FR2735145A1 - Souches de levures presentant un bilan de fermentation alcoolique des sucres modifie et leurs applications, vecteurs utilisables pour l'obtention desdites souches. - Google Patents

Abstract

Souches de levures présentant un bilan de fermentation alcoolique des sucres modifié, notamment en ce qui concerne la production de glycérol et d'éthanol, vecteurs ou séquences, utilisables pour l'obtention desdites souches. Lesdites souches de levures sont sélectionnées parmi des souches de Saccharomyces, contiennent au moins un fragment du gène GPD1 codant pour une glycérol 3 phosphate déshydrogénase NADH-dépendante (GPDH), lequel fragment est modifié pour moduler la production de glycérol et d'éthanol, dans un milieu riche en sucres, pendant la fermentation alcoolique.

Description

La présente invention est relative à des souches de levures présentant un bilan de fermentation alcoolique des sucres modifié, notamment en ce qui concerne la production de glycérol et d'éthanol.

La présente invention est également relative à des vecteurs ou des séquences, utilisables pour l'obtention desdites souches.

Le glycérol est un composé extrêmement important dans les fermentations alcooliques industrielles réalisées par des levures, notamment parce qu'il s'agit du principal sous-produit de fermentation après l'éthanol et le CC2.

La production de glycérol, réalisée dans le cytoplasme, commence par la réduction du dihydroxyacétone phosphate (DHAP) en glycérol-3-phosphate, par une glycérol 3 phosphate déshydrogénase NADH-dépendante (GPDH, EC 1.1.1.8). L'enzyme est fortement inhibée par des concentrations élevées en éthanol (NAGODAWITHANA et al. J. Am.

Soc. Brew. Chem. 39, p. 179-183, 1977), des solutions de force ionique importante ainsi que par différents métabolites et cofacteurs NALER et al., Biochem. Biophys.

Acta, 571, p. 177-185, (1979)] . Elle est vraisemblablement activée par un ou des effecteurs [GANCEDO et al.,
European Biocem., 5, p. 165-172, (1968)]. Son poids moléculaire est de 42 kDa [NILSSON et ADLER, Biochem.

Biophys. Acta, 1034, p. 180-185, (1990)] ; la forme active présente par contre un poids moléculaire de 68 kDa, ce qui semblerait montrer que l'enzyme est active sous la forme d'un dimère [ALBERTYN et al., FEBS, 308, p.

130-132, (1992)]. Un gène, dénommé GPD1, responsable de la synthèse de l'enzyme a été récemment cloné et caractérisé [LARSSON et al., Mol. Microbiol. 10, p. 1101-1111, (1993) ; ALBERTYN et al., Mol. Cell. Biol. 14, p. 41354144, (1994)], mais sa disruption n'entraîne pas une perte totale d'activité GPDH, ce qui entraîne un maintien de la production de glycérol, y compris en anaérobiose, ce qui suppose l'existence d'un deuxième gène, GPD2, codant pour une isoenzyme.

La deuxième étape consiste en la déphosphorylation du glycérol-3-phosphate en glycérol par l'a-glycérophosphatase (glycérol 3-phosphatase ou G3Pase, EC 3.1.3.21), stéréospécifique du L-glycérol-3-phosphate.

Cette étape n'est pas considérée comme limitante.

Alors que le glycérol est produit dans le cytoplasme, les enzymes impliquées dans son assimilation sont, par contre, localisées dans la mitochondrie : glycérol kinase codée par GUT1 et une GPDH flavine adénine dinucléotide (FAD)-dépendante codée par GUT2.

Le gène GPD1 [LARSSON et al., 1993 et ALBERTYN et al., 1994, précités], obtenu à partir de la levure
Saccharomyces cerivisiae comprend 1176 pb et code pour la
GPDH précitée (ou GPDlp), protéine de 391 amino-acides.

Le glycérol est synthétisé dans la levure en réponse à deux conditions environnementales différentes
- Le choc osmotique
La production de glycérol est augmentée en réponse à ce stress. Le glycérol sert de soluté permettant d'ajuster la pression osmotique intracellulaire en fonction de celle du milieu. Lors du stress osmotique, la synthèse de GPDlp (GPDH exprimée par le gène GPD1) est augmentée de façon importante.

- L'anaérobiose et en particulier l'état redox de la cellule
La formation du glycérol pendant la fermentation alcoolique est un moyen pour la cellule d'équilibrer sa balance d'oxydoréduction (balance déséquilibrée notamment au cours de la croissance cellulaire) , en fournissant un système accepteur d'électrons complémentaire (figure 1).

L'étude de mutants osmosensibles osgl-l, (LARSSON et al., 1993, précité), montre qu'ils sont incapables de croître dans un milieu à faible poten tiel en eau et présentent à a fois une diminution significative de la production du glycérol et de l'activité de la GPDH.

ALBERTYN et al., 1994, précité, ont également séquencé le même gène GDP1 et ont plus particulièrement étudié la régulation de l'expression de la GDPlp chez S.

cerevisiae par la voie métabolique HOG (= High-Osmolarity
Glycerol response). L'effet physiologique prééminent, dans les levures ayant subi un choc osmotique, est l'augmentation intracellulaire de la production de solutés compatibles pour contrebalancer la pression osmotique (essentiellement production de glycérol). Le gène GDP1 et un taux de production élevé de glycérol sont essentiels à la croissance des levures, en présence d'un choc osmoti que .

Pour étudier la régulation de la production de glycérol, ces Auteurs ont réalisé des études de surexpression et de délétion du gène GPD1. La surexpression est réalisée en sous-clonant le gène GPD1 dans un plasmide multicopies YEplacl81 (= YEpGPDl). Les transformants (levures de laboratoire) portant le plasmide multicopies
YEpGPDl, présentent une activité enzymatique GPDH-NADH dépendante, supérieure d'un facteur 5 à 7, par rapport à l'activité enzymatique des cellules non transformées toutefois, de tels transformants, bien qu'ils surproduisent l'enzyme ( GPDlp), ne présentent pas de taux plus élevés en glycérol, dans un milieu de culture contenant du glucose, alors que lorsque du galactose est utilisé à la place du glucose, les mêmes transformants produisent environ 3 à 5 fois plus de glycérol que les cellules nontransformées.Toutefois, l'étude du choc osmotique sur ces cellules transformées, a conduit les Auteurs de cet article à préciser que les cellules surproduisant la GPDH n'apparaissent pas comme étant plus résistantes au choc osmotique que les cellules sauvages, ceci étant sans doute lié au fait qu'elles ne produisent pas plus de glycérol, lors d'une fermentation alcoolique.

La modulation de la production de glycérol (augmentation ou diminution) et du rapport glycérol/éthanol, pendant la fermentation alcoolique, présente un intérêt dans l'industrie agro-alimentaire : oenologie, brasserie, distillerie, boulangerie.

En oenologie, le glycérol est un composé important en ce qui concerne les qualités organoleptiques du vin. Il apporte notamment une propriété de "moelleux", et un léger goût sucré. La concentration moyenne de glycérol dans les vins est de 5 à 12 g/l ; la variabilité observée dépend de différents paramètres, tels que la composition du milieu et les conditions de croissance, et aussi la nature de la souche utilisée.

L'obtention de teneurs plus élevées en glycérol a deux intérêts majeurs
1) une amélioration des qualités organoleptiques du produit, et
2) une diminution de la teneur en éthanol. En effet, le glycérol produit normalement au cours de la fermentation alcoolique est la résultante du fonctionnement d'un système accepteur d'électrons complémentaire, destiné à équilibrer la balance générale d'oxydoréduction de la glycolyse. Le rôle prépondérant du glycérol en anaérobiose est donc la réoxydation du NADH (figure 1).

L'amplification de la production de glycérol va d'une part limiter le flux de carbone normalement utilisé vers la production de pyruvate puis d'éthanol, et d'autre part, provoquer un déséquilibre de la balance d'oxydoréduction, par utilisation accrue du pool de NADH.

Ce déséquilibre pourra être compensé par une limitation de la principale voie impliquée dans la régénération du
NAD (voie de synthèse de l'éthanol) au niveau de la conversion acétaldéhyde vers l'éthanol.

L'obtention de teneurs faibles en glycérol, accompagnées d'une augmentation de la teneur en éthanol, présente un intérêt, notamment dans le domaine de la distillerie.

C'est pourquoi la Demanderesse s'est donné pour but de pourvoir à des souches de levures trans for- mées qui répondent mieux aux besoins de la pratique que les souches transformées de l'Art antérieur, notamment en ce qu'elles permettent effectivement, soit l'amplification de la production de glycérol, soit la réduction de la production de glycérol, avec une modification concomitante du rapport glycérol/éthanol.

La présente invention a pour objet des souches de levures, caractérisées en ce qu'elles sont sélectionnées parmi des souches de Saccharomyces, en ce qu'elles contiennent au moins un fragment du gène GPD1 codant pour une glycérol 3 phosphate déshydrogénase NADH-dépendante (GPDH), lequel fragment est modifié pour moduler la production de glycérol et d'éthanol, dans un milieu riche en sucres, pendant la fermentation alcoolique.

Lesdites souches de Saccharomyces sont, de préférence, des souches industrielles, notamment des souches oenologiques, de distillerie, de brasserie ou de boulangerie.

Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, lesdites levures appartiennent à l'espèce
Saccharomyces cerevîsîae.

A titre d'exemple, on peut citer la souche
ScV5M, dérivée d'une souche industrielle oenologique.

On entend, au sens de la présente invention, par milieu riche en sucres, un milieu contenant plus de 20 g/l de sucres (glucose, fructose, mélasses, par exemple).

De manière avantageuse, l'invention prévoit, pour l'obtention de souches aptes à une production accrue de glycérol et une réduction de la production d'éthanol, sur un milieu riche en sucres, la construction suivante
Lesdites souches de Saccharomyces sont caractérisées en ce qu'elles contiennent au moins deux copies du gène GPD1 codant pour une GPDH NADH-dépendante, sous contrôle de séquences régulant l'expression dudit gène dans la levure.

Par "séquence régulant l'expression d'un gène", on entend des séquences de type promoteur et terminateur actives dans la levure. Les promoteurs et terminateurs de différents gènes peuvent être utilisés, associés à des combinaisons différentes. On utilisera, de préférence, des promoteurs et terminateurs d'un autre gène que le gène GPD1. On citera, à titre d'exemple non limitatif, les promoteurs et terminateurs, connus en euxmêmes, des gènes alcool-déshydrogénase I (ADHI), phosphoglycérate kinase (PGK) et glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH).

L'invention comprend également la cassette d'expression obtenue en associant lesdites séquences de régulation et le gène GPD1 ; cette cassette peut être portée par un plasmide, ou intégrée dans l'ADN chromosomique de la levure hôte.

L'invention englobe également des vecteurs d'expression, comprenant une cassette d'expression telle que définie ci-dessus, et utilisables pour l'obtention des souches de levures transformées conformes à l'invention.

Ces vecteurs pourront être sélectionnés sur la base de la nature et de la force des éléments régulateurs qui entrent dans la cassette d'expression. On peut choisir les promoteurs et terminateurs décrits plus haut, ou tout autre séquence permettant de contrôler l'expression d'un gène dans la levure.

Un autre critère du choix des vecteurs réside dans le nombre de copies de ceux-ci, qui est conditionné par le choix de l'origine de réplication.

Conformément à l'invention, le gène GPD1, associé à des séquences de contrôle, est porté par un plasmide réplicatif à haut nombre de copies, possédant comme origine de réplication dans la levure : une partie du plasmide 2R endogène, une séquence ARS chromosomique ou des séquences télomériques.

Préférentiellement, les vecteurs conformes à l'invention comportent également des marqueurs de sélection dans la levure, tels que des marqueurs d'auxotrophie : URA3, LEU2, HIS3, TRP1, ADE etc.... et/ou des marqueurs de résistance aux antibiotiques (G318, hygromycine B, chloramphénicol, pléomycine), à des herbicides (sulfométuron méthyle), au cuivre..

Avantageusement, les vecteurs conformes à l'invention sont des vecteurs navettes, possédant également une origine de réplication bactérienne et un marqueur de sélection dans une bactérie (par exemple, gène de résistance à un antibiotique).

Les plasmides conformes à l'invention, portant le gène codant pour la GPDH-NADH dépendante (ou GPDlp) de levure peuvent être introduits dans toutes souches de levure, par différentes techniques de transformation.

Parmi les techniques de transformation les plus courantes, on citera la technique des protoplastes, la technique de perméabilisation aux sels de lithium et lXélectroporation.

De manière surprenante, les levures Saccharomyces, transformées par un plasmide à haut nombre de copies, dans lequel le gène GPD1 est associé à des séquences régulatrices dudit gène, ont une production accrue en glycérol et une réduction de la production d'éthanol sur un milieu riche en sucres ; à titre d'exemple, des levures transformées conformes à l'invention permettent l'expression multicopies du gène GPD1 codant pour une GPDH, sous contrôle du promoteur fort ADHI (clone SIM7, par exemple) et ainsi une production significativement accrue de glycérol pendant la fermentation alcoolique, alors que l'expression multicopies de ce gène, sous contrôle de son propre promoteur, dans une levure de laboratoire [ALBERTYN et al. (1994)] n'avait jusqu'alors pas permis d'observer une augmentation de la production de glycérol.

Le procédé de construction des souches conformes à l'invention surexprimant la GPDlp et en conséquence surproduisant du glycérol, sur un milieu riche en sucres (fermentation alcoolique) comprend les étapes suivantes
- construction d'une cassette d'expression comprenant le gène GPD1 et des éléments régulateurs forts
- introduction de cette cassette en multicopies dans une levure.

Les souches de levures surproductrices de glycérol, conformes à l'invention trouvent de nombreuses applications dans l'agro-alimentaire. Elles sont utilisables partout où une fermentation alcoolique doit s'accompagner à la fois d'une diminution du taux en éthanol et d'une diminution du taux de sucres. Ceci est particulièrement intéressant dans le domaine de l'élaboration de boissons fermentées à teneur allégée en éthanol, que ce soit des vins ou des produits plus récents comme les "cocktails à base de vin". Dans cette dernière catégorie, par exemple, la teneur en sucre ne doit pas dépasser 80 g/l, et le degré final d'alcool 40C, ce qui suppose l'utilisation de moûts ayant une richesse en sucre de 140 g/l au maximum, ce qui est rarement le cas.

D'autres modèles tels que les pétillants de raisin sont également concernés.

De façon plus générale, on constate, depuis quelques années, une tendance affirmée de la consommation pour des produits moins riches en sucre mais aussi en éthanol, tout en conservant le goût sucré.

Or, les procédés physiques susceptibles d'être mis en oeuvre dans ce but osmose inverse, évaporation sous vide, présentent dans ce contexte, des limites, dans la mesure où ces techniques, en cours de développement, sont coûteuses et altèrent souvent la qualité des produits. Pour ces raisons, les souches de levure, conformes à l'invention, susceptibles de dégrader plus de sucre en produisant moins d'alcool au profit du glycérol (saveur sucrée) présentent des avantages incontestables. De plus, les levures surproductrices de glycérol, conformes à l'invention, présentent, au niveau de leur mise en oeuvre, l'avantage de ne pas nécessiter d'investissement particulier. En s'affranchissant des métabolismes traditionnels, on peut obtenir des produits originaux au sein du secteur des boissons fermentées.

Le secteur de la boulangerie est également concerné ; mais dans ce cas, c'est l'augmentation de la production intracellulaire en glycérol qui est recherchée ; de telles levures présentent, en effet, une plus grande osmotolérance et une résistance accrue à la congélation et au séchage.

Egalement de manière avantageuse, l'invention prévoit, pour l'obtention de souches aptes à une réduction de la production de glycérol, associée à une augmentation du rendement en éthanol, sur un milieu riche en sucres, la construction suivante
Lesdites souches de Saccharomyces sont caractérisées en ce qu'elles contiennent au moins une copie d'un gène GPD1 non fonctionnel, à la place d'au moins un gène sauvage GPD1.

Selon un mode de réalisation avantageux desdites levures, ledit gène GPD1 non fonctionnel est construit par délétion ou déphasage d'au moins un fragment de la phase ouverte de lecture dudit gène.

La délétion peut être notamment obtenue par digestion par au moins une enzyme de restriction, par PCR ou par tout autre moyen.

Le déphasage est notamment obtenu par mutagénèse ou insertion d'un fragment d'ADN.

Conformément à l'invention, ledit gène GPD1 non fonctionnel correspond notamment à une séquence GPD1 digérée par les enzymes de restriction BsmI et XbaI (délétion de 800 pb de la région codante de GPD1).

Selon un autre mode de réalisation desdites levures, ledit gène GPD1 non fonctionnel est associé à au moins une autre séquence nucléique, notamment un marqueur de sélection dans la levure, tels que des marqueurs d'auxotrophie : URA3, LEU2, HIS3, TRP1, ADE, [séquence hybride n'exprimant plus la protéine GPDlp (disruption de GPD1)].

Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, la séquence hybride obtenue est constituée par un gène GPD1 non fonctionnel correspondant à une séquence GPD1 digérée par les enzymes de restriction BsmI et XbaI (délétion de 800 pb de la région codante de GPDl), dans lequel est inséré une séquence URA3 (souche disruptante pour GDP1, dénommée DG3, par exemple).

Lesdites séquences du gène GPD1 non fonctionnel, conformes à l'invention, peuvent être introduites dans toutes souches de levure, de préférence en une seule étape de transformation par recombinaison homologue entre les extrémités du fragment modifié introduit et le gène
GPD1 chromosomique sauvage (double crossing over).

De manière surprenante, les levures Saccharomyces selon l'invention, ayant intégré un gène GPD1 non fonctionnel à la place d'un gène GPD1 sauvage, présentent une réduction de la production de glycérol et une augmentation de la production d'éthanol sur milieu riche en sucres.

Le procédé de construction des souches conformes à l'invention sous-exprimant la GPDlp et en conséquence sous-produisant du glycérol, sur un milieu riche en sucres (fermentation alcoolique) comprend, par exemple, les étapes suivantes
- construction d'une séquence hybride comprenant un fragment du gène GPD1 associé à au moins un marqueur de sélection dans la levure, tels que des marqueurs d'auxotrophie URA3, LEU2, HIS3, TRP1, ADE, laquelle séquence hybride n'exprime plus la protéine GPDlp (disruption de GPD1)
- introduction de ladite séquence hybride dans une levure.

Les souches de levures sous-productrices de glycérol, conformes à l'invention trouvent également application dans l'industrie agro-alimentaire. Elles sont utilisables partout où une fermentation alcoolique doit s'accompagner à la fois d'une augmentation du taux en éthanol et d'une diminution du taux de glycérol. Ceci est particulièrement intéressant dans l'industrie de la distillerie. Des souches de levure transformées, conformes à l'invention permettent d'obtenir une augmentation du rendement en éthanol, par diminution de la production en glycérol.

Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention, ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels
- la figure 1 représente la balance d'oxydoréduction pendant la fermentation alcoolique,
- la figure 2 représente la séquence des oligonucléotides Cl et 02 et leurs positions respectives dans le gène GPD1,
- la figure 3 illustre le clonage du gène GPD1 dans le plasmide pGEM-T,
- la figure 4 représente le clonage du gène
GPD1 dans le plasmide pVT100-U,
- la figure 5 représente l'évolution de la population cellulaire en fonction de l'avancement de réaction chez V5p (souche contrôle ScV5M transformée par le plasmide pVT100-U) (O) et SIM7 (souche ScV5M transformée par le plasmide pVTl00-U-GPDl) (e),
- la figure 6 représente la production de glycérol en fonction de l'avancement de réaction chez V5p (O) et SIM7 (C)
- la figure 7 représente l'évolution de l'activité spécifique GPDH chez V5p (O) et SIM7 (-) en fonction de l'avancement de réaction,
- la figure 8 représente l'immunodétection de la protéine GPDlp chez SIM7. Les fractions protéiques sont obtenues à différents moments d'avancement de réaction. Chaque dépôt protéique contient la même quantité de protéine (10 Rg)
- la figure 9 représente l'évolution de la population cellulaire chez V5p (O) et SIM7 (e), en fonction du temps (R(V5p)=ss(SIM7)=0,54 gén./h),
- la figure 10 représente l'évolution de la concentration en glucose restante dans le milieu chez V5p (O) et SIM7 (-), en fonction du temps (fermentation sur
YNB + 5 g/l de casaminoacides pH 3,4, 280C avec [glucose]=100 g/l),
- la figure 11 représente l'évolution de la production d'acétaldéhyde en fonction de l'avancement de réaction chez V5p (O) et SIM7 (-),
- la figure 12 illustre la disruption de GPD1,
- la figure 13 représente l'évolution de la population cellulaire chez V5p (O) et DG3 (souche ScV5M transformée par un fragment AGPDl-URA3) (A), en fonction du temps (fermentation sur 'NB + 5 g/l de casaminoacides pH 3,4, 280C avec [Glucose]=100 g/l),
- la figure 14 représente la production de glycérol chez V5p (o) et DG3 (o), en fonction de l'avancement de réaction,
- la figure 15 représente l'évolution de l'activité spécifique GPDH chez V5p (O) et DG3 (-), en fonction de l'avancement de réaction (fermentation sur
YNB + 5 g/l de casaminoacides pH 3,4, 280C avec [Glucose]=100 g/l). Les valeurs représentent la moyenne de 3 déterminations, les barres verticales illustrent les écart-types, et
- la figure 16 représente la production d'acétaldéhyde chez V5p (J) et DG3 (J), en fonction de l'avancement de réaction.

I1 doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.

EXEMPLE 1 : CLONAGE DE GPD1.

Le clonage de GPD1 a été réalisé par amplifié cation PCR, à partir d'ADN total de la souche ScV5M, à l'aide des deux oligonucléotides Cl et 02 (figure 2), choisis à partir de la séquence de GPD1 [LARSSON et al., (1993)]. Cette souche a été déposée le 18 Juin 1992 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, tenue par 1'INSTITUT PASTEUR, sous le numéro I-2222. Il s'agit d'une souche de laboratoire haploïde, ura-, MAT a, dérivée d'une souche oenologique.

1) Extraction de 1'ADN pénomipue de ScV5M
La souche ScV5M a été cultivée dans le milieu
YEPD, dont la composition est la suivante : extrait de levure 10 g/l, peptone 20 g/l, glucose 20 g/l. 10 ml de milieu YEPD sont ensemencés par ScV5M et incubés pendant une nuit à 280C. 50 ml de même milieu sont ensemencés à une DO (660 nm) de 0,05, et incubés à 280C, jusqu'à atteindre une DO (660 nm) de 4 à 6.

Les cellules sont récupérées par centrifugation pendant 10 minutes à 1000 g et l'ADN extrait selon la méthode décrite par VAN SOLIGEN et VAN DER PLAAT, J.

Bacteriol., 130, p. 946-947, (1977), avec quelques modifications
Le culot cellulaire est repris dans un tampon
SCE pH 7 (sorbitol 1,2 M, Na3 citrate 0,1M, EDTA 60 mM), avec 5 Al/ml de ss-mercaptoéthanol, et incubé 15 minutes à température ambiante.

- 5 mg/ml de zymolyase 20000 sont ajoutés à la suspension cellulaire, que l'on place à 370C pendant 45 minutes, jusqu'à obtention d'un taux de protoplaste supérieur à 90%.

- Les protoplastes sont récupérés par centrifugation 5 minutes à 350 g, puis repris dans 1 ml de tampon de lyse (Tris-HCl 0,2M pH 8, EDTA 0,1M, sarkosyl 1,5%) additionné de 100 A1 de protéinase K (20 mg/ml). La solution est incubée 1 h à 500C.

- La suspension est centrifugée 30 minutes à 15000 g, et le lysat récupéré. L'ADN est précipité par 0,05 volume d'acétate de sodium 3M pH 4,8 et 2 volumes d'éthanol. Le précipité est récupéré à l'aide d'une baguette de verre et dissous dans 500 A1 de tampon TE (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8). La concentration de 1'ADN en solution est déterminée par mesure de la DO à 260 nm.

2) AmPlification de GPD1 par PCR
A partir de la séquence de GPD1 [LARSSON et al., Mol. Microbiol., 10, p. 1101-1111, (1993)] deux oligonucléotides Cl et 02 ont été synthétisés. Cl est choisi en amont du codon d'initiation de la traduction.

02 est situé après le codon stop. Aux extrémités 5' de chaque oligonucléotide, ont été rajoutées des base supplémentaires, de façon à introduire un site de restriction Xhol pour Cl et BamHl pour 02. La séquence des oligonucléotides est indiquée sur la figure 2.

Les deux amorces ont été utilisées pour amplifier GPD1, à partir de l'ADN total isolé de ScV5M, dans les conditions suivantes
Amorce Cl 5 Al (20 pmoles)
Amorce 02 5 Al (20 pmoles)
Tampon TaQ 10X (PROMEGA) 10 A1
TaQ (PROMEGA, 5 U/R1) 0,5 A1
dNTP (2 mM) 10 R1 (100 ng)
MgCl2 (25 mM) 6 p1
H2O qsp 100 1
Conditions d'amplification : 30 secondes 940C, 30 secondes 390C, 1 minute 720C pendant 30 cycles, sur amplification Perkin-Elmer Cetus modèle 9600.

Le produit d'amplification est analysé sur gel d'agarose 0,8%. Une seule bande de 1300 paires de bases environ est observée, en accord avec la taille théorique de 1260 pb.

3) Identification du fragment amplifié
Afin de vérifier que le fragment cloné correspond à GPD1, le produit PCR a été sous-cloné dans le vecteur PGEM-T (PROMEGA), afin de déterminer partiellement sa séquence. Pour cela, le produit amplifié a été précipité en ajoutant au mélange d'amplification 0,25 volumes d'acétate d'ammonium 10N et 2,5 volumes d'éthanol. Après 15 minutes à -200C, la suspension est centrifugée 15 minutes à 15000g. Le surnageant est éliminé et le culot lavé dans les mêmes conditions par de l'éthanol 70%.

Après séchage, l'ADN est repris dans 50 Al de tampon TE.

100 ng d'ADN amplifié sont ligués à 50 ng de vecteur pGEM-T dans un mélange réactionnel final de 10 A1, en présence de 2 Rl de tampon 5X (GIBCO BRL) et de 1 unité de T4 ADN ligase (GIBCO BRL), pendant une nuit à 140C. La souche de E. coli DH5a (GIBCO BRL) de génotype F- ; endAl ; hsdR17 (K-, mK-) ; supE44 ; Thi-l ; recAl gyrA96 relAl, a été utilisée. Les protocoles utilisés pour la préparation des bactéries compétentes et ceux pour la transformation sont décrits par HANAHAN, DNA cloning, vol. 1, DM Glover (ed) IRL Press, p. 109-135, (1985). Le mélange de ligation a été utilisé pour transformer les bactéries compétentes DH5a.Les colonies obtenues ont été sélectionnées sur boîtes LB (bactotryptone 10 g/l, extrait de levure 5 g/l, NaCl 10 g/l) plus ampicilline (50 pg/ml). L'ADN des clones obtenus est ensuite extrait et analysé par digestion enzymatique [SAMBROOK et al., Molecular Cloning A laboratory manuel Cold Spring
Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor HN.Y., (1989)]. Un clone possédant l'insert de 1260 pb a été sélectionné. Le plasmide obtenu, appelé pGEMT-GPDl est représenté sur la figure 3.

L'insert a été séquencé par la méthode enzymatique de terminaison de chaîne [SANGER et al., Proc.

Natl. Acad. Sci. USA, 74, p. 5463-5467, (1977)] à l'aide du séquenceur automatique A370 piloté par le logiciel
A373 (APPLIED BIOSYSTEMS). Les amorces couplées aux ddNTP fluorescents qui ont été utilisées sont le T7 et M13 reverse. Les réactions de séquence ont été réalisées à l'aide du kit "PRISM Ready Reaction DyeDeoxy Terminator
Cycle Sequencing kit" (APPLIED BIOSYSTEMS) sur l'appareil thermocycleur Perkin-Elmer Cetus modèle 9600, conformément aux indications du fournisseur.

- Les séquences obtenues ont été analysées à l'aide du logiciel DNA Strider 1,0 [MARCK, (1988)], et les recherches d'homologie ont été effectuées sur le programme FASTA avec la banque de données EMBL de Heidelberg et GENE BANK. La séquence d'au moins 300 bases de chaque brin du fragment cloné a été ainsi réalisé. Une identité de 100% a été trouvée avec la séquence de GPD1 publiée [LARSSON et al., Mol. Microbiol. 10, p. 1101-1111, (1993)], ce qui confirme que le fragment amplifié correspond bien au gène GPD1.

EXEMPLE 2 : SUREXPRESSION DE GPD1 DANS LA LEVURE S.

CEREVTSIAE ScVSM.

Afin d'obtenir une expression forte et constitutive de GPD1 dans la levure, la région codante de GPD1 a été placée sous le contrôle d'éléments régulateurs (promoteur et terminateur) de levure, dans un vecteur navette levure/E. coli.

1) Introduction de GPD1 sur le Plasmide multicotie cVTlOO-U
Le plasmide d'expression pVT100-U a été utilisé (figure 4). Ce plasmide contient l'origine de réplication de levure 2 u, le marqueur de sélection URA3 et les éléments régulateurs forts ADH (promoteur et terminateur de l'alcool déshydrogénase I), ainsi que les éléments bactériens (origine de réplication et gène de résistance à l'ampicilline). Ce plasmide a été décrit par [VERNET et al., Gene, 52, p. 225-233, (1987)].

Le produit d'amplification obtenu comme décrit à l'exemple 1 2), a été digéré par XhoI et BamHI. 100 ng de ce fragment digéré ont été ligués à 50 ng de vecteur pVT100-U digéré par XhoI et BamHI et déphosphorylé. Après transformation de bactéries et sélection des clones recombinants comme décrit à l'exemple 1, 3), plusieurs clones recombinants ont été obtenus. La carte du plasmide recombinant obtenu, appelé pVT100-U-GPDl, est représenté à la figure 4.

2) Transformation de la levure
La souches de levure Saccharomyces cerevisiae
ScV5M a été transformée par le vecteur pVT100-U-GPDl et par le vecteur pVT100-U (contrôle).

La méthode de transformation utilisée est celle de l'acétate de lithium décrite par ITO et al. (J.

Bacteriol., 1983, 153, 163-168)).

Le milieu sélectif utilisé est du YNB (Yeast nitrogen base 7 g/l DIFCO, glucose 20 g/l). L'absence d'uracile permet de conserver une pression de sélection pour les plasmides. Plusieurs clones recombinants ont été obtenus. Le clone SIM7 a été étudié par la suite.

3) Conséquences de la surexoression de GPD1
a) Obtention d'anticorps polyclonaux anti
GPDlp
Des anticorps polyclonaux anti-GPDlp ont été utilisés comme outil lors de cette étude. Ils ont été produits par injection à un lapin d'une préparation purifiée de la protéine GPDlp. La purification de cette protéine a été réalisée à partir de la souche oenologique
S267 : levure I.C.V. (88. 117.0), comme décrit ci-après
- Préparation de l'extrait brut
10 litres de milieu YEPD sont ensemencés avec
S267, à partir d'une préculture de 12 heures sur le même milieu. La culture est recueillie en fin de phase exponentielle et les cellules sont récupérées par centrifugation, 5 minutes à 4000g.Le culot est ensuite lavé avec du NaCl 0,9% et les cellules sont reprises dans un volume (v/w) de tampon A pH 7,0 (Tris-H2SO4 10 mM, EDTA 1 mM, DTT 1 mM, NaN3 0,02%, PMSF 1 mM, sulfate de protamine 0,7%).

On ajoute à 30 ml de suspension cellulaire, 15 g de billes de verre (diamètre 0,5 mm) et on effectue un broyage à l'aide d'un appareil de type B. BRAUN pendant 4 minutes à 40C. Le surnageant est récupéré après centrifugation à 20000 g, 20 minutes et conservé à 40C.

- Précipitation fractionnée par le sulfate d'ammonium
L'extrait brut est soumis à une précipitation fractionnée au sulfate d'ammonium (40% de saturation). Le surnageant obtenu est soumis à une précipitation à 60% de saturation. Le culot contenant la protéine active est resuspendu dans 50 ml de tampon A.

- Chromatoaraphie échanaeuse d'anions
L'extrait brut est dialysé 48 h contre du tampon A, puis déposé à 4 C et à raison de 20 ml/h sur une colonne (1=10 cm, diamètre = 1,6 cm) de DEAE-Sépharose
CL6B (PHARMACIA), préalablement équilibrée avec du tampon
B (Tampon A sans PMSF ni sulfate de potassium). Après élimination des protéines non retenues par passage de trois volumes de tampon d'équilibrage, un gradient linéaire de Tris-H2SO4 pH 7,0 compris entre 0 et 1M a été appliqué. L'enzyme est éluée pour une concentration en
Tris-H2SO4 de 300 mM.

- Chromatoaraphie d'exclusion moléculaire
Après concentration, la fraction enzymatique obtenue a été déposée sur colonne (1=40 cm, diamètre = 1,6 cm) de Sephadex-G100 (domaine de fractionnement 10000 à 120000 Da). L'élution est effectuée avec du tampon B, à raison de 5 ml/h. Les fractions (5ml) sont récupérées et l'activité de l'enzyme mesurée. L'enzyme est éluée entre 35 et 50 ml de tampon. Les fractions comprises entre 36 et 48 ml de volume d'élution sont conservées.

- Chromatoaraphie d'affinité
La fraction enzymatique obtenue a été déposée sur une colonne contenant une résine de Blue Sépharose
CL-6B sur laquelle est fixé un analogue du NAD+, le bleu
Cibacron F3G-A. La colonne (1=5 cm, diamètre = 1,6 cm) est équilibrée à 40C avec le tampon B et l'échantillon est déposé à raison de 6 ml/h. La colonne est ensuite lavée avec 10 volumes de colonne (tampon B). L'élution de l'enzyme fixée a été obtenue par utilisation d'un gradient mixte linéaire de Tris-H2SO4 (0 à 1,5 M) et de NADH (0 à 3 mM) . Des fractions de 1 ml sont récupérées et l'activité de l'enzyme mesurée. L'enzyme est décrochée à 1 M de Tris-H2SO4 et 2 mM de NADH.

Electrophorèse en conditions dénaturantes
L'extrait purifié a été soumis à une électrophorèse en conditions dénaturantes (SDS-PAGE), et la bande protéique (43 kDa) correspondant à GPDlp a été découpée et réduite en poudre. Les anticorps ont été produits par la société APPLIGENE, par injection à un lapin.

Le sérum est récolté au bout de deux mois. La spécificité des anticorps a été testée par Western Blot. Les membranes de nylon-nitrocellulose obtenues après transfert des protéines à partir du gel sont révélées comme décrit par SAMBROOK et al. [Molecular Cloning A laboratory manuel
Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor N.Y., (1989)], à l'aide d'immunoglobulines de chèvre anti-lapin couplées à la phosphatase alcaline comme réactif secondaire et le complexe 5-bromo-4-chloro-3-indoyl phosphate/nitro blue tetrazolium comme substrat chromogène.

b) Conditions de culture et de dosaae
Milieu
YNB [Yeast Nitrogen Base without amino-acid (DIFCO) 6,7 g/l, glucose 100 g/l, casamino-acid (DIFCO) 5 g/l, pH 3,4]. Le milieu utilisé ne contient pas d'uracile, ce qui assure une pression de sélection pour les plasmides.

Conditions de culture
10 ml de milieu sont ensemencés par les souches de levure. La croissance est réalisée en Erlenmeyer à 280C, sans agitation. Les cultures sont réalisées en anaérobiose, en fermenteurs de 250 ml remplis avec 200 ml de milieu, placés à 280C. Les fermenteurs sont ensemencés à partir de la préculture, à raison de 106 cellules/ml.

La croissance est suivie par prélèvement d'une fraction aliquote de milieu de culture et estimation du nombre de cellules sur un appareil de type Coulter counter (ZBI).

Les métabolites sont dosés dans le surnageant, après centrifugation à 2000 g pendant 3 minutes, des prélèvements sont réalisés.

Dosaae des métabolites
Glucose
Le glucose a été dosé par la méthode de dosage des sucres réducteurs (DNS). Le dosage est réalisé en ajoutant, à un volume de la solution à doser, un volume de réactif (300 g de tartrate de sodium et de potassium, 16 g de NaOH et 10 g d'acide dinitro 3,5 salicylique). Le mélange est placé à 1000C pendant 5 minutes. La réaction est arrêtée dans un bain à 40C. 10 volumes d'eau sont ajoutés. La densité optique est déterminée à 540 nm et la concentration en glucose est déterminée par comparaison des valeurs déterminées pour une gamme étalon de 0 à 2 g de glucose.

Glycérol, éthanol Acétaldéhyde, Succinate.

Acide acéticue
Le glycérol a été dosé par voie enzymatique à l'aide des kits de dosage correspondants, commercialisés par BOEHRINGER.

Tous ces métabolites, excepté l'acétaldéhyde ont également été dosés en parallèle par HPLC.

Mesure des activités enzymatique
Les cellules ont été récupérées à partir de culture, par centrifugation 3 minutes à 2000 g, et lavées avec un tampon KH2PO4 50 mM, pH 6,5. 100 mg de levure (poids humide) sont alors broyées par addition de 1 g de billes de verre (diamètre = 0,5 mm) et 0,5 ml de tampon imidazole 20 mM pH 7,0 contenant 1 mM DTT. Le tube est agité 1 minute au vortex et placé 1 minute dans la glace.

L'opération est répétée 5 fois. Après centrifugation 1 minute à 5000 g, le surnageant est récupéré et constitue l'extrait acellulaire. Les protéines sont dosées à l'aide d'un kit BCA Protein Assay Reagent (PIERCE). L'activité glycérol-3-phosphate déshydrogénase (EC 1.1.1.8) est déterminée par la méthode décrite par GANCEDO (Eur. J.

Biochem., 1968, 5, 165-172).

c) Résultats
Des fermentations en milieu YNB, décrit cidessus, ont été réalisées avec les deux souches transformées par pVT100-U et pVT100-U-GPDl (SIM7).

La souche ScV5M transformée par pVT100-U (témoin) et SIM7 ont été testées pour leur capacité à produire du glycérol au cours de fermentations en conditions proches des conditions oenologiques.

La croissance et la production de glycérol dans le milieu de culture ont été suivies au cours de la fermentation (figures 5 et 6). La quantité de glycérol produite est exprimée en fonction de l'avancement de réaction (1-S/SO) ou S représente la concentration en glucose à l'instant, t et SO la concentration initiale.

La souche SIM7 surexprimée pour le gène GPD1 produit une quantité de glycérol largement supérieure à la souche témoin transformée par le plasmide seul pVT100-U. La production finale atteint 14 g/l pour la souche SIM7 contre 4 g/l pour la souche témoin (figure 6).

Une augmentation très importante de l'activité
GPDH est observée dans la souche SIM7 par rapport à la souche témoin (figure 7, dans laquelle les valeurs représentent la moyenne de 3 déterminations, les barres verticales illustrent les écart-types) . L'activité GPDH augmente de façon très rapide, et ce, dès le début de la croissance, pour atteindre un maximum à l'entrée en phase stationnaire (figures 5 et 7). Ce maximum est de l'ordre de 180 mU par milligramme de protéine, soit près de 2,5 fois l'activité observée dans la souche témoin (figure 7). Cette activité diminue ensuite, les niveaux atteints étant alors comparables à ceux de la souche témoin. Dans la souche témoin, l'activité GPDH est relativement faible en début de fermentation et atteint un maximum d'environ 75 mU/mg de protéine à un avancement de réaction de 0,6.

Les cellules sont alors en phase stationnaire de croissance (figure 5).

Afin de confirmer que l'augmentation d'activité chez SIM7 est liée à une surproduction de la protéine codée par GPD1, la production de cette protéine a été suivie dans les deux souches par immunodétection à l'aide d'anticorps polyclonaux dirigés contre la protéine
GPD1. Les résultats sont montrés pour la souche SIM7 (figure 8).

Différents prélèvements ont été réalisés au cours de la fermentation. Les protéines d'un extrait brut préparé comme décrit ci-dessus ont été séparées par électrophorèse SDS-PAGE et transférées sur membrane de nylon-nitrocellulose. Les anticorps polyclonaux obtenus sont alors fixés sur la membrane et révélés par des anticorps anti-lapin couplés à la phosphatase alcaline [SAMBROOK et al., 1989, précité]. La protéine GPDlp est détectée pour la souche surexprimant GPD1 durant la phase exponentielle de croissance et reste produite à un niveau comparable jusqu'à la fin de la fermentation (figure 8).

Par contre, la protéine GPDlp n'est pas détectée dans la souche témoin excepté pour les points situés entre 0,4 et 0,6 d'avancement de réaction, qui correspondent au pic d'activité GPDH observé (résultats non montrés).

Une corrélation étroite est observée entre la surproduction de glycérol (figure 6) et la surproduction de GPDlp (figure 8). Par contre, la chute d'activité GPDH observée pendant la deuxième partie de la fermentation, alors que la protéine est toujours surproduite, est en contradiction avec l'importance de la production de glycérol observée également pendant cette deuxième moitié de la fermentation. Cette chute d'activité in vitro peut refléter une inactivation partielle de l'enzyme in vivo.

Cependant, on peut exclure une légère instabilité de la protéine pendant cette phase tardive, puisque dans les conditions expérimentales utilisées, la réponse immunologique n'est pas quantifiable de façon précise.

La croissance de la souche SIM7 et de la souche témoin a été comparée (figure 9). Malgré une différence au niveau de la biomasse finale atteinte, le taux de croissance est exactement le même pour les deux souches. I1 est de 0,54 générations par heure. D'autre part, tout le glucose présent dans le milieu de culture (100 g/l initialement) est dégradé par les deux souches (figure 10).

La voie de production du glycérol est donc amplifiée de façon importante, ce qui doit résulter en une utilisation accrue de NADH. Afin de voir si la cellule, pour maintenir sa balance d'oxydoréduction, corrige ce déséquilibre par une diminution de la production d'éthanol, elle même consommatrice de NADH, la production d'éthanol en fin de fermentation a été mesurée dans les deux souches et les résultats sont illustrés au
Tableau I.

Tableau I Production d'éthanol chez SIM7 et
ScV5M-pVT100-U pendant la fermentation alcoolique sur milieu YNB avec 100 g/l de glucose.

<tb>

<SEP> Souche <SEP> Ethanol <SEP> g/l <SEP>
<tb> <SEP> ScV5M-pVT100-U <SEP> 46,8
<tb> ScV5M-pTV100-U-GPDl <SEP> 37,5
<tb>
Une diminution importante (de l'ordre de 10 g/l) de la quantité d'éthanol produite par la souche
SIM7 est effectivement observée.

Cette diminution de production d'éthanol, résultant de la moindre disponibilité en NADH nécessaire à la transformation de l'acétaldhéhyde en éthanol par intervention de l'alcool déshydrogénase I, l'évolution de la production d'acétaldéhyde a été suivie, au cours de la fermentation (figure 11). En accord avec la diminution de production d'éthanol, une accumulation d'acétaldéhyde est observée dans la souche surexprimée pour GPD1. La concentration finale d'acétaldéhyde en fin de fermentation est de l'ordre de 150 mg/l et reste donc très modérée.

La surexpression ae GPD1 se traduit donc sur un milieu riche en sucres, par une augmentation très importante de la production de glycérol, contrebalancée par une diminution de la production d'éthanol.

EXEMPLE 3 : DISRUPTION DE GPD1.

La stratégie choisie pour inactiver in vitro
GPD1 a consisté à substituer une partie de la région codante de GPD1 par le gène URA3. L'allèle GPD1 chromosomique de ScV5M est alors remplacé par l'allèle modifié in vitro, en une seule étape de transformation, par recombinaison homologue aux extrémités du fragment introduit. Les disruptants sont sélectionnés en l'absence d'uracile dans le milieu.

1) Construction du vecteur DGEM-T d GPPD1-URA3
Les différentes étapes de cette construction sont résumées sur la figure 12.

Le plasmide pGEM-T-GPDl a été digéré par les enzymes de restriction Bsml et XbaI dont les sites sont uniques et situés dans le gène GPD1. Les extrémités générées ont été converties en extrémités franches par action du fragment de Klenow de la polymérase I. Le plasmide ainsi délété (délétion de 800 pb de la région codante de GPD1) a été recircularisé par action de la T4-ADN ligase, et appelé pGEM-T-S GPD1.

Le gène URA3 de S. cerevisiae a été isolé du plasmide pUT332 (CAYLA) par digestion par BgIII et purification du fragment de 1200 pb correspondant à URA3. 100 ng de ce fragment ont été ligués à 50 ng de plasmide pGEM-T GPD1 délété, linéarisé par BgIII et déphosphorylé.

Le plasmide obtenu a été appelé pGEM-T-h GPD1-URA3 (figure 12).

2) Transformation de ScV5M et sélection des disrutants
Le plasmide pGEM-T-A GPD1-URA3 a été digéré par Xhol et BamHl et le fragment A GPD1-URA3 a été purifié.

Ce fragment linéaire a été utilisé pour transformer la souche ScV5M. Le criblage des transformants sur milieu YNB sans uracile a permis d'isoler plusieurs clones susceptibles d'avoir inséré par double crossing over le fragment A GPD1 URA3, à la place de GPD1. La disruption a été vérifiée par PCR. L'ADN génomique de plusieurs transformants a été extrait et une amplification
PCR a été réalisée à partir de ces préparations en utilisant les oligonucléotides Cl et 02. La substitution d'une partie de la phase codante de GPD1 par URA3 se traduit par une différence de taille du produit d'amplification par rapport à l'allèle sauvage d'environ 300 paires de bases. Ce premier test a permis de sélectionner le disruptant DG3 dans lequel la bande correspondant au gène
GPD1 sauvage était effectivement remplacée par une bande de taille correspondant à l'allèle modifié.Des études par Southern (Southern, 1975) ont, de plus, permis de confirmer que la souche DG3 était disruptée pour GPD1.

3) Etude du disruDtant DG3
Des fermentations ont été réalisées dans les mêmes conditions que celles décrites précédemment.

La croissance des deux souches est identique (figure 13). Le disruptant DG3 produit du glycérol pendant la fermentation, mais avec un niveau de production inférieur à celui de la souche témoin (figure 14). Le niveau de production atteint en fin de fermentation est de 2,5 g/l pour la souche disruptée contre 4,5 g/l pour la souche témoin, soit près de 50% en moins. L'activité spécifique GPDH résiduelle, bien que très faible, reste constante pendant toute la durée de fermentation (figure 15). La production résiduelle de glycérol et la détection d'une activité GPDH peuvent être attribuées à l'existence d'une isoenzyme de GPDlp, codée par un gène différent de
GPD1, comme supposé par LARSSON et al. Mol. Microbiol., 10, p. 1101-111, (1993) et ALBERTYN et al., Cell. Biol., 14, p. 4135-4144 (1994).

Cette réduction de la production de glycérol s'accompagne, chez DG3, d'une augmentation de la quantité d'éthanol, qui passe de 46,8 g/l chez la souche témoin à 49,9 g/l chez DG3. Les résultats sont illustrés au
Tableau II ci-après.

Tableau II Production de glycérol et d'éthanol chez DG3 et ScV5M:pVT100-U pendant la fermentation alcoolique sur milieu YNB avec 100 g/l de glucose.

<tb>

<SEP> Souche <SEP> Glycérol <SEP> g/l <SEP> r <SEP> <SEP> Ethanol <SEP> g/l
<tb> ScV5M/pVT100-U <SEP> 4,3 <SEP> 46,8
<tb> <SEP> ScV5M <SEP> DG3 <SEP> 2,4 <SEP> 49,9
<tb>
Comme prévisible, la production d'acétaldéhyde est moins importante chez DG3 que chez la souche témoin (figure 16).

La vitesse de consommation du glucose et le nombre de cellules atteint en fin de fermentation sont exactement les mêmes pour la souche disruptée et la souche témoin.

Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention.

Claims (10)

REVENDICATIONS

10) Souches de levures, caractérisées en ce qu'elles sont sélectionnées parmi des souches de Saccharomyces, en ce qu'elles contiennent au moins un fragment du gène GPD1 codant pour une glycérol 3 phosphate déshydrogénase NADH-dépendante (GPDH), lequel fragment est modifié pour moduler la production de glycérol et d'éthanol, dans un milieu riche en sucres, pendant la fermentation alcoolique.

20) Souches de levures selon la revendication 1, caractérisées en ce qu'elles sélectionnées parmi des souches de Saccharomyces industrielles, notamment des souches oenologiques, de distillerie, de brasserie ou de boulangerie.

30) Souches de levures selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisées en ce qu'elles appartiennent à l'espèce Saccharomyces cerevisiae.

40) Souches selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisées en ce que lesdites levures contiennent au moins deux copies du gène GPD1 codant pour une GPDH NADH-dépendante, associé à des séquences de régulation actives dans la levure.

50) Cassette d'expression, caractérisée en ce qu'elle comprend le gène GPD1 de levure associé à des séquences de régulation actives dans la levure.

60) Vecteurs d'expression, comprenant une cassette d'expression selon la revendication 5, et utilisables pour l'obtention des souches de levures transformées selon la revendication 4.

70) Vecteurs selon la revendication 6, caractérisés en ce qu'il s'agit de vecteurs navette, possédant également une origine de réplication bactérienne et un marqueur de sélection dans une bactérie.

80) Boissons fermentées à teneur allégée en éthanol, caractérisées en ce qu'elles sont obtenues par fermentation alcoolique en présence de souches de levures selon la revendication 4.

90) Utilisation d'une souche de levure selon la revendication 4, pour la préparation de pain.

10 ) Souches de levures selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisées en ce que lesdites levures contiennent au moins une copie d'un gène

GPD1 non fonctionnel, à la place d'au moins un gène sauvage GPD1.

110) Utilisation d'une souche selon la revendication 10, pour la préparation d'un produit fermenté à teneur élevée en éthanol et à teneur faible en glycérol.