ES2329914T3 - Microorganismo evolucionado para la produccion de 1,2-propanodiol. - Google Patents
Microorganismo evolucionado para la produccion de 1,2-propanodiol. Download PDFInfo
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Abstract
Procedimiento de preparación de una cepa de microorganismos evolucionados para la producción de 1,2-propanodiol mediante el metabolismo de una fuente de carbono simple, a partir de una cepa inicial que comprende una deleción del gen tpiA y una deleción de por lo menos un gen que codifica para una enzima implicada en la conversión del metil-glioxal (propanol) en lactato. comprendiendo dicho procedimiento las siguientes etapas: cultivar dicha cepa inicial en un medio de cultivo apropiado, que comprende una fuente de carbono simple, aplicando unos índices de dilución crecientes de tal manera que se conservan en el medio de cultivo sólo los microorganismos que tienen un índice de crecimiento igual o superior al índice de dilución impuesto, con el fin de hacer evolucionar en dicha cepa inicial uno o varios genes implicados en la vía de biosíntesis del DHAP en metilglioxal y después en 1,2-propanodiol hacia unos genes evolucionados que tienen una actividad "1,2-propanodiol sintasa" mejorada, seleccionar y aislar la o las cepas de microorganismos evolucionados que tienen una actividad "1,2-propanodiol sintasa" mejorada.
Description
Microorganismo evolucionado para la producción
de 1,2-propanodiol.
La presente invención se refiere a un nuevo
procedimiento de preparación de un microorganismo evolucionado para
la producción de 1,2-propanodiol, al microorganismo
evolucionado así obtenido y a su uso para la preparación de
1,2-propanodiol.
El 1,2-propanodiol o
propilenglicol, dialcohol en C3, es un producto químico usado en
numerosos campos. Es un constituyente de las resinas de poliésteres
insaturados; unos detergentes líquidos; unos agentes de
enfriamiento, anticongelante y de fluido de deshielo de los
aviones. El uso del propilenglicol está en auge desde los años
1993-1994 en sustitución de los derivados etilénicos
que son reconocidos como más tóxicos que los derivados
propiléni-
cos.
cos.
El 1,2-propanodiol se produce
actualmente por vía química mediante un procedimiento de hidratación
de óxido de propileno usando amplias cantidades de agua. La
producción de óxido de propileno se puede llevar a cabo según dos
procedimientos, uno usando epiclorhidrina, y el otro hidroperóxido.
Estas dos vías usan unos productos altamente tóxicos. Además, la
vía del hidroperóxido genera unos co-productos tales
como el ter-butanol o el
1-fenil-etanol que es necesario
tener en cuenta para rentabilizar la producción de óxido de
propileno. La vía química produce generalmente
1,2-propanodiol racémico mientras que existen dos
formas de estereoisómeros, el
(R)-1,2-propanodiol y el
(S)-1,2-propanodiol, cuyo interés no
es despreciable para otras aplicaciones.
Estos inconvenientes relacionados con la
producción química del 1,2-propanodiol convierten la
vía de producción biológica en una alternativa prometedora. Varios
microorganismos son capaces de producir naturalmente (S) o
(R)-1,2-propanodiol a partir de
azúcar, tales como la glucosa o la xilosa que son metabolizadas por
la vía de la glicólisis, o también a partir de desoxihexosas que
conducen entonces a la formación de
(S)-1,2-propanodiol (Cameron D.
C. et al. (1998) Biotechnol Prog.). Entre los microorganismos
más competentes se pueden citar Clostridium sphenoides
(Tran Din K et al. 1986) y Thermoanaerobium
thermosaccharolyticum (Altaras N. E. y Cameron D. C.
2001). Ese último es capaz de fermentar varios tipos de azúcares
en (R)-1,2-propanodiol con un
rendimiento comprendido entre 0,13 y 0,28 g de
1,2-propanodiol producido/g de glucosa consumida. En
estos dos microorganismos, las enzimas responsables de la síntesis
de 1,2-propanodiol no han sido identificadas, y la
mejora de sus rendimientos está limitada por la falta de
herramientas genéticas disponibles. Por otro lado, E. coli
posee todos los genes necesarios para la producción de
1,2-propanodiol incluso si E. coli no
produce naturalmente 1,2-propanodiol. En efecto, el
1,2-propanodiol debe ser producido a partir de
metil-glioxal, un compuesto altamente tóxico para
la célula incluso a baja concentración. Asimismo, unos
procedimientos que usan unas cepas de E. coli genéticamente
modificadas con el fin de que produzcan
1,2-propanodiol han sido descritos en particular en
los documentos US nº 6.303.352, US nº 6.087.140 y WO 98/37204. Estos
procedimientos usan en particular la sobreexpresión de una o varias
enzimas implicadas en la vía metabólica de producción del
1,2-propanodiol mediante la clonación de sus genes
en unos plásmidos y por lo tanto imponen una presión de selección
con la ayuda de antibióticos. Para mejorar los rendimientos de las
cepas ciertos genes endógenos son asimismo suprimidos (véase por
ejemplo Altaras N. E. y Cameron D. C. (2000) Biotechnol. Prog.
16, 940-946: Altaras N. E. y Cameron D. (1999)
Appl. Env. Microb., 65, 1180-1185).
Un procedimiento que usa un microorganismo
evolucionado que coproduce 1,2-propanodiol y
acetona, dos co-productos valorizables, no ha sido
descrito hasta ahora.
La presente invención se refiere por lo tanto a
un procedimiento de preparación de una cepa de microorganismos
evolucionados para la producción de 1,2-propanodiol
mediante el metabolismo de una fuente de carbono simple, a partir
de una cepa inicial que comprende una deleción del gen tpiA y
una deleción de por lo menos un gen que codifica para una enzima en
la conversión del metil-glioxal (propanal) en
lactato.
Comprendiendo dicho procedimiento las etapas
siguientes:
- \bullet
- cultivar dicha cepa inicial en un medio de cultivo apropiado, que comprende una fuente de carbono simple, aplicando unos índices de dilución crecientes de tal forma que se conservan en el medio de cultivo sólo los microorganismos que tienen un índice de crecimiento igual o superior al índice de dilución impuesto, con el fin de hacer evolucionar en dicha cepa inicial uno o varios genes implicados en la vía de biosíntesis del DHAP en metilglioxal y después en 1,2-propanodiol hacia unos genes evolucionados que tienen una actividad "1,2-propanodiol sintasa" mejorada,
- \bullet
- seleccionar y aislar la o las cepas de microorganismos evolucionados que tienen una actividad "1,2-propanodiol sintasa" mejorada.
\vskip1.000000\baselineskip
El gen tpiA codifica para la triosa
fosfato isomerasa que cataliza la conversión del DHAP en
gliceraldehído 3 fosfato. La deleción de este gen tiene por
objetivo asegurar la síntesis de una cantidad suficiente de
metil-glioxal. Teóricamente, la deleción del gen
tpiA debe permitir asegurar que el 50% del carbono de la
glucosa metabolizada por las células sea afectado en la preparación
del metil-glioxal a partir del dihidroxi
acetonafosfato.
La deleción de por lo menos un gen implicado en
la conversión del metil-glioxal (propanal) en
lactato tiene por objetivo inhibir la conversión del
metil-glioxal en lactato, de manera que lo esencial
del meti-glioxal presente y producido por la cepa
inicial, tal como por la cepa evolucionada obtenida, sea usado por
la maquinaria celular de dichas cepas para la preparación de
1,2-propanodiol.
Los genes implicados en la conversión del
meti-glioxal en lactato se seleccionan de entre el
gen gloA que codifica para la glioxilasa I (que cataliza la
síntesis de lactoil-glutatión a partir de
metilglioxal) y los genes aldA y aldB que codifican
para una lactaldehído deshidrogenasa (que cataliza la síntesis de
(S)-lactato a partir de
(S)-lactaldehído). Preferentemente, la cepa inicial
comprende la deleción de los tres genes gloA, aldA y
aldB.
De manera ventajosa, se efectúa una modificación
suplementaria de la cepa inicial que consiste en suprimir las vías
naturales de fermentación de la glucosa que son consumidoras de
equivalentes reductores en forma de NADH con el fin de eliminar
estas vías metabólicas que están en competición con la producción de
1,2-propanodiol.
Se citará en particular la deleción del gen
idhA que codifica para la lactato deshidrogenasa que cataliza
la síntesis de lactato a partir de piruvato, y la del gen
adhE que codifica para la alcohol-aldehído
deshidrogenasa que cataliza la síntesis de etanol a partir de
acetil-CoA.
Asimismo, se puede obligar al microorganismo a
usar el complejo piruvato deshidrogenasa para producir, en
anaerobiosis, acetil-CoA y NADH a partir del
piruvato. Esto se puede obtener delecionando los genes pflA
y pflB que codifican para la
piruvato-formato-liasa.
Según un modo particular de realización de la
invención, la cepa inicial comprende por lo tanto asimismo una
deleción de por lo menos un gen seleccionado de entre ldhA,
pflA, pflB y adhE, preferentemente la deleción
de los cuatro genes ldhA, pflA, pflB y
adhE.
De manera todavía más ventajosa, la cepa inicial
según la invención comprenderá asimismo por lo menos un gen que
codifica para una enzima que favorece en anaerobiosis, el
metabolismo del piruvato en acetato.
Preferentemente, la enzima favorece, en
anaerobiosis, el metabolismo del piruvato hacia la producción de
acetil-CoA y de NADH. Más preferentemente, esta
enzima es un complejo piruvato deshidrogenasa.
De manera ventajosa, dicho gen que codifica para
una enzima que favorece, en anaerobiosis, el metabolismo del
piruvato en acetato es poco sensible a la inhibición por NADH.
Este gen puede ser un gen endógeno, que codifica
para una proteína endógena, o también un gen exógeno o heterólogo,
que codifica para una enzima endógena o exógena.
En el caso de un gen endógeno que codifica para
una proteína endógena sensible a la inhibición por NADH, el
procedimiento de evolución según la invención permitirá seleccionar
las cepas con actividad "1,2-propanodiol
sintasa" mejorada cuyo gen que codifica para una enzima que
favorece, en anaerobiosis, el metabolismo de piruvato en acetato
codifica para una enzima evolucionada poco sensibilizada a la
inhibición por el NADH.
Según otro modo de realización de la invención,
se puede introducir en la cepa inicial un gen heterólogo que
codifica para una enzima poco sensible a la inhibición por NADH, o
que codifica para una enzima sensible, pero poco sensibilizada
mediante la realización del procedimiento de evolución según la
invención.
Además, es ventajoso delecionar asimismo el gen
edd que codifica para la
6-fosfo-gluconato deshidratasa,
primera enzima implicada en la vía de Entner Doudoroff, para evitar
la metabolización directa de la glucosa en
gliceraldehído-3-fosfato y piruvato
y forzar así la conversión de la glucosa en
1,2-propanodiol y acetato.
De manera ventajosa, se introduce en la cepa
evolucionada previamente aislada, obtenida mediante el procedimiento
de evolución según la invención, uno o varios genes heterólogos que
codifican para una o varias enzimas implicadas en la conversión del
acetil-CoA y del acetato en acetona, para obtener
una cepa evolucionada modificada.
Esta nueva modificación permite producir con el
1,2-propanodiol, acetona,
co-producto valorizable. Esta modificación tiene
además la ventaja de mejorar los rendimientos de producción en
1,2-propanodiol. En efecto, el acetato es un
compuesto inhibidor del crecimiento bacteriano a baja concentración
(15 g/l) y bloquea rápidamente la evolución de los rendimientos de
la cepa cultivada en quimiostato en condiciones anaerobias.
La introducción en la cepa evolucionada de los
genes que codifican para las enzimas que catalizan la transformación
del acetato en acetona provoca una disminución de la concentración
residual en acetato durante el cultivo en quimiostato. Se produce
acetona, compuesto bastante menos inhibidor del crecimiento que el
acetato, y se favorece el crecimiento de la cepa y la producción de
1,2-propanodiol.
De manera ventajosa, el o los genes heterólogos
que codifican para una o varias enzimas implicadas en la conversión
del acetil-CoA y del acetato proceden de C.
acetobutylicum. Los genes que codifican para una o varias
enzimas implicadas en la conversión del acetil-CoA y
del acetato en acetona se pueden expresar cromosómicamente o
extracromosómicamente. Cromosómicamente, una o varias copias se
pueden introducir en el genoma con la ayuda de los métodos de
recombinación conocidos por el experto en la materia.
Extracromosómicamente, los genes pueden estar contenidos por
diferentes tipos de plásmidos que difieren por su origen de
replicación, su número de copias y su estabilidad en la célula.
Pueden estar presentes de 1 a 5 copias, hasta 20 o hasta más de 500
copias que corresponden a los plásmidos de bajo número de copias con
un origen de replicación de tipo estricto (pSC101, KK2,) a los
plásmidos con bajo número de copias (pACYC, pRSF1010) o con un gran
número de copias (pSK bluescript II). Los genes se pueden expresar
usando unos promotores de diferentes fuerzas, inducibles o no
inducibles. Se pueden citar, por ejemplo, los promotores Ptrc, Ptac,
Plac, u otros promotores conocidos por el experto en la materia. La
expresión de los genes dianas se puede aumentar o disminuir mediante
unos elementos que estabilizan o que desestabilizan el ARN
mensajero (Carrier y Keasling (1998) Biotechnol. Prog., 15,
58-64) o las proteínas (por ejemplo GSTtags,
Amersham Biosciences).
Según un modo preferido de realización de la
invención, se cultiva la cepa evolucionada modificada obtenida
anteriormente a presión de selección en un medio de cultivo
apropiado que comprende una fuente de carbono simple con el fin de
hacer evolucionar en dicha cepa evolucionada modificada uno o varios
genes implicados en la conversión del acetil-CoA y
del acetato en acetona hacia una actividad "acetona sintasa"
mejorada, y después se seleccionan y se aíslan las cepas de
microorganismos evolucionados de segunda generación que tienen una
actividad "1,2-propanodiol sintasa" mejorada y
una actividad "acetona sintasa" mejorada.
La presente invención se refiere asimismo a una
cepa inicial según la invención tal como se ha definido
anteriormente, y se describe a continuación y en los ejemplos, que
comprende asimismo una deleción de los genes aldA y/o
aldB y/o en la que las vías naturales de fermentación de la
glucosa que son consumidores de NADH están suprimidas y/o que
comprende asimismo la deleción de los genes adhE y
ldha y/o en la que el gen lpd que codifica para la
lipoamida deshidrogenasa del complejo piruvato deshidrogenasa
contiene una mutación puntual que provoca una modificación de la
alanina 55 en valina y/o comprende asimismo una deleción de los
genes pflA y pflB y/o del gen
edd.
edd.
La invención se refiere asimismo a una cepa
evolucionada que tiene una actividad
"1,2-propanodiol sintasa" mejorada en la que
el gen lpd contiene una mutación puntual que provoca una
modificación de la alanina 55 en valina, abarcando esta definición
las cepas evolucionadas de segunda generación que tienen además una
actividad "acetona sintasa" mejorada.
La invención se refiere por último a un
procedimiento de preparación de 1,2-propanodiol en
el que se cultiva una cepa evolucionada en la que el gen lpd
contiene una mutación puntual que provoca una modificación de la
alanina 55 en valina en un medio de cultivo apropiado que comprende
una fuente simple de carbono, y se recupera a continuación el
1,2-propanodiol producido y, llegado el caso,
acetona, que son eventualmente purificados.
Las cepas de microorganismos modificados,
iniciales y evolucionados, según la invención pueden ser
procarióticos o eucarióticos, susceptibles de ser transformados y
cultivados para permitir la producción de
1,2-propanodiol y, llegado el caso, de acetona.
El experto en la materia sabrá seleccionar
dichos microorganismos en base a sus conocimientos generales en el
campo de la biología celular y molecular, y, llegado el caso,
identificar los genes de estos microorganismos que corresponden a
los genes de E. coli mencionados anteriormente.
Mediante la expresión "cepa de
microorganismos" se entiende, según la invención, un conjunto de
microorganismos de una misma especie que comprende por lo menos un
microorganismo de dicha especie. Así, las características descritas
para la cepa se aplican a cada uno de los microorganismos de dicha
cepa. Asimismo, las características descritas para uno de los
microorganismos de la cepa se aplicarán al conjunto de dichos
microorganismos que la componen.
Los microorganismos modificados según la
invención se seleccionan de entre las bacterias, las levaduras y
los hongos, y en particular los de las siguientes especies:
Aspergillus sp., Bacillus sp., Brevibacterium sp., Clostridium
sp., Corynebacterium sp., Escherichia sp., Gluconobacter sp.,
Pseudomonas sp., Rhodococcus sp., Saccharomyces sp., Streptomyces
sp., Xanthomonas sp., Candida sp.
En un modo de realización preferido, la cepa
bacteriana es una cepa de Escherichia, en particular de E.
coli. En otro modo de realización, la cepa bacteriana es una
cepa Corynebacterium, y en particular C.
glutamicum.
En otro modo de realización, la cepa de levadura
es una cepa de Saccharomyces, en particular S.
cerevisiae.
La invención se ha descrito anteriormente, y se
describe a continuación y en los ejemplos con relación a E.
coli. Así, los genes susceptibles de ser delecionados o
sobreexpresados para las cepas evolucionadas según la invención se
definen principalmente por el uso de la denominación del gen de
E. coli. Sin embargo, este uso tiene un significado más
general según la invención y abarca los genes correspondientes de
otros microorganismos. En efecto, usando las referencias GenBank de
los genes de E. coli, el experto en la materia es capaz de
determinar los genes equivalentes en otras cepas bacterianas
distintas de E. coli.
Los medios de identificación de las secuencias
homólogas y de sus porcentajes de homología son bien conocidos por
el experto en la materia, y comprenden en particular los programas
BLAST que se pueden usar a partir del sitio
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ con los parámetros indicados por
defecto en este sitio. Las secuencias obtenidas se pueden explotar
entonces (por ejemplo alineadas) usando, por ejemplo, los programas
CLUSTALW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/) o MULTALIN
(http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/cgi-bin/multalin.pl),
con los parámetros indicados por defecto en estos sitios.
Usando las referencias proporcionadas en GenBank
para los genes conocidos, el experto en la materia es capaz de
determinar los genes equivalentes en otros organismos, cepas
bacterianas, levaduras, hongos, mamíferos, plantas, etc. Este
trabajo de rutina se efectúa ventajosamente usando las secuencias de
consenso que se pueden determinar realizando unos alineamientos de
secuencias con unos genes procedentes de otros microorganismos, y
dibujando unas sondas degeneradas que permiten clonar el gen
correspondiente en otro organismo. Estas técnicas de rutina de
biología molecular son bien conocidas en la técnica y se describen,
por ejemplo, en Sambrook et al. (1989 Molecular cloning: a
laboratory manual. 2ª Ed. Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring
Harbor, Nueva
York.).
York.).
Por "deleción" se entiende, según la
invención, una supresión de la actividad del gen "delecionado".
Esta supresión puede ser una desactivación del producto de
expresión del gen en cuestión mediante un medio apropiado, o bien
la inhibición de la expresión del gen en cuestión, o también la
deleción de por lo menos una parte del gen en cuestión de manera, o
bien que su expresión no tenga lugar (por ejemplo deleción de una
parte o del conjunto de la región promotora necesaria para su
expresión), o bien que el producto de expresión haya perdido su
función (por ejemplo deleción en la parte que codifica para del gen
en cuestión). De manera preferida, la deleción de un gen comprende
la supresión de lo esencial de dicho gen, y, llegado el caso, de su
sustitución por un gen marcador de selección que permite facilitar
la identificación, el aislamiento y la purificación de las cepas
evolucionadas según la
invención.
invención.
La desactivación de un gen se realiza
preferentemente mediante recombinación homóloga. (Datsenko, K.A.;
Wanner, B.L. (2000) One-step inactivation of
chromosomal genes in Escherichia coli K-12
using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:
6640-6645). Se recuerda brevemente el principio de
un protocolo: un fragmento de ADN lineal se introduce en la célula,
fragmento que se obtiene in vitro, que comprende las dos
regiones que flanquean el gen, y por lo menos un gen de selección
entre estas dos regiones (generalmente un gen de resistencia a un
antibiótico), presentando por lo tanto dicho fragmento lineal un gen
desactivado. Las células que han sufrido un acontecimiento de
recombinación y que han integrado el fragmento introducido se
seleccionan mediante esparcido en medio selectivo. Se seleccionan a
continuación las células que han sufrido un acontecimiento de doble
recombinación, en las que el gen nativo ha sido sustituido por el
gen desactivado. Este protocolo se puede mejorar usando unos
sistemas de selecciones positiva y negativa, con el fin de acelerar
la detección de los acontecimientos de doble
recombinación.
recombinación.
La técnica usada preferentemente para la
introducción de estos genes en la cepa es la electroporación,
técnica bien conocida por el experto en la materia. Se recuerda
brevemente el protocolo: los genes heterólogos de interés se clonan
en un vector de expresión entre un promotor y un terminador. Este
vector posee además un gen de resistencia a un antibiótico con el
fin de seleccionar las células que lo contienen y un origen de
replicación funcional en la cepa hospedante a fin de que pueda
mantenerse. El protocolo necesita la preparación de células
hospedantes electrocompetentes que son transformadas a continuación
mediante electroporación por el vector.
Según la invención, los genes introducidos por
electroporación son preferentemente los genes adc,
ctfA y B, thl que codifican respectivamente
para la acetoacetato carboxilasa, la coenzima A transferasa y la
tiolasa de la vía natural de producción de acetona de Clostridium
acetobutylicum, microorganismo reconocido como extremadamente
competente para la producción de acetona por vía biológica.
El procedimiento de evolución según la invención
es un procedimiento de preparación de microorganismos evolucionados
que permite una modificación de las vías metabólicas, que comprende
preferentemente las siguientes
etapas:
etapas:
- a)
- Modificar un microorganismo para obtener un microorganismo inicial de manera que se inhibe la producción o el consumo de un metabolito consumido de otra forma, o producido cuando las células del microorganismo inicial se cultivan en un medio definido,
- b)
- Cultivar los microorganismos iniciales modificados anteriormente obtenidos en dicho medio definido para hacerlo evolucionar, pudiendo el medio definido comprender asimismo un co-sustrato necesario para esta evolución,
- c)
- Seleccionar las células de microorganismos modificados capaces desarrollarse en el medio definido, eventualmente con un co-sustrato.
\vskip1.000000\baselineskip
Dicho procedimiento de evolución se describe en
particular en la solicitud de patente WO 04/076659.
En este caso, la vía metabólica evolucionada es
la vía de biosíntesis del 1,2-propanodiol, y,
llegado el caso, la vía de biosíntesis de la acetona.
Mediante la expresión "medio definido" se
entiende según la invención un medio de composición molecular
conocido, adaptado al crecimiento del microorganismo. El medio
definido está sustancialmente exento de metabolito cuya producción
o cuyo consumo se suprimen realizando la modificación.
Por el término
"co-sustrato" se entiende, según la invención,
una molécula carbonada o no, diferente del sustrato, que está
implicada en una reacción y que proporciona uno o varios átomos al
sustrato con el fin de formar el producto. El
co-sustrato no tiene ninguna propiedad de
mutagénesis reconocida.
Por el término "selección" se entiende,
según la invención, un procedimiento de cultivo eventualmente en
continuo, llevado a cabo aplicando unos índices de dilución
crecientes de tal forma que se conserva en el medio de cultivo sólo
los microorganismos que tienen un índice de crecimiento igual o
superior al índice de dilución impuesto. Así, se conservan los
microorganismos que han evolucionado de tal forma que la
modificación realizada ya no afecta al
crecimiento.
crecimiento.
Mediante la expresión "gen evolucionado" se
entiende, según la invención, una sucesión de ácido nucleico
delimitado por un codón start y un codón stop en fase y que tiene,
al final de la selección, por lo menos un ácido nucleico diferente
con relación a la secuencia inicial.
Mediante la expresión "proteína
evolucionada" se entiende, según la invención, una sucesión de
aminoácidos (secuencia proteica) que tiene, al final de la
selección, por lo menos un aminoácido diferente con relación a la
secuencia proteica inicial.
Los genes y las proteínas se pueden identificar
por sus secuencias primarias, pero asimismo por homologías de
secuencias o alineaciones que definen unos grupos de proteínas.
Los PFAM (Protein families database of
alignments and Hidden Markov Models; http://www.sanger.ac.uk/
Software/Pfam) representan una amplia colección de alineamientos de secuencias proteicas. Cada PFAM permite visualizar unos alineamientos múltiples, observar unos dominios proteicos, evaluar la repartición entre los organismos, tener acceso a otras bases de datos, visualizar unas estructuras conocidas de proteínas.
Software/Pfam) representan una amplia colección de alineamientos de secuencias proteicas. Cada PFAM permite visualizar unos alineamientos múltiples, observar unos dominios proteicos, evaluar la repartición entre los organismos, tener acceso a otras bases de datos, visualizar unas estructuras conocidas de proteínas.
Los COG (Clusters of Orthologous Groups of
proteins; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/) se obtienen comparando
las secuencias proteicas procedentes de 43 genomas completamente
secuenciados que representan 30 líneas filogenéticas principales.
Cada COG se define a partir de por lo menos tres líneas, lo que
permite así identificar unos antiguos dominios conservados.
Según la invención, los términos "cultivo"
y "fermentación" se usan indiferentemente para designar el
crecimiento de la bacteria en un medio de cultivo apropiado que
comprende una fuente de carbono simple.
Mediante la expresión "fuente de carbono
simple", según la presente invención, se entiende unas fuentes de
carbono que pueden ser utilizadas por el experto en la materia para
el crecimiento normal de un microorganismo, de una bacteria en
particular, que puede ser la arabinosa, la fructosa, la galactosa,
la lactosa, la maltosa, la sacarosa y la xilosa. Una fuente de
carbono simple muy particularmente preferida es la glucosa.
La definición de las condiciones de cultivo de
los microorganismos según la invención (fermentación) está al
alcance del experto en la materia. Se fermentan en particular las
bacterias a una temperatura comprendida entre 20ºC y 55ºC,
preferentemente entre 25ºC y 40ºC, más particularmente de
aproximadamente 30ºC para C. glutamicum y S.
cerevisiae, y de aproximadamente 34ºC para E. coli.
Se lleva a cabo generalmente la fermentación en
fermentadores con un medio mineral de cultivo de composición
conocido definido y adaptado en función de las bacterias usadas, que
contiene por lo menos una fuente de carbono simple y, llegado el
caso, un co-factor necesario para la producción del
metabolito.
En particular, el medio mineral de cultivo para
E. coli podrá ser así de composición idéntica o similar a un
medio M9 (Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad. Sci: USA
32:120-128), un medio M63 (Miller, 1992; A Short
Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for
Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York) o un medio tal
como el definido por Schaefer et al. (1999, Anal.
Biochem. 270: 88-96), más particularmente el
medio de cultivo mínimo descrito a continuación:
- El pH del medio se ajusta a 7,4 con sosa.
- \text{*}
- Disolución de oligoelemento: Ácido cítrico a 4 g/l, MnSO_{4} a 3 g/l, NaCl a 1 g/l, CoCl_{2} a 0,1 g/l, ZnSO_{4} a 0,10 g/l, CuSO_{4} a 10 m g/l, H_{3}BO_{3} a 10 m g/l, NaMoO_{4} a 10 m g/l.
\vskip1.000000\baselineskip
De manera análoga, el medio mineral de cultivo
para C. glutamicum podrá así ser de composición idéntica o
similar al medio BMCG (Liebl et al., 1989, Appl.
Microbiol. Biotechnol. 32: 205-210) a un medio
tal como el definido por Riedel et al. (2001, J. Mol.
Microbiol. Biotechnol. 3: 573-583).
La fermentación se realiza preferentemente en
anaerobiosis y en quimiostato, es decir, alimentada en continuo,
con un índice de dilución fijo, con dicho medio de cultivo mínimo
que contiene una concentración en fuente de carbono fijo y siendo
desgasificado con nitrógeno.
La concentración en fuente de carbono del medio
de alimentación de la fermentación se aumenta sólo cuando se
alcanza un régimen permanente limitado por la concentración en
fuente de carbono residual y es estable durante varios días.
El modo de cultivo en quimiostato es el modo de
cultivo preferido puesto que es el que favorece la mejora de los
rendimientos de crecimiento y de producción en
1,2-propanodiol de la cepa modificada y conduce a
aislar los microorganismos evolucionados.
Mediante la expresión "actividad
``1,2-propanodiol sintasa'' mejorada" se
entiende, según la invención, el conjunto de las actividades
enzimáticas mejoradas implicadas en la vía de conversión del DHAP en
1,2-propanodiol. La actividad enzimática mejorada
en el microorganismo evolucionado consiste en un aumento de la
cantidad de 1,2-propanodiol por el microorganismo
evolucionado con relación a las cantidades producidas por el
microorganismo inicial correspondiente, en unas condiciones de
cultivo idénticas.
Mediante la expresión "actividad ``acetona
sintasa'' mejorada" se entiende, según la invención, el conjunto
de las actividades enzimáticas mejoradas implicadas en la vía de
conversión del acetato y del acetil-CoA en acetona.
La actividad enzimática evolucionada en el microorganismo
evolucionado de segunda generación consiste en un aumento de la
cantidad de acetona producida por el microorganismo evolucionado de
segunda generación con relación al microorganismo evolucionado
transformado correspondiente, en unas condiciones de cultivo
idénticas.
La invención se refiere asimismo al aislamiento
y a la caracterización de los genes evolucionados en las cepas
evolucionadas obtenidas mediante el procedimiento según la
invención, y de las proteínas evolucionadas codificadas por dichos
genes evolucionados. Estos genes evolucionados se pueden introducir
a continuación en un organismo hospedante bajo el control de
elementos de regulación apropiados para su expresión en dicho
organismo con el fin de permitir la producción de la proteína
evolucionada correspondiente.
La mejora de los rendimientos de los
microorganismos modificados, en particular de la cepa E. coli
MG16555 \DeltatpiA, \DeltapflAB, \DeltaadhE,
ldhA::kana, \DeltagloA, \DeltaaldA,
\DeltaaldB durante el cultivo en quimiostato sugiere que
estas condiciones de cultivo permiten seleccionar un complejo
piruvato deshidrogenasa endógeno funcional en condiciones de
anaerobiosis, condiciones de fuertes producciones de NADH. En
efecto, se sabe que el complejo piruvato deshidrogenasa que cataliza
la transformación del piruvato en acetil-CoA
liberando NADH es funcional sólo en aerobia, mientras que cuando se
está en condición de anaerobiosis es la piruvato formato liasa la
que es funcional y la que cataliza la transformación del piruvato
en acetil-CoA y formato (Snoep J. L., De Graef M.
R., Westphal A. H., De Kok A. Teixeira de Mattos M. J. y Neijssel
O. M. (1993). Ahora bien, una de las modificaciones efectuadas en la
cepa modificada de E. coli construida para la producción de
1,2-propanodiol para producir un NADH mediante
descarboxilación del piruvato, es la deleción de los genes
pflA y pflB que codifican para la actividad piruvato
formato liasa. La única posibilidad para la célula modificada es
metabolizar el piruvato en acetil-CoA mediante el
complejo piruvato deshidrogenasa produciendo un NADH. El complejo
piruvato deshidrogenasa de la cepa modificada evolucionada ha sido
caracterizado y es menos sensible al NADH que el complejo piruvato
deshidrogenasa de la cepa
salvaje.
salvaje.
La presente invención conduce a la selección de
un complejo piruvato deshidrogenasa funcional en anaerobiosis que
permite producir dos NADH mediante oxidación del
gliceraldehído-3-fosfato en acetato,
NADH que se pueden volver a oxidar sólo por vía de reducción del
dihidroxiacetona-fosfato en
1,2-propanodiol. La selección de un complejo
enzimático poco sensible el NADH favorece la velocidad de producción
del 1,2-propanodiol.
La presente invención conduce ventajosamente a
la selección de mutaciones del gen lpd (cuya secuencia
salvaje es conocida http://genolist.pasteur.fr/Colibri) que codifica
para la lipoamida deshidrogenasa del complejo piruvato
deshidrogenasa. En particular, se ha identificado la presencia de
una mutación puntual que provoca la sustitución de la alanina 55
por una valina. Esta enzima es conocida por ser responsable de la
inhibición del complejo piruvato deshidrogenasa por el NADH. Esta
enzima modificada forma asimismo parte de la presente inven-
ción.
ción.
La presente invención permite la mejora de los
rendimientos de los microorganismos modificados, en particular de
la cepa E. coli MG1655 \DeltatpiA,
\DeltapflAB, \DeltaadhE, ldhA::kana,
\DeltagloA, \DeltaaldA, \DeltaaldB
asimismo, por evolución, a lo largo del cultivo anaeróbico en
quimiostato, de las enzimas endógenas implicadas en la vía de
conversión del DHAP en 1,2-propanodiol. La evolución
de estas enzimas tiene como consecuencia un aumento del porcentaje
de crecimiento y de la concentración final en
1,2-propanodiol.
De manera preferida según la invención, la cepa
evolucionada no comprende ninguna evolución del gen gldA.
Según un modo particular, la cepa de evolución comprende una
deleción del gen gldA.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 1: Esquema del metabolismo de la cepa
modificada E. coli para la producción de
1,2-propanodiol y de acetona según la
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
LDH: lactato deshidrogenasa
ADH: aldehído-alcohol
deshidrogenasa
PFL: piruvato formato liasa
PDHc: complejo piruvato deshidrogenasa
Figura 2: Evolución de la cepa E. coli
MG1655 \DeltatpiA, \DeltapflAB,
\DeltaadhE, ldhA::kana, \DeltagloA,
\DeltaaldA, \DeltaaldB en cultivo quimiostato
sobre glucosa: concentración de glucosa (figura 2A) y otros
productos (figura 2B).
Figura 3: Comparación de la actividad enzimática
del complejo piruvato deshidrogenasa de la cepa salvaje y de la
cepa evolucionada según la invención en función de concentraciones
crecientes en NADH.
Los ejemplos de realización siguientes permiten
ilustrar la invención, sin limitar por ello su alcance.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
La desactivación del gen tpiA se realiza
insertando un casete de resistencia al antibiótico cloramfenicol
delecionando al mismo tiempo la mayor parte del gen en cuestión. La
técnica usada se describe por Datsenko, K.A.; Wanner, B.L. (2000)
One-step inactivation of chromosomal genes in
Escherichia coli K-12 using PCR products.
Proc. Natl Acad. Sci. USA 97: 6640-6645.
\newpage
Se usan dos oligonucleótidos para realizar la
sustitución del gen tpiA:
\vskip1.000000\baselineskip
DtpiAr de 100 bases (SEC ID nº 1):
atgcgacatcctttagtgatgggtaactggaaactgaacggcagccgccacatggttcacgagctggtttctaacctgcgtaCATATGAATATCCTCCT
TAG
TAG
con:
una región (caracteres en minúscula) homóloga a
la secuencia (4109007-4109087) del gen tpiA
(secuencia 4108320 a 4109087), secuencia de referencia en el sitio
http://genolist.pasteur.fr/Colibri/)
una región (caracteres en mayúscula) para la
amplificación del casete de resistencia al cloramfenicol del
plásmido pKD3 (Datsenko, K.A.; Wanner, B.L. (2000)
One-step inactivation of chromosomal genes in
Escherichia coli K-12 using PCR products.
Proc. Natl. Acad. Sci USA 97: 6640-6645).
\vskip1.000000\baselineskip
DtpiAf de 100 bases (SEC ID nº 2):
cttaagcctgtttagccgcttctgcagctttaacgattactgcgaaggcgtcagctttcagagaagcaccaccaaccagcTGTAGGCTGGAGCTGCTT
CG
CG
con:
una región (caracteres en minúscula) homóloga a
la secuencia (4108320-4108400) del gen
tpiA
una región (caracteres en mayúscula) para la
amplificación del casete de resistencia al cloramfenicol contenido
por el plásmido pKD3.
\vskip1.000000\baselineskip
Los oligonucleótidos DtpiAr y DtpiAf se usan
para amplificar el casete de resistencia al cloramfenicol a partir
del plásmido pKD3. El producto PCR obtenido se introduce entonces
mediante electroporación en la cepa MG1655 (pKD46) en la que el
sistema \lambda Red (\gamma, \beta, exo) expresado favorece en
gran medida la recombinación homóloga. Los transformantes
resistentes al antibiótico se seleccionan entonces y la inserción
del casete de resistencia se verifica mediante un análisis PCR con
los oligonucleótidos cdh y YIIQ.
\vskip1.000000\baselineskip
cdh (SEC ID nº 3):
ggtgatgatagttatcgccg (homóloga a la secuencia de
4107536 a 4107555)
\vskip1.000000\baselineskip
YIIQ (SEC ID nº 4):
cgtgccatcgacagcagtcc (homóloga a la secuencia de
4109599 a 4109580)
El casete de resistencia al cloramfenicol se
elimina a continuación. El plásmido pCP20 portador de la recombinasa
FLP que actúa a nivel de los sitios FRT del casete de resistencia
al cloramfenicol, se introduce entonces en las cepas recombinantes
mediante electroporación (Cheperanov P. P. y Wackernagel W. (1995)
Gene disruption in Escherichia coli: Tc^{R} and Km^{R}
cassettes with option of Flp-catalyzed excision of
the antibiotic-resistance determinant, gene, 158,
9-14). Después de una serie de cultivo a 42ºC, la
pérdida del casete de resistencia al antibiótico se verifica
mediante un análisis PCR con los mismos oligonucleótidos que los
usados anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
La desactivación de los genes plfA y
plfB se realiza insertando un casete de resistencia al
antibiótico cloramfenicol delecionando al mismo tiempo la mayor
parte de los genes en cuestión. La técnica usada se describe por
Datsenko, K.A. y Wanner, B.L. (2000).
Se usan dos oligonucleótidos para realizar la
sustitución de los genes pflA y pflB:
\vskip1.000000\baselineskip
DplfB r de 100 bases (SEC ID nº 5):
ccggacatcctgcgttgccgtaaatctggtgttctgaccggtctgccagatgcatatggccgtggccgtatcatcggtgaCATATGAATATCCTCCTT
AG
AG
con:
una región (caracteres en minúscula) homóloga a
la secuencia (952235-952315) del gen plfB
(secuencia 950495 a 952777), secuencia de referencia en el sitio
http://genolist.pasteur.fr/Colibri/)
una región (caracteres en mayúscula) para la
amplificación del casete de resistencia al cloramfenicol del
plásmido pKD3 (Datsenko, K.A.; Wanner, B.L. (2000)
One-step inactivation of chromosomal genes in
Escherichia coli K-12 using PCR products.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:
6640-6645).
\vskip1.000000\baselineskip
DplfAf de 100 bases (SEC ID nº 6):
gatgcactataagatgtgttaaaaacgctgtagcagaatgaagcgcggaataaaaaagcggcaactcaataaagttgccgCTGGAGCTGCTTCG
con:
una región (caracteres en minúscula) homóloga a
la secuencia (949470-949550) situada corriente
arriba del gen pflA (secuencia de 949563 a 950303)
una región (caracteres en mayúscula) para la
amplificación del casete de resistencia al cloramfenicol contenido
por el plásmido pKD3.
\vskip1.000000\baselineskip
Los oligonucleótidos pflAB1 y pflAB2 se usan
para amplificar el casete de resistencia al cloramfenicol a partir
del plásmido pKD3. El producto PCR obtenido se introduce entonces
mediante electroporación en la cepa MG1655 (pKD46) en la que la
enzima Red recombinasa expresada permite la recombinación homóloga.
Los transformantes resistentes al antibiótico se seleccionan
entonces y la inserción del casete de resistencia se verifica
mediante un análisis PCR con los oligonucleótidos pflAB1 y
pflAB2.
\vskip1.000000\baselineskip
pflAB 1 (SEC ID nº 7):
agacattaaaaatatacgtgcagctacccg (homóloga a la
secuencia de 948462 a 948491)
\vskip1.000000\baselineskip
pflAB 2 (SEC ID nº 8):
gtgaaagctgacaacccttttgatctttta (homóloga a la
secuencia de 953660 a 983689)
\vskip1.000000\baselineskip
La deleción de los genes pflA y
pflb mediante sustitución de los genes por un casete de
resistencia al cloramfenicol en la cepa MG1655 \DeltatpiA
se ha realizado mediante la técnica de transducción con el fago P1.
El protocolo está constituido por dos etapas, por un lado la
preparación del lisado de fago en la cepa MG1655
\DeltaplfAB::cm y, por otro lado, la transducción de la
cepa MG1655 \DeltatpiA por este lisado de fago.
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- inoculación por 100 \mul de un cultivo de noche de la cepa MG1655 (\DeltaplfAB::cm) de 10 ml de LB + Cm 30 \mug/ml + glucosa 0,2% + CaCl_{2} 5 mM
- -
- incubación durante 30 min. a 37ºC bajo agitación
- -
- adición de 100 \mul de lisado de fago P1 preparado en la cepa salvaje MG1655 (aproximadamente 1.10^{9} fago/ml)
- -
- agitación a 37ºC durante 3 horas hasta la lisis total de las células
- -
- adición de 200 \mul de cloroformo y vortex
- -
- centrifugación durante 10 min. a 4.500 g para eliminar los restos celulares
- -
- transferencia del sobrenadante a un tubo estéril y adición de 200 \mul de cloroformo
- -
- conservación del lisado a 4ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- centrifugación durante 10 min. a 1.500 g de 5 ml de un cultivo de noche de la cepa MG1566 (\DeltatpiA) en medio LB
- -
- suspensión del residuo celular en 2,5 ml de MgSO_{4} 10 mM, CaCl_{2} 5 mM
- -
- tubos de control: 100 \mul células 100 \mul fagos P1 de la cepa MG1655 (\DeltapflAB::cm)
- -
- tubo de ensayo: 100 \mul de células + 100 \mul de fagos P1 de la cepa MG1655 (\DeltapflAB::cm)
- -
- incubación durante 30 min. a 30ºC sin agitación
- -
- adición de 100 \mul de citrato de sodio 1M en cada tubo y después vortex
- -
- adición de 1 ml de LB
- -
- incubación durante 1 hora a 37ºC bajo agitación
- -
- esparcido sobre unas cajas LB + Cm 30 \mug/ml después de una centrifugación durante 3 min. a 7.000 rpm de los tubos
- -
- incubación a 37ºC hasta el día siguiente.
\vskip1.000000\baselineskip
Los transformantes resistentes al antibiótico se
seleccionan entonces y la inserción de la región que contiene
(pflAB::cm) se verifica mediante un análisis PCR con los
oligonucleótidos pflAB1 y pflAB2 por un lado, y cdh y YIIQ por otro
lado, con el fin de verificar asimismo la deleción del gen
tpiA en la cepa \DeltapflAB::cm. La cepa
considerada se denomina MG1655 \Delta(pflAB::cm,
\DeltatpiA).
Tal como anteriormente, el casete de resistencia
al cloramfenicol se elimina a continuación. El plásmido pCP20
portador de la recombinasa FLP que actúa a nivel de los sitios FRT
del casete de resistencia al cloramfenicol se introduce entonces en
las cepas recombinantes mediante electroporación. Después de una
serie de cultivo a 42ºC, la pérdida del casete de resistencia al
antibiótico se verifica mediante un análisis PCR con los mismos
oligonucleótidos que los usados anteriormente. La cepa obtenida se
denomina MG16555 \DeltatpiA, \DeltapflAB.
\vskip1.000000\baselineskip
Tal como anteriormente, la desactivación del gen
adhE se realiza insertando un casete de resistencia al
antibiótico cloramfenicol delecionando al mismo tiempo la mayor
parte del gen en cuestión mediante la técnica descrita por
Datsenko, K.A. y Wanner, B.L. (2000).
Se usan dos oligonucleótidos para realizar la
deleción:
\vskip1.000000\baselineskip
DadhE r de 100 bases (SEC ID nº 9):
atggctgttactaatgtcgctgaacttaacgcactcgtagagcgtgtaaaaaaagcccagcgtgaatatgccagtttcactCATATGAATATCCTCCTT
AG
AG
con:
una región (caracteres en minúscula) homóloga a
la secuencia (1297263-1297343) del gen adhE
(secuencia
1294669 a 1297344), secuencia de referencia en el sitio http://genolist.pasteur.fr/Colibri/)
1294669 a 1297344), secuencia de referencia en el sitio http://genolist.pasteur.fr/Colibri/)
una región (caracteres en mayúscula) para la
amplificación del casete de resistencia al cloramfenicol del
plásmido pKD3 (Datsenko, K.A. y Wanner, B.L. (2000).
\vskip1.000000\baselineskip
DadhEf de 100 bases (SEC ID nº 10):
caataacgaatgatagcaattttaagtagttaggaggtgaaaaatgctgtcaaaaggcgtattgtcagcgcgtcttttcaTGTAGGCTGGAGCTGCTT
CG
CG
\newpage
con:
una región (caracteres en minúscula) homóloga a
la secuencia (1294694-1294774) del gen
adhE
una región (caracteres en mayúscula) para la
amplificación del casete de resistencia al cloramfenicol portado
por el plásmido pKD3.
\vskip1.000000\baselineskip
Los oligonucleótidos DadhEr y DadhEf se usan
para amplificar el casete de resistencia al cloramfenicol a partir
del plásmido pKD3. El producto PCR obtenido se introduce entonces
mediante electroporación en la cepa MG1655 (pKD46) en la que la
enzima Red recombinasa expresada permite la recombinación homóloga.
Los transformantes resistentes al antibiótico se seleccionan
entonces y la inserción del casete de resistencia se verifica
mediante un análisis PCR con los oligonucleótidos ychGf y
adhECr.
\vskip1.000000\baselineskip
ychGf (SEC ID nº 11):
ggctcattgcaccaccatccag (homóloga a la secuencia
de 1294357 a 1294378)
\vskip1.000000\baselineskip
adhECr (SEC ID nº 12):
gaaaagacgcgctgacaatacgcc (homóloga a la
secuencia de 1297772 a 1297749)
\vskip1.000000\baselineskip
La deleción del gen adhE en la cepa
MG1655 \DeltatpiA, \DeltapflAB se efectúa como
anteriormente con la ayuda de la técnica de transducción con la
ayuda de fago P1 (véase el protocolo en c)). El lisado de fago P1
se efectúa sobre la cepa MG1655 \DeltaadhE::cm, y la
transducción de la cepa MG1655 \DeltatpiA,
\DeltapflAB se realiza con la ayuda de este lisado. Los
transductantes resistentes al cloramfenicol se controlan con la
ayuda de los oligonucleótidos ychCf y adhECr para verificar la
mutación del gen adhE y también con la ayuda de los
oligonucleótidos pflAB1 y pflAB2 por un lado, y cdh y YIIQ por otro
lado, con el fin de verificar asimismo la deleción de los genes
pflA y B, y tpiA en la cepa
\DeltaadhE:: cm.
Tal como anteriormente, el casete de resistencia
al cloramfenicol se elimina a continuación. El plásmido pCP20
portador de la recombinasa FLP que actúa a nivel de los sitios FRT
del casete de resistencia al cloramfenicol se introduce entonces en
las cepas recombinantes por electroporación. Después de una serie de
cultivo a 42ºC, la pérdida del casete de resistencia al antibiótico
se verifica mediante un análisis PCR con los mismos oligonucleótidos
que los usados anteriormente. La cepa obtenida se denomina MG16555
\DeltatpiA, \DeltapflAB, \DeltaadhE.
\vskip1.000000\baselineskip
La desactivación del gen ldhA
(coordenadas 1439878 a 1440867) en la cepa MG1655
\DeltatpiA, \DeltapflAB, \DeltaadhE se
ha realizado como anteriormente con la ayuda de la técnica del fago
P1 (véase el protocolo en c)). El lisado de fago se realiza con la
cepa E. coli K12 NZN11 \Deltaplf::cam, IdhA::kana
suministrada por Clark D.P. (Bunch P. K., Mat-Jan
F. y Clark D. P. (1997) The ldhA gene encoding the
fermentative lactate dehydrogenase of Escherichia coli:
microlbiology, 143, 187-195.). La transducción de la
cepa MG1655 \DeltatpiA, \DeltapflAB,
\DeltaadhE se realiza con la ayuda del lisado de fago de la
cepa E. coli K12 NZN11 \Deltaplf::cam, IdhA::kana.
Los transductantes se seleccionan sobre kanamicina y la inserción
del casete kanamicina en el gen IdhA se verifica con la
ayuda de los oligonucleótidos hsIJC y
IdhAC2.
IdhAC2.
\vskip1.000000\baselineskip
hsIJC (SEC ID nº 13):
gccatcagcaggcttagccg (homóloga a la secuencia
1439345 a 1439767)
\vskip1.000000\baselineskip
IdhAC2: (SEC ID nº 14):
gggtattgtggcatgtttaaccg (homóloga a la secuencia
1441007 a 1441029)
La cepa obtenida se denomina MG1655
\DeltatpiA, \DeltapflAB, \DeltaadhE,
IdhA::kana
\newpage
La desactivación del gen gloA se realiza
como anteriormente insertando un casete de resistencia al
antibiótico cloramfenicol delecionando al mismo tiempo la mayor
parte de los genes en cuestión mediante la técnica descrita por
Datsenko, K.A. y Wanner, B.L. (2000).
Se usan dos oligonucleótidos para realizar la
deleción:
\vskip1.000000\baselineskip
GLOAD f de 100 bases (SEC ID nº 15)
atgcgtcttcttcataccatgctgcgcgttggcgatttgcaacgctccatcgatttttataccaaagtgctgggcatgaaGTGTAGGCTGGAGCTGCTT
CG
CG
con:
una región (caracteres en minúscula) homóloga a
la secuencia (1725861-1725941) del gen gloA
(secuencia 1725861 a 1726268), secuencia de referencia en el sitio
http://genolist.pasteur.fr/Colibri/)
una región (caracteres en mayúscula) para la
amplificación del casete de resistencia al cloramfenicol del
plásmido pKD3 (Datsenko, K.A. y Wanner, B.L. (2000).
\vskip1.000000\baselineskip
GLOA D R (SEC ID nº 16)
ttagttgcccagaccgcgaccggcgtcttftctcttcgattaactcaattttgtaaccgtccggatcttccacaaacgcgaCATATGAATATCCTCCTTAG
una región (caracteres en minúscula) homóloga a
la secuencia (1726188-1726268) del gen gloA
(1725861-
1726268)
1726268)
una región (caracteres en minúscula) para la
amplificación del casete de resistencia al cloramfenicol contenida
por el plásmido pKD3.
\vskip1.000000\baselineskip
Los oligonucleótidos GLOADr y GLOADf se usan
para amplificar el casete de resistencia al cloramfenicol a partir
del plásmido pKD3. El producto de PCR obtenido se introduce entonces
mediante electroporación en la cepa MG1655 (pKD46) en la que la
enzima Red recombinasa expresada permite la recombinación homóloga.
Los transformantes resistentes al antibiótico se seleccionan
entonces y la inserción del casete de resistencia se verifica
mediante un análisis PCr con los oligonucleótidos Nem A C d y Rnt C
r.
\vskip1.000000\baselineskip
NemAQd (SEC ID nº 17):
gaagtggtcgatgccgggattgaagaatggg (homóloga de
1725331 a 1725361)
\vskip1.000000\baselineskip
Rnt Cr (SEC ID nº 18):
gggttacgtttcagtgaggcgcgttctgcgg (homóloga a la
secuencia de 1726765 a 1726795)
\vskip1.000000\baselineskip
La desactivación del gen gloA en la cepa
MG1655 \DeltatpiA, \DeltapflAB, \DeltaadhE, IdhA::kana,
se ha realizado como anteriormente con la ayuda de la técnica del
fago P1 (véase el protocolo en c)). El lisado de fago P1 se ha
efectuado sobre la cepa MG1655 \DeltagloA::cm, y la
transducción de la cepa MG1655 \DeltatpiA, \DeltapflAB,
\DeltaadhE, IdhA::kana, se ha realizado con la ayuda de este
lisado. Los transductantes resistentes al cloramfenicol se
controlan con la ayuda de los oligonucleótidos NemAQd y Rnt Cr para
verificar la mutación del gen gloA y también con la ayuda de
los oligonucleótidos pflAB1 y pflAB2, cdh y YIIQ, ychCf y adhECr,
hslJC y ldhAC2, con el fin de verificar asimismo respectivamente la
deleción de los genes pflA y B, tpiA,
adhE, y ldhA en la cepa \DeltagloA::cm.
Tal como anteriormente, el casete de resistencia
al cloramfenicol se elimina a continuación. El plásmido pCP20
portador de la recombinasa FLP que actúa a nivel de los sitios FRT
del casete de resistencia al cloramfenicol, se introduce entonces
en las cepas recombinantes mediante electroporación. Después de una
serie de cultivo a 42ºC, la pérdida del casete de resistencia al
antibiótico se verifica mediante un análisis PCR con los mismos
oligonucleótidos que los usados anteriormente. La cepa obtenida se
denomina MG16555 \DeltatpiA, \DeltapflAB,
\DeltaadhE, IdhA::kana, \DeltagloA.
\vskip1.000000\baselineskip
La desactivación del gen aldA se realiza
como anteriormente insertando un casete de resistencia al
antibiótico cloramfenicol delecionando al mismo tiempo la mayor
parte de los genes en cuestión mediante la técnica descrita por
Datsenko, K.A. y Wanner, B.L. (2000).
Se usan dos oligonucleótidos para realizar la
deleción:
\vskip1.000000\baselineskip
AldA D f de 100 bases (SEC ID nº 19)
atgtcagtacccgttcaacatcctatgtatatcgatggacagtttgttacctggcgtggagacgcatggattgatgtggtaGTGTAGGCTGGAGCTGCT
TCG
TCG
con:
una región (caracteres en minúscula) homóloga a
la secuencia (1486256-1486336) del gen aldA
(secuencia 1486256 a 1487695), secuencia de referencia en el sitio
http://genolist.pasteur.fr/Colibri/)
una región (caracteres en mayúscula) para la
amplificación del casete de resistencia al cloramfenicol del
plásmido pKD3 (Datsenko, K.A. y Wanner, B.L. (2000).
\vskip1.000000\baselineskip
aldAD r de 100 bases (SEC ID nº 20):
ttaagactgtaaataaaccacctgggtctgcagatattcatgcaagccatgtttaccatctgcgccgccaataccggatttCATATGAATATCCTCCTTA
G
G
una región (caracteres en minúscula) homóloga a
la secuencia (1487615-1487695) del gen aldA
(1486256 a 1487695).
una región (caracteres en mayúscula) para la
amplificación del casete de resistencia al cloramfenicol portada
por el plásmido pKD3
\vskip1.000000\baselineskip
Los oligonucleótidos AldA D r y aldAD f se usan
para amplificar el casete de resistencia al cloramfenicol a partir
del plásmido pKD3. El producto PCR obtenido se introduce entonces
mediante electroporación en la cepa MG1655 (pKD46) en la que la
enzima Red recombinasa expresada permite la recombinación homóloga.
Los transformantes resistentes al antibiótico se seleccionan
entonces y la inserción del casete de resistencia se verifica
mediante un análisis PCR con los oligonucleótidos Ydc F C f y
gapCCr.
\vskip1.000000\baselineskip
Ydc F C f (SEC ID nº 21):
tgcagcggcgcacgatggcgacgttccgccg (homóloga de
1485722 a 1485752)
\vskip1.000000\baselineskip
gapCCr (SEC ID nº 22):
cacgatgacgaccattcatgcctatactggc (homóloga a la
secuencia de 1488195 a 1488225)
\vskip1.000000\baselineskip
La desactivación del gen aldA en la cepa
MG1655 \DeltatpiA, \DeltapflAB,
\DeltaadhE, IdhA::kana, \DeltagloA se ha
realizado como anteriormente con la ayuda de la técnica del fago P1
(véase el protocolo en c)). El lisado de fago P1 se efectúa en la
cepa MG1655 \DeltaaldA::cm, y la transducción de la
cepa MG1655 \DeltatpiA, \DeltapflAB,
\DeltaadhE, IdhA::kana, \DeltagloA se
realiza con la ayuda de este lisado. Los transductantes resistentes
al cloramfenicol se controlan con la ayuda de los oligonucleótidos
Ydc F C f y gapCCr para verificar la mutación del gen aldA y
también con la ayuda de los oligonucleótidos, NemAQd y Rnt Cr,
pflAB1 y pflAB2, cdh y YIIQ, ychCf y adhECr, hsIJC y ldhAC2, con el
fin de verificar asimismo respectivamente la deleción de los genes
gloA, pflA y B, tpiA, adhE en la
cepa \DeltaaldA::cm.
Tal como anteriormente, el casete de resistencia
al cloramfenicol se elimina a continuación. El plásmido pCP20
portador de la recombinasa FLP que actúa a nivel de los sitios FRT
del casete de resistencia al cloramfenicol se introduce entonces en
las cepas recombinantes mediante electroporación. Después de una
serie de cultivo a 42ºC, la pérdida del casete de resistencia al
antibiótico se verifica mediante un análisis PCR con los mismos
oligonucleótidos que los usados anteriormente. La cepa obtenida se
denomina MG16555 \DeltatpiA, \DeltapflAB,
\DeltaadhE, IdhA::kana, \DeltagloA,
\DeltaaldA.
\vskip1.000000\baselineskip
La desactivación del gen aldB se realiza
como anteriormente insertando un casete de resistencia al
antibiótico cloramfenicol delecionando al mismo tiempo la mayor
parte de los genes en cuestión mediante la técnica descrita por
Datsenko, K.A. Wanner, B.L. (2000).
Se usan dos oligonucleótidos para realizar la
deleción:
\vskip1.000000\baselineskip
AldB D f de 100 bases (SEC ID nº 23)
tcagaacagccccaacggtttatccgagtagctcaccagcaggcacttggtttgctggtaatgctccagcatcatcttgtGTGTAGGCTGGAGCTGCT
TCG
TCG
con:
una región (caracteres en minúscula) homóloga a
la secuencia (3752603-3752683) del gen aldB
(secuencia 3752603 a 3754141), secuencia de referencia en el sitio
http://genolist.pasteur.fr/Colibri/)
una región (caracteres en mayúscula) para la
amplificación del casete de resistencia al cloramfenicol del
plásmido pKD3 (Datsenko, K.A. y Wanner, B.L. (2000).
\vskip1.000000\baselineskip
aldBD r de 100 bases (SEC ID nº 24):
atgaccaataatcccccttcagcacagattaagcccggcgagtatggtttccccctcaagttaaaagcccgctatgacaaCATATGAATATC
CTCCTT
AG
AG
una región (caracteres en minúscula) homóloga a
la secuencia (3754061-3754141) del gen aldB
(3752603 a 3754141)
una región (caracteres en mayúscula) para la
amplificación del casete de resistencia al cloramfenicol portada
por el plásmido pKD3.
\vskip1.000000\baselineskip
Los oligonucleótidos AldB D r y aldB D f se usan
para amplificar el casete de resistencia al cloramfenicol a partir
del plásmido pKD3. El producto PCR obtenido se introduce entonces
mediante electroporación en la cepa MG1655 (pKD46) en la que la
enzima Red recombinasa expresada permite la recombinación homóloga.
Los transformantes resistentes al antibiótico se seleccionan
entonces y la inserción del casete de resistencia se verifica
mediante un análisis PCR con los oligonucleótidos aldB C f y
YiaYCr.
\vskip1.000000\baselineskip
aldB C f (SEC ID nº 25):
catatttccctcaaagaatataaaaaagaacaattaacgc
(homóloga a la secuencia de 3752057 a 3752095)
\vskip1.000000\baselineskip
YiaYCr (SEC ID nº 26):
tatgttcatgcgatggcgcaccagctgggcg (homóloga a la
secuencia de 3754644 a 3754674)
\vskip1.000000\baselineskip
La desactivación del gen aldB en la cepa
MG1655 \DeltatpiA, \DeltapflAB,
\DeltaadhE, IdhA::kana, \DeltagloA,
\DeltaaldA se ha realizado como anteriormente con la ayuda
de la técnica del fago P1 (véase el protocolo en c)). El lisado de
fago P1 se efectúa en la cepa MG1655 \DeltaaldB::cm,
y la transducción de la cepa MG1655 \DeltatpiA,
\DeltapflAB, \DeltaadhE, IdhA::kana,
\DeltagloA, \DeltaaldA se realiza con la ayuda de
este lisado. Los transductantes resistentes al cloramfenicol se
controlan con la ayuda de los oligonucleótidos aldB C f y YiaYCr
para verificar la mutación del gen aldB y también con la
ayuda de los oligonucleótidos, NemAQd y Rnt Cr, pflAB1 y pflAB2, cdh
y YIIQ, ychCf y adhECr, hsIJC y IdhAC2, Ydc F C f y gapCCr, con el
fin de verificar asimismo respectivamente la deleción de los genes
gloA pflA y B, tpiA, adhE,
aldA en la cepa \DeltaaldB::cm.
Tal como anteriormente, el casete de resistencia
al cloramfenicol se elimina a continuación. El plásmido pCP20
portador de la recombinasa FLP que actúa a nivel de los sitios FRT
del casete de resistencia al cloramfenicol se introduce entonces en
las cepas recombinantes mediante electroporación. Después de una
serie de cultivo a 42ºC, la pérdida del casete de resistencia al
antibiótico se verifica mediante un análisis PCR con los mismos
oligonucleótidos que los usados anteriormente. La cepa obtenida se
denomina MG1655 \DeltatpiA, \DeltapflAB,
\DeltaadhE, ldhA::kana, \DeltagloA,
\DeltaaldA, \DeltaaldB.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Para optimizar la producción de
1,2-propanodiol a partir de glucosa mediante la cepa
E. coli MG16555 \DeltatpiA, \DeltapflAB,
\DeltaadhE, IdhA::kana, \DeltagloA,
\DeltaaldA, \DeltaaldB, se realiza en condición
de anaerobiosis un cultivo de la cepa en quimiostato, en un medio de
cultivo mínimo suplementado con nitrato de sodio y con extracto de
levadura, durante varias semanas.
Al principio del cultivo, la concentración
inicial en glucosa en el tanque de alimentación del cultivo es de
20 g/l, el índice de dilución es de 0,04 h^{-1} y se mantiene un
flujo de nitrógeno en continuo para realizar las condiciones de
anaerobiosis. La concentración celular y las producciones en
1,2-propanodiol y acetato son bajas. Después de
varias semanas de cultivo, el crecimiento y las concentraciones en
productos aumentan, y se alcanza un régimen permanente,
caracterizado por una concentración en glucosa residual y unas
concentraciones en productos constantes
(figura 2).
(figura 2).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
La evolución del complejo piruvato
deshidrogenasa (PDHc) hacia un PDHc poco sensible al NADH se
demuestra al mismo tiempo mediante una dosificación de la actividad
de la enzima evolucionada in vitro y mediante la comparación
de la secuencia de uno de los genes (lpd) que codifica para
la lipoamida deshidrogenasa del PDHc evolucionado con la del gen
del PDHc nativo.
\vskip1.000000\baselineskip
La dosificación de la actividad enzimática del
PDHc in vitro de la cepa E. coli* MG1655
\DeltatpiA, \DeltapflAB, \DeltaadhE,
ldhA::kana, \DeltagloA, \DeltaaldA,
\DeltaaldB se efectúa según el protocolo descrito por
Schwartz y Reed (Schwartz E. R. y Reed L. J. (1970) Regulation of
the activity of the pyruvate dehydrogenase complex of
Escherichia coli; Biochemistry,
6,1434-1439).
Un volumen de 100 ml de cultivo celular se
extrae del quimiostato en unos frascos previamente desgasificados e
introducidos en una campana anaerobia. Las células se centrifugan
durante 10 minutos a 6.000 rpm. El residuo se suspende en
aproximadamente 100 ml de tampón fosfato de potasio 50 mM, pH 7,9,
0,5 mM tiamina pirofosfato, y después de centrifugan nuevamente
durante 10 minutos a 6.000 rpm. El lavado se efectúa una segunda vez
en las mismas condiciones. El residuo celular se suspende en 800
\mul de tampón. La suspensión celular se desintegra mediante un
aparato con ultrasonidos en 4 ciclos de tratamiento (30 segundos a
30%), entrecortados por 2 minutos de reposo en hielo. Los restos
celulares se eliminan mediante centrifugación durante 5 minutos a
13.400 rpm, y el sobrenadante es el extracto acelular en bruto. Las
sales presentes en el extracto acelular, susceptibles de interferir
en la dosificación enzimática, se eliminan mediante el paso del
extracto a través de una columna PD10 equilibrada con tampón
fosfato de potasio pH 7,9, 0,5 mM de tiamina pirofosfato. El
extracto se eluye con 3,5 ml del mismo tampón que anteriormente. El
eluato recuperado es el extracto acelular en bruto.
La actividad enzimática del extracto acelular en
bruto se mide en un primer tiempo en ausencia de NADH, y después en
un segundo tiempo en presencia de concentraciones crecientes de NADH
de 0,14 mM a 2,7 mM. Los resultados obtenidos se comparan con los
presentados en la bibliografía para la cepa de E. coli
salvaje de la figura nº 3 (Snoep J. L., De Graef M. R., Westphal A.
H., De Kok A. Teixeira de Mattos M. J. y Neijssel O. M. (1993)
Differences in sensitivity to NADH of purified pyruvate
dehydrogenase complexes of Enterococcus faecalis,
Lactococcus lactis, Azotobacter vinelandii and
Escherichia coli: implications for their activity in
vivo, FEMS microbiology letters,
114,279-284)).
Los resultados obtenidos indican que el PDHc de
la cepa modificada E. coli MG1655 \DeltatpiA,
\DeltapflAB, \DeltaadhE, IdhA::kana,
\DeltagloA, \DeltaaIdA, \DeltaaldB evolucionada
es menos sensible al NADH que la cepa salvaje de E. coli.
Para una relación [NAD+]/[NADH] \cong 33, se observa una
inhibición total de la actividad del PDHc de la cepa salvaje,
mientras que se mide 80% de la actividad del PDHc evolucionado.
\newpage
El ADN cromosómico de la cepa E. coli*
MG1655 \DeltatpiA, \DeltapflAB,
\DeltaadhE, ldhA::kana, \DeltagloA,
\DeltaaIdA, \DeltaaldB se extrae a partir de 1 ml
de un cultivo de noche en LB. Después de la centrifugación, las
células se lavan con agua estéril y después estallan mediante choque
térmico durante 5 minutos a 94ºC. El ADN cromosómico se recupera en
el sobrenadante después de la centrifugación. El gen lpd
(secuencia 127912 a 129336) que codifica para la lipoamida
deshidrogenasa (E3) del complejo piruvato deshidrogenasa se
amplifica mediante PCR con la ayuda de los dos oligonucleótidos
siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
AceEf (SEC ID nº 27)
cgcgtgatcgacggtgctgatggtgcccg (homóloga a la
secuencia 127504 a 127532)
\vskip1.000000\baselineskip
YacH r (SEC ID nº 28)
aagttcaggagagccgccc (homóloga a la secuencia
127513 a 129531)
Se obtiene y se secuencia un producto PCR de
2.000 pares de bases que corresponde al gen lpd. Los
resultados obtenidos muestran la presencia de una mutación puntual
que provoca la sustitución de la alanina 55 por una valina.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Con el fin de mostrar que la mejora de los
rendimientos de la cepa modificada E. coli MG1655
\DeltatpiA, \DeltapflAB, \DeltaadhE,
ldhA::kana, \DeltagloA, \DeltaaldA,
\DeltaaldB evolucionada no está relacionada con una
evolución de la gliceril-deshidrogenasa codificada
por el gen gldA, se ha construido una cepa E.
coli MG1655 \DeltatpiA, \DeltapflAB,
\DeltaadhE, ldhA::kana, \DeltagloA,
\DeltaaldA, \DeltaaldB evolucionada, en la que el
gen gldA está delecionado.
\vskip1.000000\baselineskip
La desactivación del gen gldA se realiza
tal como se indica en el ejemplo 1 insertando un casete de
resistencia al antibiótico cloramfenicol delecionando al mismo
tiempo la mayor parte de los genes en cuestión mediante la técnica
descrita por Datsenko, K.A.; Wanner, B.L. (2000).
Se usan dos oligonucleótidos para realizar la
deleción:
\vskip1.000000\baselineskip
gldA D f de 100 bases (SEC ID nº 29)
gttattcccactcttgcaggaaacgctgaccgtactggtcggctaccagcagagcggcgtaaacctgatctggcgtcgcgGTGTAGGCTGGAGCTGC
TTCG
TTCG
con:
una región (caracteres en minúscula) homóloga a
la secuencia (4135512 a 4135592) del gen gldA (secuencia
4135512 a 4136615), secuencia de referencia en el sitio
http://genolist.pasteurfr/Colibri/)
una región (caracteres en mayúscula) para la
amplificación del casete de resistencia al cloramfenicol del
plásmido pKD3 (Datsenko, K.A. y VVanner, B.L. (2000)
\vskip1.000000\baselineskip
gldA D r de 100 bases (SEC ID nº 30):
atggaccgcattattcaatcaccgggtaaatacatccagggcgctgatgtgattaatcgtctgggcgaatacctgaagccCATATGAATATCCTCCTTA
G
G
una región (caracteres en minúscula) homóloga a
la secuencia (4136535-4136615) del gen gldA
(4135512 a 4136615)
una región (caracteres en mayúscula) para la
amplificación del casete de resistencia al cloramfenicol portada
por el plásmido pKD3.
Los oligonucleótidos gldA D r y gldA D f se usan
para amplificar el casete de resistencia al cloramfenicol a partir
del plásmido pKD3. El producto PCR obtenido se introduce entonces
mediante electroporación en la cepa MG1655 (pKD46) en la que la
enzima Red recombinasa expresada permite la recombinación homóloga.
Los transformantes resistentes al antibiótico se seleccionan
entonces y la inserción del casete de resistencia se verifica
mediante un análisis PCR con los oligonucleótidos YijF D y
TalCr.
\vskip1.000000\baselineskip
YijF D (SEC ID nº 31):
gcctggatttgtaccacggttggtggaacggcggg (homóloga a
la secuencia de 4135140 a 4135174)
\vskip1.000000\baselineskip
TalCr (SEC ID nº 32):
cacgcatattccccattgccgggg (homóloga a la
secuencia de 4137216 a 4137239)
Se obtiene un producto PCR de 2.100 pb para el
gen salvaje tal como para el gen delecionado y sustituido por el
gen de resistencia al cloramfenicol. Asimismo, los productos PCR
obtenidos son digeridos a continuación por la enzima de restricción
Sall. Se obtienen dos fragmentos de aproximadamente 1.000 pb para el
producto PCR salvaje mientras que el producto PCR que contiene el
gen de resistencia al cloramfenicol no está digerido.
\vskip1.000000\baselineskip
La desactivación del gen gldA en la cepa
MG1655 \DeltatpiA, \DeltapflAB,
\DeltaadhE, IdhA::kana, \DeltagloA,
\DeltaaldA, \DeltaaldB evolucionada se ha
realizado tal como en el ejemplo 1 con la ayuda de la técnica del
fago P1 (véase el protocolo en c)). El lisado de fago P1 se efectúa
en la cepa MG1655 \DeltagldA::cm, y la transducción
de la cepa MG1655 \DeltatpiA, \DeltapflAB,
\DeltaadhE, IdhA::kana, \DeltagloA,
\DeltaaldA, se realiza con la ayuda de este lisado. Los
transductantes resistentes al cloramfenicol se controlan con la
ayuda de los oligonucleótidos YijF D y TalCr para verificar la
mutación del gen gldA.
\vskip1.000000\baselineskip
Las dos cepas modificadas E. coli* MG1655
\DeltatpiA, \DeltapflAB, \DeltaadhE,
ldhA::kana, \DeltagloA, \DeltaaldA,
\DeltaaldB, \DeltagldA::cm evolucionada y
E. coli* MG1655 \DeltatpiA, \DeltapflAB,
\DeltaadhE, IdhA::kana, \DeltagloA,
\DeltaaldA, \DeltaaldB evolucionada se cultivan a
pH no regulado en un medio de cultivo mínimo suplementado con
nitrato de sodio y con extracto de levadura con una concentración
inicial en glucosa de 20 g/l en condición de anaerobiosis durante
10 días. El perfil de productos de fermentación obtenido muestra
que la deleción del gen gldA no provoca ninguna disminución
de la producción de 1,2-propanodiol (tabla 1).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Ejemplo
5
La desactivación del gen edd se realiza
tal como se indica en el ejemplo 1 insertando un casete de
resistencia al antibiótico cloramfenicol delecionando al mismo
tiempo la mayor parte de los genes en cuestión mediante la técnica
descrita por Datsenko, K.A.; Wanner, B.L. (2000).
Se usan dos oligonucleótidos para realizar la
deleción:
\vskip1.000000\baselineskip
edd D f de 100 bases (SEC ID nº 33)
ttaaaaagtgatacaggttgcgccctgttcggcaccggacagtttttcacgcaaggcgctgaataattcacgtcctgttcGTGTAGGCTGGAGCTGCT
TCG
TCG
con:
una región (caracteres en minúscula) homóloga a
la secuencia (1930817 a 4) del gen edd (secuencia 1930817 a
1932628), secuencia de referencia en el sitio
http://genolist.pasteur.fr/Colibrin
una región (caracteres en mayúscula) para la
amplificación del casete de resistencia al cloramfenicol del
plásmido pKD3 (Datsenko, K.A. y Wanner, B.L. (2000).
\vskip1.000000\baselineskip
edd D r de 100 bases (SEC ID nº 34):
atgaatccacaattgttacgcgtaacaaatcgaatcattgaacgttcgcgcgagactcgctctgcttatctcgcccggatCATATGAATATCCTCCTTAG
una región (caracteres en minúscula) homóloga a
la secuencia (1932548-1932628) del gen edd
(secuencia 1930817 a 1932628)
una región (caracteres en mayúscula) para la
amplificación del casete de resistencia al cloramfenicol portada
por el plásmido pKD3.
\vskip1.000000\baselineskip
Los oligonucleótidos edd D r y edd
D f se usan para amplificar el casete de resistencia al
cloramfenicol a partir del plásmido pKD3. El producto PCR obtenido
se introduce entonces mediante electroporación en la cepa MG1655
(pKD46) en la que la enzima Red recombinasa expresada permite la
recombinación homóloga. Los transformantes resistentes al
antibiótico se seleccionan entonces y la inserción del casete de
resistencia se verifica mediante un análisis PCR con los
oligonucleótidos eda d y zwf r:
\vskip1.000000\baselineskip
Eda d (SEC ID nº 35):
CCCCGGAATCAGAGGAATAGTCCC (homóloga a la
secuencia de 1930439 a 1930462)
\vskip1.000000\baselineskip
Zwf r (SEC ID nº 36):
GGGTAGACTCCATTACTGAGGCGTGGGCG (homóloga a la
secuencia de 1932968 a 1932996)
\vskip1.000000\baselineskip
La desactivación del gen edd en la cepa
MG1655 \DeltatpiA, \DeltapflAB,
\DeltaadhE, IdhA::kana, \DeltagloA,
\DeltaaldA, \DeltaaldB, evolucionada se ha
realizado como en el ejemplo 1, con la ayuda de la técnica del fago
P1 (véase el protocolo en c)). El lisado de fago P1 se efectúa en
la cepa MG1655 \Deltaedd::cm, y la transducción de
la cepa MG1655 \DeltatpiA, \DeltapflAB,
\DeltaadhE, IdhA::kana, \DeltagloA,
\DeltaaldA, \DeltaaldB, se realiza con la ayuda
de este lisado. Los transductantes resistentes al cloramfenicol se
controlan con la ayuda de los oligonucleótidos eda d y zwf r para
verificar la mutación del gen edd.
\vskip1.000000\baselineskip
Las dos cepas modificadas E. coli* MG1655
\DeltatpiA, \DeltapfIAB, \DeltaadhE,
IdhA::kana; \DeltagloA, \DeltaaldA,
\DeltaaldB, \Deltaedd::cm evolucionada y
E. coli *MG1655 \DeltatpiA, \DeltapflAB,
\DeltaadhE, IdhA::kana, \DeltagloA,
\DeltaaldA, \DeltaaldB evolucionada se cultivan
con un pH no regulado en un medio de cultivo mínimo suplementado
con nitrato de sodio y con extracto de levadura con una
concentración inicial en glucosa de 20 g/l en condición de
anaerobiosis durante 10 días. El perfil de productos de fermentación
obtenido muestra que la deleción del gen edd provoca un
aumento del rendimiento de conversión de la glucosa en
1,2-propanodiol de 0,13 g/g a 0,35 g/g (tabla 2).
La deleción del gen edd en la cepa E. coli *MG1655
\DeltatpiA, \DeltapflAB, \DeltaadhE,
IdhA::kana, \DeltagloA, \DeltaaldA,
\DeltaaldB evolucionada permite por lo tanto mejorar los
rendimientos de la cepa.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
El plásmido denominado pSOS95T es un vector
puente de expresión para E. coli/C. acetobutylicum que
contiene el operón acetona de Clostridum acetobutylicum
constituido por cuatro genes adc, ctfAB, thl
que codifican respectivamente para la
acetoacetato-carboxilasa, la coenzima A transferasa
y la tiolasa bajo la dependencia del promotor tiolasa. Estas tres
enzimas catalizan la transformación del acetil-CoA y
del acetato en acetona y dióxido de carbono. El plásmido pSOS95T se
ha obtenido mediante la inserción en el plásmido pSOS95 (Genebank
número de acceso AY187686) del gen thl de C.
acetobutylicum que codifica para la tiolasa, en el sitio BamH1
situado entre el promotor tiolasa y el gen ctfA. El plásmido
pSOS95T se introduce en la cepa E. Coli MG1655
\DeltatpiA, \DeltapflAB, \DeltaadhE,
IdhA::kana, \DeltagloA, \DeltaaldA,
\DeltaaldB, \Deltaedd::cm evolucionada
mediante electroporación.
Unas células electrocompetentes de la cepa E.
Coli* MG1655 \DeltatpiA, \DeltapflAB,
\DeltaadhE, IdhA::kana, \DeltagloA,
\DeltaaldA, \DeltaaldB,
\Deltaedd::cm se preparan a partir de un cultivo de
una noche de la cepa en LB. Un cultivo de 10 ml LB en Erlenmeyer se
inocula a la 100ª mediante el cultivo de noche y se incuba a 37ºC.
Cuando la densidad óptica a 550 nm del cultivo alcanza un valor
comprendido entre 0,4 y 0,6, se centrifuga 1 ml de cultivo. Las
células se lavan con agua, y después con una disolución de glicerol
al 10%, antes de ser resuspendidas en 0,05 ml de una disolución de
glicerol al 10%. Las células se electroporan inmediatamente (25
\muF, 200 \Omega, 2,5 KV) (Gene pulser, Biorad) con 5 \mul de
la preparación plasmídica pSOS95T (Qiagen, Hilden, Alemania).
Después de 1 hora de expresión fenotípica en medio SOC (Sambrook J.,
Fristch E. F. y Maniatis T. (1989) Molecular cloning: a laboratory
manual, 2ª ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,
N.Y.) a 37ºC, los transformantes se seleccionan en medio agar agar
con carbenicilina 100 \mug/ml a 37ºC.
Los transformantes se vuelven a poner en cultivo
líquido en presencia de carbenicilina durante una noche para
realizar una extracción de ADN plasmídico (Qiagen, Hilden, Alemania)
con el fin de controlar la presencia del plásmido pSOS95T y
verificar mediante digestión enzimática que es correcto.
\newpage
Ejemplo
7
La cepa modificada E. coIi*MG1655
\DeltatpiA, \DeltapflAB, \DeltaadhE,
ldhA::kana, \DeltagloA, \DeltaaldA,
\DeltaaldB, \Deltaedd::cm
(pSOS95T) evolucionada se cultiva a pH no regulado en un medio de cultivo mínimo suplementado con nitrato de sodio y con extracto de levadura con una concentración inicial en glucosa de 20 g/l en condición de anaerobiosis (tabla 3). La dosificación de los productos de fermentación muestra que la cepa E. coIi*MG1655 \DeltatpiA, \DeltapflAB, \DeltaadhE, ldhA::kana, \DeltagloA, \DeltaaldA, \DeltaaldB, \Deltaedd::cm (pSOS95T) evolucionada produce una mezcla de 1,2-propanodiol, de acetato y de acetona.
(pSOS95T) evolucionada se cultiva a pH no regulado en un medio de cultivo mínimo suplementado con nitrato de sodio y con extracto de levadura con una concentración inicial en glucosa de 20 g/l en condición de anaerobiosis (tabla 3). La dosificación de los productos de fermentación muestra que la cepa E. coIi*MG1655 \DeltatpiA, \DeltapflAB, \DeltaadhE, ldhA::kana, \DeltagloA, \DeltaaldA, \DeltaaldB, \Deltaedd::cm (pSOS95T) evolucionada produce una mezcla de 1,2-propanodiol, de acetato y de acetona.
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<210> 1
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<211> 102
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<212> ADN
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<213> Artificial
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\hskip0,8cm
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<400> 2
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\hskip0,8cm
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<212> AND
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<212> ADN
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<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcctggattt gtaccacggt tggtggaacg gcggg
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcacgcatatt ccccattgcc gggg
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 101
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
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\hskip0,8cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 100
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<212> ADN
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<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
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\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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<210> 35
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<211> 24
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<400> 35
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\hskip-.1em\dddseqskipccccggaatc agaggaatag tccc
\hfill24
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<210> 36
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<211> 29
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<212> ADN
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<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggtagactc cattactgag gcgtgggcg
\hfill29
Claims (24)
1. Procedimiento de preparación de una cepa de
microorganismos evolucionados para la producción de
1,2-propanodiol mediante el metabolismo de una
fuente de carbono simple, a partir de una cepa inicial que comprende
una deleción del gen tpiA y una deleción de por lo menos un
gen que codifica para una enzima implicada en la conversión del
metil-glioxal (propanol) en lactato.
comprendiendo dicho procedimiento las siguientes
etapas:
- \bullet
- cultivar dicha cepa inicial en un medio de cultivo apropiado, que comprende una fuente de carbono simple, aplicando unos índices de dilución crecientes de tal manera que se conservan en el medio de cultivo sólo los microorganismos que tienen un índice de crecimiento igual o superior al índice de dilución impuesto, con el fin de hacer evolucionar en dicha cepa inicial uno o varios genes implicados en la vía de biosíntesis del DHAP en metilglioxal y después en 1,2-propanodiol hacia unos genes evolucionados que tienen una actividad "1,2-propanodiol sintasa" mejorada,
- \bullet
- seleccionar y aislar la o las cepas de microorganismos evolucionados que tienen una actividad "1,2-propanodiol sintasa" mejorada.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque el gen implicado en la conversión del
metil-glioxal en lactato se selecciona de entre
gloA, aldA y aldB.
3. Procedimiento según la reivindicación 2,
caracterizado porque la cepa inicial comprende la deleción de
los genes aldA y/o aldB.
4. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque la cepa inicial
comprende la deleción de los genes gloA, aldA, aldB y
tpiA.
5. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque en la cepa
inicial, las vías naturales de fermentación de la glucosa que son
consumidoras de NADH está suprimidas.
6. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la cepa inicial
comprende la deleción de los genes adhE y ldhA.
7. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la cepa inicial
comprende asimismo por lo menos un gen que codifica para un
complejo piruvato deshidrogenasa.
8. Procedimiento según la reivindicación 7,
caracterizado porque el gen lpd que codifica para la
lipoamida deshidrogenasa del complejo piruvato deshidrogenasa
contiene una mutación puntual que provoca una modificación de la
alanina 55 en valina.
9. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 7 u 8, caracterizado porque el complejo
piruvato deshidrogenasa es endógeno.
10. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque la cepa inicial
comprende la deleción de los genes pflA y pflB.
11. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque la cepa inicial
comprende asimismo una deleción del gen edd.
12. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque la cepa inicial
comprende una deleción de los genes gloA, aldA, aldB, tpiA,
adhE, ldhA, pflA, pflB, y edd.
13. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque se introduce en
la cepa evolucionada uno o varios genes heterólogos que codifican
para una o varias enzimas implicadas en la conversión del
acetil-CoA y del acetato en acetona, siendo estas
enzimas seleccionadas de entre el acetoacetato carboxilasa, la
coenzima A transferasa y la tiolasa.
14. Procedimiento según la reivindicación 13,
caracterizado porque el o los genes heterólogos que codifican
para una o varias enzimas implicadas en la conversión del
acetil-CoA y del acetato proceden de Clostridium
acetobutylicum.
15. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 13 ó 14, caracterizado porque se cultiva
bajo presión de selección en un medio de cultivo apropiado que
comprende una fuente de carbono simple, una cepa evolucionada
modificada obtenida según una de las reivindicaciones 13 ó 14, con
el fin de hacer evolucionar en dicha cepa evolucionada modificada
uno o varios genes implicados en la conversión del
acetil-CoA y del acetato en acetona hacia una
actividad "acetona sintasa" mejorada, y después se seleccionan
y se aíslan los microorganismos evolucionados de segunda generación
que tienen
\hbox{una actividad
1,2-propanodiol sintasa mejorada y una
actividad acetona sintasa mejorada.} 16. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque la cepa se
selecciona de entre las bacterias, las levaduras y los hongos.
17. Procedimiento según la reivindicación 16,
caracterizado porque la cepa se selecciona de entre una cepa
de Escherichia, en particular E. coli, y de
Corynebacterium, en particular C. glutamicum.
18. Cepa inicial tal como la definida según una
de las reivindicaciones 3 a 6, 8, 10, 11 ó 12.
19. Cepa inicial según la reivindicación 18,
caracterizada porque se selecciona de entre las bacterias,
las levaduras y los hongos.
20. Cepa inicial según la reivindicación 19,
caracterizada porque se selecciona de entre una cepa de
Escherichia, en particular E. coli, y de
Corynebacterium, en particular C. glutamicum.
21. Cepa evolucionada obtenida mediante el
procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 17, en la que
el gen lpd porta una mutación puntual que provoca una
modificación de la alanina 55 en valina.
22. Procedimiento de preparación de
1,2-propanodiol en el que se cultiva una cepa
evolucionada según la reivindicación 21, en un medio de cultivo
apropiado que comprende una fuente simple de carbono, y después se
recupera el 1,2-propanodiol producido.
23. Procedimiento según la reivindicación 22,
caracterizado porque se recupera
1,2-propanodiol y acetona.
24. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 22 ó 23, caracterizado porque el
1,2-propanodiol y/o la acetona están
purificados.
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