CN1894404A

CN1894404A - 有机酸存在下的启动子及其用途

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Publication number: CN1894404A
Application number: CNA200480032916XA
Authority: CN
Inventors: 石田亘广; 德弘健郎; 长森英二; 高桥治雄; 斋藤聪志; 大西彻
Original assignee: Toyota Motor Corp
Current assignee: Toyota Motor Corp
Priority date: 2003-11-07
Filing date: 2004-11-05
Publication date: 2007-01-10
Anticipated expiration: 2024-11-05
Also published as: JP2005137306A; US7696333B1; WO2005045024A1; AU2004288072A1; JP4460876B2; CN1894404B; AU2004288072B2

Abstract

本发明提供了在有机酸存在下可利用的启动子。作为所述启动子，使用了具有酵母的高渗透压应答7基因(HOR7基因)、甘油醛－3－磷酸脱氢酶2基因(TDH2基因)、热休克蛋白30基因(HSP30基因)、己糖转运蛋白7基因(HXT7基因)、硫氧还蛋白过氧化物酶1基因(AHP1基因)和膜蛋白1相关基因(MRH1基因)中任一基因的启动子活性的DNA。

Description

有机酸存在下的启动子及其用途

技术领域

本发明涉及有机酸存在下的启动子DNA、DNA构建体、转化体、重组基因的表达方法、以及利用它们的有机酸生产方法。

技术背景

随着重组DNA技术的进展，已开发通过在微生物、真菌、动植物和昆虫等宿主中表达外源基因、增殖其转化体获得目的基因产物的技术。例如通过重组酵母等的培养允许通过发酵生产方式产生大量目的基因产物。对于生产L-乳酸等有用的有机酸而言，已有通过将L-乳酸脱氢酶基因导入酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)生产L-乳酸的众多实验报告。

为从重组体中获得目的产物的高产率，有必要构建稳定的基因高表达系统。本发明人已通过在染色体中的PDC1基因启动子下游连接作为目的的有用基因(此时是L-乳酸脱氢酶基因)的同时破坏酵母染色体中的PDC1基因，开发了这样的系统，所述系统利用原始的PDC1基因启动子功能表达L-乳酸脱氢酶基因、且排除了利用原始的该启动子对PDC1蛋白的表达。在特开2003-164295号公报中公开了通过使用该系统可确立克服了现有困难的稳定的基因高表达系统。

虽然已经建立了此类稳定的基因高表达系统，但是仍需要具有强烈表达能力的启动子以进一步提高重组产物产率。已发表的酵母启动子可例举醇脱氢酶1基因(ADH1)启动子(J Ferment Bioeng，1998，卷86(3)，284-289页)、磷酸丙糖异构酶基因(TPI1)启动子(FEMS Microbial Lett，1999年2月，卷171(2)，133-140页)等。

发明公开

然而，对于以大量生产有机酸如乳酸为目的而言，ADH1启动子和TPI1启动子等并不具备作为对有机酸生产具有特异且强大表达能力的启动子。此外，也不适用于用作有机酸存在下的强表达启动子。因此本发明的目的之一是提供有机酸存在下可利用的启动子、包含所述启动子的DNA构建体、包含所述DNA构建体的转化体、通过所述转化体进行重组基因表达的方法、使用所述转化体的有机酸生产方法。

本发明人从产乳酸酵母或从在含乳酸的培养基中生长的酵母获得mRNA并且通过定量PCR法进行了详细的基因表达分析。结果，本发明人发现了几种在产乳酸酵母中特异性高表达的基因并且分离了这些基因的启动子。然后，将在这些启动子下游连接有L-乳酸脱氢酶基因的表达盒导入已确定的染色体上PDC1基因座处并破坏酵母染色体上的PDC1基因，确认了L-乳酸的大量生产。即本发明人已经获得了在有机酸生产下活化目的基因转录的启动子、确认了这些启动子确实提高L-乳酸的产量，从而完成了本发明。

因此，在有机酸存在下活化有效连接的DNA转录的启动子对于在有机酸存在下使目的基因产物增加是有用的，特别地，对于在有机酸生产下使目的基因产物的生产增加是有用的。因此，该启动子可通过和参与有机酸生产的蛋白质基因有效连接用于增加有机酸生产。利用所述启动子，通过基因重组可获得在酵母属(Saccharomyces)等的酵母中产生有机酸如乳酸的经转化重组体，并且这样的重组体作为有机酸的高生产性重组体是有用的。

本发明涉及在有机酸存在下可利用的启动子，具体地提供了以下的实施方案：

(1)具有如下(a)-(c)中任一项所述碱基序列的DNA，其为有机酸存在下的表达用启动子：

(a)包含任一序列编号1-6中所示碱基序列的DNA。

(b)与包含任一序列编号1-6中所示碱基序列的DNA在严谨条件下杂交的DNA。

(c)包含在任一序列编号1-6的所示碱基序列中替代、缺失、添加和/或插入一个或多个碱基的序列的DNA。

(2)(1)所述DNA的一部分DNA，其为有机酸存在下的表达用启动子。

(3)DNA，其具有酵母属酵母的高渗透压应答7基因(HOR7基因)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶2基因(TDH2基因)、热休克蛋白30基因(HSP30基因)、己糖转运蛋白7基因(HXT7基因)、硫氧还蛋白过氧化物酶1基因(AHP1基因)和膜蛋白1相关基因(MRH1基因)中任一基因的启动子活性，为在有机酸存在下的表达用启动子。

(4)(1)至(3)中任一项所述的DNA，其用于表达用来产生有机酸的DNA。

(5)(4)所述的DNA，其中所述有机酸是乳酸。

(6)基因重组用DNA构建体，其包含(1)至(3)中任一项所述的DNA。

(7)(6)所述的DNA构建体，其具有与上述DNA有效连接的、编码参与有机酸生产的蛋白质的DNA。

(8)(7)所述的DNA构建体，其中所述参与有机酸生产的蛋白质为具有乳酸脱氢酶活性的蛋白质。

(9)(8)所述的DNA构建体，其中所述蛋白质是牛乳酸脱氢酶。

(10)(7)至(9)中任一项所述的DNA构建体，其还具有用于同源重组具有自体调节机制的酵母基因的DNA。

(11)(10)所述的DNA构建体，其中所述酵母基因是丙酮酸脱羧酶1(PDC1)基因。

(12)(6)至(11)中任一项所述的DNA构建体，其为质粒载体或病毒载体。

(13)携带(1)至(3)中任一项所述DNA的转化体。

(14)(13)所述的转化体，其具有与上述DNA有效连接的编码参与有机酸生产的蛋白质的DNA。

(15)(14)所述的转化体，其中所述参与有机酸生产的蛋白质为具有乳酸脱氢酶活性的蛋白质。

(16)(14)或(15)所述的转化体，其中(1)至(3)中任一项所述的DNA和编码具有上述乳酸脱氢酶活性的蛋白质的DNA整合至宿主染色体上。

(17)(13)至(16)中任一项所述的转化体，其为酵母转化体。

(18)酵母转化体，其中酵母染色体上具有(1)至(3)中任一项所述的DNA和与其有效连接的编码具有乳酸脱氢酶活性的蛋白质的DNA，并且通过这些DNA的至少一部分破坏具有自体调节机制的酵母基因。

(19)(18)所述的酵母转化体，其中所述具有自体调节机制的酵母基因是丙酮酸脱羧酶1基因。

(20)(19)所述的酵母转化体，其中所述具有乳酸脱氢酶活性的蛋白质是牛乳酸脱氢酶。

(21)(18)至(20)中任一项所述的酵母转化体，其中所述酵母属于酵母属。

(22)目的基因的表达方法，所述表达方法使用携带有(1)至(3)中任一项所述的DNA和与所述DNA下游有效连接的编码预定蛋白质的DNA的宿主细胞。

(23)(22)所述的表达方法，其中所述宿主细胞的培养系统含有有机酸。

(24)(22)或(23)所述的表达方法，其中所述宿主是酵母，酵母染色体上具有(1)至(3)中任一项所述的启动子DNA和编码前述蛋白质的DNA，并且通过这些DNA的至少一部分破坏具有自体调节机制的酵母基因。

(25)(24)所述的表达方法，其中所述蛋白质是参与有机酸生产的蛋白质。

(26)(25)所述的表达方法，其中所述蛋白质是具有乳酸脱氢酶活性的蛋白质。

(27)使用酵母转化体的有机酸生产方法，其中所述酵母转化体具有(1)至(3)中任一项所述的DNA和与所述DNA下游有效连接的、编码参与有机酸生产的蛋白质的DNA。

(28)(27)所述的生产方法，其中所述有机酸是乳酸而且所述蛋白质是具有乳酸脱氢酶活性的蛋白质。

(29)(27)或(28)所述的生产方法，其中所述DNA是在酵母染色体上并且丙酮酸脱羧酶1基因由所述DNA的至少一部分破坏。

(30)如下(a)-(c)中任一项所述的具有启动子活性的DNA：

(a)包含任一序列编号1-6中所示碱基序列的DNA。

(31)包含(30)所述DNA的至少一部分的、具有启动子活性的DNA。

附图简述

图1是显示由定量PCR测定的乳酸发酵期间mRNA表达量的示图；

图2是显示染色体整合型载体构建步骤的部分示意图；

图3是显示染色体整合型载体构建步骤的部分示意图；

图4是显示pBTRP-HOR7P-LDH载体图谱的示意图；

图5是显示pBTRP-TDH2P-LDH载体图谱的示意图；

图6是显示pBTRP-HSP30P-LDH载体图谱的示意图；

图7是显示pBTRP-HXT7P-LDH载体图谱的示意图；

图8是显示pBTRP-AHP1P-LDH载体图谱的示意图；

图9是显示pBTRP-MRH1P-LDH载体图谱的示意图；

图10是显示pBTRP-PDC1P-LDH载体图谱的示意图；

图11是显示pBTRP-TDH3P-LDH载体图谱的示意图；

图12是显示通过pBTRP-HOR7P-LDH载体转化的转化株的染色体结构示意图；

图13是显示通过pBTRP-TDH2P-LDH载体转化的转化株的染色体结构示意图；

图14是显示通过pBTRP-HXT7P-LDH载体转化的转化株的染色体结构示意图；

图15是显示通过pBTRP-HSP30P-LDH载体转化的转化株的染色体结构示意图；

图16是显示通过pBTRP-AHP1P-LDH载体转化的转化株的染色体结构示意图；

图17是显示通过pBTRP-MRH1P-LDH载体转化的转化株的染色体结构示意图；

图18是显示通过pBTRP-PDC1P-LDH载体转化的转化株的染色体结构示意图；

图19是显示通过pBTRP-TDH3P-LDH载体转化的转化株的染色体结构示意图；

图20是显示在多种转化酵母株中乳酸发酵试验结果(YPD培养液)的图示；

图21是显示在多种转化酵母株中乳酸发酵试验结果(蔗汁培养液)的图示。

实施本发明的最佳方案：

本发明的启动子活化或促进有机酸存在下的表达。即，本发明的启动子具有这样的启动子活性：在有机酸存在下才活化与该启动子有效连接的编码蛋白质的DNA表达、或与有机酸不存在时相比较，在有机酸存在下促进与该启动子有效连接的编码蛋白质的DNA表达、或有机酸浓度增高时促进与该启动子有效连接的编码蛋白质的DNA表达(在下文中，所述活性指该启动子活性)。“有效连接”如此处所用，指在该启动子影响或控制下使得所连接的编码蛋白质的DNA表达的连接。另外，“有机酸”指显示酸性的有机化合物并且有机酸的酸官能团优选地是羧酸基。而且，有机酸除了游离酸之外还包括有机酸盐。作为这样的有机酸，具体地可例举乳酸、丁酸、乙酸、丙酮酸、琥珀酸、甲酸、苹果酸、柠檬酸、丙二酸、丙酸、抗坏血酸和己二酸；优选乳酸。乳酸中存在L-乳酸、D-乳酸和DL-乳酸；这三种乳酸全部包括。“有机酸存在下”意指在携带本发明启动子DNA的宿主的生长环境中存在有机酸，并且该有机酸可以是由携带本发明启动子的宿主所产生的、可以是由宿主以外的培养基等提供的、也可以是这两者。有机酸浓度在培养系统中不特别地限定，只要是处于使与本发明启动子有效连接的编码DNA表达或促进的范围内均可。

本发明的在有机酸存在下活化转录的启动子DNA可例举如包含任一序列编号1-6中所示序列的具有启动子活性的DNA。除了包含这些序列的DNA外，本发明的启动子DNA还包含这样的DNA，所述DNA与包含任一序列编号1-6中所示碱基序列的DNA杂交并且具有上述启动子活性。这样的DNA可通过常规的杂交技术，以包含任一序列编号1-6中所示碱基序列的DNA或它们的一部分作为探针而获得(Southern，EM.，J Mol Biol，1975，98，503)。此外，所述DNA可以与包含任一序列编号1-6中所示碱基序列的DNA特异性杂交的寡核苷酸作为引物，通过PCR技术(Saiki RK.Science，1985，230，1350，Saiki RK等，Science，1988，239，487)合成。与包含任一序列编号1-6中所示碱基序列的DNA高度同源的DNA可通过所述杂交或PCR分离。严谨条件下的杂交优选地用于分离。所述严谨条件指存在50％甲酰胺和杂交温度为37℃时的杂交条件或具有相同严谨性的那些杂交条件。更严谨的条件可分离具有更高同源性的DNA。作为所述杂交条件，例如可例举存在50％甲酰胺和杂交温度为大约42℃时的那些杂交条件，作为更严谨的条件，可例举存在50％甲酰胺和杂交温度为大约65℃时的那些杂交条件。

此外，作为本发明的启动子DNA，可为包含在任一序列编号1-6的所示碱基序列中替代、缺失、添加和/或插入一个或多个碱基的碱基序列并具有所述启动子活性的DNA。这样的DNA可通过已提及的杂交和PCR技术等获得，也可通过定点诱变法(Kramer W & Fritz HJ.，Method Enzymol，1987，154，350)向任一序列编号1-6中所示碱基序列内人工导入突变而获得。

经分离的DNA与任一序列编号1-6中所示碱基序列的同源性优选地为70％及以上，更优选地为80％及以上，最优选地为90％及以上。DNA碱基序列的同源性可通过BLAST基因分析程序等确定。另外，DNA碱基序列的同源性可通过BLAST( http://blast.genome.ad.jp)和FASTA( http://fasta.genome.ad.jp/SIT/FASTA.html)等基因分析程序确定。

含有序列编号1-6中所示碱基序列的各DNA分别作为对酿酒酵母的高渗透压应答7基因(HOR7基因)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶2基因(TDH2基因)、己糖转运蛋白7基因(HXT7基因)、热休克蛋白30基因(HSP30基因)、硫氧还蛋白过氧化物酶1基因(AHP1基因)和膜蛋白1相关基因(MRH1基因)具有基因启动子活性的DNA片段获得。因此，本发明的启动子DNA可以是酵母或酵母属酵母中具有这些基因的启动子活性的DNA，或者可以是与所述启动子区域具有同源性且具有所述启动子活性的DNA。这样的DNA可从酵母中通过使用含有任一序列编号1-6中所示碱基序列的至少一部分的探针的杂交技术或通过使用与所述碱基序列杂交的寡核苷酸探针的PCR技术获得。此外，可以选择在以上提及的严谨条件下杂交的DNA。

此外，本发明的启动子DNA可以是所述多种形式DNA的一部分，只要其具有所述启动子活性即可。

包含序列编号1-6中所示碱基序列的各DNA为在产乳酸酵母中于中和条件下(pH4.0-8.0)经乳酸发酵下的筛选而选择的DNA。所述筛选为使用产乳酸酵母并在上述中和条件下进行乳酸发酵，将自发酵开始后的预定时间点收集的mRNA获得的cDNA通过定量PCR技术等定量，选择表现高表达量的基因。通过这样的筛选可提取在乳酸生产时(乳酸存在时)产乳酸酵母中的高表达基因，并且可通过分离所述基因的启动子而获得在乳酸生产时(乳酸存在时)表现高水平基因表达的启动子。

通过所述筛选获得的启动子还可认为是由乳酸诱导基因表达的乳酸诱导型启动子。因此，非常期待通过将编码参与乳酸产生的具有酶活性的蛋白质如乳酸脱氢酶等的DNA与所述启动子有效连接而获得乳酸产生不受乳酸产量增大的抑制或者乳酸产量增大接下来促进乳酸产生的产乳酸酵母等的实用转化体。

可通过报道基因测定法使用本领域技术人员熟知的报道基因证实所述已获得DNA是否具有所述启动子活性。对报道基因不作特别限定，可使用已知的基因，例如，可例举氯霉素乙酰基转移酶基因(CAT)、β-半乳糖苷酶基因(LacZ)、萤光素酶基因(LUC)、β-葡糖醛酸糖苷酶基因、和绿色荧光蛋白基因(GFP)等等。此外，可使用这样的基因证实存在所述启动子活性，其中所述基因的表达可通过测定由该基因编码的蛋白质的量和这种蛋白质(酶)的活性(例如代谢物的量)证实。另外，所述启动子活性可利用由基因表达获得的mRNA通过Northern杂交法和定量PCR法测定基因的转录水平证实。由于所述启动子活性为在有机酸存在下活化或促进表达，当证实所述启动子活性时，优选地使用存在有机酸的培养系统或使用产生有机酸的宿主。

本发明的启动子DNA可以是基因组DNA，也可以是经化学合成的DNA。

本发明还提供了含有该启动子DNA的重组用DNA构建体。对重组用DNA构建体不特别地限定，可根据导入外源基因的模式(染色体外的或染色体内的)和宿主细胞的种类，选择质粒(DNA)、病毒(DNA)、噬菌体(DNA)、反转录转座子(DNA)和人工染色体(YAC、PAC、BAC、MAC等)作为载体形式。因此该DNA构建体可具有除了该启动子DNA以外的、作为任一这些形式的载体的DNA等。该DNA构建体优选地采用质粒载体或病毒载体形式。此外，优选的原核细胞载体、真核细胞载体、动物细胞载体和植物细胞载体在本领域内众所周知。该DNA构建体可在细胞质或宿主细胞的宿主染色体外存在，或整合在宿主染色体中而存在。

该DNA构建体携带有与该启动子DNA有效连接的编码目的蛋白质的DNA(在下文中也称作编码DNA)。编码DNA不仅包含cDNA，还包含转录但不翻译的DNA序列。虽然不特别地限定蛋白质，编码DNA可以是用于乳酸等有机酸生产的DNA，即可为编码参与有机酸生产的具有酶活性的蛋白质的DNA。编码所述蛋白质的DNA与所述启动子DNA的有效连接预期导致协同性促进的有机酸产生。作为这样的酶，可例举乳酸生产时的L-乳酸脱氢酶和D-乳酸脱氢酶等酶、丙酮酸生产时的丙酮酸激酶等、乙酸生产时的丙酮酸氧化酶等、琥珀酸生产时的琥珀酸CoA合成酶等、苹果酸生产时的延胡索酸水合酶等、柠檬酸生产时的柠檬酸合成酶等。

作为乳酸脱氢酶(LDH)，根据生物的种类或即使在生物体内也存在多种同源物。本发明中所用的乳酸脱氢酶除包含天然来源的LDH外，还包含经化学合成的或经基因工程而人工合成的LDH。优选地，LDH来源于乳酸菌等原核生物或真菌等真核微生物，并且更优选地来源于植物、动物、昆虫等高等真核生物，并且进一步优选地来源于包含以牛为首的哺乳类的高等真核生物。来源于牛的LDH(L-LDH)最为优选。例如，作为来源于牛的LDH，可例举包含序列编号8中所示氨基酸序列的蛋白质。此外，作为编码该LDH的DNA，可例举包含序列编号7中所示碱基序列的DNA。而且，本发明中的LDH包含这些LDH的同源物。LDH同源物包含这样的蛋白质，所述蛋白质在天然来源LDH的氨基酸序列中具有1个或多个氨基酸的替代、缺失、插入和/或添加并且具有LDH活性，以及为与天然来源LDH的氨基酸序列具有至少70％同源性、优选地具有80％或更高同源性并且具有LDH活性。

该DNA构建体可具有旨在通过同源重组将该启动子DNA和编码DNA整合入宿主染色体的同源重组用DNA序列。通过具有这样的DNA，除了可实现将这些DNA整合入宿主染色体的目的部位外，还可同时实现破坏目的基因。同源重组用DNA序列是与宿主染色体中欲导入所述DNA的靶部位或该部位附近的DNA序列同源的DNA序列。同源重组用DNA序列具有与一种靶基因或该靶基因至少一个侧翼区同源的一个序列，优选地具有与靶基因或该靶基因侧翼序列中的至少两个区域分别同源的序列。例如，优选地将2个同源重组用DNA序列作为分别与染色体上靶位点上游侧或下游侧DNA同源的DNA序列，在这些同源重组用DNA序列之间连接该启动子DNA和编码DNA。

当通过同源重组向宿主染色体中导入本DNA时，本DNA构建体通过选择合适的同源重组用DNA将本启动子DNA和编码DNA整合至宿主染色体上的目的位点，从而可通过本启动子DNA控制编码DNA的表达。选择用来向染色体中实现这种整合的同源重组用DNA为本领域技术人员众所周知，因此本领域技术人员可根据需要选择合适的同源重组用DNA并且构建同源重组用DNA构建体。

如果宿主染色体天然具有本启动子DNA，通过选择合适的同源重组用DNA，还可将本启动子DNA和编码DNA整合至宿主染色体上本启动子DNA天然存在的部位处。通过这种方式，替换了染色体上的本启动子DNA本来可控制的内源性编码DNA，从而可由本启动子DNA控制外源性编码DNA。因此，抑制了本来表达应被活化的内源性编码DNA的表达，而在本启动子DNA天然存在的染色体部位，可通过本启动子DNA活化外源性编码DNA的表达。这样的DNA构建体通过具有本启动子DNA和受本启动子控制的内源性结构基因的至少一部分作为同源重组用DNA，可整合至这样的宿主染色体上。

另外，通过选择同源重组用DNA，可在本启动子DNA整合至染色体的同时破坏宿主染色体上需要破坏的基因。所破坏的基因优选地是下文中描述的存在自体调节机制的基因。例如，当在酵母如酵母属酵母中利用编码参与有机酸生产的蛋白质的DNA产生有机酸时，优选地破坏丙酮酸脱羧酶基因(尤其是丙酮酸脱羧酶1基因)。这是因为丙酮酸脱羧酶1基因的启动子是强启动子并且如后所述具有自体调节机制。通过破坏该基因的整合，可抑制丙酮酸脱羧酶的表达而表达由外源DNA编码的蛋白质。此外，由于外源编码DNA的表达是在有机酸存在下受本启动子而活化的表达，因此通过由所表达的蛋白质促进有机酸生产而进一步促进外源性编码DNA的表达。

尤其，当利用编码乳酸脱氢酶的DNA生产乳酸时，以上提及的破坏模式更为有效。这是因为丙酮酸脱羧酶1基因与乳酸脱氢酶竞争乳酸脱氢酶的底物-丙酮酸。通过破坏该基因，可抑制丙酮酸脱羧酶的表达并且允许乳酸脱氢酶表达，同时由于本启动子DNA在有机酸(乳酸)存在下活化乳酸脱氢酶表达；期待乳酸生产会进一步促进。为了完成这种向染色体上的整合，本DNA构建体例如可包含丙酮酸脱羧酶结构基因的一部分或该基因的侧翼序列(起始密码子周围的序列、起始密码子上游区域序列(包含所述结构基因的启动子)、结构基因内的序列等)或与染色体上该基因上游区域和/或下游同源的DNA序列。优选地，以酵母属酵母(尤其酿酒酵母)作为宿主，以该宿主的丙酮酸脱羧酶1基因作为靶标构建DNA构建体。

丙酮酸脱羧酶基因的启动子是强启动子，因此可与本启动子DNA组合使用。即，可使用这样的同源重组用DNA构建体，其中所述同源重组用DNA构建体向酵母染色体上的丙酮酸脱羧酶基因(优选地是丙酮酸脱羧酶1基因)内在部位导入编码具有乳酸脱氢酶活性的蛋白质的DNA以替代本来可由丙酮酸脱羧酶基因的启动子控制的结构基因，并且可使用这样的同源重组用DNA构建体，其中所述同源重组用DNA构建体向酵母染色体上的本DNA启动子的内在部位导入编码具有乳酸脱氢酶活性的蛋白质的DNA以替代本来可由本DNA启动子控制的结构基因。通过PDC基因(优选地是PDC1基因)启动子和本启动子DNA两者的表达促进效果，以及通过破坏PDC(优选地是PDC1)结构基因而抑制丙酮酸脱羧酶基因的表达，预期将更有效地产生乳酸。此外，即便PDC1基因受到破坏，酵母的生长能力仍因为别的PDC5基因等替代性地生物合成丙酮酸脱羧酶而维持。另外，在这样的DNA构建体中，可将具有PDC1启动子活性的DNA作为发挥启动子DNA和同源重组用DNA这两种功能的DNA而具有。除了包含序列编号9中所示碱基序列的DNA以外，还可将与该DNA在严谨条件下杂交的DNA；在该碱基序列中含有1个或多个碱基替换、缺失、增加和/或插入的DNA用作PDC1基因启动子。这类DNA可以本启动子DNA相同的方式分离。

已由本发明人公开了PDC1基因为具有自体调节机制的基因(特开2003-164295号)。自体调节机制是指在同一生物中存在具备相同功能的多种基因，并且通常这些基因中的至少一种基因表达，而其它基因的表达则受到抑制，仅仅当通常表达的基因受到破坏等而失去功能时，其它的基因表达以维持这个基因的功能的一种机制。由于这种机制的存在，例如即便破坏酵母的PDC1基因，PDC5基因被活化，并且酵母的乙醇产生功能仍维持以维持生理功能。通过破坏具备这种自体调节机制的基因允许生物存活并且维持生长功能，结果导致维持携带外源DNA的转化体生长并同时有效产生目的物质。

在DNA构建体中，除了终止子外，根据需要还可连接增强子等的顺式作用元件、剪接信号、多聚A添加信号、选择性标记、核糖体结合序列(SD序列)。作为选择性标记，不作特别的限定，可利用以药物抗性基因、营养缺陷型基因为首的多种公知的选择性标记基因。例如可使用氨苄青霉素抗性基因、卡那霉素抗性G418基因、潮霉素抗性基因、博莱霉素抗性基因、新霉素抗性基因、二氢叶酸还原酶基因、氯霉素抗性基因、放线菌酮抗性基因等等。

本DNA构建体可通过多种恰当的方法导入合适的宿主细胞，所述方法包括转化法、转染法、接合法、原生质体融合、电穿孔法、脂质体转染法、乙酸锂法、粒子枪法、磷酸钙沉淀法、农杆菌(Agrobacterium)法、PEG法、直接显微注射法等。在导入本DNA构建体后，受体细胞在选择培养基上培养。

宿主细胞可为大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)等细菌；酿酒酵母、粟酒酵母(Saccharomyces pombe)等酵母属酵母、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)等酵母；sf9、sf21等昆虫细胞；COS细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)等动物细胞；甜马铃薯、烟草等植物细胞等。优选地使用进行醇发酵的微生物如酵母或耐酸性微生物，如以酿酒酵母等酵母属酵母为首的酵母。更具体地，以酿酒酵母IFO2260株和YPH株为例示。

可通过PCR法和Southern杂交法证实本DNA构建体是否已导入宿主或是否已导入染色体上的目的部位处。例如证实可通过从转化体中制备DNA，并通过导入部位特异性引物实施PCR，电泳检测PCR产物中的目的条带。备选地，使用荧光染料等标记的引物进行PCR也可用于证实。这些方法为本领域技术人员众所周知。

在由本DNA构建体转化的转化体中，DNA构建体的组分—本启动子DNA和编码DNA等在染色体上或染色体外因子(包含人工染色体)上存在。当导入了上述DNA构建体中可完成同源重组的同源重组用DNA构建体时，可获得在宿主染色体的目的位置处具有本启动子DNA和与该DNA有效连接的编码DNA的转化体。

在通过与宿主染色体同源重组获得的转化体的一个优选实施方案中，在本启动子DNA天然存在的染色体上的部位，编码DNA与本启动子DNA有效连接。由于通过所述转化体，编码DNA的表达受有机酸存在下的本启动子DNA活化，因此目的产物在有机酸存在下有效地获得。在该实施方案中，编码DNA优选地是编码具有乳酸脱氢酶活性的蛋白质。所述转化体通过该乳酸脱氢酶活性产生乳酸，并且通过乳酸产生进一步促进所述酶活性的表达，从而促进乳酸产生。

在本发明转化体的另一个优选实施方案中，宿主(酵母等)染色体上具有自体调节机制的基因受到破坏，而且与此同时，该基因的启动子被替代，具备的是本启动子DNA和与该DNA有效连接的编码DNA。在该转化体中，这些DNA特别地未对宿主产生致命的功能性损害，且可使编码DNA表达。当将编码具有乳酸脱氢酶活性的蛋白质的DNA用作编码DNA时，可在产生乳酸同时抑制对所述宿主生长的损害。

在本发明转化体的另一个优选实施方案中，宿主(酵母等)染色体上的PDC1基因受到破坏，而且与此同时，该基因的启动子被替代，具备的是本启动子DNA和与该DNA有效连接的编码DNA。在该转化体中，尤其当使用编码具有乳酸脱氢酶活性的蛋白质的DNA作为编码DNA时，可通过本启动子DNA表达乳酸脱氢酶，同时抑制竞争性丙酮酸脱羧酶表达；因此，可获得适用于产生乳酸的转化体。如前所述，即使PDC1基因被破坏，由于所述基因存在自体调节机制，故仍能维持宿主的生长性等。

在转化体的另一优选实施方案中，在宿主染色体上具有本启动子DNA和与该DNA有效连接的编码DNA(例如，以上提及的三个优选实施方案之一或它们的组合)，而且与此同时，在宿主染色体上或在宿主染色体外具有PDC1启动子DNA和与该DNA有效连接的编码DNA。在该实施方案，若编码DNA为任一编码具有参与有机酸例如乳酸生物合成的酶活性的蛋白质的DNA时，则有机酸生物合成酶的表达由PDC1启动子组成型活化，并且由本启动子DNA有机酸诱导型地活化有机酸生物合成酶的表达；因此可预期高效的有机酸产生。特别在该实施方案中，作为PDC1启动子，优选地利用宿主染色体上的内在性PDC1启动子。此时，通过PDC1启动子使得可稳定地表达。

转化体的优选宿主是酵母，其中优选酵母属酵母，并且更优选酿酒酵母。此外，编码DNA优选地是编码具有乳酸脱氢酶活性的蛋白质的DNA，并且更优选地是编码牛乳酸脱氢酶的DNA。

在本发明中，重要的是在宿主染色体中由本启动子DNA表达编码DNA。特别地，为获得使本来不产生有机酸的或使得较本来的有机酸生产量而言该生产量增加的转化体，常常使用利用2μm DNA的YEP型质粒载体的方法，但在此情况下，有报道称难以保留编码DNA。然而，在本发明中，发现表达活性极高以至于不用考虑这仅是由于高DNA保留所引起的。因此根据本发明，通过利用位于染色体上的有机酸存在下的本启动子DNA，可活化与该DNA有效连接的编码DNA的表达，可构建编码DNA的稳定且出乎意料地具备高表达性的基因表达系统。此外，当编码DNA为编码乳酸脱氢酶这样的参与有机酸生物合成的具有酶活性的蛋白质的DNA时，通过本启动子DNA活化表达的编码DNA的终产物-有机酸预期将进一步活化由本启动子DNA活化的编码DNA表达。也即可期待产生协同的且连续的蛋白质生物合成以及促进终产物的生物合成。

此外，当编码具有乳酸脱氢酶活性的DNA用作编码DNA时，通过将本启动子DNA和编码DNA导入宿主染色体的PDC1基因并破坏PDC1基因，除了上述效果之外，可由于PDC1基因的破坏而致的丙酮酸脱羧酶表达抑制效应有效地促进乳酸产生。

当在本发明启动子DNA的下游连接编码乳酸脱氢酶的DNA并导入染色体中时，作为增加乳酸生产量的目的，可制造在染色体中导入了多个所述基因导入片段的转化体。此时，可使用1种本启动子DNA，此外还可组合使用2种或2种以上本启动子。在组合使用2种或2种以上本启动子的实施方案中，编码DNA与每种启动子连接以从每种启动子表达乳酸脱氢酶。例如可制备这样的转化体，其中所述转化体导入了本启动子DNA中2种或2种以上的启动子DNA分别与编码具有乳酸脱氢酶活性的蛋白质的DNA连接而制备的1种或多种基因导入片段。在一个更具体的例子中，通过将在HOR7启动子下游连接有编码DNA的基因导入片段和在TDH2启动子下游连接有编码DNA的基因导入片段导入宿主，可获得由HOR7启动子进行的具有乳酸脱氢酶活性的蛋白质的表达和TDH2启动子进行的具有乳酸脱氢酶活性的蛋白质的表达在同一个转化体内组合表达的转化体。启动子不限于上述启动子；例如也可与PDC1启动子等其它启动子组合。

虽然不限制本发明，认为以上提及的利用宿主染色体上的内源性启动子(本DNA启动子和PDC1启动子)活化编码具有乳酸脱氢酶活性的蛋白质的DNA表达出乎意料地获得更大量的乳酸产生主要是因为在染色体上这些启动子本来内在的部位处，应由这些启动子天然控制的结构基因被替代为编码具有乳酸脱氢酶活性的蛋白质的DNA的表达。即，认为在染色体上的这些启动子部位处利用该启动子备选地表达另外的乳酸脱氢酶，或替换该启动子和结构基因而利用另外的启动子备选地表达乳酸脱氢酶是重要的。除了这些原因外，就PDC1启动子而言，认为PDC1启动子是一种强组成型启动子并且是具有自体调节机制的基因的启动子，对乳酸产生量的增大有贡献，并且就本启动子DNA而言，认为是在有机酸(乳酸)存在下活化表达的诱导型启动子。

培养导入了本DNA构建体而获得的转化体允许培养基内产生由外源基因表达的产物-蛋白质。由于所述表达方法在有机酸存在下促进编码DNA的表达，因此向培养系统中添加有机酸等使有机酸存在于培养系统，可促进产生有用的蛋白质。当编码DNA编码参与有机酸生产的蛋白质时，由该编码DNA表达推动的有机酸产生进一步促进了该编码DNA的表达。另外，即便编码DNA编码了参与有机酸生产的蛋白质，还可从外部向所述培养系统添加有机酸。当该蛋白质是与有机酸生物合成相关的酶如乳酸脱氢酶时，在培养系统中产生了有机酸如乳酸。可通过实施从所述培养基中分离有机酸的方法获得所述有机酸。本发明的培养物包括培养上清、培养细胞或菌体、细胞或菌体的破碎物。

在培养本发明的转化体时，可根据转化体的种类选择培养条件。此类培养条件为本领域技术人员众所周知。在生产有机酸如乳酸时，可根据需要将产物(乳酸等)进行中和或进行连续地除去乳酸等处理。作为培养以大肠杆菌(E.coli)和酵母等微生物为宿主获得的转化体的培养基，可使用天然培养基或合成培养基，只要所述培养基含有微生物可同化的碳源、氮源、无机盐等并且可有效地培养转化体即可。作为碳源，可使用葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉、纤维素等糖类；乙酸、丙酸等有机酸；乙醇、丙醇等醇类。作为氮源，可使用氨、氯化铵、硫酸铵、乙酸铵、磷酸铵等无机酸的铵盐或有机酸的铵盐或其它含氮化合物，还可使用蛋白胨、肉膏、玉米浆等。作为无机物，可使用磷酸二氢钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜、碳酸钙等。

培养通常在30℃好气条件下实施6-24小时，如振荡培养或通气搅拌培养等。优选地，在培养期间将pH维持在2.0-6.0。所述pH可用无机酸或有机酸、碱溶液等调节。根据需要，在培养期间可向培养基中添加氨苄青霉素、四环素等抗生素。

培养结束后，为从培养物中分离基因产物，可使用常用的乳酸纯化方法。例如当基因产物在所转化的细胞内产生时，为从细胞中分离基因产物，通过常规方法超声破坏处理、磨碎处理、加压破碎菌体等而破坏细胞。在在这种情况下，根据需要添加蛋白酶。此外，当基因产物在培养上清中产生时，经过滤和离心从所述溶液中取出固体成分。

乳酸可从这些粗提取级分中使用多种已知的纯化分离方法纯化。此外，根据需要可将所述粗提取级分及其纯化产物酯化等以获得多种乳酸衍生物。

实施例1

在下文中，将描述本发明具体的实施例，然而，本发明不受它们的限制而且可应用于本发明范围内的多种实施方案。

(经定量PCR法进行启动子的表达分析)

作为具有乳酸生产能力的重组酵母，使用根据特开2003-259878号公报(日本专利申请第2002-65879号)制备的重组酵母，在中性条件(pH4.0-8.0)实施乳酸发酵，并且发酵开始后6小时和30小时收集菌体用于RNA制备。使用了RNeasy Mini试剂盒(Qiagen公司生产)制备RNA。cDNA利用第一链cDNA合成试剂盒(Roche Diagnostics公司生产)从获得的RNA合成。另外，将酵母IFO2260株(社团法人发行研究所登录株)的色氨酸合成缺陷株在10ml YPD培养基中30℃培养至对数生长期，收集菌体并以TE缓冲液洗涤，然后加入0.5ml TE缓冲液和0.5mM乙酸锂，在30℃振荡培养后，将下述的pBTrp-PDC1-LDHKCB载体以限制性酶ApaI和SacI(均为宝酒生产)处理并且添加，并将得到的菌落在色氨酸选择培养基中培养，对于可确认稳定性的经选择株，可获得所用的上述重组酵母，其作为确认的具有稳定的色氨酸合成能力且前述DNA片段导入特定染色体位置的菌株。

将上述样品、目的基因引物和Light Cycler DNA Master SYBR GreenI(Roche Diagnostics公司生产)混合，使用定量PCR分析装置Light Cycler(Roche Diagnostics公司生产)进行表达分析。具体地遵循附加的操作方法进行。此外，同样设置各基因片段量4fM、20fM、100fM，以它们作为对照测定表达量。

共分析28种基因的表达。对28种基因中最终可确认有效表达的6种高表达候选启动子，列出了所用的引物序列和Light Cycler分析时的Tm值。另外，也分析了作为高表达对照启动子的PDC1基因启动子和TDH3基因启动子。同样地，对这些对照启动子也列出了引物序列和Tm值。

<证实HOR7基因表达的引物>Tm值：60℃

5’-CGT CGC CTT CAC TGG TTT AG-3’(序列编号10)

5’-CAA AAA GGC CAA AGC ACC AG-3’(序列编号11)

<证实TDH2基因表达的引物>Tm值：57℃

5’-CAA GGT AAG TTG ACC GGT ATG-3’(序列编号12)

5’-GAT GGA AGA GTT AGA GTC ACC C-3’(序列编号13)

<证实HXT7基因表达的引物>Tm值：57℃

5’-TCA TGG GCT GTT TGG TCT TC-3’(序列编号14)

5’-AGC GTC GTA GTT GGC ACC TC-3’(序列编号15)

<证实HSP30基因表达的引物>Tm值：57℃

5’-AAT TGC AGT CAG CCG TGA TG-3’(序列编号16)

5’-TCG ACA GCT TGC TCT GCT TC-3’(序列编号17)

<证实AHP1基因表达的引物>Tm值：60℃

5’-AAC CAA GCG TGG GCT AAG AG-3’(序列编号18)

5’-GGT TTC CTT GGC AGC GTA AG-3’(序列编号19)

<证实MRH1基因表达的引物>Tm值：57℃

5’-GCT GCC TGT GTT CAC TCC AC-3’(序列编号20)

5’-TGG CTG CAA AAC GTT ACC AC-3’(序列编号21)

<证实PDC1基因表达的引物>Tm值：60℃

5’-CAA CGA ATT GAA CGC TGC TTA C-3’(序列编号22)

5’-ATT CAA CGG CTT CCT TAA CTT CTG-3’(序列编号23)

<证实TDH3基因表达的引物>Tm值：57℃

5’-GTT TTC AAG GAA TTA GAC ACT GC-3’(序列编号24)

5’-CAA CAG TCT TTT GAG TAG CAG TC-3’(序列编号25)

作为定量PCR的结果，选择了HOR7基因启动子、TDH2基因启动子、HXT7基因启动子、HSP30基因启动子、AHP1基因启动子和MRH1基因启动子。这些基因在产乳酸酵母中表现高于PDC1和TDH3基因的表达。所述结果在图1中显示。此外，这些基因中的任一基因的表达量均高于非重组株中的表达量。以上结果显示这些基因的表达由有机酸存在下诱导型表达的启动子活化。

实施例2

(启动子的获得和碱基序列的确定)

选择了六种基因启动子(HOR7基因启动子、TDH2基因启动子、HXT7基因启动子、HSP30基因启动子、AHP1基因启动子、MRH1基因启动子)作为在实施例1中显示有效表达的高表达候选启动子，并且将这些基因片段克隆。同时也获得了已知是高表达启动子的PDC1基因启动子和TDH3基因启动子作为评估启动子的对照。

作为启动子获得中的所述基因资源，通过使用酵母IFO2260株(社团法人发酵研究所登录的菌株)的基因组DNA作为模板，通过PCR扩增法分离。此菌株在2ml YPD培养基中过夜培养，使用基因组DNA制备试剂盒GenToRukun^TM-酵母用-(TAKARA BIO INC.生产)制备基因组DNA。将所制备的基因组DNA的DNA浓度以分光光度计Urtro spec 3000(Amersham Pharmacia Biotech公司生产)测定。

使用给予所扩增片段高保真的KOD plus DNA聚合酶(东洋纺社)作为PCR反应的扩增酶。DNA扩增通过PCR扩增仪Gene Amp PCR system9700(PE Applied Biosystems)在总体积50μl的反应液中实施，其中所述反应液含有50ng从酵母IFO2260株制备的基因组DNA、50pmol×2引物DNA、5μl 10倍浓缩的KOD酶反应缓冲液、2μl 25mM MgSO₄、5μl2mM dNTP混合物和1.0单位KOD plus DNA聚合酶。PCR扩增仪的反应条件是：96℃热处理2分钟，随后是25个循环(1个循环为96℃ 30秒、53℃ 30秒、72℃ 60秒的3个温度变化)以及最终4℃温育。将本反应样品5μl通过1％TBE琼脂糖凝胶(含0.5μg/ml溴化乙锭)电泳，并且所述凝胶中的DNA条带经254nm的紫外线照射(Funakoshi公司生产)检测，进行基因扩增的确认。

引物序列如下：

<扩增HOR7基因启动子的引物>

HOR7P-U(35聚体；Tm值：72.6℃；末端添加限制性酶NotI位点)

5’-ATA TAT GCG GCC GCT CGC AGC CAC GGG TCA ACC CG-3’(序列编号26)

HOR7P-D(41聚体；Tm值：53.7℃；末端添加限制性酶SpeI位点)

5’-ATA TAT ACT AGT TTT TAT TAT TAG TCT TTT TTT TTTTTG AC-3’(序列编号27)

<扩增TDH2基因启动子的引物>

TDH2P-U(39聚体；Tm值：67.1℃；末端添加限制性酶NotI位点)

5’-ATA TAT GCG GCC GCT TGA CGG GTA TTC TGA GCA TCTTAC-3’(序列编号28)

TDH2P-D(38聚体；Tm值：56.5℃；末端添加限制性酶SpeI位点)

5’-TAT ATA CTA GTT TGT TTT GTT TGT TTG TGT GAT GAATT-3’(序列编号29)

<扩增HXT7基因启动子的引物>

HXT7P-U(33聚体；Tm值：68.4℃；末端添加限制性酶NotI位点)

5’-ATA TAT GCG GCC GCC CTG CTA AAC ACG CCC TAC-3’(序列编号30)

HXT7P-D(40聚体；Tm值：52.5℃；末端添加限制性酶SpeI位点)

5’-ATA TAT ACT AGT TTT TGA TTA AAA TTA AAA AAA CTTTTT G-3’(序列编号31)

<扩增HSP30基因启动子的引物>

HSP30P-U(34聚体；Tm值：64.5℃；末端添加限制性酶NotI位点)

5’-ATA TAT GCG GCC GCT GAA TAC GTC CTG TCA ATT C-3’(序列编号32)

HSP30P-D(36聚体；Tm值：54.0℃；末端添加限制性酶SpeI位点)

5’-ATA TAT ACT AGT TGA AAT TTG TTG TTT TTA GTA ATC-3’(序列编号33)

<扩增AHP1基因启动子的引物>

AHP1P-U(35聚体；Tm值：65.5℃；末端添加限制性酶NotI位点)

5’-ATA TAT GCG GCC GCA TCC GAA TTC AAT GTA GCA CC-3’(序列编号34)

AHP1P-D(37聚体；Tm值：58.6℃；末端添加限制性酶SpeI位点)

5’-ATA TAT ACT AGT GTT TTG TTG TGG TTA TTG GTA GTAC-3’(序列编号35)

<扩增MRH1基因启动子的引物>

MRH1P-U(47聚体；Tm值：71.1℃；末端添加限制性酶NotI位点)

5’-AGC TAG CTA GCG GCC GCG ATG GAA GAT GCA ACT TGCAAA TGT AGT CC-3’(序列编号36)

MRH1P-D(47聚体；Tm值：64.1℃；末端添加限制性酶SpeI位点)

5’-AGC TAG CTA CTA GTG TTA TTT TTC TTC TTT GTT CTGTGG GTT AAA GG-3’(序列编号37)

<扩增TDH3基因启动子的引物(对照)>

TDH3P-U(42聚体；Tm值：69.5℃；末端添加限制性酶NotI位点)

5’-AGC TAG CTA GCG GCC GCG TTG AAT GTT AGC GTC AACAAC AAG-3’(序列编号38)

TDH3P-D(47聚体；Tm值：62.3℃；末端添加限制性酶SpeI位点)

5’-AGC TAG CTA CTA GTT TGT TTG TTT ATG TGT GTT TATTCG AAA CTA AG-3’(序列编号39)

<扩增PDC1基因启动子的引物(对照)>

PDC1P-U(42聚体；Tm值：67.1℃；末端添加限制性酶NotI位点)

5’-AGC TAG CTA GCG GCC GCG TTG AAT GTT AGC GTC AACAAC AAG-3’(序列编号40)

PDC1P-D(37聚体；Tm值：56.4℃；末端添加限制性酶SpeI位点)

5’-TAT ATA CTA GTT TGA TTG ATT TGA CTG TGT TAT TTTG-3’(序列编号41)

将所获的PCR片段亚克隆至pBluescriptII SK+载体(东洋纺社)内。根据常规的DNA亚克隆方法实施一系列反应过程。即，通过T4 DNA连接酶将经限制性酶NotI和SpeI(TAKARA BIO INC.)处理的上述载体与经相同限制性酶处理的各启动子片段连接。使用LigaFast Rapid DNALigation(0Promega公司)进行T4 DNA连接酶反应，具体操作遵循所附的操作说明。

随后，通过向大肠杆菌感受态细胞中导入连接反应液而转化大肠杆菌。使用JM109株(东洋纺社)作为大肠杆菌感受态细胞，具体操作遵循所附的操作说明。在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB平板上选择菌落，从每个所挑选的菌落中制备质粒DNA，随后通过使用如序列编号26-41中所示引物进行菌落PCR证实，并且随后将分别的启动子序列亚克隆。一系列操作如乙醇沉淀处理、限制性酶处理等遵循Molecular Cloning-A LaboratoryManual，第二版(Maniatis等，Cold Spring Harbor Laboratory press.1989)。

通过碱提取法制备含有经分离启动子序列的每一种载体，并且经GFXDNA纯化试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech)柱纯化。随后DNA浓度以分光光度计Urtro spec 3000(Amersham Pharmacia Biotech)测定，并使用DNA碱基序列试剂盒BigDye Terminator Cycle Sequencing ReadyReaction Kit(PE Applied Biosystems)实施测序反应。将反应样品置于碱基序列分析仪ABI PRISM 310 Genetic Analyzer(PE AppliedBiosystems)，确定所述6种启动子的碱基序列。所述仪器的详细用法遵循该仪器附带的说明手册。由序列分析确定的DNA序列在序列编号1-6给出。

实施例3

(重组载体的构建)

新构建的染色体导入型载体分别命名为pBTRP-HOR7P-LDH载体、pBTRP-TDH2P-LDH载体、pBTRP-HXT7P-LDH载体、pBTRP-HSP30P-LDH载体、pBTRP-AHP1P-LDH载体和pBTRP-MRH1P-LDH载体。另外，作为启动子比较的对照，也构建了可在TDH3基因启动子、PDC1基因启动子下可表达L-LDH基因的载体，分别命名为pBTRP-TDH3P-LDH载体、pBTRP-PDC1P-LDH载体。下文中基于图2和图3详细地描述了在本实施例中的载体构建步骤，然而，载体构建程序并不限于此。一系列在载体构建中的反应操作遵循常用的DNA亚克隆方法，一系列的酶类使用了TAKARA BIO公司生产的酶。

(前载体(prevector)的构建)。

根据常用的DNA亚克隆方法，构建了pBTRP-LDH前载体。将经ApaI和PstI限制性酶处理本发明人已构建的pBTrp-PDC1-LDHKCB载体(在特开2003-259878号中描述)所获得的片段导入经相同限制性酶处理的pBluescriptII SK+载体(东洋纺社)，构建了pBTRP-PDC1D载体。随后，将通过PCR扩增获得，随后以SacI和NotI限制性酶处理的TRX1片段(700碱基对)以及通过PCR扩增获得，随后以Spe和BamHI限制性酶处理的LDHKCB片段(2,000碱基对)顺次连接至pBTRP-PDC1D载体，构建了pBTRP-LDH前载体。

pBTrp-PDC1P-LDHKCB载体以如下方式构建。即为了在酿酒酵母中有效地产生源自高等真核生物牛的L-乳酸脱氢酶，根据如下设计要点对编码牛L-乳酸脱氢酶的氨基酸序列的DNA设计天然不存在的新基因序列(序列编号42)，利用已知作为长链DNA合成方法的藤本等人的方法(藤本英也；合成基因的制备法，植物细胞工程系列7植物的PCR实验方法；1997；秀润社，第95-100页)合成了所述DNA(所合成的DNA命名为LDHKCB序列)。使用全合成的LDHKCB序列构建了酵母染色体导入型载体pBTRP-PDC1-LDHKCB(见图2右上)。此外，将经EcoRI酶处理的LDHKCB序列与根据常用方法同样地经EcoRI消化的pCR2.1TOPOVector(Invitrogen)连接，并且将得到的载体命名为pBTOPO-LDHKCB。

1.用于构建pBTrp-PDC1-LDHKCB的PDC1P片段通过使用酿酒酵母YPH株(Stratagene公司)的基因组DNA作为模板进行PCR扩增而分离。酿酒酵母YPH株的基因组DNA是使用基因组制备试剂盒Fast DNAKit(Bio 101公司)制备；所述细节遵循附带的操作手册。通过分光光度计Ultro spec 3000(Amersham Pharmacia Biotech公司)测定DNA浓度。使用Pyrobest DNA聚合酶(宝酒造)作为PCR反应扩增酶以获得所扩增片段的高保真性。

制备总共50μl的反应体系，其中含有50ng/样品的根据以上方法制备的酿酒酵母YPH株基因组DNA、引物DNA 50pmol/样品、以及0.2单位/样品的Pyrobest DNA聚合酶。将反应溶液在PCR扩增仪Gene Amp PCRsystem 9700(PE Applied Biosystems公司)中进行DNA扩增。PCR扩增仪的反应条件是：96℃热处理2分钟，随后25个循环(3个温度变化为1个循环：96℃ 30秒、53℃ 30秒和72℃ 60秒)以及最终4℃温育。PDC1引物扩增的片段在1％TBE琼脂糖凝胶中电泳以证实基因扩增片段。在本反应中，使用合成DNA(Sawady technology公司)作为引物DNA，其序列如下：

-PDC1P-LDH-U(31聚体；Tm值：58.3℃)，其末端添加有限制性酶BamHI位点：ATA TAT GGA TCC GCG TTT ATT TAC CTA TCT C(序列编号44)

-PDC1P-LDH-D(31聚体；Tm值：54.4℃)，其末端添加有限制性酶EcoRI位点：ATA TAT GAA TTC TTT GAT TGA TTT GAC TGT G(序列编号45)

2.如上所述通过使用酿酒酵母YPH株基因组DNA为模板的PCR扩增法分离作为基因片段的PDC1基因启动子片段(PDC1P)971碱基对和PDC1基因下游区片段(PDC1D)518碱基对。PCR扩增的步骤如上所述，但使用如下引物扩增PDC1基因下游区片段：

-PDC1D-LDH-U(34聚体；Tm值：55.3℃)，其末端添加有限制性酶XhoI位点：ATA TAT CTC GAG GCC AGC TAA CTT CTT GGT CGA C(序列编号46)

-PDC1D-LDH-D(31聚体；Tm值：54.4℃)，其末端添加有限制性酶ApaI位点：ATA TAT GAA TTC TTT GAT TGA TTT GAC TGT G(序列编号47)

3.上述反应获得的PDC1P和PDC1D基因扩增片段分别通过乙醇沉淀处理纯化，随后将PDC1P扩增片段经限制性酶BamHI/EcoRI进行限制性酶反应处理，并将PDC1D扩增片段经限制性酶XhoI/ApaI进行限制性酶反应处理。以下使用的所有酶是宝酒造社生产的产品。此外，一系列用于乙醇沉淀处理和限制性酶处理的详细操作遵循Molecular Cloning-ALaboratory Manual，第二版(Maniatis等，Cold Spring Harbor Laboratorypress.1989)。由以上PCR法扩增并经限制性酶处理的PDC1P片段通过T4 DNA连接酶与经限制性酶BamHI/EcoRI(宝酒造社)并经去磷酸化酶的碱性磷酸酶(BAP，宝酒造社)处理的pBluescriptII SK+载体(东洋纺社)连接。LigaFast Rapid DNA Ligation System(Promega公司)用于所述T4 DNA连接反应；其细节遵循附带的操作手册。

4.接下来，使用连接反应溶液向感受态细胞进行转化。使用大肠杆菌JM109株(东洋纺社)作为感受态细胞；其细节遵循附带的操作手册。得到的培养液涂布在含100μg/ml氨苄青霉素抗生素的LB平板上，过夜培养。所生长的菌落利用插入片段的引物DNA通过菌落PCR法确认；以及对小量制备的质粒DNA溶液以限制性酶处理进行确认，分离载体pBPDC1P。

5.其次，将如上所构建的pBTOPO-LDHKCB载体以限制性酶EcoRI处理并以末端修饰酶T4 DNA聚合酶处理而得到的LDHKCB基因片段亚克隆至以如上相同方式经相同的限制性酶EcoRI处理和末端修饰酶T4DNA聚合酶处理的pBPDC1P载体内，由此构建pBPDC1P-LDHKCB载体。

6.另一方面，将已构建的pYLD1载体以限制性酶EcoRI/AatII处理和末端修饰酶T4 DNA聚合酶处理，并且将得到的LDH基因(源自长双歧杆菌(Bifidobacterium longum))片段亚克隆至以如上相同方式经同样的限制性酶EcoRI和末端修饰酶T4 DNA聚合酶处理的pBPDC1P载体，由此构建pBPDC1P-LDH1载体。将上述pYLD1载体导入大肠杆菌(称作大肠杆菌pYLD1)并且根据布达佩斯条约进行了国际保藏，保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(茨城县筑波市东1丁目1番地1)，保藏号FERMBP-7423(原保藏日：1999年10月26日)。

7.随后，将该载体以XhoI/ApaI处理并且与同样经限制性酶处理的PDC1D扩增片段连接，由此构建pBPDC1P-LDH载体。最后，将经EcoRV处理的pBPDC1P-LDHII载体与以AatII/SspI和T4 DNA聚合酶处理pRS404载体(Stratagene)所得到的Trp标记片段连接，由此构建pBTrp-PDC 1-LDH载体。

8.随后，将pBPDC1P-LDHKCB载体以ApaI/EcoRI限制性酶处理，另外，将p BTrp-PDC1-LDH载体用限制性酶ApaI和StuI处理的含有Trp标记的片段与所处理的扩增片段连接，由此构建了最终的构建体，即染色体导入型pBTrp-PDC1-LDHKCB载体。

(最终载体的构建和确认)

通过将经限制性酶NotI和SpeI处理的前载体pBTRP-LDH与经相同限制性酶处理的以上实施例2中所获启动子序列连接，获得最终载体。本文所制备的pBTRP-HOR7P-LDH载体、pBTRP-TDH2P-LDH载体、pBTRP-HXT7P-LDH载体、pBTRP-HSP30P-LDH载体、pBTRP-AHP1P-LDH载体、pBTRP-MRH1P-LDH载体、以及作为比较对照而制备的pBTRP-TDH3P-LDH载体、pBTRP-PDC1P-LDH载体的详细图谱在图4至图11中呈现。

LigaFast Rapid DNA Ligation(Promega)用于以上的一系列DNA连接反应，所述细节遵循附带的操作手册进行。使用大肠杆菌JM109株(东洋纺社)作为以连接反应溶液进行转化的感受态细胞。在所有情况下，菌落在含有100μg/ml氨苄青霉素抗生素的LB平板上选择，并且对每个菌落使用菌落PCR法确认是否为目的载体。一系列用于乙醇沉淀处理和限制性酶处理的详细操作遵循Molecular Cloning-A Laboratory Manual，第二版(Maniatis等，Cold Spring Harbor Laboratory press.1989)。

实施例4

(酵母转化体的制备)

宿主酵母IFO2260株(社团法人发酵研究所登录的菌株)的色氨酸合成能力缺乏株在10ml YPD培养液中30℃培养至对数生长期(OD600nm＝0.8)。从所述酵母株中利用Frozen-EZ酵母转化II试剂盒(ZYMORESEARCH)制备感受态细胞。根据所述试剂盒附带的操作手册，向这些感受态细胞基因导入经限制性酶PvuII处理的上述实施例4构建的染色体导入型载体。具体的导入载体为pBTRP-HOR7P-LDH载体、pBTRP-TDH2P-LDH载体、pBTRP-HXT7P-LDH载体、pBTRP-HSP30P-LDH载体、pBTRP-AHP1P-LDH载体、pBTRP-MRH1P-LDH载体、以及作为比较对照的pBTRP-TDH3P-LDH载体、pBTRP-PDC1P-LDH载体这8种。这些转化样品洗涤后，在100μl灭菌水中溶解并且在色氨酸选择性培养基上涂板，并且随后将每种转化体30℃静置培养选择。

所获的每个菌落再次在新鲜色氨酸选择性培养基内分离，并且将保持稳定生长能力的那些菌落确定为候选转化体。随后，这些候选菌株在2mlYPD培养液中过夜培养，并且使用基因组DNA制备试剂盒GenToRukun^TM for yeasts(TAKARA BIO INC.)从这些候选菌株中制备基因组DNA。使用所制备的每种基因组DNA作为模板实施PCR分析，并且将已经证实存在所导入基因的那些菌株确定为转化体。每种酵母转化体的染色体中导入基因的结构在图12至图19中显示。

实施例5

(通过发酵试验检查每种启动子)

测定了由制备的转化体产生L-乳酸的生产量，并且与使用已知为高表达启动子的TDH3基因启动子和PDC1启动子所产生的乳酸生产量比较，检查所获得的6种启动子的活性(有机酸存在下的活性)。所获得的八种酵母转化体接种至5ml YPD培养液并且30℃ 130转/分钟振荡培养过夜，以OD600nm＝1.2的菌体为初始菌体。向含有10％葡萄糖的20ml YPD培养液和含有约10％蔗糖的20ml蔗汁培养液分别接种2ml培养物(总体积：22ml)并且添加1g碳酸钙(Nacalai tesque)作为中和剂。30℃静置培养4日。为测定乳酸生产量，使用多功能生物传感器BF-4装置(王子计测机器公司)；详细说明遵循附带的手册。结果在图20和图21中显示。

如在图20和图21中所示，HOR7基因启动子、TDH2基因启动子、和HXT7基因启动子表现出与作为对照的PDC1启动子和TDH3启动子同等的表达水平或较高的表达水平。而另一方面，HSP30基因启动子、AHP1基因启动子、和MRH1基因启动子未表现出高于对照启动子的表达水平，然而，据认为由于乳酸生产量少，通过这些启动子的表达水平处于不高的状态；因此，从外部向所述培养系统内添加有机酸如乳酸或通过组成型启动子使乳酸表达，可确认高的表达水平。

序列表独立文本

序列编号10-41：合成引物

序列编号42和43：合成DNA

序列编号44-47：合成引物

序列表

<110>株式会社丰田中央研究所

丰田自动车株式会社

<120>有机酸存在下的启动子及其用途

<130>FNTCA001WO

<150>JP2003-379076

<151>2003-11-07

<160>47

<170>PatentIn版本3.1

<210>1

<211>810

<212>DNA

<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400>1

ctcgctcgca gccacgggtc aacccgattg ggatcacccc actggggccc aagcctgata 60

tccgacctcc atgaaatttt tttttttctt tcgattagca cgcacacaca tcacatagac 120

tgcgtcataa aaatacacta cggaaaaacc ataaagagca aagcgatacc tacttggaag 180

gaaaaggagc acgcttgtaa gggggatggg ggctaagaag tcattcactt tcttttccct 240

tcgcggtccg gacccgggac ccctcctctc cccgcacgat ttcttccttt catatcttcc 300

ttttattcct atcccgttga agcaaccgca ctatgactaa atggtgctgg acatctccat 360

ggctgtgact tgtgtgtatc tcacagtggt aacggcaccg tggctcggaa acggttcctt 420

cgtgacaatt ctagaacagg ggctacagtc tcgataatag aataataagc gcatttttgc 480

tagcgccgcc gcggcgcccg tttcccaata gggaggcgca gtttatcggc ggagctctac 540

ttcttcctat ttgggtaagc ccctttctgt tttcggccag tggttgctgc aggctgcgcc 600

ggagaacata gtgataaggg atgtaacttt cgatgagaga attagcaagc ggaaaaaaac 660

tatggctagc tgggagttgt ttttcaatca tataaaaggg agaaattgtt gctcactatg 720

tgacagtttc tgggacgtct taacttttat tgcagaggac tatcaaatca tacagatatt 780

gtcaaaaaaa aaaaagacta ataataaaaa 810

<210>2

<211>869

<212>DNA

<213>酿酒酵母

<400>2

cttgacgggt attctgagca tcttactcag tttcaagatc ttttaatgtc caaaaacatt 60

tgagccgatc taaatacttc tgtgttttca ttaatttata aattgtactc ttttaagaca 120

tggaaagtac caacatcggt tgaaacagtt tttcatttac atatggttta ttggtttttc 180

cagtgaatga ttatttgtcg ttaccctttc gtaaaagttc taacacgttt ttaagtattg 240

tttagttgct ctttcgacat atatgattat ccctgcgcgg ctaaagttaa agatgcaaaa 300

aacgtaagac aactgaagtt aatttacgtc aattaagttt tccagggtaa tgatgttttg 360

ggcttccact aattcaataa gtgtgtcatg aaatacgttg tgaagagcat ccagaaataa 420

tgaaaagaaa caacgaaact gggtcggcct gttgtttctt ttctttacca cgtgatctgc 480

ggcatttaca ggaagtcgct cgttttgcgc agttgttgca acgcagctac ggctaacaaa 540

gcctagtgga actcgactga tgtgttaggg cctaaaactg gtggtgacag ctgaagtgaa 600

ctattcaatc caatcatgtc atggctgtca caaagacctt gcggaccgca cgtacgaaca 660

catacgtatg ctaatatgtg ttttgatagt acccagtgat cgcagacctg caattttttt 720

gtaggtttgg aagaatatat aaaggttgca ctcattcaag atagtttttt tcttgtgtgt 780

ctattcattt tattattgtt tgtttaaatg ttaaaaaaac caagaactta gtttcaaatt 840

aaattcatca cacaaacaaa caaaacaaa 869

<210>3

<211>957

<212>DNA

<213>酿酒酵母

<400>3

gccctgctaa acacgcccta ctaaacactt caaaagcaac ttaaaatatt tttatctaat 60

tatagctaaa acccaatgtg aaagacatat catactgtaa aagtgaaaaa gcagcaccgt 120

tgaacgccgc aagagtgctc ccataacgct ttactagagg gctagatttt aatggcccct 180

tcatggagaa gttatgagga caaatcccac tacagaaagc gcaacaaatt tttttttccg 240

taacaacaaa catctcatct agtttctgcc ttaaacaaag ccgcagccag agccgttttt 300

ccgccatatt tatccaggat tgttccatac ggctccgtca gaggctgcta cgggatgttt 360

tttttttacc ccgtggaaat gaggggtatg caggaatttg tgcggggtag gaaatctttt 420

ttttttttag gaggaacaac tggtggaaga atgcccacac ttctcagaaa tgcatgcagt 480

ggcagcacgc taattcgaaa aaattctcca gaaaggcaac gcaaaatttt ttttccaggg 540

aataaacttt ttatgaccca ctacttctcg taggaacaat ttcgggcccc tgcgtgttct 600

tctgaggttc atcttttaca tttgcttctg ctggataatt ttcagaggca acaaggaaaa 660

attagatggc aaaaagtcgt ctttcaagga aaaatcccca ccatctttcg agatcccctg 720

taacttattg gcaactgaaa gaatgaaaag gaggaaaata caaaatatac tagaactgaa 780

aaaaaaaaag tataaataga gacgatatat gccaatactt cacaatgttc gaatctattc 840

ttcatttgca gctattgtaa aataataaaa catcaagaac aaacaagctc aacttgtctt 900

ttctaagaac aaagaataaa cacaaaaaca aaaagttttt ttaattttaa tcaaaaa 957

<210>4

<211>940

<212>DNA

<213>酿酒酵母

<400>4

cgctgaatac gtcctgtcaa ttcaaatata tcacgttgtg agcagcccta aagaagaaaa 60

cctcaacagc agtattacta ttacaatcaa acaactttag tgccgcgtga taccgggggt 120

tgaagtgggt gcattgagcc gtattcttct tccccgtaag aaagttgtgt atccttttta 180

ctgcgttgta atagcttctg aaaacctaaa aaatgaacgc tatgtagctc atatccgttt 240

tgcataagta agaataacta cttgtgcagg gtgccgaaag ggatggaaaa ccgctgcagc 300

aacccttgtt acatacagtc ggatccatct gacttacttt ccttgcgtct ccctgcgcga 360

ttttgttggc cattttccag atcctctaga atttttcaag ggtcgagccg taggaggatt 420

ctctcagaag gcaaaaacgc atcgaaagcg tgctttgtaa gaatatttgg tatggctaaa 480

gtaagcaaag ccatatcccg atcccgatcc cgactcttat tccgatccct tccgccacat 540

cctgcatgtt tattcgaata ccaaattagc tcatcttcgt tatttcatca tccctttctg 600

ctatggcaag gacaagtttt tttctagcat ctcatcgaaa actttcctct ccctaattgg 660

ccaaagtttt catattcatc atcagttaga aagtataata tcaatccctt acctcattac 720

aagttgtatc acactaaaaa aatcatatat aagtctgtga gagtcttcaa ttatttagcg 780

taacacctat tcactttcta atcttgtttc ttgtttttac attctgcaat acaacacaac 840

aacaaatatt aactcaatta ttattattta taattacaaa aacaaaacaa caagtttgag 900

actttaatat cttttgatta ctaaaaacaa caaatttcaa 940

<210>5

<211>800

<212>DNA

<213>酿酒酵母

<400>5

cgcatccgaa ttcaatgtag cacctgagat ctcaaatagc ttttggccaa tcctaatctt 60

gaaaacttca tggtttggta aaagctcggg ggtagtttct aactcttttg tataaaccac 120

gatctcgccc ttttggccag acatctgata tgagcgtgcg tgtgagtgac tttacacttg 180

tctatccacg tcctgaagtt gttcgtgttc tttggatatt cgtgttcaag ctaataatga 240

gcctttaagg taatacaatt tataaaccac caccttggcc tcgatctatt gcgcttatgt 300

tgtctattag taatcaagaa aagaacccta aatcatcggc gtcccctgtg gggctctcgg 360

aaaaaccggt cctgacgtca ctgaaaagat ttcggcacat ggtcatggga ccagagaaaa 420

attaatccga catgtggaat atttccttcc gttaaggtag tgagcgcgga ttttttctga 480

tttgtaatta tacggggagc tctggccaaa aaggtcagta tttggtgatg aagttgaata 540

tcatcttttg attttcttct gtatcattct ttttcttttt ccacacccct tccggacggt 600

attcacatat tgttgagagg ttaaatgaaa aataaagggg tggaaaatta aggacgagat 660

gtaagggaaa agcataaacg aaacattata taaaggagca caatttcctc tcccttgcca 720

attgtgcata taccgtttct ttataacgaa atttcaacaa accagaacaa cacaagtact 780

accaataacc acaacaaaac 800

<210>6

<211>901

<212>DNA

<213>酿酒酵母

<400>6

tcgatggaag atgcaacttg caaatgtagt ccggttacca agagacccaa acctcttcca 60

ctttactatt tctcctttga gaaatatatc agtttgcggt aataggtaat atgaaaaagg 120

caataaaaaa aagagatact tgtcaccatc tcgtctccct ttaccttttt tacttaatct 180

tcttcgtcgt catctgttcc atccctttcc tagcttagtc ttctccggct agttcttagt 240

gcggtaagca aaaaaatagc gttttttttc cctcaccagg actttttttg ttaaccgaaa 300

atcggcatct ctagttttcc tggacaaaaa agacaaaatg gaaataaaca ctcatacgaa 360

tcagtaaaga tgtaaataat cgcagtaacg actgcacaag gatgtcagaa aaagcagttt 420

aattccagaa gtggttttcc aatttatcac acatgtacat gaagggaaat gtttaaatac 480

ggtcttcgta aaacaaagga tctcttcacc tggtttcttc atttataagt agtgtctttt 540

tcggtaactt aagatatatc cttatttctt tcccacttct cgttatttct tctttttccc 600

ttttcaagtt cttcttttta tttattatta agcttatttt aattcttaga tcgttgtcac 660

tatcttttgt ccttattgtt aagaaacatt gcgaagaaaa agaataataa aagaaactca 720

gaaaaaaaag aagtttcctc gaacaaaaat attattattt caataacttt ttctttctct 780

acatccaatt ttttgaccct attttaacat taattttttg ctttaatttt aactaatacc 840

taatttcact taatatctaa tcatcttcct ttaacccaca gaacaaagaa gaaaaataac 900

a 901

<210>7

<211>999

<212>DNA

<213>牛的

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(999)

<223>乳酸脱氢酶

<400>7

atg gca act ctc aag gat cag ctg att cag aat ctt ctt aag gaa gaa 48

Met Ala Thr Leu Lys Asp Gln Leu Ile Gln Asn Leu Leu Lys Glu Glu

1 5 10 15

cat gtc ccc cag aat aag att aca att gtt ggg gtt ggt gct gtt ggc 96

His Val Pro Gln Asn Lys Ile Thr Ile Val Gly Val Gly Ala Val Gly

20 25 30

atg gcc tgt gcc atc agt atc tta atg aag gac ttg gca gat gaa gtt 144

Met Ala Cys Ala Ile Ser Ile Leu Met Lys Asp Leu Ala Asp Glu Val

35 40 45

gct ctt gtt gat gtc atg gaa gat aaa ctg aag gga gag atg atg gat 192

Ala Leu Val Asp Val Met Glu Asp Lys Leu Lys Gly Glu Met Met Asp

50 55 60

ctc caa cat ggc agc ctt ttc ctt aga aca cca aaa att gtc tct ggc 240

Leu Gln His Gly Ser Leu Phe Leu Arg Thr Pro Lys Ile Val Ser Gly

65 70 75 80

aaa gac tat aat gtg aca gca aac tcc agg ctg gtt att atc aca gct 288

Lys Asp Tyr Asn Val Thr Ala Asn Ser Arg Leu Val Ile Ile Thr Ala

85 90 95

ggg gca cgt cag caa gag gga gag agc cgt ctg aat ttg gtc cag cgt 336

Gly Ala Arg Gln Gln Glu Gly Glu Ser Arg Leu Asn Leu Val Gln Arg

100 105 110

aac gtg aac atc ttt aaa ttc atc att cct aat att gta aaa tac agc 384

Asn Val Asn Ile Phe Lys Phe Ile Ile Pro Asn Ile Val Lys Tyr Ser

115 120 125

cca aat tgc aag ttg ctt gtt gtt tcc aat cca gtc gat att ttg acc 432

Pro Asn Cys Lys Leu Leu Val Val Ser Asn Pro Val Asp Ile Leu Thr

130 135 140

tat gtg gct tgg aag ata agt ggc ttt ccc aaa aac cgt gtt att gga 480

Tyr Val Ala Trp Lys Ile Ser Gly Phe Pro Lys Asn Arg Val Ile Gly

145 150 155 160

agt ggt tgc aat ctg gat tca gct cgc ttc cgt tat ctc atg ggg gag 528

Ser Gly Cys Asn Leu Asp Ser Ala Arg Phe Arg Tyr Leu Met Gly Glu

165 170 175

agg ctg gga gtt cac cca tta agc tgc cat ggg tgg atc ctt ggg gag 576

Arg Leu Gly Val His Pro Leu Ser Cys His Gly Trp Ile Leu Gly Glu

180 185 190

cat ggt gac tct agt gtg cct gta tgg agt gga gtg aat gtt gct ggt 624

His Gly Asp Ser Ser Val Pro Val Trp Ser Gly Val Asn Val Ala Gly

195 200 205

gtc tcc ctg aag aat tta cac cct gaa tta ggc act gat gca gat aag 672

Val Ser Leu Lys Asn Leu His Pro Glu Leu Gly Thr Asp Ala Asp Lys

210 215 220

gaa cag tgg aaa gcg gtt cac aaa caa gtg gtt gac agt gct tat gag 720

Glu Gln Trp Lys Ala Val His Lys Gln Val Val Asp Ser Ala Tyr Glu

225 230 235 240

gtg atc aaa ctg aaa ggc tac aca tcc tgg gcc att gga ctg tca gtg 768

Val Ile Lys Leu Lys Gly Tyr Thr Ser Trp Ala Ile Gly Leu Ser Val

245 250 255

gcc gat ttg gca gaa agt ata atg aag aat ctt agg cgg gtg cat ccg 816

Ala Asp Leu Ala Glu Ser Ile Met Lys Asn Leu Arg Arg Val His Pro

260 265 270

att tcc acc atg att aag ggt ctc tat gga ata aaa gag gat gtc ttc 864

Ile Ser Thr Met Ile Lys Gly Leu Tyr Gly Ile Lys Glu Asp Val Phe

275 280 285

ctt agt gtt cct tgc atc ttg gga cag aat gga atc tca gac gtt gtg 912

Leu Ser Val Pro Cys Ile Leu Gly Gln Asn Gly Ile Ser Asp Val Val

290 295 300

aaa gtg act ctg act cat gaa gaa gag gcc tgt ttg aag aag agt gca 960

Lys Val Thr Leu Thr His Glu Glu Glu Ala Cys Leu Lys Lys Ser Ala

305 310 315 320

gat aca ctt tgg ggg atc cag aaa gaa ctg cag ttt taa 999

Asp Thr Leu Trp Gly Ile Gln Lys Glu Leu Gln Phe

325 330

<210>8

<211>332

<212>PRT

<213>牛的

<400>8

Met Ala Thr Leu Lys Asp Gln Leu Ile Gln Asn Leu Leu Lys Glu Glu

1 5 10 15

His Val Pro GIn Asn Lys Ile Thr Ile Val Gly Val Gly Ala Val Gly

20 25 30

Met Ala Cys Ala Ile Ser Ile Leu Met Lys Asp Leu Ala Asp Glu Val

35 40 45

Ala Leu Val Asp Val Met Glu Asp Lys Leu Lys Gly Glu Met Met Asp

50 55 60

Leu Gln His Gly Ser Leu Phe Leu Arg Thr Pro Lys Ile Val Ser Gly

65 70 75 80

Lys Asp Tyr Asn Val Thr Ala Asn Ser Arg Leu Val Ile Ile Thr Ala

85 90 95

Gly Ala Arg Gln Gln Glu Gly Glu Ser Arg Leu Asn Leu Val Gln Arg

100 105 110

Asn Val Asn Ile Phe Lys Phe Ile Ile Pro Asn Ile Val Lys Tyr Ser

115 120 125

Pro Asn Cys Lys Leu Leu Val Val Ser Asn Pro Val Asp Ile Leu Thr

130 135 140

Tyr Val Ala Trp Lys Ile Ser Gly Phe Pro Lys Asn Arg Val Ile Gly

145 150 155 160

Ser Gly Cys Asn Leu Asp Ser Ala Arg Phe Arg Tyr Leu Met Gly Glu

165 170 175

Arg Leu Gly Val His Pro Leu Ser Cys His Gly Trp Ile Leu Gly Glu

180 185 190

His Gly Asp Ser Ser Val Pro Val Trp Ser Gly Val Asn Val Ala Gly

195 200 205

Val Ser Leu Lys Asn Leu His Pro Glu Leu Gly Thr Asp Ala Asp Lys

210 215 220

Glu Gln Trp Lys Ala Val His Lys Gln Val Val Asp Ser Ala Tyr Glu

225 230 235 240

Val Ile Lys Leu Lys Gly Tyr Thr Ser Trp Ala Ile Gly Leu Ser Val

245 250 255

Ala Asp Leu Ala Glu Ser Ile Met Lys Asn Leu Arg Arg Val His Pro

260 265 270

Ile Ser Thr Met Ile Lys Gly Leu Tyr Gly Ile Lys Glu Asp Val Phe

275 280 285

Leu Ser Val Pro Cys Ile Leu Gly Gln Asn Gly Ile Ser Asp Val Val

290 295 300

Lys Val Thr Leu Thr His Glu Glu Glu Ala Cys Leu Lys Lys Ser Ala

305 310 315 320

Asp Thr Leu Trp Gly Ile Gln Lys Glu Leu Gln Phe

325 330

<210>9

<211>971

<212>DNA

<213>酿酒酵母

<400>9

aagggtagcc tccccataac ataaactcaa taaaatatat agtcttcaac ttgaaaaagg 60

aacaagctca tgcaaagagg tggtacccgc acgccgaaat gcatgcaagt aacctattca 120

aagtaatatc tcatacatgt ttcatgaggg taacaacatg cgactgggtg agcatatgct 180

ccgctgatgt gatgtgcaag ataaacaagc aagacggaaa ctaacttctt cttcatgtaa 240

taaacacacc ccgcgtttat ttacctatct ttaaacttca acaccttata tcataactaa 300

tatttcttga gataagcaca ctgcacccat accttcctta aaagcgtagc ttccagtttt 360

tggtggttcc ggcttccttc ccgattccgc ccgctaaacg catatttttg ttgcctggtg 420

gcatttgcaa aatgcataac ctatgcattt aaaagattat gtatgctctt ctgacttttc 480

gtgtgatgaa gctcgtggaa aaaatgaata atttatgaat ttgagaacaa ttctgtgttg 540

ttacggtatt ttactatgga ataattaatc aattgaggat tttatgcaaa tatcgtttga 600

atatttttcc gaccctttga gtacttttct tcataattgc ataatattgt ccgctgcccg 660

tttttctgtt agacggtgtc ttgatctact tgctatcgtt caacaccacc ttattttcta 720

actatttttt ttttagctca tttgaatcag cttatggtga tggcacattt ttgcataaac 780

ctagctgtcc tcgttgaaca taggaaaaaa aaatatatta acaaggctct ttcactctcc 840

ttgcaatcag atttgggttt gttcccttta ttttcatatt tcttgtcata ttcctttctc 900

aattattatt ttctactcat aaccacacgc aaaataacac agtcaaatca atcaaagatc 960

ccccaattct c 971

<210>10

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成引物

<400>10

cgtcgccttc actggtttag 20

<210>11

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成引物

<400>11

caaaaaggcc aaagcaccag 20

<210>12

<211>21

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成引物

<400>12

caaggtaagt tgaccggtat g 21

<210>13

<211>22

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成引物

<400>13

gatggaagag ttagagtcac cc 22

<210>14

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成引物

<400>14

tcatgggctg tttggtcttc 20

<210>15

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成引物

<400>15

agcgtcgtag ttggcacctc 20

<210>16

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成引物

<400>16

aattgcagtc agccgtgatg 20

<210>17

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成引物

<400>17

tcgacagctt gctctgcttc 20

<210>18

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成引物

<400>18

aaccaagcgt gggctaagag 20

<210>19

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成引物

<400>19

ggtttccttg gcagcgtaag 20

<210>20

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成引物

<400>20

gctgcctgtg ttcactccac 20

<210>21

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成引物

<400>21

tggctgcaaa acgttaccac 20

<210>22

<211>22

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成引物

<400>22

caacgaattg aacgctgctt ac 22

<210>23

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成引物

<400>23

attcaacggc ttccttaact tctg 24

<210>24

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成引物

<400>24

gttttcaagg aattagacac tgc 23

<210>25

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成引物

<400>25

caacagtctt ttgagtagca gtc 23

<210>26

<211>35

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成引物

<400>26

atatatgcgg ccgctcgcag ccacgggtca acccg 35

<210>27

<211>41

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成引物

<400>27

atatatacta gtttttatta ttagtctttt ttttttttga c 41

<210>28

<211>39

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成引物

<400>28

atatatgcgg ccgcttgacg ggtattctga gcatcttac 39

<210>29

<211>38

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成引物

<400>29

tatatactag tttgttttgt ttgtttgtgt gatgaatt 38

<210>30

<211>33

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成引物

<400>30

atatatgcgg ccgccctgct aaacacgccc tac 33

<210>31

<211>40

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成引物

<400>31

atatatacta gtttttgatt aaaattaaaa aaactttttg 40

<210>32

<211>34

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成引物

<400>32

atatatgcgg ccgctgaata cgtcctgtca attc 34

<210>33

<211>36

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成引物

<400>33

atatatacta gttgaaattt gttgttttta gtaatc 36

<210>34

<211>35

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成引物

<400>34

atatatgcgg ccgcatccga attcaatgta gcacc 35

<210>35

<211>37

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成引物

<400>35

atatatacta gtgttttgtt gtggttattg gtagtac 37

<210>36

<211>47

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成引物

<400>36

agctagctag cggccgcgat ggaagatgca acttgcaaat gtagtcc 47

<210>37

<211>47

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成引物

<400>37

agctagctac tagtgttatt tttcttcttt gttctgtggg ttaaagg 47

<210>38

<211>42

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成引物

<400>38

agctagctag cggccgcgtt gaatgttagc gtcaacaaca ag 42

<210>39

<211>47

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成引物

<400>39

agctagctac tagtttgttt gtttatgtgt gtttattcga aactaag 47

<210>40

<211>42

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成引物

<400>40

agctagctag cggccgcgtt gaatgttagc gtcaacaaca ag 42

<210>41

<211>37

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成引物

<400>41

tatatactag tttgattgat ttgactgtgt tattttg 37

<210>42

<211>1052

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的DNA

<220>

<221>CDS

<222>(13)..(1011)

<223>

<400>42

acagaattca ca atg gct act ttg aaa gat caa ttg att caa aat ttg ttg 51

Met Ala Thr Leu Lys Asp Gln Leu Ile Gln Asn Leu Leu

1 5 10

aaa gaa gaa cat gtt cca caa aat aaa att act att gtt ggt gtt ggt 99

Lys Glu Glu His Val Pro Gln Asn Lys Ile Thr Ile Val Gly Val Gly

15 20 25

gct gtt ggt atg gct tgt gct att tct att ttg atg aaa gat ttg gct 147

Ala Val Gly Met Ala Cys Ala Ile Ser Ile Leu Met Lys Asp Leu Ala

30 35 40 45

gat gaa gtt gct ttg gtt gat gtt atg gaa gat aaa ttg aaa ggt gaa 195

Asp Glu Val Ala Leu Val Asp Val Met Glu Asp Lys Leu Lys Gly Glu

50 55 60

atg atg gat ttg caa cat ggt tct ttg ttt ttg aga act cca aaa att 243

Met Met Asp Leu Gln His Gly Ser Leu Phe Leu Arg Thr Pro Lys Ile

65 70 75

gtt tct ggt aaa gat tat aat gtt act gct aat tct aga ttg gtt att 291

Val Ser Gly Lys Asp Tyr Asn Val Thr Ala Asn Ser Arg Leu Val Ile

80 85 90

att act gct ggt gct aga caa caa gaa ggt gaa tct aga ttg aat ttg 339

Ile Thr Ala Gly Ala Arg Gln Gln Glu Gly Glu Ser Arg Leu Asn Leu

95 100 105

gtt caa aga aat gtt aat att ttt aaa ttt att att cca aat att gtt 387

Val Gln Arg Asn Val Asn Ile Phe Lys Phe Ile Ile Pro Asn Ile Val

110 115 120 125

aaa tat tct cca aat tgt aaa ttg ttg gtt gtt tct aat cca gtt gat 435

Lys Tyr Ser Pro Asn Cys Lys Leu Leu Val Val Ser Asn Pro Val Asp

130 135 140

att ttg act tat gtt gct tgg aaa att tct ggt ttt cca aaa aat aga 483

Ile Leu Thr Tyr Val Ala Trp Lys Ile Ser Gly Phe Pro Lys Asn Arg

145 150 155

gtt att ggt tct ggt tgt aat ttg gat tct gct aga ttt aga tat ttg 531

Val Ile Gly Ser Gly Cys Asn Leu Asp Ser Ala Arg Phe Arg Tyr Leu

160 165 170

atg ggt gaa aga ttg ggt gtt cat cca ttg tct tgt cat ggt tgg att 579

Met Gly Glu Arg Leu Gly Val His Pro Leu Ser Cys His Gly Trp Ile

175 180 185

ttg ggt gaa cat ggt gat tct tct gtt cca gtt tgg tct ggt gtt aat 627

Leu Gly Glu His Gly Asp Ser Ser Val Pro Val Trp Ser Gly Val Asn

190 195 200 205

gtt gct ggt gtt tct ttg aaa aat ttg cat cca gaa ttg ggt act gat 675

Val Ala Gly Val Ser Leu Lys Asn Leu His Pro Glu Leu Gly Thr Asp

210 215 220

gct gat aaa gaa caa tgg aaa gct gtt cat aaa caa gtt gtt gat tct 723

Ala Asp Lys Glu Gln Trp Lys Ala Val His Lys Gln Val Val Asp Ser

225 230 235

gct tat gaa gtt att aaa ttg aaa ggt tat act tct tgg gct att ggt 771

Ala Tyr Glu Val Ile Lys Leu Lys Gly Tyr Thr Ser Trp Ala Ile Gly

240 245 250

ttg tct gtt gct gat ttg gct gaa tct att atg aaa aat ttg aga aga 819

Leu Ser Val Ala Asp Leu Ala Glu Ser Ile Met Lys Ash Leu Arg Arg

255 260 265

gtt cat cca att tct act atg att aaa ggt ttg tat ggt att aaa gaa 867

Val His Pro Ile Ser Thr Met Ile Lys Gly Leu Tyr Gly Ile Lys Glu

270 275 280 285

gat gtt ttt ttg tct gtt cca tgt att ttg ggt caa aat ggt att tct 915

Asp Val Phe Leu Ser Val Pro Cys Ile Leu Gly Gln Asn Gly Ile Ser

290 295 300

gat gtt gtt aaa gtt act ttg act cat gaa gaa gaa gct tgt ttg aaa 963

Asp Val Val Lys Val Thr Leu Thr His Glu Glu Glu Ala Cys Leu Lys

305 310 315

aaa tct gct gat act ttg tgg ggt att caa aaa gaa ttg caa ttt taa 1011

Lys Set Ala Asp Thr Leu Trp Gly Ile Gln Lys Glu Leu Gln Phe

320 325 330

taactcgagc ttggttgaac acgttgccaa ggcttaagtg a 1052

<210>43

<211>332

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的DNA

<400>43

Met Ala Thr Leu Lys Asp Gln Leu Ile Gln Asn Leu Leu Lys Glu Glu

1 5 10 15

His Val Pro Gln Asn Lys Ile Thr Ile Val Gly Val Gly Ala Val Gly

20 25 30

Met Ala Cys Ala Ile Ser Ile Leu Met Lys Asp Leu Ala Asp Glu Val

35 40 45

Ala Leu Val Asp Val Met Glu Asp Lys Leu Lys Gly Glu Met Met Asp

50 55 60

Leu Gln His Gly Ser Leu Phe Leu Arg Thr Pro Lys Ile Val Ser Gly

65 70 75 80

Lys Asp Tyr Asn Val Thr Ala Asn Ser Arg Leu Val Ile Ile Thr Ala

85 90 95

Gly Ala Arg Gln Gln Glu Gly Glu Ser Arg Leu Asn Leu Val Gln Arg

100 105 110

Asn Val Asn Ile Phe Lys Phe Ile Ile Pro Asn Ile Val Lys Tyr Ser

115 120 125

Pro Asn Cys Lys Leu Leu Val Val Ser Asn Pro Val Asp Ile Leu Thr

130 135 140

Tyr Val Ala Trp Lys Ile Ser Gly Phe Pro Lys Asn Arg Val Ile Gly

145 150 155 160

Ser Gly Cys Asn Leu Asp Ser Ala Arg Phe Arg Tyr Leu Met Gly Glu

165 170 175

Arg Leu Gly Val His Pro Leu Ser Cys His Gly Trp Ile Leu Gly Glu

180 185 190

His Gly Asp Ser Ser Val Pro Val Trp Ser Gly Val Asn Val Ala Gly

195 200 205

Val Ser Leu Lys Asn Leu His Pro Glu Leu Gly Thr Asp Ala Asp Lys

210 215 220

Glu Gln Trp Lys Ala Val His Lys Gln Val Val Asp Ser Ala Tyr Glu

225 230 235 240

Val Ile Lys Leu Lys Gly Tyr Thr Ser Trp Ala Ile Gly Leu Ser Val

245 250 255

Ala Asp Leu Ala Glu Ser Ile Met Lys Asn Leu Arg Arg Val His Pro

260 265 270

Ile Ser Thr Met Ile Lys Gly Leu Tyr Gly Ile Lys Glu Asp Val Phe

275 280 285

Leu Ser Val Pro Cys Ile Leu Gly Gln Asn Gly Ile Ser Asp Val Val

290 295 300

Lys Val Thr Leu Thr His Glu Glu Glu Ala Cys Leu Lys Lys Ser Ala

305 310 315 320

Asp Thr Leu Trp Gly Ile Gln Lys Glu Leu Gln Phe

325 330

<210>44

<211> 31

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成引物

<400>44

atatatggat ccgcgtttat ttacctatct c 31

<210>45

<211>31

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成引物

<400>45

atatatgaat tctttgattg atttgactgt g 31

<210>46

<211>34

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成引物

<400>46

atatatctcg aggccagcta acttcttggt cgac 34

<210>47

<211>31

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成引物

<400>47

atatatgaat tctttgattg atttgactgt g 31

Claims

1.具有以下(a)-(c)中任一项所述碱基序列的DNA，其为有机酸存在下的表达用启动子：

(a)包含任一序列编号1-6中所示碱基序列的DNA，

(b)与包含任一序列编号1-6中所示碱基序列的DNA在严谨条件下杂交的DNA，

2.权利要求1所述DNA的一部分DNA，其为有机酸存在下的表达用启动子。

3.DNA，其具有酵母属酵母的高渗透压应答7基因(HOR7基因)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶2基因(TDH2基因)、热休克蛋白30基因(HSP30基因)、己糖转运蛋白7基因(HXT7基因)、硫氧还蛋白过氧化物酶1基因(AHP1基因)和膜蛋白1相关基因(MRH1基因)中任一基因的启动子活性，为在有机酸存在下的表达用启动子。

4.权利要求1至3中任一项所述的DNA，其用于表达用来产生有机酸的DNA。

5.权利要求4所述的DNA，其中所述有机酸是乳酸。

6.基因重组用DNA构建体，其包含权利要求1至3中任一项所述的DNA。

7.权利要求6所述的DNA构建体，其具有与上述DNA有效连接的、编码参与有机酸生产的蛋白质的DNA。

8.权利要求7所述的DNA构建体，其中所述参与有机酸生产的蛋白质为具有乳酸脱氢酶活性的蛋白质。

9.权利要求8所述的DNA构建体，其中所述蛋白质是牛乳酸脱氢酶。

10.权利要求6至9中任一项所述的DNA构建体，其还具有用于同源重组具有自体调节机制的酵母基因的DNA。

11.权利要求10所述的DNA构建体，其中所述酵母基因是丙酮酸脱羧酶1(PDC1)基因。

12.权利要求6至11中任一项所述的DNA构建体，其为质粒载体或病毒载体。

13.携带权利要求1至3中任一项所述DNA的转化体。

14.权利要求13所述的转化体，其具有与上述DNA有效连接的编码参与有机酸生产的蛋白质的DNA。

15.权利要求14所述的转化体，其中所述参与有机酸生产的蛋白质为具有乳酸脱氢酶活性的蛋白质。

16.权利要求14或15所述的转化体，其中权利要求1至3中任一项所述的DNA和上述编码参与有机酸生产的蛋白质的DNA整合至宿主染色体上。

17.权利要求13至16中任一项所述的转化体，其为酵母转化体。

18.酵母转化体，其中酵母染色体上携带有权利要求1至3中任一项所述的DNA和与该DNA有效连接的编码具有乳酸脱氢酶活性的蛋白质的DNA，并且通过这些DNA的至少一部分破坏具有自体调节机制的酵母基因。

19.权利要求18所述的酵母转化体，其中所述具有自体调节机制的酵母基因是丙酮酸脱羧酶1基因。

20.权利要求19所述的酵母转化体，其中所述具有乳酸脱氢酶活性的蛋白质是牛乳酸脱氢酶。

21.权利要求18至20中任一项所述的酵母转化体，其中所述酵母为属于酵母属的酵母。

22.目的基因的表达方法，所述表达方法使用了携带有权利要求1至3中任一项所述的DNA和与该DNA下游有效连接的编码预定蛋白质的DNA的宿主细胞。

23.权利要求22所述的方法，其中所述宿主细胞的培养系统含有有机酸。

24.权利要求22或23所述的表达方法，其中所述宿主是酵母，酵母染色体上携带有权利要求1至3中任一项所述的DNA和编码前述蛋白质的DNA，并且通过这些DNA的至少一部分破坏具有自体调节机制的酵母基因。

25.权利要求24所述的表达方法，其中所述蛋白质是参与有机酸生产的蛋白质。

26.权利要求25所述的方法，其中所述蛋白质是具有乳酸脱氢酶活性的蛋白质。

27.使用酵母转化体的有机酸生产方法，其中所述酵母转化体携带有权利要求1至3中任一项所述的DNA和与该DNA下游有效连接的、编码参与有机酸生产的蛋白质的DNA。

28.权利要求27所述的方法，其中所述有机酸是乳酸，所述蛋白质是具有乳酸脱氢酶活性的蛋白质。

29.权利要求27或28所述的生产方法，其中所述DNA是在酵母染色体上，并且丙酮酸脱羧酶1基因由所述DNA的至少一部分破坏。

30.以下(a)-(c)中任一项所述的具有启动子活性的DNA：

(a)包含任一序列编号1-6中所示碱基序列的DNA，

31.权利要求29所述DNA的一部分DNA，其具有启动子活性。