CN1910278A - 生产1,2－丙二醇的进化微生物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种制备经代谢简单碳源生产1，2－丙二醇的进化微生物菌株的新方法，这种方法包括在选择压力下在含有简单碳源的合适培养基中制备起始细菌菌株培养物，所述起始细菌菌株中tpiA基因缺失并且参与将甲基乙二醛(丙醛)转化为乳酸的至少一个基因缺失，以使所述起始菌株中参与DHPA向甲基乙二醛、继而向1，2－丙二醇生物合成的一个或多个基因向表现出改良1，2－丙二醇合酶活性的基因进化，该方法还包括随后选择表现出改良1，2－丙二醇合酶活性的进化微生物菌株。还公开了起始菌株、如此获得的进化微生物和由进化微生物培养物制备1，2－丙二醇和可能的丙酮的方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种制备用来生产1，2-丙二醇的进化微生物的新方法，由此获得的进化微生物和其用于制备1，2-丙二醇的用途。
背景技术
1，2-丙二醇或者丙二醇，是一种三碳二元醇，一种广泛应用的化学制品。它是不饱和聚酯树脂、液态去污剂、冷却剂、防冻剂和用于航空器的去冰流质中的组分。自从1993-1994年以来，作为比丙烯衍生物更具毒性的乙烯衍生物的替代品，丙二醇的使用量逐渐增加。
目前，1，2-丙二醇主要通过使用氧化丙烯水合工艺的化学方法来生产，这种方法消耗大量的水。氧化丙烯可以通过两种方法生产，一种方法使用表氯醇，另一种方法使用氢过氧化物。两种途径都使用毒性大的物质。另外，氢过氧化物途径产生副产物，如叔丁醇和1-苯乙醇。为了使丙烯的生产更有利，必须找到使用这些副产物的方法。化学途径通常产生外消旋的1，2-丙二醇，然而，两种立体异构体(R)1，2-丙二醇和(S)1，2-丙二醇中的每一种对于特定应用都是值得关注的。
化学合成1，2-丙二醇的这些缺点使得生物合成的替代方法变得有吸引力。几种微生物能够从诸如葡萄糖或木糖的糖通过糖酵解途径自然代谢产生(S)或(R)1，2-丙二醇，或者从脱氧己糖产生(S)1，2-丙二醇(Cameron D.C.et al.(1998)Biotechnol.Prog.)。具有最好表现的微生物包括楔形梭菌(Tran Din K.et al.1986)和热解糖梭菌(Altaras N.E & Cameron D.C.2001)。后者能够发酵几种类型的糖生成(R)1，2-丙二醇，产量为每消耗一克葡萄糖生成0.13-0.28克1，2-丙二醇。尚未鉴定到这两种微生物中负责合成1，2-丙二醇的酶，可用基因工具的缺乏限制了对它们性能的改良。另外，尽管大肠杆菌不能天然产生1，2-丙二醇，但是它拥有产生1，2-丙二醇所必需的所有基因。当前，1，2-丙二醇必须从甲基乙二醛合成，甲基乙二醛是一种即使在低浓度也对细胞高度有毒的物质。另外，使用遗传修饰过的大肠杆菌菌株来生产1，2-丙二醇的方法已经被介绍过，特别是在US 6 303 352，US 6 087 140和WO 98/37204中。具体而言，这些方法通过将基因克隆到质粒中来超表达一种或几种参与代谢产生1，2-丙二醇途径的酶，因此需要抗生素作为一种选择压力。为了改善菌株的性能，还删除某些内源基因(例如见Altaras N.E.&Cameron D.C.(2002)Biotechnol.Prog.16，940-946：Altaras N.E.&Cameron D.(1999)Appl.Env.Microb.，65，1180-1185)。
直到今天，还没有描述过使用进化的微生物去共合成两种有用产物1，2-丙二醇和丙酮的方法。
发明内容
本发明涉及一种制备一种进化微生物菌株的方法，这种微生物用于通过代谢简单的碳源来生产1，2-丙二醇，这种方法包括在选择压力下在含有简单碳源的合适生长培养基中培养起始细菌菌株，所述起始细菌菌株缺失tpiA基因并缺失参与甲基乙二醛(丙醛)向乳酸转化的至少一个基因，以使所述起始菌株中负责DHAP向甲基乙二醛、随后向1，2-丙二醇生物转化的一个或多个基因向具有改良“1，2-丙二醇合酶”活性的修饰基因进化，然后选择和分离具有所述改良“1，2-丙二醇合酶”活性的该进化微生物菌株。
tpiA基因编码磷酸丙糖异构酶，该酶催化DHAP转化成3-磷酸甘油醛。删除该基因的目的是为了确保合成足够量的甲基乙二醛。理论上，tpiA基因的删除必将保证细胞代谢的50％的葡萄糖碳被分配用于从二羟基丙酮磷酸制备甲基乙二醛。
删除参与甲基乙二醛向乳酸转化的至少一个基因的目的是为了抑制甲基乙二醛转化成乳酸，以至于现存的和起始菌株产生的、以及所得进化菌株产生的甲基乙二醛被所述菌株的细胞机构基本上用来制备1，2-丙二醇。
参与甲基乙二醛向乳酸转化的基因可以是编码乙二醛酶I的gloA基因(催化从甲基乙二醛合成乳酰谷胱甘肽)，或者是编码呋喃葡烯糖(lactaldehyde)脱氢酶的aldA和aldB基因(催化从(S)呋喃葡烯糖合成(S)乳酸)。优选从起始菌株中删除所有三个基因gloA、aldA和aldB。
对起始菌株进行的另外一种有益修饰包括抑制消耗NADH作为还原当量的天然葡萄糖发酵途径，以消除与1，2-丙二醇生成竞争的代谢路径。
具体而言，有益的是删除编码乳酸脱氢酶(催化从丙酮酸合成乳酸)的基因ldhA，和编码乙醇乙醛脱氢酶(催化从乙酰-CoA合成乙醇)的基因adhE。
相似的，有可能使微生物厌氧使用丙酮酸脱氢酶复合物从丙酮酸生成乙酰-CoA和NADH。这能够通过删除编码丙酮酸甲酸裂合酶的基因pflA和pflB来实现。
因此在一个具体的实施方案中，起始菌株还缺失ldhA、pflA、pflB和adhE基因中的一个或多个，优选缺失ldhA、pflA、pflB和adhE所有四个基因。
更有益的是，根据本发明的起始菌株也将包含编码有利于将丙酮酸厌氧代谢为乙酸的酶的至少一个基因。
优先的是，所述酶有利于将丙酮酸厌氧代谢生成乙酰-CoA和NADH。更优选的是，这种酶是丙酮酸脱氢酶复合物。
有益的是，所述的编码有利于将丙酮酸厌氧代谢成乙酸的酶的基因对NADH的抑制作用的敏感性降低。
这种基因可以是编码内源蛋白质的内源基因，或者是编码内源或外源酶的外源或异源基因。
对于编码对NADH的抑制作用敏感的内源蛋白质的内源基因，根据本发明的进化方法使得可以选择具有改良“1，2-丙二醇合酶”活性的菌株，其中所述的编码有利于将丙酮酸厌氧代谢成乙酸的酶的基因编码一种进化酶，它对NADH的抑制作用的敏感性降低。
根据发明的另一个实施方案，可以将异源基因导入起始菌株，该基因编码对对NADH的抑制作用的敏感性降低的酶，或者编码敏感性酶，然后通过实施根据发明的进化方法使得其不那么敏感。
此外，同样有益的是删除编码参与ED途径的第一个酶即6-磷酸葡萄糖酸脱水酶的基因edd，以阻止葡萄糖直接代谢生成3-磷酸甘油醛和丙酮酸，从而诱导葡萄糖转化生成1，2-丙二醇和乙酸。
有利的是，将编码一个或更多参与乙酰-CoA和乙酸向丙酮转化的酶的一个或更多异源基因导入先前根据发明的进化方法获得的进化菌株中，来获得经修饰的进化菌株。
该新的修饰方法使得生产1，2-丙二醇和有用的副产物丙酮变得可能。此外，这种修饰方法具有改善1，2-丙二醇生产性能的优点。乙酸在低浓度条件下(15g/l)是细菌生长抑制物，在厌氧条件下快速的阻止恒化生长菌株性能的进化。
在恒化生长期间，向进化菌株导入编码催化乙酸向丙酮转化的酶的基因使残留乙酸浓度降低。产生丙酮，与乙酸相比没有不那么抑制生长。因此有利于菌株的生长和1，2-丙二醇的产生。
有益的是，编码一个或多个参与乙酰-CoA和乙酸转化的酶的异源基因来源于丙酮丁酸羧杆菌。编码一个或多个参与乙酰-CoA和乙酸向丙酮转化的酶的基因能以染色体的或染色体外的方式表达。对于染色体方式，借助本领域技术人员已知的重组方法将一个或多个拷贝引入基因组。对于染色体外的方式，基因能被不同类型的质粒携带，这些质粒在复制起源、拷贝数和细胞内稳定性等方面有所不同。它们能以1-5个拷贝、或20个拷贝或者超过500个拷贝存在，对应于低拷贝数和严紧复制型质粒(pSC101、RK2)，低拷贝数质粒(pACYC、pRSF1010)或高拷贝数质粒(pSKbluescript II)。基因能够通过使用不同强度的可诱导或不可诱导的启动子来表达。这些可以作为例子使用的启动子有Ptrc、Ptac或者Plac，或者其它为本领域技术人员所知的启动子。稳定或者去稳定mRNA(Carrier&Keasling(1998)Biotechnol.Prog.，15，58-64)或者蛋白质(例如GSTtags，Amersham Biosciences)的元件可以增加或者降低目的基因的表达，。
在一个发明的优选实施方案中，先前获得的修饰进化的菌株在选择压力条件下，在含有简单碳源的合适生长培养基中生长，以使所述修饰进化菌株中参与乙酰-CoA和乙酸向丙酮转化的一个或更多基因向改良“丙酮合酶活性”进化。然后，选择和分离具有改良“1，2-丙二醇合酶活性”和改良“丙酮合酶活性”的第二代进化菌株。
本发明还涉及根据发明上面、下面和实施例中描述的起始菌株。
发明也涉及具有改良“1，2-丙二醇合酶活性”的进化菌株，它能够使用发明中上面、下面和实施例中描述的方法获得，包括额外具有“改良丙酮合酶活性”的第二代进化菌株。
最后，发明涉及制备1，2-丙二醇的方法，其中根据本发明的进化菌株在含有简单碳源的合适生长培养基中生长，然后回收生成的1，2-丙二醇和丙酮共产物，如果需要进行纯化。
根据本发明的起始修饰和进化菌株可以是原核生物或者真核生物，它们能够被转化和培养，以使它们生成1，2-丙二醇和可能的丙酮。
本领域的技术人员将能够基于细胞和分子生物学的公知常识选择所述的微生物，如果必要的话可以鉴定这些微生物中对应于上述提及的大肠杆菌基因的基因。
根据本发明的术语“微生物菌株”是表示一类属于同一物种的微生物，包括该物种的至少一种微生物。因此，所描述的菌株特征适用于该菌株的每一微生物。相呼应的是，所描述的该菌株的任何一个微生物的特征适用于该菌株的所有微生物。
根据本发明方法修饰的微生物可以是细菌、酵母菌或真菌，尤其是以下任何菌种：曲霉属、杆菌属、短杆菌属、梭状芽孢杆菌属、棒状杆菌属、埃希氏杆菌属、葡糖杆菌属、假单胞菌属、红球菌属、酿酒酵母属(Saccharomycessp.)、链霉菌属、黄单胞菌属、念珠菌属。
在一个优选实施方案中，细菌菌株是埃希氏杆菌属菌株，具体是大肠杆菌菌株。在另一个实施方案中，细菌菌株是棒状杆菌属菌株，具体是谷氨酸棒状杆菌。
在另一个实施方案中，酵母菌株是酿酒酵母属，具体是酿酒酵母。
在发明的上面、下面和在实施例中描述的菌株都是大肠杆菌。因此，对于根据本发明的进化菌株中可以被删除或过表达的基因主要使用大肠杆菌的基因命名。然而，根据本发明，这种命名具有更通常的含义，涵盖其它微生物中的相应基因。使用GenBank中大肠杆菌基因的参考序列，本领域的技术人员能够判定大肠杆菌以外的细菌菌株的等同基因。
确定同源序列和它们的同源百分率的方法对于本领域的技术人员是众所周知的，具体包括BLAST程序，它可以在网站
http://www.ncbi.nlm.nih.gov./BLAST/中按照网站中指示的缺省系数使用。可以比对获得的序列，例如按照网站中指示的缺省系数使用CLUSTALW程序(
http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)或者MULTALIN程序(
http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/cgi-bin/multalin/pl)进行。
使用GenBank给出的已知基因的参考序列，本领域的技术人员能够确定在其它生物如细菌菌株、酵母、真菌、哺乳动物和植物等中的等同基因。使用通过和来源于其他微生物的基因进行序列比对确定的共有序列，设计简并探针，这种惯常的工作可以容易的进行，其中通过所述简并探针可以克隆另一种生物中的相应基因。这些惯常的分子生物学技术在技术领域内是众所周知，例如描述于Sambrook et al.(1989 Molecular cloning：a laboratory manual.2nd Ed.Cold Spring Harbor Lab.，Cold Spring Harbor，New York)。
根据本发明的术语“删除”表示对基因活性的抑制，因此被称为‘删掉’。这种活性的抑制可以是通过合适的方法对相关基因表达产物的钝化，或者可以是对相关基因表达的抑制，或者可以是相关基因的至少一部份被删除(例如删除其表达所必需的部分或全部的启动子区域)以至于它不能被表达，或者使表达产物丧失其功能(例如删除相关基因的编码部分)。优选的是，基因的删除基本上是抑制该基因，该基因可以被选择标记基因置换，所述选择标记基因有利于鉴定、分离和纯化根据本发明的进化菌株。
优选通过同源重组使基因失活(Datsenko，K.A.& Wanner，B.L.(2000)One-stepinactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：6640-6645)。简要地说，灭活步骤可以如下所述：将线性DNA片段导入细胞。该片段是从体外获得，包含基因旁侧的两个区域，和位于这两个区域之间的至少一个选择基因(通常是抗生素抗性基因)。因此该片段代表失活基因。已经发生重组事件和整合所导入片段的细胞通过铺在选择性生长培养基中来选择。选择发生双重重组事件的细胞，该细胞中天然基因已经被失活基因所置换。可以使用阳性和阴性选择系统来改进该方法，以加快双重重组事件的检测。
优选用于将这些基因导入菌株的方法是电穿孔法，它是本领域技术人员众所周知的方法。简要的说，电穿孔步骤可以如下所述：将感兴趣异源基因克隆到表达载体中启动子和终止子之间。该载体也具有用来选择含有它的细胞的抗生素抗性基因和在宿主菌株中维持其存在的功能复制起点。该方法需要制备电感受态宿主细胞，然后通过电穿孔法用载体转化。
根据本发明，通过电穿孔法引入的基因优选是基因adc、ctfA和B，thl，其分别编码丙酮丁酸羧杆菌天然丙酮生成途径的乙酰乙酸羧化酶，辅酶A转移酶和硫解酶。丙酮丁酸羧杆菌被认为是一种非常高效的用生物法生产丙酮的微生物。
根据本发明的进化方法是一种制备进化微生物的方法，由此可能用来修饰代谢途径，优选包括以下步骤：
a)修饰微生物以获得起始微生物，使得这种修饰抑制起始微生物在设定培养基上生长时所生成或消耗的代谢物的生成或消耗，
b)使上述获得的起始修饰微生物生长在所述设定培养基上以使之进化，其中设定培养基也可以含有进化所必需的共底物，
c)选择能够在设定培养基上生长的修饰微生物细胞，如果需要培养基加入共底物。
这类进化方法具体描述在专利申请WO 04/076659中，其内容并入本文作为参考。
被进化的代谢途径具体是1，2-丙二醇合成途径，合适时是丙酮合成途径。
根据本发明的术语“设定培养基”表示含有已知的适于微生物生长的分子组分的培养基。设定培养基基本上不含有其生成或消耗被修饰所抑制的代谢物
根据本发明的术语“共底物”表示一种物质，其可以是有机的或者无机的，和底物不同，参加反应并在反应中向底物提供其一个或多个原子以形成终产物。共底物没有已知的诱变特征。
根据本发明的术语“选择”表示一种培养方法，它可以是持续的过程，它以通过逐渐增加稀释率的方式实施，以这种方式，在生长培养基中只保存那些显示出与施加的稀释率相等或更高生长率的微生物。在这种方法中，被保存的微生物是那些经过修饰不再影响其生长的微生物。
根据本发明的术语“进化基因”表示连接有起始密码子和终止密码子的核酸序列，其在选择后与起始序列至少有一个核苷酸不同。
根据本发明的术语“进化蛋白质”表示选择后与起始序列至少有一个氨基酸不同的氨基酸序列(蛋白质序列)。
基因和蛋白质可以通过它们的一级序列鉴定，也可以通过序列同源性或者限定蛋白质类别的序列比对来确定。
PFAM数据库(序列比对的蛋白质家族数据库和内部的马尔可夫模型http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)是一个大规模的收集蛋白质比对序列的数据库。每个PFAM可以实现多重序列比对，评估蛋白质结构域，估计蛋白质在生物中的分布，链接其它数据库并显示已知的蛋白质结构。
COGs(蛋白质的正向同源组的进化簇
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)可以通过比较来源于代表30个主要系统进化系的43个全序列基因组的蛋白质序列获得。每个COG至少从3个系统进化系确定，这使得鉴定古老的保守结构域变得可能。
根据本发明的术语“培养”、“生长”和“发酵”可以互换使用，表示细菌在含有简单碳源的合适培养基上的生长。
根据本发明的术语“简单碳源”表示可以被本领域技术人员使用的可以维持微生物、特别是细菌正常生长的任意碳源，它可以是阿拉伯糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖或木糖。尤其优选的简单碳源是葡萄糖。
根据本发明(发酵)的微生物培养条件可以很容易由本领域的技术人员确定。具体而言，细菌发酵的温度在20℃到55℃之间，优选在25℃到40℃之间，对于谷氨酸棒状杆菌和酿酒酵母优选是大约30℃，对于大肠杆菌是大约34℃。
发酵通常在具有已知设定组成的、适于细菌使用的无机培养基的发酵器中进行，所述无机培养基含有至少一种简单碳源，如果需要的话还含有产生代谢物所必需的协同因子。
具体而言，大肠杆菌的无机培养基可以是与以下培养基同样的或相似的培养基：M9培养基(Anderson，1946，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 32：120-128)、M63培养基(Miller，1992；A Short Course in Bacterial Genetics：A Laboratory Manual andHandbook for Escherichia coli and Related Bacteria，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，New York)或例如由Schaefer等(1999，Anal.Biochem.270：88-96)定义的培养基一种培养基，具体是下述的基本培养基：
| K2HPO4 | 1g/l |
| N.T.A | 0.2g/l |
| 微量元素溶液* | 10ml/l |
| (NH4)2SO4 | 1g/l |
| NaCl | 0.2g/l |
| NaHCO3 | 0.2g/l |
| MgSO4 | 0.2g/l |
| 葡萄糖 | 20～100g/l |
| 硝酸钠 | 0.424g/l |
| 硫胺 | 10mg/l |
| FeSO4 | 50mg/l |
| 酵母提取物 | 4g/l |
| 大观霉素 | 100mg/l |
用氢氧化钠调节培养基pH值到7.4。
* 微量元素溶液：柠檬酸4g/L，MnSO4 3g/L，NaCL 1g/L，CoCL2 0.1g/L，ZnSO40.10g/L，CuSO4 10mg/L，H3BO3 10mg/L，NaMoO4 10mg/L.
近似的，谷氨酸棒状杆菌的无机培养基也可以是与BMCG培养基(Liebl et al.，1989，Appl.Microbiol.Biotechnol.32：205-210)或者Riedel等定义的培养基(2001，J.Mol.Microbiol.Biotechnol.3：573-583)相同或相似的培养基。
发酵优选在厌氧和恒化条件下进行，也就是以固定的稀释率持续补料，所说的基本生长培养基含有固定浓度的碳源，并用氮气脱气。
只有当残留碳源的浓度达到稳定并维持稳定数天限制了发酵的时候，增加发酵给料培养基中的碳源浓度。
优选的培养模式是恒化培养模式，因为它有利于提高修饰菌株的生长和产生1，2-丙二醇的性能，并允许微生物的分离。
根据本发明的术语改良“1，2-丙二醇合酶活性”是表示所有参与DHAP向1，2-丙二醇转化途径的酶活性得以改良。与相同培养条件下相应起始微生物的1，2-丙二醇的产量，进化微生物中的改良酶活性导致进化微生物产生1，2-丙二醇的量增加。
根据本发明的术语改良“丙酮合酶活性”是表示所有参与乙酸和乙酰-CoA向丙酮转化途径的酶活性得以改良。与相同培养条件下相应修饰进化微生物相比，第二代进化微生物中进化的酶活性导致第二代进化微生物产生丙酮的量增加。
本发明也涉及根据本发明方法获得的进化菌株中进化基因以及所述进化基因所编码的进化蛋白质的分离和表征。然后，可以将这些进化基因导入宿主生物，在合适的调节元件控制下，在上述生物中表达产生相应的进化蛋白质。
恒化培养过程中进化微生物尤其是菌株E.coli MG16555 ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB性能的改善表明这些生长条件使得在厌氧条件下选择功能性内源丙酮酸脱氢酶复合物变得可能，在此条件下可以产生大量的NADH。已知的是，催化丙酮酸生成乙酰-CoA并释放NADH的丙酮酸脱氢酶复合物只在有氧条件下起作用，而在厌氧条件下丙酮酸甲酸裂合酶有功能，催化丙酮酸转化为乙酰-CoA和甲酸(Snoep J.L.，De Graef M.R.，Westphal A.H.，De Kok A.Teixeira de Mattos M.J.and Neijssel O.M.(1993))。通过丙酮酸脱羧基产生NADH来生成1，2-丙二醇的大肠杆菌修饰菌株中，一种修饰是删除编码丙酮酸甲酸裂合酶活性的基因pflA和pflB。对修饰细胞的唯一可能性是通过丙酮酸脱氢酶复合物将丙酮酸代谢为乙酰-CoA，并产生一个当量的NADH。已经表征了修饰进化菌株的丙酮酸脱氢酶复合物，其与野生型菌株的丙酮酸脱氢酶复合物相比对NADH敏感性降低。
本发明使得选择在厌氧条件下有功能并通过将3-磷酸甘油醛氧化为乙酸而产生两当量NADH的丙酮酸脱氢酶复合物变成可能。这些NADH当量只有通过将磷酸二羟基丙酮还原生成1，2-丙二醇的途径才可以被再氧化。对具有NADH低敏感性的酶复合物的选择有利于实现1，2-丙二醇的高生产率。
本发明有利于编码丙酮酸脱氢酶复合物中硫辛酰氨脱氢酶的基因lpd突变的选择(其野生型序列见：
http://genolist.pasteur.fr/Colibri)。具体而言，已经鉴定到使丙氨酸55替换为缬氨酸的点突变的存在。已知该酶与NADH对丙酮酸脱氢酶复合物的抑制相关。这种修饰酶也是本发明的一个目标。
本发明可以改善修饰微生物尤其是菌株E.coli MG1655 ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB的性能，并通过厌氧恒化培养过程中的进化，改善参与DHAP向1，2-丙二醇的转化途径的内源酶。这些酶的进化导致更高的生长率和更高的1，2-丙二醇终浓度。
优选的是，根据本发明，进化菌株不包括基因gldA的进化。在一个特定的实施方案中，基因gldA从进化菌株中被删除。
附图说明
图1：根据本发明修饰用来生产1，2-丙二醇和丙酮的大肠杆菌菌株代谢的图示
文字说明：
LDH：乳酸脱氢酶
ADH：乙醛乙醇脱氢酶
PFL：丙酮酸甲酸裂合酶
PDHc：丙酮酸脱氢酶复合物
图2：在葡萄糖上恒化培养过程中菌株E.coli MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB的进化：葡萄糖浓度(图2A和其它物质(图2B)。
图3：随NADH浓度浓度增加，野生型菌株和根据本发明的进化菌株中丙酮酸脱氢酶复合物的酶活性的比较。
以下给出的实施方案的实施例是用来说明本发明，但并不限制它的范围。
实施例1：构建经葡萄糖发酵只能产生1，2-丙二醇和乙酸的修饰菌株E.coliMG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB。
a)构建修饰菌株E.coli MG1655ΔtpiA::cm
通过插入氯霉素抗生素抗性盒和删除大部分相关基因使基因tpiA失活。所用的这项技术描述于Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.(2000)One-step inactivation ofchromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：6640-6645.
使用两个寡核苷酸置换基因tpiA：
1.DtpiAr，由100个碱基组成(SEQ ID NO 1)：
atgcgacatcctttagtgatgggtaactggaaactgaacggcagccgccacatggttcacgagctggtttctaacctgcgtaCATATGAATATCCTCCTTAG
具有：
—与基因tpiA(序列4108320-4109087)的序列(4109007-4109087)同源的区域(小写字母)，参考序列见网址
http://www.genolist.pasteur.fr/Colibri/，和
—用来扩增质粒pKD3的氯霉素抗性盒的区域(大写字母)(Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.(2000)One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coliK-12 using PCR products.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：6640-6645)。
2.DtpiAf，由100个碱基组成(SEQ ID NO 2)：
cttaagcctgtttagccgcttctgcagctttaacgattactgcgaaggcgtcagctttcagagaagcaccaccaaccagcTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
具有：
—与tpiA的序列(4108320-4108400)同源的区域(小写字母)，和
—用来扩增质粒pKD3携带的氯霉素抗性盒的区域(大写字母)。
用寡核苷酸DtpiAr和DtpiAf来扩增质粒pKD3的氯霉素抗性盒。然后，将得到的PCR产物通过电穿孔法导入菌株MG1655(pKD46)，其中表达的系统λRed(γ，β，exo)极有利于同源重组。然后，选择抗生素抗性转化子，并用寡核苷酸cdh和YIIQ进行PCR分析来检查抗性盒的插入。
cdh(SEQ ID NO 3)：
ggtgatgatagttatcgccg(与4107536-4107555序列同源)
YIID(SEQ ID NO 4)：
cgtgccatcgacagcagtcc(与4109599-4109580序列同源)
然后除去(eliminate)氯霉素抗性盒。然后，将携带有FLP重组酶的质粒pCP20经电穿孔法导入重组菌株中，所述FLP重组酶在氯霉素抗性盒的FRT位点处起作用(Cheperanov P.P.&Wackernagel W.(1995)Gene disruption in Escherichia coli.TcRand KmR cassettes with option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistancedeterminant，gene，158，9-14)。在42℃连续培养之后，通过用前面所用的相同寡核苷酸进行PCR分析来检查抗生素抗性盒的缺失。
b)构建修饰菌株E.coli MG1655 ΔpflAB::cm
通过插入氯霉素抗生素抗性盒和删除大部分相关基因使基因plfA和plfB失活。所用的这项技术描述于Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.(2000)。
使用两个寡核苷酸置换基因plfA和plfB：
1.DplfB r，由100个碱基组成(SEQ ID NO 5)：
ccggacatcctgcgttgccgtaaatctggtgttctgaccggtctgccagatgcatatggccgtggccgtatcatcggtgaCATATGAATATCCTCCTTAG
具有：
—与基因plfB(序列950495-952777)的序列(952235-952315)同源的区域(小写字母)，参考序列见网址
http://genolist.pasteur.fr/Colibri/，和
—用来扩增质粒pKD3的氯霉素抗性盒的区域(大写字母)(Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.(2000)One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coliK-12 using PCR products.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：6640-6645)。
2.DplfA，由100个碱基组成(SEQ ID NO 6)：
gatgcactataagatgtgttaaaaacgctgtagcagaatgaagcgcggaataaaaaagcggcaactcaataaagttgccgCTGGAGCTGCTTCG
具有：
—与定位在基因plfA(序列949563-950303)上的序列(949470-949550)同源的区域(小写字母)，和
—用来扩增质粒pKD3携带的氯霉素抗性盒的区域(大写字母)，。
用寡核苷酸pflAB1和pflAB2来扩增质粒pKD3的氯霉素抗性盒。然后，将获得的PCR产物通过电穿孔法导入菌株MG1655(pKD46)，其中表达的酶Red重组酶允许进行同源重组。然后，选择抗生素抗性转化子，并通过用寡核苷酸pflAB1和pflAB2进行PCR分析来检查抗性盒的插入。
pflAB1(SEQ ID NO 7)：
agacattaaaaatatacgtgcagctacccg(与948462-948491序列同源)。
pflAB2(SEQ ID NO 8)：
gtgaaagctgacaacccttttgatctttta(与953660-983689序列同源)。
c)构建修饰菌株E.coli MG1655 ΔtpiA，ΔplfAB
通过用噬菌体P1转导的技术，通过在菌株MG1655 ΔtpiA中用氯霉素抗性盒置换基因的方法来删除基因plfA和plfB。方法有两步：(i)制备菌株MG1655ΔplfAB::cm的噬菌体裂解物；(ii)用该噬菌体裂解物转导菌株MG1655 ΔtpiA。
制备噬菌体裂解物
—接种100μl的菌株MG1655(ΔplfAB::c)的过夜培养物到10ml LB+Cm 30μg/ml+葡萄糖0.2％+CaCl25mM。
—37℃摇培30分钟。
—加入100μl在野生菌株MG1655上制备的噬菌体裂解物P1(大约1×109噬菌体/ml)。
—37℃摇动3小时直到所有细胞被裂解。
—加入200μl氯仿，并涡旋。
—以4500g离心10分钟去除细胞碎片。
—转移上清液到无菌管中，并加入200μl氯仿。
—在4℃保存裂解物。
转导
—将菌株MG1655(ΔtpiA)的5ml LB过夜培养液以1500g离心10分钟。
—将细胞沉淀悬浮在2.5ml的MgSO4 10mM，CaCl2 5mM中。
—对照管：100μl细胞
100μl菌株MG1655(ΔpflAB::cm)的噬菌体P1。
—测试管：100μl细胞+100μl菌株MG1655(ΔpflAB::cm)的噬菌体P1。
—在30℃培养30分钟，不振荡
—在每个试管中加入100μl 1M的柠檬酸钠，涡旋
—加入1ml的LB
—在37℃振荡培养1小时
—以7000rpm将管离心3分钟后，铺到LB+Cm30μg/ml的皿中。
—37℃培养过夜。
菌株的鉴定
随后，选择抗生素抗性转化子，用(i)寡核苷酸pflAB1和pflAB2与(ii)cdh和YIIQ进行PCR分析来检查含有区域(pflAB::cm)的插入，并检测菌株ΔpflAB::cm中基因tpiA的缺失。所得菌株命名为MG1655Δ(pflAB::cm，ΔtpiA)。
如上所述，随后去除氯霉素抗性盒。然后，将携带有FLP重组酶的质粒pCP20经电穿孔法导入重组菌株，所述FLP重组酶在氯霉素抗性盒的FRT位点起作用。连续在42℃培养之后，用前面所用的相同寡核苷酸进行PCR分析来检测抗生素抗性盒的丢失。获得的菌株命名为MG16555ΔtpiA，ΔpflAB。
d)构建修饰菌株E.coli MG1655ΔadhE::cm
正如前面所示，使用Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.(2000)介绍的技术，通过插入氯霉素抗生素抗性盒和删除大部分相关基因使基因adhE失活。
使用两个寡核苷酸进行删除：
1.DadhEr，由100个碱基组成(SEQ ID NO 9)：
atggctgttactaatgtcgctgaacttaacgcactcgtagagcgtgtaaaaaaagcccagcgtgaatatgccagtttcactCATATGAATATCCTCCTTAG
具有：
—与基因adhE(序列1294669-1297344)的序列(1297263-1297343)同源的区域(小写字母)，参考序列见网址
http://genolist.pasteur.fr/Colibri/，和
—用来扩增质粒pKD3的氯霉素抗性盒的区域(大写字母)(Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.(2000))。
2.DadhEf，由100个碱基组成(SEQ ID NO 10)：
caataacgaatgatagcaattttaagtagttaggaggtgaaaaatgctgtcaaaaggcgtattgtcagcgcgtcttttcaTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
具有：
—与基因adhE的序列(1294694-1294774)同源的区域(小写字母)，和
—用来扩增质粒pKD3携带的氯霉素抗性盒的区域(大写字母)。
使用寡核苷酸DadhEr和DadhEf从质粒pKD3扩增氯霉素抗性盒。然后，将获得的PCR产物通过电穿孔法导入菌株MG1655(pKD46)，其中表达的酶Red重组酶允许同源重组。然后，选择抗生素抗性转化子，并用寡核苷酸ychGf和adhECr进行PCR分析来检查抗性盒的插入。
ychGf(SEQ ID NO 11)：
ggctcattgcaccaccatccag(与1294357-1294378的序列同源)
adhECr(SEQ ID NO 12)：
gaaaagacgcgctgacaatacgcc(与1297772-1297749的序列同源)
e)构建菌株MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE
如上所述使用噬菌体P1转导技术(见步骤c))删除菌株MG1655ΔtpiA，ΔpflAB中的基因adhE。获得菌株MG1655ΔadhE::cm的噬菌体P1裂解物，并使用该裂解物转导菌株MG1655ΔtpiA ΔpflAB。使用寡核苷酸ychCf和adhECr检测基因adhE的突变，也使用(i)寡核苷酸pflAB1和pflAB2和(ii)cdh和YIIQ检测菌株ΔadhE::cm中基因pflA和B以及tpiA的删除，以检测抗生素抗性转导子。
如前所述，随后去除氯霉素抗性盒。然后，将携带有FLP重组酶的质粒pCP20经电穿孔法导入重组菌株，所述FLP重组酶在氯霉素抗性盒的FRT位点处起作用。连续在42℃培养之后，使用前面同样的寡核苷酸进行PCR分析来检测抗生素抗性盒的丢失。获得的菌株命名为MG16555ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE。
f)构建修饰菌株E.coli MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana
如上所述使用噬菌体P1技术(见步骤c))使菌株MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE中的基因ldhA(对应于1439878-1440867)失活。用Clark D.P.(Bunch P.K.，Mat-Jan F.and Clark D.P.(1997)The ldhA gene encoding the fermentative lactatedehydrogenase of Escherichia coli.Microbiology，143，187-195.)提供的菌株E.coliK12NZN11 Δpfl::cam，ldhA::kana获得噬菌体裂解物。使用菌株E.coli K12 NZN11Δpfl::cam，ldhA::kana的噬菌体裂解物转导菌株MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE。用卡那霉素选择转导子，使用寡核苷酸hslJC和ldhAC2检测基因ldhA中卡那霉素盒的插入。
HslJC(SEQ ID NO 13)
gccatcagcaggcttagccg(与1439345-1439767序列同源)
ldhAC2(SEQ ID NO 14)
gggtattgtggcatgtttaaccg(与1441007-1441029序列同源)
获得的菌株命名为MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana.
g)构建修饰菌株E.coli MG1655ΔgloA::cm
按照上面Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.(2000)介绍的技术，插入氯霉素抗生素抗性盒并删除大部分相关基因使基因gloA失活。
使用两个寡核苷酸进行删除：
1.GLOAD f，由100个碱基组成(SEQ ID NO 15)
atgcgtcttcttcataccatgctgcgcgttggcgatttgcaacgctccatcgatttttataccaaagtgctgggcatgaaGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
具有：
—与基因gloA(序列1725861-1726268)的序列(1725861-1725941)同源的区域(小写字母)，参考序列见网址
http://genolist.pasteur.fr/Colibri/，和
—用来扩增质粒pKD3的氯霉素抗性盒的区域(大写字母)(Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.(2000))。
2.GLOAD R(SEQ ID NO 16)
ttagttgcccagaccgcgaccggcgtctttctcttcgattaactcaattttgtaaccgtccggatcttccacaaacgcgaCATATGAATATCCTCCTTAG
—与基因gloA(序列1725861-1726268)的序列(1726188-1726268)同源的区域(小写字母)，和
—用来扩增质粒pKD3携带的氯霉素抗性盒的区域(大写字母)。
使用寡核苷酸GLOADr和GLOADf从质粒pKD3扩增氯霉素抗性盒。然后，将获得的PCR产物通过电穿孔法导入菌株MG1655(pKD46)，其中表达的酶Red重组酶允许同源重组。然后，选择抗生素抗性转化子，用寡核苷酸Nem AC d和RntCr进行PCR分析来检测抗性盒的插入。
NemAQd(SEQ ID NO 17)：
gaagtggtcgatgccgggattgaagaatggg(与1725331-1725361序列同源)
Rnt Cr(SEQ ID NO 18)：
gggttacgtttcagtgaggcgcgttctgcgg(与1726765-1726795序列同源)
h)构建修饰菌株E.coli MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA
如上所述使用噬菌体P1技术(见步骤c))使菌株MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana中的基因gloA失活。获得菌株MG1655ΔgloA::cm的噬菌体P1裂解物，并使用这种裂解物转导菌株MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana。通过使用寡核苷酸NemAQd和RntCr检测基因gloA的突变，也使用寡核苷酸pflAB1和pflAB2，cdh和YIIQ，ychCf和adhECr以及hslJC和ldhAC2检测菌株ΔgloA::cm的基因pflA与B、tpiA、adhE和ldhA的删除的方法来验证氯霉素抗性转导株。
如上所述，随后去除氯霉素抗性盒。然后，将携带有FLP重组酶的质粒pCP20经电穿孔法导入重组菌株，所述FLP重组酶在氯霉素抗性盒FRT位点处起作用。在42℃连续培养之后，使用前面同样的寡核苷酸进行PCR分析来检测抗生素抗性盒的丢失。获得的菌株命名为MG16555ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA。
i)构建修饰菌株E.coli MG1655 ΔaldA::cm
按照上面Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.(2000)的方法，插入氯霉素抗生素抗性盒并删除大部分相关基因使基因aldA失活。
使用两个寡核苷酸进行删除：
1.AldA Df，由100个碱基组成(SEQ ID NO 19)：
atgtcagtacccgttcaacatcctatgtatatcgatggacagtttgttacctggcgtggagacgcatggattgatgtggtaGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
具有：
—与基因aldA(序列1486256-1487695)的序列(1486256-1486336)同源的区域(小写字母)，参考序列见网址
http://genolist.pasteur.fr/Colibri/，和
—用来扩增质粒pKD3的氯霉素抗性盒的区域(大写字母)(Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.(2000))。
2.aldADr，由100个碱基组成(SEQ ID NO 20)
ttaagactgtaaataaaccacctgggtctgcagatattcatgcaagccatgtttaccatctgcgccgccaataccggatttCATATGAATATCCTCCTTAG
—与基因aldA(序列1486256-1487695)的序列(1487615-1487695)同源的区域(小写字母)，和
—用来扩增质粒pKD3携带的氯霉素抗性盒的区域(大写字母)。
使用寡核苷酸AldA Dr和aldADf从质粒pKD3扩增氯霉素抗性盒。然后，将获得的PCR产物通过电穿孔法导入菌株MG1655(pKD46)，其中表达的酶Red重组酶允许同源重组。然后，选择抗生素抗性转化子，用寡核苷酸Ydc FCf和gapCCr进行PCR分析来检测抗性盒的插入。
Ydc FCf(SEQ ID NO 21)
tgcagcggcgcacgatggcgacgttccgccg(与1485722-1485752序列同源)
gapCCr(SEQ ID NO 22)：
cacgatgacgaccattcatgcctatactggc(与1488195-1488225序列同源)
h)构建修饰菌株E.coli MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA
如上所述使用噬菌体P1技术(见步骤c))使菌株MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA中的基因aldA失活。获得菌株MG1655ΔaldA::cm的噬菌体P1裂解物，并使用这种裂解物转导菌株MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA。使用寡核苷酸Ydc FCf和gapCCr检测基因aldA的突变，也使用寡核苷酸NemAQd和Rnt Cr，pflAB1和pflAB2，cdh和YIIQ，ychCf和adhECr，以及hslJC和ldhAC2分别检测菌株ΔaldA::cm的基因gloA、plfA和B、tpiA、adhE的删除的方法来验证氯霉素抗性转导株。
如上所述，随后去除氯霉素抗性盒。然后，将携带有FLP重组酶的质粒pCP20经电穿孔法导入重组菌株，所述FLP重组酶在氯霉素抗性盒FRT位点处起作用。在42℃连续培养之后，使用前面同样的寡核苷酸进行PCR分析来检测抗生素抗性盒的丢失。获得的菌株命名为MG16555ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA。
g)构建修饰菌株E.coli MG1655ΔaldB::cm
按照上面Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.(2000)的方法，插入氯霉素抗生素抗性盒并删除大部分相关基因使基因aldB失活。
使用两个寡核苷酸进行删除：
1.AldB Df，由100个碱基组成(SEQ ID NO 23)：
tcagaacagccccaacggtttatccgagtagctcaccagcaggcacttggtttgctggtaatgctccagcatcatcttgtGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
具有：
—与基因aldB(序列3752603-3754141)的序列(3752603-3752683)同源的区域(小写字母)，参考序列见网址
http://genolist.pasteur.fr/Colibri/，和
—用来扩增质粒pKD3的氯霉素抗性盒的区域(大写字母)(Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.(2000))。
2.AldBDr，由100个碱基组成(SEQ ID NO 24)
atgaccaataatcccccttcagcacagattaagcccggcgagtatggtttccccctcaagttaaaagcccgctatgacaaCATATGAATATCCTCCTTAG
具有
—与基因aldB(序列3752603-3754141)的序列(3754061-3754141)同源的区域(小写字母)，和
—用来扩增质粒pKD3携带的氯霉素抗性盒的区域(大写字母)。
使用寡核苷酸AldB Dr和aldBDf从质粒pKD3扩增氯霉素抗性盒。然后，将获得的PCR产物通过电穿孔法导入菌株MG1655(pKD46)，其中表达的酶Red重组酶允许同源重组。然后，选择抗生素抗性转化子，并通过用寡核苷酸aldB Cf和YiaYCr进行PCR分析来检测抗性盒的插入。
aldB Cf(SEQ ID NO 25)
catatttccctcaaagaatataaaaaagaacaattaacgc(与3752057-3752095序列同源)
YiaYCr(SEQ ID NO 26)：
tatgttcatgcgatggcgcaccagctgggcg(与3754644-3754674序列同源)
h)构建修饰菌株E.coli MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB
如上所述使用噬菌体P1技术(见步骤c))使菌株MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，aldA中的基因aldB失活。获得菌株MG1655ΔaldB::cm的噬菌体P1裂解物，并使用这种裂解物转导菌株MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA。使用寡核苷酸aldB Cf和YiaYCr检测基因aldA的突变，也使用寡核苷酸NemAQd和Rnt Cr，pflAB1和pflAB2，cdh和YIIQ，ychCf和adhECr，hslJC和ldhAC2以及Ydc FCf和gapCCr分别检测菌株ΔaldBA::cm的基因gloA、pflA和B、tpiA、adhE、aldA的删除的方法来验证氯霉素抗性转导株。
如上所述，随后去除氯霉素抗性盒。然后，将携带有FLP重组酶的质粒pCP20经电穿孔法导入重组菌株，所述FLP重组酶在氯霉素抗性盒FRT位点处起作用。在42℃连续培养之后，使用前面同样的寡核苷酸进行PCR分析来检测抗生素抗性盒的丢失。获得的菌株命名为MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB。
实施例2：恒化培养下修饰菌株E.coli MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB的培养和进化
为了优化菌株E.coli MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB代谢葡萄糖生成1，2-丙二醇的产出，菌株在补充有硝酸钠和酵母提取物的基本培养基中在厌氧条件下恒化培养数周。
在培养起始阶段，在给料培养箱中，葡萄糖的起始浓度是20g/l，稀释率是0.04h-1，维持持续的氮气流来确保厌氧条件。细胞浓度和1，2-丙二醇以及乙酸的产量低。在培养数周后，细胞生长和产物浓度增加，残余葡萄糖浓度和稳定的产物浓度达到稳定状态(图2)
实施例3：表征对NADH低敏感性的进化丙酮酸脱氢酶复合物
通过在体外对进化丙酮酸脱氢酶复合物(PDHc)进行活性分析，和通过对进化的PDHc中和野生型PDHc中的编码硫辛酰胺脱氢酶的基因(lpd)序列进行比较，来验证这种酶向NADH低敏感性的进化。
a)丙酮酸脱氢酶复合物的酶活性分析
使用Schwartz和Reed描述的方法(Schwartz E.R.& Reed L.J.(1970)Regulation of the activity of the pyruvate dehydrogenase complex of Escherichia coli，Biochemistry，6，1434-1439)在体外对菌株E.coli*MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB的PDHc酶活性进行分析。
从恒化发酵物中取出100ml等份的细胞培养物放入事先在厌氧罩中脱气的瓶中。将细胞悬浮液以6000rpm离心10分钟。将沉淀重悬在含有50mM磷酸钾缓冲液、pH7.9，0.5mM焦磷酸硫胺素的大约100ml的溶液中，再次以6000rpm离心10分钟。在相同的条件再洗涤一次。将细胞沉淀重悬在800μl缓冲液中。使用超声波仪通过四次处理循环(以30％处理30秒)破碎细胞悬浮液，每次循环间隔两分钟冰浴。以13,400rpm离心5分钟去除细胞碎片。上清液是无细胞粗提物。在无细胞提取物中存在的盐可能干扰对酶的分析，通过跑用磷酸钾缓冲液pH7.9、0.5mM焦磷酸硫胺素平衡的PD10柱去除。用3.5ml的上述缓冲液洗脱提取液。重新获得的洗脱液是无细胞粗提物。
首先，在无NADH条件下测定无细胞粗提物的酶活性，然后在NADH浓度从0.14mM增加到2.7mM的条件下测定酶活性。在表3中，获得的结果与文献中报道的野生型大肠杆菌的数据进行比较(Snoep J.L.，De Graef M.R.，Westphal A.H.，DeKok A.Teixeira de Mattos M.J.and Neijssel O.M.(1993)Differences in sensitivity toNADH of purified pyruvate dehydrogenase complexes of Enterococcus faecalis，Lactococcus lactis，Azotobacter vinelandii and Escherichia coli：implications for theiractivity in vivo，FEMS Microbiology Letters，114，279-284)。
获得的结果显示：进化修饰菌株E.coli MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB对NADH的敏感性比野生型大肠杆菌菌株低。在[NAD+]/[NADH]≌33时，野生型菌株的PDHc活性完全被抑制，而进化型PDHc还有80％的活性。
b)对进化菌株MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB的丙酮酸脱氢酶复合物中编码硫辛酰胺脱氢酶的基因lpd序列的鉴定
从1ml在LB中过夜培养的培养物中提取菌株E.coli*MG1655ΔtpiA，δpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB的染色体DNA。离心后，用无菌水洗涤细胞并通过94℃热激5分钟破碎细胞。再次离心后回收上清液中的染色体DNA。丙酮酸脱氢酶复合物中编码硫辛酰胺脱氢酶(E3)的基因lpd(序列127912-129336)通过使用以下两种寡核苷酸进行PCR扩增：
AceEf(SEQ ID NO 27)：
cgcgtgatcgacggtgctgatggtgcccg(与127504-127532序列同源)
YacH r(SEQ ID NO 28)：
aagttcaggagagccgccc(与127513-129531序列同源)
获得并测序含有2000个碱基对的与基因lpd相应的PCR产物。所得结果显示存在使丙氨酸55替换为缬氨酸的点突变。
例4：进化修饰菌株E.coli MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB中甲基乙二醛向1，2-丙二醇的转化路径中不涉及甘油脱氢酶。
为了显示进化修饰菌株E.coli MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB的性能改善并不是由于基因gldA编码的甘油脱氢酶的进化而引起的，构建删除基因gldA的菌株E.coli MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB。
a)构建修饰菌株MG1655ΔgldA::cm
如实施例1所述，使用Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.(2000)的方法，通过插入氯霉素抗生素抗性盒并删除大部分相关基因使基因gldA失活。
使用两个寡核苷酸进行删除：
1.gldA Df，由100个碱基组成(SEQ ID NO 29)：
gttattcccactcttgcaggaaacgctgaccgtactggtcggctaccagcagagcggcgtaaacctgatctggcgtcgcgGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
具有：
—与基因gldA(序列4135512-4136615)的序列(4135512-4135592)同源的区域(小写字母)，参考序列见网址
http://genolist.pasteur.fr/Colibri/，和
—用来扩增质粒pKD3的氯霉素抗性盒的区域(大写字母)(Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.(2000))。
2.GldA Dr，由100个碱基组成(SEQ ID NO 30)
atggaccgcattattcaatcaccgggtaaatacatccagggcgctgatgtgattaatcgtctgggcgaatacctgaagccCATATGAATATCCTCCTTAG
—与基因gldA(序列4135512-4136615)的序列(4136535-4136615)同源的区域(小写字母)，和
—用来扩增质粒pKD3携带的氯霉素抗生素抗性盒的区域(大写字母)。
使用寡核苷酸gldA Dr和gldA Df从质粒pKD3扩增氯霉素抗性盒。然后，将获得的PCR产物通过电穿孔法导入菌株MG1655(pKD46)，其中表达的酶Red重组酶允许同源重组。然后，选择抗生素抗性转化子，并用寡核苷酸YijF D和TalCr进行PCR分析来检测抗性盒的插入。
YijF D(SEQ ID NO 31)：
gcctggatttgtaccacggttggtggaacggcggg(与4135140-4135174序列同源)
TalCr(SEQ ID NO 32)：
cacgcatattccccattgccgggg(与4137216-4137239序列同源)
从野生型基因和被氯霉素抗性基因置换的删除基因分别获得具有2100个碱基对的PCR产物。然后，将获得的PCR产物用SalI限制酶消化。野生型PCR产物获得两个大约1000个碱基对的片段，然而含有氯霉素抗性基因的PCR产物没有被酶消化。
b)构建进化修饰菌株MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldBΔgldA::cm
如实施例1所述使用噬菌体P1技术(见步骤c))，使进化菌株MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB中的基因gldA失活。获得菌株MG1655ΔgldA::cm的噬菌体P1裂解物，并使用这种裂解物转导菌株MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA。使用寡核苷酸YijF D和TalCr检测基因gldA的突变，来确认氯霉素抗性转导株。
c)培养进化修饰菌株E.coli*MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，ΔgldA::cm和E.coli* MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB
在没有调节PH值、补充有钠和酵母提取物、葡萄糖起始浓度为20g/l的基本培养基中，在厌氧条件下对两个进化修饰菌株E.coli* MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB ΔgldA::cm和E.coli*MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB培养10天。获得的发酵产物谱显示删除基因gldA并没有引起任何1，2-丙二醇产量的降低(表1)。
表1：进化修饰菌株E.coli* MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB ΔgldA::cm和E.coli* MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB培养10天后，对底物和发酵产物浓度的比较。
| 菌株 | 光密度 | 消耗的葡萄糖(g/l) | 甲基乙二醛(g/l) | 乙酸(g/l) | 1，2-丙二醇(g/l) |
| E.coli*MG 1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，dhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，ΔgldA::cm | 1.5 | 7.3 | 1.2 | 2.1 | 1.7 |
| E.coli*MG 1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，dhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB | 1.9 | 9.6 | 1.4 | 1.9 | 1.2 |
实施例5：通过删除进化菌株E.coli* MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB中编码6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的基因edd，改善转化葡萄糖生成1，2-丙二醇的产量
a)构建修饰菌株MG1655Δedd::cm
如实施例1所述，使用Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.(2000)的方法，通过插入氯霉素抗生素抗性盒并删除大部分相关基因使基因edd失活。
使用两个寡核苷酸进行删除：
1.edd Df，由100个碱基组成(SEQ ID NO 33)：
ttaaaaagtgatacaggttgcgccctgttcggcaccggacagtttttcacgcaaggcgctgaataattcacgtcctgttcGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
具有：
—与基因edd(序列1930817-1932628)的序列(1930817-4)同源的区域(小写字母)，参考序列见网址
http://genolist.pasteur.fr/Colibri/，和
—用来扩增质粒pKD3的氯霉素抗性盒的区域(大写字母)(Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.(2000))。
2.edd Dr，由100个碱基组成(SEQ ID NO 34)
atgaatccacaattgttacgcgtaacaaatcgaatcattgaacgttcgcgcgagactcgctctgcttatctcgcccggatCATATGAATATCCTCCTTAG
—与基因edd(序列1930817-1932628)的序列(1932548-1932628)同源的区域(小写字母)，和
—用来扩增质粒pKD3携带的氯霉素抗生素抗性盒的区域(大写字母)。
使用寡核苷酸edd Dr和edd Df从粒pKD3扩增氯霉素抗性盒。然后，将得的PCR产物通过电穿孔法导入菌株MG1655(pKD46)，其中表达的酶Red重组酶允许同源重组。然后，选择抗生素抗性转化子，并用寡核苷酸eda d和zwf r进行PCR分析来检测抗性盒的插入。
eda d(SEQ ID NO 35)：
CCCCGGAATCAGAGGAATAGTCCC(与1930439-1930462序列同源)
zwf r(SEQ ID NO 36)：
GGGTAGACTCCATTACTGAGGCGTGGGCG(与1932968-1932996序列同源)
b)构建进化修饰菌株MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB Δedd::cm
如实施例1所述使用噬菌体P1技术(见步骤c))使进化菌株MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB中的基因edd失活。获得菌株MG1655Δedd::cm的噬菌体P1裂解物，并使用这种裂解物转导菌株MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB。使用寡核苷酸eda d和zwf r检测基因edd的突变，来确认氯霉素抗性转导株。
c)培养进化修饰菌株E.coli* MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB Δedd::cm和E.coli* MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB
在没有调节PH值的、补充有硝酸钠和酵母提取物的、葡萄糖起始浓度为20g/l的基本培养基中，在厌氧条件下对两个进化修饰菌株E.coli* MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB Δedd::cm和E.coli* MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB培养10天。获得的发酵产物谱显示删除基因edd引起转化葡萄糖生成1，2-丙二醇的产量从0.13g/g增加到0.35g/g(表2)。因此，在进化菌株E.coli* MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB中删除基因edd改善了菌株的性能。
表2：进化修饰菌株E.coli* MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB Δedd::cm和E.coli* MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB培养10天后，对底物和发酵产物浓度的比较。
| 菌株 | 光密度 | 消耗的葡萄糖(g/l) | 甲基乙二醛(g/l) | 乙酸(g/l) | 1，2-丙二醇(g/l) | 1，2-丙二醇/葡萄糖产量(g/g) |
| E.coli*ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，dhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，Δedd::cm | 1.2 | 5 | 0.2 | 1.5 | 1.8 | 0.35 |
| E.coli*ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，dhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB | 1.9 | 9.6 | 1.4 | 1.9 | 1.2 | 0.13 |
例6：构建能够产生1，2-丙二醇和丙酮的修饰菌株E.coli* MG1655 ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，Δedd::cm(pSOS95T)
质粒pSOS95T是大肠杆菌/丙酮丁酸羧杆菌穿梭表达载体，携带有丙酮丁酸羧杆菌的丙酮操纵子，其由依赖硫解酶启动子的分别编码乙酰乙酸羧化酶、辅酶A转移酶、硫解酶的四个基因adc、ctfA与B、thl组成。这三个酶催化乙酰-CoA和乙酸转化为丙酮和二氧化碳。通过在质粒pSOS95(Gene bank accession number AY187686)中插入丙酮丁酸羧杆菌的编码硫解酶的基因thl，获得质粒pSOS95T，插入位点介于硫解酶启动子和基因ctfA之间的BamH1位点。将质粒pSOS95T通过电穿孔法导入进化菌株E.coli* MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB Δedd::cm。
在LB培养基中过夜培养菌株，制备菌株E.coli* MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB Δedd::cm的电感受态细胞。接种(1/100)锥形瓶中的LB过夜培养物在37℃培养。当培养物的550nm光密度值达到0.4到0.6之间时，取出1ml培养物并离心。用水和10％的甘油溶液洗涤细胞，然后重新悬浮在0.05ml 10％的甘油溶液中。立即用5μl的质粒制备物pSOS95T(Qiagen，Hilden，Germany)经电穿孔法(25μF，200Ω，2.5kV)(Gene Pulser，Biorad)处理细胞。在SOC培养基(Sambrook J.，Fristch E.F.& Maniatis T.(1989)Molecular Cloning：aLaboratory Manual，2nd ed Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.)中于37℃表型表达一小时之后，在37℃含有100μg/ml羧苄青霉素的琼脂培养基上培养选择转化子。
使转化子返还到含有羧苄青霉素的液体培养基中过夜，提取质粒DNA(Qiagen，Hilden，Germany)来检查质粒pSOS95T的存在，并保证能够满足酶消化的要求。
例7：培养能够产生1，2-丙二醇和丙酮的进化修饰菌株E.coli*MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，Δedd::cm(pSOS95T)
在没有调节PH值的、补充有硝酸钠和酵母提取物的、葡萄糖起始浓度为20g/l的基本培养基中，在厌氧条件下对进化修饰菌株E.coli* MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB Δedd::cm(pSOS95T)进行培养(表3)。分析发酵产物显示，进化菌株E.coli* MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB Δedd::cm(pSOS95T)产生1，2-丙二醇、乙酸和丙酮的混合物。
表3：进化修饰菌株E.coli* MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB Δedd::cm(pOS95T)和E.coli* MG1655ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB Δedd::cm培养10天后，对底物和发酵产物浓度的比较。
| 菌株 | 光密度 | 消耗的葡萄糖(g/l) | 甲基乙二醛(g/l) | 乙酸(g/l) | 1，2丙二醇(g/l) | 内酮(g/l) |
| E.coli*ΔtpiA，ΔpflA，ΔadhE，dhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，Δedd::cm(pSOS95T) | 1.4 | 4.8 | 0.3 | 1.3 | 1.6 | 0.1 |
| E.coli*ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::kana，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，Δedd::cm | 1.2 | 5 | 0.2 | 1.5 | 1.8 | / |
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<160>36
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>102
<212>DNA
<213>人工的
<400>1
atgcgacatc ctttagtgat gggtaactgg aaactgaacg gcagccgcca catggttcac 60
gagctggttt ctaacctgcg tacatatgaa tatcctcctt ag 102
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<212>DNA
<213>人工的
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cttaagcctg tttagccgct tctgcagctt taacgattac tgcgaaggcg tcagctttca 60
gagaagcacc accaaccagc tgtaggctgg agctgcttcg 100
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<212>DNA
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cgtgccatcg acagcagtcc 20
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ccggacatcc tgcgttgccg taaatctggt gttctgaccg gtctgccaga tgcatatggc 60
cgtggccgta tcatcggtga catatgaata tcctccttag 100
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gatgcactat aagatgtgtt aaaaacgctg tagcagaatg aagcgcggaa taaaaaagcg 60
gcaactcaat aaagttgccg ctggagctgc ttcg 94
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<212>DNA
<213>人工的
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<213>人工的
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<212>DNA
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atggctgtta ctaatgtcgc tgaacttaac gcactcgtag agcgtgtaaa aaaagcccag 60
cgtgaatatg ccagtttcac tcatatgaat atcctcctta g 101
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tcagaacagc cccaacggtt tatccgagta gctcaccagc aggcacttgg tttgctggta 60
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atgaccaata atcccccttc agcacagatt aagcccggcg agtatggttt ccccctcaag 60
ttaaaagccc gctatgacaa catatgaata tcctccttag 100
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atggaccgca ttattcaatc accgggtaaa tacatccagg gcgctgatgt gattaatcgt 60
ctgggcgaat acctgaagcc catatgaata tcctccttag 100
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ttaaaaagtg atacaggttg cgccctgttc ggcaccggac agtttttcac gcaaggcgct 60
gaataattca cgtcctgttc gtgtaggctg gagctgcttc g 101
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atgaatccac aattgttacg cgtaacaaat cgaatcattg aacgttcgcg cgagactcgc 60
tctgcttatc tcgcccggat catatgaata tcctccttag 100
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ccccggaatc agaggaatag tccc 24
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gggtagactc cattactgag gcgtgggcg 29
Claims (20)
1.一种制备经代谢简单碳源生产1，2-丙二醇的进化微生物菌株的方法，这种方法包括在选择压力下在含有简单碳源的合适生长培养基中培养起始细菌菌株，所述起始细菌菌株缺失基因tpiA并缺失参与甲基乙二醛(丙醛)向乳酸转化的至少一个基因，以使所述菌株中参与从DHAP向甲基乙二醛、继尔向1，2-丙二醇生物合成路径的一个或多个基因向具有改良“1，2-丙二醇合酶”活性的进化基因进化，然后选择和分离所得的具有改良“1，2-丙二醇合酶”活性的进化微生物菌株。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于参与甲基乙二醛向乳酸转化的基因是golA、aldA或aldB。
3.根据权利要求1或2的方法，其特征在于所述起始菌株缺失基因golA、aldA、aldB和tpiA。
4.根据权利要求1-3中任意一项的方法，其特征在于所述起始菌株缺失基因ldhA、pflA、pflB、adhE和edd。
5.根据权利要求1-4中任意一项的方法，其特征在于所述起始菌株还含有至少一个编码有利于将丙酮酸代谢为乙酸的酶的基因。
6.根据权利要求5的方法，其特征在于有利于将丙酮酸代谢为乙酸的酶对NADH的抑制作用有低敏感性。
7.根据权利要求5或6的方法，其特征在于所述的酶有利于将丙酮酸代谢生成乙酰-CoA和NADH。
8.根据权利要求7的方法，其特征在于所述酶是丙酮酸脱氢酶复合物。
9.根据权利要求6-8中任意一项的方法，其特征在于有利于将丙酮酸代谢为乙酸的酶是内源酶。
10.根据权利要求1-9中任意一项的方法，其特征在于将编码一个或多个参与乙酰-CoA和乙酸向丙酮转化的酶的一个或多个异源基因导入进化菌株中。
11.根据权利要求10的方法，其特征在于编码一个或多个参与乙酰-CoA和乙酸转化的酶的异源基因来自丙酮丁酸羧杆菌。
12.根据权利要求10或11的方法，其特征在于根据权利要求10或11的方法获得的进化修饰菌株在选择压力下在含有简单碳源的合适生长培养基中生长，以使所述进化修饰菌株中参与乙酰-CoA和乙酸向丙酮转化的一个或多个基因向改良“丙酮合酶”活性进化；然后选择和分离具有改良“1，2-丙二醇合酶”活性和改良“丙酮合酶”活性的第二代所得进化微生物。
13.根据前述权利要求中任意一项的方法，其特征在于所述菌株是细菌、酵母或真菌。
14.根据权利要求13的方法，其特征在于所述菌株是埃希氏杆菌属，具体是大肠杆菌；和棒状杆菌属，具体是谷氨酸棒状杆菌。
15.根据权利要求1-9中任何一项所限定的起始菌株。
16.能够用根据权利要求1-14中任意一项的方法获得的进化菌株。
17.根据权利要求16的菌株，其中基因lpd具有使丙氨酸55替换为缬氨酸的点突变。
18.制备1，2-丙二醇的方法，其中使根据权利要求16或17的进化菌株在含有简单碳源的合适生长培养基中生长，并回收生成的1，2-丙二醇。
19.根据权利要求18的方法，其特征在于回收1，2-丙二醇和丙酮。
20.根据权利要求18或19的方法，其特征在于纯化1，2-丙二醇和/或丙酮。
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