CN1320103C - 高产甘油的酵母工程菌 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种高产甘油的酵母工程菌及其制法和用途。在本发明的酵母工程菌中导入了盐生杜氏藻(Dunaliella salina)3-磷酸甘油脱氢酶基因，从而可以高产、优质和低耗地生产优质甘油。
Description
技术领域
本发明涉及发酵和生物技术领域，更具体地涉及一种高产甘油的酵母工程菌及其制法和用途。
背景技术
甘油作为一种基础化工原料，广泛应用于食品、军工、日化医药等行业的上千个产品中。国内历来由油脂皂化中的副产物中提取。其产量早已不能满足社会发展需要，2001年国内甘油产量4万吨，进口4万吨；随着生活水平的提高，甘油缺口将进一步扩大。
生产甘油主要有合成法和油脂皂化产物提取法以及发酵法。随着工业生产的不断发展和人民生活水平的提高，国内外市场对甘油需求量日益加大，皂化法等传统甘油生产方法生产的甘油不论从产量还是质量上均不能满足整个甘油市场，而化学合成由于丙稀价格受到国际市场的影响，往往使甘油价格与丙烯价格呈倒挂之势。
利用传统育种的微生物例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，假丝酵母(Candida glycerolgenesis)等发酵生产甘油虽然具有较高的甘油产率，但甘油产率还难以令人满意，而且残糖等杂质高。
粉状毕赤酵母隶属于真菌门，子囊菌亚门，酵母菌科，毕赤酵母属，细胞短椭圆形，多边芽殖，形成子囊孢子，可以在石油，农副产品如玉米粉或工业废料中分离获得，粉状毕赤酵母具有耐受高渗等特性，可以在70％的葡萄糖中生长。然而，粉状毕赤酵母甘油产率还难以令人满意。
因此，本领域迫切需要开发新的低耗的高产甘油的工程菌。
发明内容
本发明的目的就是提供一种低耗的高产甘油的工程菌。
在本发明的第一方面，提供了一种产甘油的酵母工程菌，在该酵母的基因组中整合有盐生杜氏藻的3-磷酸甘油脱氢酶基因的表达盒，所述的表达盒依次含有：启动子序列，盐生杜氏藻的3-磷酸甘油脱氢酶的编码序列、终止密码子。
在另一优选例中，所述的盐生杜氏藻的3-磷酸甘油脱氢酶选自下组：
(a)具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽；
(b)将SEQ ID NO：2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有3-磷酸甘油脱氢酶功能的由(a)衍生的多肽。
更佳地，3-磷酸甘油脱氢酶具有SEQ ID NO：2氨基酸序列。
在另一优选例中，所述的酵母可在葡萄糖重量百分比浓度为60-85％的培养基中生长。
在另一优选例中，所述的酵母是毕赤酵母、假丝酵母、甲醇酵母或酿酒酵母。
在另一优选例中，所述的酵母是粉状毕赤酵母。
在另一优选例中，所述的酵母是粉状毕赤酵母(Pichia farinosa)Kaiya-0917，保藏号为：CGMCC No.1059。
在本发明的第二方面，提供了一种生产甘油的方法，它包括步骤：
在适合生长的情况下，于28-30℃培养本发明所述的酵母工程菌，从而使工程菌产生甘油；
从培养基中分离出甘油。
在另一优选例中，所述的酵母是粉状毕赤酵母。
更佳地，所述的酵母是粉状毕赤酵母(Pichia farinosa)Kaiya-0917，保藏号为：CGMCC No.1059。
具体实施方式
盐生杜氏藻(Dunaliella salina)属绿藻门、绿藻纲、团藻目、多毛藻科、杜氏藻属，主要生长于高盐度水体中。细胞形态通常为卵圆形，当外界渗透压发生变化时，其形态可变为球形至纺锤形。它具有两条等长的鞭毛和一个杯状叶绿体，在叶绿体的外缘可积累大量的β-胡萝卜素小滴，是细胞呈橙红色。细胞无细胞壁，具有由糖蛋白形成的包被。本发明人通过多年对盐生杜氏藻的研究，首次发现和分离了盐生杜氏藻的3-磷酸甘油脱氢酶，并将该甘油脱氢酶导入耐高渗酵母，获得了耐高渗且高产甘油的酵母工程菌。在此基础上完成了本发明。
3-磷酸甘油脱氢酶
3-磷酸甘油脱氢酶在申请人的2003年11月26日提交的200310108875.5号专利申请中有详细描述。为了方便起见，仍将相关内容列出。
在本发明中，术语“3-磷酸甘油脱氢酶(glycerol-3-phosphate dehydrogenase，GPDH)”，“3-磷酸甘油脱氢酶多肽”或“GPD”可互换使用，都指具有盐生杜氏藻3-磷酸甘油脱氢酶氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的3-磷酸甘油脱氢酶。
3-磷酸甘油脱氢酶催化的反应如下：
本发明还包括盐生杜氏藻3-磷酸甘油脱氢酶的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然盐生杜氏藻3-磷酸甘油脱氢酶相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在本发明中，术语“盐生杜氏藻3-磷酸甘油脱氢酶”指具有盐生杜氏藻3-磷酸甘油脱氢酶活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。该术语还包括具有与盐生杜氏藻3-磷酸甘油脱氢酶相同功能的、SEQ ID NO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括盐生杜氏藻3-磷酸甘油脱氢酶的活性片段和活性衍生物。
在本发明中，术语“盐生杜氏藻3-磷酸甘油脱氢酶”还包括了“盐生杜氏藻3-磷酸甘油脱氢酶保守性变异多肽”。这些保守性变异多肽是指与SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表1
| 最初的残基 | 代表性的取代 | 优选的取代 |
| Ala(A) | Val；Leu；Ile | Val |
| Arg(R) | Lys；Gln；Asn | Lys |
| Asn(N) | Gln；His；Lys；Arg | Gln |
| Asp(D) | Glu | Glu |
| Cys(C) | Ser | Ser |
| Gln(Q) | Asn | Asn |
| Glu(E) | Asp | Asp |
| Gly(G) | Pro；Ala | Ala |
| His(H) | Asn；Gln；Lys；Arg | Arg |
| Ile(I) | Leu；Val；Met；Ala；Phe | Leu |
| Leu(L) | Ile；Val；Met；Ala；Phe | Ile |
| Lys(K) | Arg；Gln；Asn | Arg |
| Met(M) | Leu；Phe；Ile | Leu |
| Phe(F) | Leu；Val；Ile；Ala；Tyr | Leu |
| Pro(P) | Ala | Ala |
| Ser(S) | Thr | Thr |
| Thr(T) | Ser | Ser |
| Trp(W) | Tyr；Phe | Tyr |
| Tyr(Y) | Trp；Phe；Thr；Ser | Phe |
| Val(V) | Ile；Leu；Met；Phe；Ala | Leu |
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：2的蛋白质，但与SEQ ID NO：1所示的编码区序列有差别的核酸序列。
编码SEQ ID NO：2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明的盐生杜氏藻3-磷酸甘油脱氢酶核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
载体和工程菌
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或3-磷酸甘油脱氢酶编码序列经基因工程产生的宿主细胞，尤其是酵母细胞。
本发明中，盐生杜氏藻3-磷酸甘油脱氢酶多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含盐生杜氏藻3-磷酸甘油脱氢酶编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞等。较佳地，宿主细胞是酵母细胞，更佳地是毕赤酵母，最佳地是粉状毕赤酵母(Pichia farinosa)。
一类特别优选的酵母是耐高渗的酵母，即可以在葡萄糖浓度为50％以上(如50-95％)，较佳地60％以上(如60-90％)，更佳地70％以上(如70-85％)的培养基中生长的酵母。代表性的耐高渗酵母包括假丝酵母属(Candida)的酵母、部分甲醇酵母和粉状毕赤酵母。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。
甘油生产和分离
本发明的产甘油的酵母工程菌可在常规的发酵条件下发酵生产甘油，可以选用常规的培养基和发酵条件。例如温度为30±3℃，pH为8.2±1，时间为100±50h。合适的培养基包括各种用于酵母发酵的培养基，例如葡萄糖浓度33±5％，玉米浆0.2±0.1％，尿素0.1±0.05％的培养基。
在本发明中对于甘油的分离步骤，没有任何特别限制，可以采用本领域常规的方法和工艺。
本发明的主要优点在于：
本发明高产甘油菌株具有高产、优质、低耗等特点，为甘油生产提供了广阔的前景。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
盐生杜氏藻3-磷酸甘油脱氢酶基因的克隆
1.盐生杜氏藻的采集(Collection)
盐生杜氏藻(Dunaliella salina)购自武汉水生生物研究所藻种库。
2.Poly A+RNA的分离(Poly A+RNA isolation)
用Trizol试剂(Gibco，NY，USA)提取盐生杜氏藻的总RNA。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量。使用Oligotex mRNA Kits(Qiagen)提供的试剂盒操作说明书抽取盐生杜氏藻的mRNA。
3.盐生杜氏藻cDNA文库的构建(Cloning of Full-length cDNA)
使用Smart cDNA Library Construction Kit(Clon Tech)提供的试剂盒说明书，以λTriplEX2为载体，构建盐生杜氏藻的cDNA噬菌体文库。
4.基因的全长克隆(Cloning of Full-length cDNA)
通过对大量不同物种(包括衣藻、酵母、大肠杆菌等)的3-磷酸甘油脱氢酶进行比较，确定了部分氨基酸保守序列。据此设计简并引物，采用RACE方法(Gibco试剂盒，NY，USA)进行cDNA全长克隆，分三个阶段进行：
(1)使用简并引物，以Poly A+RNA为模板，进行RT-PCR扩增
以寡核苷酸：5′GTN GGN TCN GGN GCI TGG G 3′(SEQ ID NO：3)为正向引物；寡核苷酸：5′CNG CDA TRT TNG CIC CCA T 3′(SEQ ID NO：4)为反向引物，以Poly A+RNA为模板，进行RT-PCR扩增，扩增条件为94℃5分钟，随后94℃30秒、55℃30秒、72℃1分钟进行35个循环，最后以72℃延伸5分钟。电泳检测PCR扩增产物，获得的片段长度约为0.45kb，回收片段连接到购买的T-easy载体上，用SP6或T7作为通用引物，采用终止荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI377测序仪(perkin-Elmer，USA)上进行测序，测得一个457bp序列。
将该序列及其编码蛋白质序列用BLAST程序在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+Swissprot+Superdate+PIR数据库进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与千屈菜的3-磷酸甘油脱氢酶基因有较高的同源性，证实了简并引物的正确。
(2).RACE
根据以上序列分析设计
5’RACE引物：5’TAC GGG ACA CCA TCT GGC TAA TGA G 3’(SEQ ID NO：5)；
3’RACE引物：5’TGC ACA GCC GTG CGC ATG GT3’(SEQ ID NO：6)；
使用SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit(Clontech)，按照操作手册进行，得到盐生杜氏藻3-磷酸甘油脱氢酶基因的5’和3’端序列。
(3).PCR扩增得到3-磷酸甘油脱氢酶基因编码区(过程同(1))。
在拼接得到全长(包括完整的开放读框)的基础上，进一步设计引物：以寡核苷酸：5’CTT GGC AGC AGA ACA GTG AGG3’(SEQ ID NO：7)为正向引物；寡核苷酸：5’TGT GGT TGC TTA GTA GTA GTC GTT C 3’(SEQ ID NO：8)为反向引物，以用常规方法抽提的盐生杜氏藻总RNA为模板，进行RT-PCR扩增，然后按常规方法以PCR扩增产物进行克隆、测序。结果验证了盐生杜氏藻3-磷酸甘油脱氢酶蛋白的全长编码序列的正确性。
盐生杜氏藻3-磷酸甘油脱氢酶基因全长序列如SEQ ID NO：1所示，其中读框位置是1-2103位。
atgcttctcc agaaaggaaa cattggcaag gggatcgccc agcctgtgca gcgccgagga 60
gtgccctcag ccttgcgcca cgccccgctt gcgaacaagg tcgccacccc agcggtcgct 120
ccccaaggcc tcttgaggcc tatcctgagt gaaaggggca gcccagcgtt gctgaagcgc 180
caacgggcgc tggatgtcgt gttgcgcgct gcggagaccg agcaggaggc ggagaatgcc 240
ggcacggtgg tgcccgggga tgggtgggag agcttccccc cgcccccgta cgagccctct 300
gagcaggtcc tcgacctgtg gcagcaggcg gatgccgtgt gtttcgatgt ggaccgcacc 360
gtgacaactg acgcctcagt tggcctgctg gccaagttca tgggcatcga ggatgaggca 420
cagtccctga cggagcaggc caacaggggc gagatcaacc tcaccaaggc ctttgaggat 480
cgcctggcca aactgaactt cacccccaca gacattgacc gattccttga ggagcaccct 540
gctcacaccc gcctggttcc gggtgtggag aacctcattg cagccctgaa ggctcgtgga 600
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tcgcgcgcta ttgagcgcat taggaggaag tacccctaca acaacatcat catggttgga 840
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ccaggctccg tgttcgagaa ggaggtgacc atgtgggtgc acgaggagaa gcactccggc 1140
cgcaacctga tcgagtacat caacgagaac catgagaacc ccatctactt gcctggcatt 1200
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ttcgccatta acctgcttgc ggatgtgccg ggcgctgaga tgtgcggtac cctgaagaac 1620
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tccatcctgc gacaaggcct gagtgagatg aggaagttct gcaagttcat ctccccctca 1740
gtgcgcgatg acaccttctt cgagtcctgc ggtgtagctg atttgattgc cagcagctat 1800
ggcggccgca acaggcgcgt ggctgaggcc tgggcccaga agaggatcgc tggtgatgac 1860
caggtcacgt tcgagaagct tgagaaggag atgctgaacg gccagaagct gcagggtgtg 1920
ctaacaagcg acgaggtcca agaaatcctg cacgcacgtg gctgggagct ggaattcccc 1980
ttgttcacca ccatcaacag aatcatccat ggcgaggtcc caccaaccat gatcttgagg 2040
taccgcgtgg cctgctccat gcccagcatg cctccagctc gccgtgtagt gaacgactac 2100
tactaa 2106
(SEQ ID NO：1)
盐生杜氏藻3-磷酸甘油脱氢酶基因编码一个由701个氨基酸构成3-磷酸甘油脱氢酶，其序列如SEQ ID NO：2所示。
1 MLLQKGNIGK GIAQPVQRRG VPSALRHAPL ANKVATPAVA PQGLLRPILS
51 ERGSPALLKR QRALDVVLRA AETEQEAENA GTVVPGDGWE SFPPPPYEPS
101 EQVLDLWQQA DAVCFDVDRT VTTDASVGLL AKFMGIEDEA QSLTEQANRG
151 EINLTKAFED RLAKLNFTPT DIDRFLEEHP AHTRLVPGVE NLIAALKARG
201 VEVFLISGGF REMALPIASH LKIPAKNVFC NTMSWQLDDH GEPVRLQGLD
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301 CFGGVMQRPA VASQADWFVR SYDELMAKLK RYKVTMVGSG AWACTAVRMV
351 AQSTAEAAQL PGSVFEKEVT MWVHEEKHSG RNLIEYINEN HENPIYLPGI
401 DLGENVKATS DLIEAVRGAD ALIFCAPHQF MHGICKQLAA ARVVGRGVKA
451 ISLTKGMRVR AEGPQLISQM VSRILGIDCS VLMGANIAGD IAKEELSEAV
501 IAYANRESGS LWQQLFQRPY FAINLLADVP GAEMCGTLKN IVAVGAGIGD
551 GLGVGPNSKA SILRQGLSEM RKFCKFISPS VRDDTFFESC GVADLIASSY
601 GGRNRRVAEA WAQKRIAGDD QVTFEKLEKE MLNGQKLQGV LTSDEVQEIL
651 HARGWELEFP LFTTINRIIH GEVPPTMILR YRVACSMPSM PPARRVVNDY
701 Y(SEQ ID NO：2)
实施例2
粉状毕赤酵母菌种的分离
从乐山犍为糖厂的糖蜜中通过高渗培养基作为选择培养基(60％葡萄糖的YPD培养基)，分离得到了耐高渗酵母，经过微生物鉴定确定为粉状毕赤酵母，可在70％以上浓度的葡萄糖培养基中生长而且具有产甘油的能力。
实施例3
粉状毕赤基因工程菌株Kaiya-0917构建
(1)粉状毕赤酵母菌感受态制备
a.用无菌牙签挑取YEPD平板中粉状毕赤酵母(实施例1)单菌落于2mL液体YEPD培养基中，28℃，200rpm振荡培养过夜。
b.次日转入200mLYEPD培养基中28℃，200rpm振荡培养直至OD600＝1.0～1.3之间。
c.将细胞转移至50mL离心管中4000rpm，4℃离心10min，弃取上清。
d.将等体积的去离子水加入离心管中，重悬细胞，4000rpm，4℃离心10min。弃取上清。
e.将一半体积的去离子水加入离心管中，重悬细胞，4000rpm，4℃离心10min。弃取上清。
f.将一半体积的1M山梨醇加入离心管中，重悬细胞，4000rpm，4℃离心10min。弃取上清。
g.将500μL的1M山梨醇加入离心管。
(2)3-磷酸甘油脱氢酶基因表达载体的构建
a.整合位点选用URA3基因。通过NCBI上目前已知的毕赤酵母，酿酒酵母的URA3基因设计引物，并加上Bgl II酶切位点。
正向引物：5’agatctAACTCGGACCTTTCATCTGT3’(SEQ ID NO：9)
反向引物：5’agatctGGAAGAGGAGGGTATTTTGG3’(SEQ ID NO：10)
b.通过常规PCR技术获得从粉状毕赤酵母总DNA中扩增出753bp片段。
c.将片段按常规的TA克隆法克隆至pMD-T-18(TaKaRa公司)载体中，获得载体pMD-URA。
d.通过Bgl II限制内切酶酶切pMD-URA质粒，获得具有粘性末端URA3整合位点片段。
e.对表达载体pGAPZb载体(购自Invitrogen公司)进行Bgl II酶切，获得大片段。
f.将步骤d中带有粘性末端的URA3整合位点片段与步骤e的载体大片段连接，然后转化TOP10菌种(购自Invitrogen公司)获得克隆子。
g.抽提步骤f获得的克隆子中的中间载体，对中间载体进行EcoR I和XhoI双酶切。
h.将盐藻GPD PCR扩增产物
用引物5’-GCAAgaattcGCGAGCAGGAGGCGGAGAATG-3’(SEQ ID NO：11)和5’-TTCTctcgagTAGCAGCATGATGGGTGTGGT-3’(SEQ ID NO：12)
通过常规的RT-PCR获得进行EcoR I和Xho I双酶切。
i.连接中间载体和GPD基因构建成含GPD基因整合型表达载体。
j.转化TOP10菌种获得克隆子，质粒命名为pURA-GPD。
k.使用Van91 I限制酶切酶酶切pURA-GPD载体，形成线形DNA分子，用于转化。
(3)电击转化粉状毕赤酵母
将如上制备的100μL感受态酵母细胞与100ng线形化质粒DNA混匀，加入至0.1cm电击杯中冰浴20min，放置于BioRed电穿孔仪中按25μF，1500V电击。
然后迅速加入1mL 1M山梨醇，混匀后将部分细胞涂布于选择平板上(含200mg/L的zeocinYPD培养基)30℃培养3～6天。从平板上获得转化菌种。
通过PCR方法(引物同上)对转化有pURA-GPD载体的酵母克隆子进行检测，扩增出盐藻GPD序列的克隆为阳性克隆。结果获得了转入盐藻GPD基因的粉状毕赤酵母，命名为粉状毕赤酵母Kaiya-0917。
该粉状毕赤酵母(Pichia farinosa)Kaiya-0917菌种于2003年11月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(中国，北京)，保藏号(即登记入册编号)为：CGMCC No.1059。
实施例4
粉状毕赤基因工程菌株Kaiya-0917的分子检测
(1)对基因工程菌种Kaiya-0917的Northern检测
a.使用Trizol试剂按照使用说明书提取基因工程菌种的总RNA
b.对总RNA进行变性电泳
c.通过真空转膜的方法将变性电泳的RNA转移至尼龙膜。在紫外交联仪固定RNA
d.以盐藻GPD基因作为探针，按照罗氏试剂公司的地高辛非放射杂交试剂盒操作步骤进行杂交并检测。
结果：在尼龙膜上具有一条明显的杂交条带并证明是表达盐藻GPD基因RNA。这表明，粉状毕赤基因工程菌株Kaiya-0917中转入了3-磷酸甘油脱氢酶基因。
实施例5
粉状毕赤基因工程菌种Kaiya-0917的传代培养
通过对筛选到的粉状毕赤酵母基因工程改造菌种在没有选择压力条件下传代培养，以每传十代作为检测点，在每个检测点时使用高浓度的zeocinTM(购自Invitrogen公司)(200mg/l)检测一次，剔除不能生长的菌种，经传50代后获得遗传稳定性好的菌种。
实施例6
基因工程菌种Kaiya-0917甘油发酵实验
将菌种(CGMCC No.1059)接入2ml的完全培养基中30℃培养过夜。次日将菌悬液转入装有40ml发酵培养基500ml三角瓶中，在230rpm摇瓶转速下，摇瓶发酵100小时。中途用碱液调节发酵液pH值8.2左右。
发酵结束后发酵液中甘油浓度可达到16％以上(未转入盐藻GPD基因的对照粉状毕赤酵母约为7％)，甘油全糖转化率52-55％，远高于现有技术中30％的转化率。发酵周期短于现有技术(至少120小时)。
发酵获得甘油残糖含量低于1％，低于传统甘油发酵工艺的传统残糖量(通常远大于1％)，因此便于甘油提制工艺。
实施例7
制备转入盐藻GPD基因的产甘油的假丝酵母工程菌
重复实施例3的过程，不同点在于，(a)宿主细胞用假丝酵母替换粉状毕赤酵母；(b)整合位点用假丝酵母的URA3替换粉状毕赤酵母的URA3基因。
结果，获得了转入盐藻GPD基因的产甘油的假丝酵母工程菌。该工程菌的甘油产量比未转入盐藻GPD基因的假丝酵母高约60％。
菌种保藏
本发明的粉状毕赤酵母(Pichia farinosa)Kaiya-0917菌种子2003年11月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(中国，北京)，保藏号(即登记入册编号)为：CGMCC No.1059。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110>四川川大光耀生物工程有限公司
<120>高产甘油的酵母工程菌
<130>037631
<160>12
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>2106
<212>DNA
<213>盐生杜氏藻(Dunaliella salina)
<400>1
atgcttctcc agaaaggaaa cattggcaag gggatcgccc agcctgtgca gcgccgagga 60
gtgccctcag ccttgcgcca cgccccgctt gcgaacaagg tcgccacccc agcggtcgct 120
ccccaaggcc tcttgaggcc tatcctgagt gaaaggggca gcccagcgtt gctgaagcgc 180
caacgggcgc tggatgtcgt gttgcgcgct gcggagaccg agcaggaggc ggagaatgcc 240
ggcacggtgg tgcccgggga tgggtgggag agcttccccc cgcccccgta cgagccctct 300
gagcaggtcc tcgacctgtg gcagcaggcg gatgccgtgt gtttcgatgt ggaccgcacc 360
gtgacaactg acgcctcagt tggcctgctg gccaagttca tgggcatcga ggatgaggca 420
cagtccctga cggagcaggc caacaggggc gagatcaacc tcaccaaggc ctttgaggat 480
cgcctggcca aactgaactt cacccccaca gacattgacc gattccttga ggagcaccct 540
gctcacaccc gcctggttcc gggtgtggag aacctcattg cagccctgaa ggctcgtgga 600
gtggaggtgt tcctcatctc tggcggcttc agggagatgg ccctgcccat tgcttcccac 660
ctcaagatcc ctgcaaagaa cgtgttctgc aacaccatgt cctggcagct ggacgaccat 720
ggtgagcccg tccgcctgca gggcctggac atgacccgcg ccgcagagag ccacttcaaa 780
tcgcgcgcta ttgagcgcat taggaggaag tacccctaca acaacatcat catggttgga 840
gatggcttca gtgacctgga ggccatgcag ggctcccccg atggagcaga tgccttcatc 900
tgcttcggtg gcgtcatgca acgacctgcc gtggccagcc aggccgactg gtttgtgcgc 960
tcatacgatg agctgatggc caagctgaag cgctacaagg tgaccatggt gggctccggg 1020
gcctgggcct gcacagccgt gcgcatggtg gcccagagca cagcagaggc cgcccagctg 1080
ccaggctccg tgttcgagaa ggaggtgacc atgtgggtgc acgaggagaa gcactccggc 1140
cgcaacctga tcgagtacat caacgagaac catgagaacc ccatctactt gcctggcatt 1200
gacctgggcg agaacgtcaa ggccacctcc gatttgatcg aggcggtccg tggcgctgat 1260
gccctcatct tctgcgcacc ccatcaattc atgcatggca tttgcaagca gctggctgct 1320
gcgcgcgtcg tcggccgcgg cgtgaaggcc atcagcttga ccaagggcat gcgtgtgcgt 1380
gctgagggcc cgcagctcat tagccagatg gtgtcccgta tcctgggcat cgactgctca 1440
gtgctcatgg gtgctaacat tgctggcgac attgccaagg aggagctgtc tgaggctgtg 1500
attgcctatg ccaaccgcga gtctggcagc ctgtggcagc agctgttcca gcgcccctac 1560
ttcgccatta acctgcttgc ggatgtgccg ggcgctgaga tgtgcggtac cctgaagaac 1620
atcgtggctg tgggcgcagg cattggtgac ggcctgggcg taggccccaa cagtaaagcc 1680
tccatcctgc gacaaggcct gagtgagatg aggaagttct gcaagttcat ctccccctca 1740
gtgcgcgatg acaccttctt cgagtcctgc ggtgtagctg atttgattgc cagcagctat 1800
ggcggccgca acaggcgcgt ggctgaggcc tgggcccaga agaggatcgc tggtgatgac 1860
caggtcacgt tcgagaagct tgagaaggag atgctgaacg gccagaagct gcagggtgtg 1920
ctaacaagcg acgaggtcca agaaatcctg cacgcacgtg gctgggagct ggaattcccc 1980
ttgttcacca ccatcaacag aatcatccat ggcgaggtcc caccaaccat gatcttgagg 2040
taccgcgtgg cctgctccat gcccagcatg cctccagctc gccgtgtagt gaacgactac 2100
tactaa 2106
<210>2
<211>701
<212>PRT
<213>盐生杜氏藻(Dunaliella salina)
<400>2
Met Leu Leu Gln Lys Gly Asn Ile Gly Lys Gly Ile Ala Gln Pro Val
1 5 10 15
Gln Arg Arg Gly Val Pro Ser Ala Leu Arg His Ala Pro Leu Ala Asn
20 25 30
Lys Val Ala Thr Pro Ala Val Ala Pro Gln Gly Leu Leu Arg Pro Ile
35 40 45
Leu Ser Glu Arg Gly Ser Pro Ala Leu Leu Lys Arg Gln Arg Ala Leu
50 55 60
Asp Val Val Leu Arg Ala Ala Glu Thr Glu Gln Glu Ala Glu Asn Ala
65 70 75 80
Gly Thr Val Val Pro Gly Asp Gly Trp Glu Ser Phe Pro Pro Pro Pro
85 90 95
Tyr Glu Pro Ser Glu Gln Val Leu Asp Leu Trp Gln Gln Ala Asp Ala
100 105 110
Val Cys Phe Asp Val Asp Arg Thr Val Thr Thr Asp Ala Ser Val Gly
115 120 125
Leu Leu Ala Lys Phe Met Gly Ile Glu Asp Glu Ala Gln Ser Leu Thr
130 135 140
Glu Gln Ala Asn Arg Gly Glu Ile Asn Leu Thr Lys Ala Phe Glu Asp
145 150 155 160
Arg Leu Ala Lys Leu Asn Phe Thr Pro Thr Asp Ile Asp Arg Phe Leu
165 170 175
Glu Glu His Pro Ala His Thr Arg Leu Val Pro Gly Val Glu Asn Leu
180 185 190
Ile Ala Ala Leu Lys Ala Arg Gly Val Glu Val Phe Leu Ile Ser Gly
195 200 205
Gly Phe Arg Glu Met Ala Leu Pro Ile Ala Ser His Leu Lys Ile Pro
210 215 220
Ala Lys Asn Val Phe Cys Asn Thr Met Ser Trp Gln Leu Asp Asp His
225 230 235 240
Gly Glu Pro Val Arg Leu Gln Gly Leu Asp Met Thr Arg Ala Ala Glu
245 250 255
Ser His Phe Lys Ser Arg Ala Ile Glu Arg Ile Arg Arg Lys Tyr Pro
260 265 270
Tyr Asn Asn Ile Ile Met Val Gly Asp Gly Phe Ser Asp Leu Glu Ala
275 280 285
Met Gln Gly Ser Pro Asp Gly Ala Asp Ala Phe Ile Cys Phe Gly Gly
290 295 300
Val Met Gln Arg Pro Ala Val Ala Ser Gln Ala Asp Trp Phe Val Arg
305 310 315 320
Ser Tyr Asp Glu Leu Met Ala Lys Leu Lys Arg Tyr Lys Val Thr Met
325 330 335
Val Gly Ser Gly Ala Trp Ala Cys Thr Ala Val Arg Met Val Ala Gln
340 345 350
Ser Thr Ala Glu Ala Ala Gln Leu Pro Gly Ser Val Phe Glu Lys Glu
355 360 365
Val Thr Met Trp Val His Glu Glu Lys His Ser Gly Arg Asn Leu Ile
370 375 380
Glu Tyr Ile Asn Glu Asn His Glu Asn Pro Ile Tyr Leu Pro Gly Ile
385 390 395 400
Asp Leu Gly Glu Asn Val Lys Ala Thr Ser Asp Leu Ile Glu Ala Val
405 410 415
Arg Gly Ala Asp Ala Leu Ile Phe Cys Ala Pro His Gln Phe Met His
420 425 430
Gly Ile Cys Lys Gln Leu Ala Ala Ala Arg Val Val Gly Arg Gly Val
435 440 445
Lys Ala Ile Ser Leu Thr Lys Gly Met Arg Val Arg Ala Glu Gly Pro
450 455 460
Gln Leu Ile Ser Gln Met Val Ser Arg Ile Leu Gly Ile Asp Cys Ser
465 470 475 480
Val Leu Met Gly Ala Asn Ile Ala Gly Asp Ile Ala Lys Glu Glu Leu
485 490 495
Ser Glu Ala Val Ile Ala Tyr Ala Asn Arg Glu Ser Gly Ser Leu Trp
500 505 510
Gln Gln Leu Phe Gln Arg Pro Tyr Phe Ala Ile Asn Leu Leu Ala Asp
515 520 525
Val Pro Gly Ala Glu Met Cys Gly Thr Leu Lys Asn Ile Val Ala Val
530 535 540
Gly Ala Gly Ile Gly Asp Gly Leu Gly Val Gly Pro Asn Ser Lys Ala
545 550 555 560
Ser Ile Leu Arg Gln Gly Leu Ser Glu Met Arg Lys Phe Cys Lys Phe
565 570 575
Ile Ser Pro Ser Val Arg Asp Asp Thr Phe Phe Glu Ser Cys Gly Val
580 585 590
Ala Asp Leu Ile Ala Ser Ser Tyr Gly Gly Arg Asn Arg Arg Val Ala
595 600 605
Glu Ala Trp Ala Gln Lys Arg Ile Ala Gly Asp Asp Gln Val Thr Phe
610 615 620
Glu Lys Leu Glu Lys Glu Met Leu Asn Gly Gln Lys Leu Gln Gly Val
625 630 635 640
Leu Thr Ser Asp Glu Val Gln Glu Ile Leu His Ala Arg Gly Trp Glu
645 650 655
Leu Glu Phe Pro Leu Phe Thr Thr Ile Asn Arg Ile Ile His Gly Glu
660 665 670
Val Pro Pro Thr Met Ile Leu Arg Tyr Arg Val Ala Cys Ser Met Pro
675 680 685
Ser Met Pro Pro Ala Arg Arg Val Val Asn Asp Tyr Tyr
690 695 700
<210>3
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(19)
<223>n＝a，t，c，g
<400>3
gtnggntcng gngcrtggg 19
<210>4
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(19)
<223>n＝a，t，c，g
<400>4
cngcdatrtt ngcrcccat 19
<210>5
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>5
tacgggacac catctggcta atgag 25
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>6
tgcacagccg tgcgcatggt 20
<210>7
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>7
cttggcagca gaacagtgag g 21
<210>8
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>8
tgtggttgct tagtagtagt cgttc 25
<210>9
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>9
agatctaact cggacctttc atctgt 26
<210>10
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>10
agatctaact cggacctttc atctgt 26
<210>11
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>11
gcaagaattc gcgagcagga ggcggagaat g 31
<210>12
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>12
ttctctcgag tagcagcatg atgggtgtgg t 31
Claims (9)
1.一种产甘油的酵母工程菌，其特征在于，在酵母的基因组中整合有盐生杜氏藻的3-磷酸甘油脱氢酶基因的表达盒，所述的表达盒依次含有：启动子序列，盐生杜氏藻的3-磷酸甘油脱氢酶的编码序列、终止密码子，
其中，所述的酵母是毕赤酵母或假丝酵母，
并且所述的盐生杜氏藻的3-磷酸甘油脱氢酶是氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的多肽，和
所述的表达盒整合于酵母基因组的URA3位点。
2.如权利要求1所述的酵母工程菌，其特征在于，3-磷酸甘油脱氢酶的的编码序列如SEQ ID NO：1所示。
3.如权利要求1所述的酵母工程菌，其特征在于，所述的酵母可在葡萄糖重量百分比浓度为60-85％的培养基中生长。
4.如权利要求1所述的酵母工程菌，其特征在于，所述的酵母是毕赤酵母。
5.如权利要求1所述的酵母工程菌，其特征在于，所述的酵母是粉状毕赤酵母。
6.如权利要求1所述的酵母工程菌，其特征在于，所述的酵母工程菌是粉状毕赤酵母(Pichia farinosa)Kaiya-0917，保藏号为：CGMCC No.1059。
7.一种生产甘油的方法，其特征在于，包括步骤：
在适合生长的情况下，于28-30℃培养权利要求1所述的酵母工程菌，从而使工程菌产生甘油；
从培养基中分离出甘油。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的酵母是粉状毕赤酵母。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的酵母工程菌是粉状毕赤酵母(Pichia farinosa)Kaiya-0917，保藏号为：CGMCC No.1059。
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| EP0424117B1 (en) * | 1989-10-18 | 1996-07-31 | Delta Biotechnology Limited | Yeast promoter |
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Patent Citations (3)
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|---|
| PCR 产物真核TA 克隆法构建基因表达重组体 金春元 等，中华医学遗传学杂志，第14卷第2期 1997 * |
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| 一种新的食品酵母表达系统! 产朊假丝酵母 赵颖怡 等，生物技术通讯，第13卷第6期 2002 * |
| 外源蛋白在巴氏毕赤酵母中高效表达的策略 聂东宋 等，吉首大学学报(自然科学版)，第22卷第3期 2001 * |
| 影响外源基因在巴氏毕赤酵母中表达的因素 李欣 等，生物技术通讯，第11卷第2期 2000 * |
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Effective date of registration: 20100813 Address after: 5 groups of economic and Technological Development Zone, Tang Xun Zhen Village in Sichuan province Mianyang city en 621000 Patentee after: Sichuan Heben Bioengineering Co., Ltd. Address before: 610041, China Southern Securities Building No. three, south section 47, ring road, Sichuan, Chengdu, 3F Patentee before: Guangyao Biological Engineering Co., Ltd., Sichuan Univ. |
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| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: MIANYANG HABIO BIOENGINEERING CO., LTD. Free format text: FORMER OWNER: SICHUAN HEBEN BIOENGINEERING CO., LTD. Effective date: 20110525 |
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| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20110525 Address after: 5 groups of economic and Technological Development Zone, Tang Xun Zhen Village in Sichuan province Mianyang city en 621000 Patentee after: Mianyang Heben Bioengineering Co., Ltd. Address before: 5 groups of economic and Technological Development Zone, Tang Xun Zhen Village in Sichuan province Mianyang city en 621000 Patentee before: Sichuan Heben Bioengineering Co., Ltd. |
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20070606 Termination date: 20161224 |
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |