements obtenus après dégradation de la totalité des sucres (200 g/I) sont indiqués pour les souches témoin (avancement de réaction 1).
Une baisse très significative (15%) du rendement éthanol est observée pour les 3 souches exprimant l'oxydase à NADH par rapport aux souches témoins cultivées dans les même conditions (souche non transformée et souche portant un plasmide vide).
Par ailleurs le métabolisme central des souches exprimant l'oxydase est particulièrement affecté. Le rendement de production de l'acétaldéhyde, acétate, pyruvate et acétoine est augmenté en réponse au ralentissement du flux de carbone vers la production d'éthanol, alors que celui du glycérol est réduit. La présence de plasmide vide (pVTZEO-ADH1 et pVTZEO- TDH3) interférant avec les productions d'a-cétoglutarate et de 2hydroxyglutarate, seules les différences observées entre les souches V5 et V5noxE sont prises en compte, montrant une forte diminution de la production de ces composés dans la souche V5noxE.
L'analyse des résultats (Tableau 3, et données cinétiques non montrées) ne fait apparaître aucune différence significative entre les trois souches exprimant l'oxydase, que ce soit au niveau de la croissance ou des profils métaboliques, malgré des niveaux d'activités très différents (Tableau 2).
L'analyse détaillée de l'impact de l'expression de l'oxydase sur la croissance, la vitesse de fermentation et les profils métaboliques est présentée uniquement pour la souche V5noxE, en comparaison à la souche V5 (Figure 5). La diminution du rendement de production en éthanol chez la souche V5noxE est visible dés le début de la fermentation. Cette diminution conduirait à une réduction de 17 g/I d'éthanol soit 2 d'alcool dans le produit fini si tout le glucose était consommé. En fin de fermentation, 100g de glucose sur 200g sont consommés par la souche V5noxE.
La production de glycérol est également diminuée dès le début de fermentation. L'oxydase, en réoxydant une partie du NADH intracellulaire, entre donc en compétition d'autres enzymes levuriennes utilisant ce cofacteur. En particulier, les deux réactions NADH dépendantes catalysées par l'alcool déshydrogénase (ADH) et la glycérol 3-P déshydrogénase (GPDH) sont limitées du fait de la moindre disponibilité en NADH. Ces résultats montrent une utilisation très efficace de ce cofacteur par la NADH oxydase, en accord un Km NADH de 4,1 pM déterminé sur l'enzyme purifiée de L. lactis, (Lopez de Felipe et Hugenholtz, 2001). L'affinité de la NADH oxydase pour le NADH est plus élevée que celle de l'ADH (110 pM) et de la GPDH (23 pM) (Teusink et al., 2000) levuriennes.
La première conséquence de la limitation du flux de carbone vers la synthèse d'éthanol est une augmentation de la production d'acétaldéhyde et d'acétate chez les transformants. La synthèse d'acétate génère principalement du NADPH, via les acétaldéhyde déshydrogénases Ald6p et Ald5p localisées dans le cytoplasme et dans la mitochondrie respectivement (Saint-Prix et al., 2004). La souche V5noxE présente également une forte diminution de la production d'acétoglutarate. Cet effet pourrait être dû au surplus de NADPH lié à l'augmentation de synthèse d'acétate. En effet la synthèse du glutamate à partir de l'a- cétoglutarate via la glutamate déshydrogénase est une voie très consommatrice de NADPH (Nissen et al. 1997) (Figure 1). Le fait qu'un mutant V5ald6 présente une augmentation de la production d'a- cétoglutarate en réponse à un déficit en NADPH (Saint-Prix et al., 2004) va dans le sens de cette hypothèse.
L'hydroxyglutarate est une forme réduite de l'a-cétoglutarate (Figure 1) et pourrait avoir un rôle de soupape rédox à NADH (Albers et al., 1998). La baisse de sa production dans la souche V5noxE pourrait donc provenir d'une moindre disponibilité de substrat (a-cétoglutarate) et/ou d'une moindre disponibilité en NADH due à la compétition avec l'oxydase à NADH. Notons que la déshydrogénase impliquée, NADH dépendante, n'est pas identifiée chez S. cerevisiae.
L'augmentation d'acétate peut être liée à l'accumulation de son précurseur, l'acétaldéhyde, dont la production est augmentée de façon drastique et très précoce. Il est intéressant de noter un arrêt précoce (autour de 20h) de la croissance de la souche V5noxE, alors qu'à ce stade la concentration en acétaldéhyde dans le milieu atteint 1,1 g/I au lieu de 0,2 g/I pour la souche témoin. Le nombre de cellules atteint par V5noxE est trois fois plus faible que celui de la souche sauvage. L'acétaldéhyde est un composé toxique pour la levure. Il affecte négativement la formation de biomasse (Aranda et del 01mo, 2004; Liu et Pilone, 2000) et à forte concentration la vitesse de fermentation (Roustan et Sablayrolles, 2002). Sa forte polarité induit un stress hydrique chez la levure (Hallsworth, 1998;. Liu et Pilone, 2000). La forte accumulation d'acétaldéhyde pourrait donc être responsable des effets négatifs de l'oxydase sur la croissance et la fermentescibilité des sucres. Cette toxicité pourrait être pénalisante en présence d'une forte expression de l'oxydase et pourrait expliquer qu'un même effet soit obtenu lorsque le gène noxE est exprimé en multicopies ou intégré.
Chez la levure, l'acétaldéhyde peut être métabolisé en acétoïne et en 2,3butanediol (Figure 1), composés non toxiques pour la levure. L'acétoïne est produit par la condensation de 2 molécules d'acétaldéhyde par la pyruvate décarboxylase (PDC), puis réduit en 2,3-butanediol par la butanediol déshydrogénase (BDH). Cette réduction est NADH dépendante (Gonzalez et al., 2000). Le dosage de ces composés chez les souches V5 etV5noxE montre que le niveau d'acétoïne est pratiquement doublé chez la souche V5noxE alors que la production de butanediol reste semblable pour les 2 souches. Ces résultats montrent que l'oxydase à NADH entre également en compétition avec la BDH dont le Km est de 55 pM pour le NADH. Du fait du ralentissement de cette réaction, l'acétaldéhyde accumulé ne peut être résorbé, et affecte à la fois la croissance et l'activité fermentaire. En appui de cette hypothèse, il a été observé qu'une addition de 900 mg/I d'acétaldéhyde affecte la croissance de la souche V5 de manière transitoire, la conversion de ce composé en acétoïne puis en 2, 3-butanediol permettant une reprise rapide de la croissance.
Afin d'évaluer l'impact de l'oxydase sur l'équilibre d'oxydoréduction intracellulaire, nous avons mesuré la concentration intracellulaire en cofacteurs réduits et oxydés NADH et NAD à deux stades différents de la fermentation alcoolique en conditions de microoxygénation contrôlées à vitesse de transfert constante 10mg/l/h. Les résultats, indiqués Tableau 4, montrent une diminution très marquée de la concentration intracellulaire en NADH, qui diminue de 80% par rapport à la souche témoin. Ces données montrent que la NADH oxydase affecte de manière drastique le pool NADH/NAD, et que la levure, dans ces conditions, n'est pas capable de rééquilibrer sa balance d'oxydoréduction. Le ratio NADH/NAD est en effet très diminué aussi bien en phase de croissance qu'en phase stationnaire, par rapport à la souche témoin.
Tableau 4: Concentrations intracellulaires en NAD et NADH des souches V5 et V5noxE sur milieu MS avec apport constant de 10 mg/l/h d'oxygène.
En conclusion, ces données montrent que l'expression d'une NADH oxydase chez S. cerevisiae diminue fortement le pool de NADH intracellulaire, entraînant une déviation importante des flux carbonés, qui se traduit notamment par une diminution très significative du rendement de production de l'éthanol, une augmentation de l'acétaldéhyde et dérivés acétate et acétoïne, et une diminution de la formation de glycérol, de l'a-cétoglutarate et de l'hydroxyglutarate. L'accumulation d'acétaldéhyde rapide et importante d'acétaldéhyde entraîne des effets défavorables au niveau de la fermentation et de la croissance. En effet, ce composé ne peut pas être éliminé par la cellule, du fait d'une diminution de l'efficacité du système de détoxication constitué par la BDH, due au déficit en NADH. Afin de limiter ces effets indésirables, les inventeurs ont étudié l'impact d'une diminution de l'apport en oxygène (exemple 3), puis d'un apport d'oxygène limité à la phase stationnaire (exemple 4).
Exemple 3: Expression de la NADH oxydase lors de la fermentation avec différents apports en oxygène 1. Conditions de culture et de microoxygénation Les conditions utilisées sont telles que décrites dans l'exemple 2, paragraphe a.
Concentration en cofacteurs en pmoles / g de biomasse Phase exponentielle de croissance Phase stationnaire Souche NADH NAD NADH/NAD NADH NAD NADH/NAD 0,05 0,â8 0,13 0,04 0,02 0,15 2,83 V5 0,36 2,70 V5noxE 0, 07 3,93 0,04 3,75 0,00 0,00 0,02 0,10 2. Méthodes analytiques Les méthodes analytiques sont telles que décrites dans l'exemple 2, paragraphe b.
3. Résultats Des fermentations en mode batch ont été réalisées avec différentes conditions de microoxygénation afin de déterminer l'apport minimal en oxygène nécessaire à une déviation du flux carboné. En effet, alors que la souche sauvage consomme la totalité de l'oxygène apporté à une vitesse de 10 mg/I/h (Figure 4), la souche V5noxE ne consomme pas tout l'oxygène apporté, du fait probablement de la réduction de biomasse.
Les cinq conditions d'oxygénation testées sur la souche V5noxE correspondent à des vitesses maximales de transfert de 2, 4, 6, 7 et 10 mg/I/h d'oxygène. Pour chaque condition, la production des différents métabolites ainsi que de la consommation de l'oxygène ont été suivis tout au long de la fermentation. Le Tableau 5 montre les effets obtenus sur le rendement de production en éthanol, l'accumulation d'acétaldéhyde, la dégradation du glucose, la croissance et la consommation de l'oxygène.
2887258 28 Tableau 5: 02 dissous, rendement éthanol, concentration en acétaldéhyde, consommation du glucose et biomasse finale pour la souche V5 à 10m g/l/h d'O2 transféré et pour la souche V5noxE à différentes vitesses de transfert (OTR).
a pourcentage de saturation en air du milieu, la sonde indique 100% lorsque la concentration en oxygène dans le milieu (MS 20%glucose) est de 6,4mg/l.
b g éthanol produit par g glucose consommé La diminution du rendement en éthanol observée pour la souche V5noxE à 10 mg/l/h d'O2 transféré par rapport à la souche V5 est observée avec la même intensité si l'on réduit la vitesse de transfert à 7 et 6 mg/l/h. A ces trois vitesses d'apport, l'O2 n'est pas limitant pour la souche V5noxE puisque les quantités minimales d'O2 dissous mesurées dans le milieu sont de 38, 27 et 24% respectivement. Par contre, en conditions d'apport à 4 et 2 mg/l/h d'O2 transféré, l'oxygène devient limitant pour la souche V5noxE. Dans ces conditions, le rendement de production de l'éthanol est similaire à celui obtenu pour la souche V5 avec apport d'02 à Io mg/l/h.
La réduction du rendement de production en éthanol s'accompagne d'une accumulation d'acétaldéhyde, corrélée à une réduction de la biomasse d'environ 60% et une consommation incomplète (environ la moitié) du substrat. Le défaut de croissance est également observé dans les deux cas où l'O2 n'est pas limitant, quoique de façon moins marquée pour 2 mg/l/h d'O2 transféré.
02 Rendement Souche OTR max résiduels éthanolb (mg/l/h) (%) (g/g) Glucose consommé (% glucose initial) Biomasse finale (x 10') V5 10 0 0, 460 100 27 38 0,397 48 9 7 27 0,396 46,5 9 V5noxE 6 24 0,379 45 9 4 0 0, 469 97 10 2 0 0,481 100 17 Dans toutes les conditions d'oxygénation testées, la production de glycérol reste inférieure à celle obtenue pour la souche sauvage cultivée à 10 mg/l/h d'02, ce qui indique que l'apport en 02 est suffisant pour permettre un fonctionnement de l'oxydase.
Ces données permettent de conclure que la NADH oxydase est fonctionnelle avec de très faibles vitesses de transfert d'O2, mais que l'oxygène doit préférentiellement être apporté en conditions non limitantes pour observer une diminution significative du rendement de production de l'éthanol.
Exemple 4: Expression de la NADH oxydase lors de la fermentation avec apport d'oxygène limité à la phase stationnaire (découplage phase de croissance de la phase d'expression) 1. Conditions de culture et de microoxygénation Les conditions utilisées sont telles que décrites dans l'exemple 2, paragraphe a.
2. Méthodes analytiques Les méthodes analytiques sont telles que décrites dans l'exemple 2, paragraphe b.
3. Résultats Afin de limiter les effets secondaires sur la croissance et la fermentescibilité des sucres liés à l'expression de l'oxydase, la phase d'activité de l'oxydase à NADH a été découplée de la phase de croissance. Pour cela, des fermentations en mode batch ont été réalisées en conditions anaérobies jusqu'à 28h de fermentation (fin de la phase de croissance), puis en conditions de microoxygénation contrôlée à partir de l'entrée en phase stationnaire puis pendant toute cette phase.
Les fermentations ont été réalisées avec la souche exprimant la NADH oxydase V5noxE et la souche témoin V5. Un débit d'air de 17 ml/min, correspondant à une vitesse maximale de transfert d'oxygène de 10 mg/I/h, est imposé à partir de 28h et maintenu constant jusqu'à la fin de la fermentation. Dans ces conditions, la totalité de l'oxygène est consommée par la souche témoin V5, alors que l'oxygène reste majoritairement non limitant pour la souche V5noxE (Figure 6).
Les effets obtenus sur la croissance, la dégradation du glucose, la formation d'éthanol, acétate, acétaldéhyde, acétoïne et butanediol sont présentés Figure 7.
Un apport d'oxygène limité à la phase stationnaire, phase pendant laquelle 70% du glucose est consommé, permet une réduction de 7 g/1 de la teneur en éthanol soit 1 , par rapport à la souche témoin cultivée dans les même conditions.
La souche V5noxE, dans ces conditions, a une croissance identique à celle de la souche témoin, une biomasse finale identique (30.10' cellules) et est capable de fermenter la quasi totalité du glucose présent (près de 200 g/1). Dissocier la phase de croissance de la phase d'activité de la NADH oxydase permet donc de s'affranchir des effets secondaires observés précédemment, sur la croissance et la fermentescibilité.
L'alimentation en oxygène provoque, de manière attendue, une augmentation de la formation d'acétaldéhyde, qui reste cependant limitée à 400 mg/I, concentration qui n'affecte pas de manière drastique la fermentescibilité. La production d'acétate est légèrement augmentée par rapport à la souche témoin cultivée dans les mêmes conditions. Le flux carboné est également réorienté vers la formation d'acétoïne, alors que la production de 2,3 butanediol reste similaire entre les 2 souches et n'est pas affecté par l'apport d'O2.
Les résultats obtenus ont été comparés à ceux obtenus lors d'une fermentation oenologique standard, réalisée dans les mêmes conditions, mais en absence d'apport d'oxygène (conditions de forte anaérobiose) (Tableau 6).
Tableau 6: Concentration finale des principaux métabolites fermentaires et production de la biomasse des souches V5 et V5noxE sur MS en conditions d'apport de 10 mg/I/h d'oxygène en phase stationnaire et d'anaérobiose.
Concentrations finales (en g/I) sur MS 20% glucose Composé Apport de 10 mg/I/h d'02 à Anaérobiose 28h de culture V5 V5noxE V5 V5noxE Glucose 200 200 200 200 consommé 94,8 88 95,4 96,2 Ethanol CO2a 47,47 44 47,8 48,1 Glycérol 5,6 5,2 6,2 6 Acétate 1,2 2 0,6 0,6 Acétaldéhyde 0,2 0, 4 0,02 0, 02 Pyruvate 2,6 2 0,18 0,26 a-cétoglutatrate 1,2 1,4 0,8 0,8 Hydroxyglutarate 0,2 0,2 0,2 0,2 Succinate 0,6 0,6 0,4 0,4 Acétoïne 0,6 6 0 0 Butanediol 1,2 1,8 0,80 0,80 Biomasse 6 6 4 4 5: CO2 estimé à partir production éthanol En anaérobiose, la souche V5noxE se comporte comme la souche témoin, l'oxydase n'étant pas active. La production d'éthanol par la souche V5noxE en conditions de microoxygénation limitée à la phase stationnaire est diminuée de 8 g/I comparativement à celle de la souche sauvage en anaérobiose. Comparé au procédé traditionnel, l'utilisation d'une souche exprimant la NADH oxydase en conditions de microoxygénation contrôlée et découplée de la phase de croissance permet une réduction du degré éthanol qui atteint dans cet exemple 1 alcool.
Dans les conditions utilisées dans cet exemple, l'oxygène est limitant pendant les premières heures de l'apport, puis non limitant pendant la majeure partie de la phase d'oxygénation (Figure 6).
De manière générale, ces données montrent que limiter l'apport d'oxygène à une phase du procédé fermentaire (ici la phase stationnaire) permet une diminution significative de la production d'éthanol tout en restant compatible avec la physiologie levurienne et ses performances technologiques. L'expression de l'oxydase permet de modifier significativement les profils métaboliques. Une modulation fine de la quantité et de la durée des apports en 02 au cours du procédé fermentaire de la souche exprimant l'oxydase à NADH permet d'optimiser non seulement le niveau de réduction de la formation d'éthanol, mais également la formation d'autres sous produits fermentaires.
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Claims (19)
1. Souche de levure transformée appartenant au genre Saccharomyces qui comprend un acide nucléique hétérologue codant une NADH 5 oxydase produisant de l'eau.
2. Souche de levure transformée selon la revendication 1, l'acide nucléique hétérologue codant une NADH oxydase produisant de l'eau étant intégré dans le génome de ladite levure.
3. Souche de levure transformée selon la revendication 1 ou 2, ladite souche du genre Saccharomyces étant une souche Saccharomyces cerevisiae.
4. Souche de levure transformée selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle ladite NADH oxydase produisant de l'eau est d'origine bactérienne.
5. Souche de levure transformée selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans laquelle ledit acide nucléique hétérologue codant une NADH oxydase produisant de l'eau comprend une séquence sélectionnée dans le groupe constitué des séquences SEQ ID No.1, SEQ ID No.2, SEQ ID No.3, SEQ ID No.4, SEQ ID No.5 et SEQ ID No.6.
6. Procédé de préparation d'une souche de levure transformée appartenant au genre Saccharomyces qui présente, en fermentation alcoolique, un rendement de production d'éthanol réduit par rapport à la souche Saccharomyces sauvage, ledit procédé comprenant l'étape consistant à introduire au moins un acide nucléique hétérologue codant une NADH oxydase produisant de l'eau dans une souche de levure du genre Saccharomyces.
7. Procédé selon la revendication 6, dans lequel ledit acide nucléique hétérologue codant une NADH oxydase produisant de l'eau est introduit dans le génome de ladite souche de levure du genre Saccharomyces.
8. Procédé selon la revendication 6 ou 7, dans lequel ladite souche du genre Saccharomyces est une souche Saccharomyces cerevisiae.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 8, dans lequel ladite NADH oxydase produisant de l'eau est d'origine bactérienne.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 9, dans lequel ledit acide nucléique hétérologue codant une NADH oxydase produisant de l'eau comprend une séquence sélectionnée dans le groupe constitué des séquences SEQ ID No.1, SEQ ID No.2, SEQ ID No.3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5 et SEQ ID No.6.
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 10, dans 15 lequel le rendement de production d'éthanol de la souche genre Saccharomyces transformée par rapport à la souche sauvage du genre Saccharomyces est réduit de 1 .
12. Cassette d'expression comprenant une séquence codant une NADH oxydase produisant de l'eau d'origine bactérienne associée à des séquences de régulation de l'expression de ladite séquence codant une NADH oxydase produisant de l'eau dans la levure.
13. Vecteur comprenant la cassette d'expression selon la revendication 12.
14. Utilisation d'une souche de levure transformée appartenant au genre Saccharomyces selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, pour mettre en oeuvre une fermentation alcoolique.
15. Utilisation selon la revendication 14, pour la préparation d'une boisson fermentée ou en panification.
16. Procédé de fermentation comprenant les étapes consistant à : a) inoculer un milieu contenant une forte teneur en sucres avec au moins une souche de levure transformée appartenant au genre Saccharomyces selon l'une quelconques des revendications 1 à 5; b) cultiver ladite souche de levure transformée Saccharomyces; et c) laisser la fermentation se dérouler pour transformer les sucres en alcool.
17. Procédé de fermentation selon la revendication 16, ledit procédé étant un procédé de vinification et le milieu contenant une forte teneur en sucres étant un moût de raisins.
18. Procédé de vinification selon la revendication 17, dans lequel ladite au moins une souche de levure transformée Saccharomyces est initialement cultivée en conditions anaérobies, puis cultivée en conditions aérobies lorsque essentiellement la totalité de l'azote du moût de raisins est consommé.
19. Utilisation d'une souche de levure transformée appartenant au genre Saccharomyces selon l'une quelconques des revendications 1 à 5, pour régénérer du NAD+ à partir de NADH.
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