CN101679940A - 用于产生1,2-丙二醇的代谢工程改造的微生物 - Google Patents

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Abstract

用于从碳源产生1，2－丙二醇的微生物，其中所述微生物的特征为：从磷酸二羟丙酮到1，2－丙二醇的生物合成途径的活性提高，和3－磷酸甘油醛脱氢酶的活性削弱，本发明还涉及用根据本发明的微生物通过发酵产生1，2－丙二醇的方法。

Description

用于产生1，2-丙二醇的代谢工程改造的微生物
本发明涉及经代谢工程改造的微生物及其用于制备1，2-丙二醇的用途。
1，2-丙二醇或丙二醇，一种C3二醇，是广泛使用的化学品。它是用于航空器的不饱和聚酯树脂、液体洗涤剂、冷却剂、抗冻和除冰流体的组分。自从1993-1994年以来，丙二醇作为乙烯衍生物的替代物已经越来越多地被使用，所述乙烯衍生物被认为比丙烯衍生物毒性更强。
目前使用消耗大量水的环氧丙烷水合工艺通过化学手段产生1，2-丙二醇。环氧丙烷可以由两种方法中的任一种产生，一种使用表氯醇(epichlorhydrin)，另一种使用氢过氧化物。两条途径都使用高毒性物质。此外，氢过氧化物途径产生副产物如叔丁醇和1-苯基乙醇。为使丙烯生产成为有利可图的，必须使用这些副产物。化学途径通常产生消旋的1，2-丙二醇，而两种立体异构体(R)1，2-丙二醇和(S)1，2-丙二醇中每种对于某些应用是感兴趣的。
用于产生1，2-丙二醇的化学方法的缺点使生物合成成为具有吸引力的替代方法。已表征了两种途径用于通过微生物由糖天然产生1，2-丙二醇。
在第一个途径中，将6-脱氧糖(例如L-鼠李糖或L-岩藻糖)裂解成磷酸二羟基丙酮和(S)-乳醛，其能进一步还原至(S)-1，2-丙二醇(Badia等，1985)。此途径在大肠杆菌中有功能，但是因为脱氧己糖的高成本，不能得到经济上可行的工艺。
第二个途径是通过糖酵解途径，然后是丙酮醛途径来代谢普通糖(例如葡萄糖或木糖)。将磷酸二羟基丙酮转化成丙酮醛，后者可以还原成乳醛或丙酮醇。然后这两个化合物可以进行第二次还原反应，得到1，2-丙二醇。此途径由(R)-1，2-丙二醇的天然生产菌使用，如楔形梭菌(Clostridium sphenoides)和热解糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter thermosaccharolyticum)。已经使用楔形梭菌产生1，2-丙二醇，在磷酸盐受限条件下效价(titer)为1.58g/l(Tran Din和Gottschalk，1985)。也已经研究热解糖热厌氧杆菌用于产生1，2-丙二醇(Cameron和Cooney，1986，Sanchez-Rivera等，1987)。获得的最佳性能是9g/l的效价和0.2g/g由葡萄糖的得率。然而，用这些生物获得的性能的改进可能由于缺少可用的遗传工具而受到限制。
现有技术
Cameron等(1998)研究了大肠杆菌作为平台用于将糖转化为1，2-丙二醇的代谢工程的用途。他们的理论分析显示实际产物得率的上限(考虑质量平衡和生长所需能量的产生)取决于培养条件而显著不同。在厌氧条件下，将产生乙酸(acetate)作为副产物，以循环还原辅因子，而最佳得率限制在1摩尔1，2-丙二醇每摩尔葡萄糖(0.42g/g)。在需氧条件下，使用氧作为终端电子受体通过呼吸链确保辅因子的循环，并且可能在没有副产物产生的情况下产生1，2-丙二醇。在这些条件下，得率能到达最高1.42mol/mol(0.6g/g)。考虑1，2-丙二醇的最大效价量，Cameron等讨论了其对于产物和副产物毒性的依赖性。1，2-丙二醇的毒性显著低于1，3-丙二醇，而且大肠杆菌在100g/l 1，2-丙二醇时表现出0.5h-1的残余生长速率。对生长的抑制更可能是由于副产物乙酸，已知其高度抑制生长。开发以高效价和得率产生1，2-丙二醇的厌氧工艺将解决乙酸问题。已经提出了将乙酸转化成抑制性较低而且容易原位去除的丙酮(WO2005/073364)。
已经由Cameron小组(Cameron等，1998，Altaras和Cameron，1999，Altaras和Cameron，2000)和Bennett小组(Huang等，1999，Berrios-Rivera等，2003)进行了几项大肠杆菌遗传修饰的研究，以获得使用简单碳源的1，2-丙二醇产生菌。这些研究一方面依赖于从磷酸二羟基丙酮到1，2-丙二醇的途径中一种或几种酶活性的表达，另一方面依赖于去除宿主菌株中的NADH和碳的消耗途径。由Cameron小组获得的最佳结果是在厌氧摇瓶培养中产生1.4g/l 1，2-丙二醇，得率为0.2g/g消耗的葡萄糖。当外推至厌氧补料批式发酵罐时，产生4.5g/l 1，2-丙二醇，由葡萄糖的得率为0.19g/g，与Cameron等的理论估计相差较大。已经通过在缺乏编码乳酸脱氢酶的基因(ldhA)的菌株中过表达大肠杆菌的丙酮醛合酶基因(mgs)、大肠杆菌的甘油脱氢酶基因(gldA)和大肠杆菌的1，2-丙二醇氧化还原酶基因(fucO)而获得了这些性能。在专利US 6,087,140，US 6,303,352和WO 98/37204中还描述了用同样的方法获得但效价和得率更低的结果。
Bennett小组还使用缺乏ldhA的大肠杆菌宿主菌株过表达来自丙酮丁醇梭菌的mgs基因和来自大肠杆菌的gldA基因。在厌氧条件下的摇瓶培养得到1.3g/l的效价和0.12g/g的得率，而微需氧培养得到1.4g/l的效价和0.13g/g的得率。
在这个阶段，所有这些结果都未能优于用菌种热解糖热厌氧杆菌(T.thermosaccharolyticum)获得的结果。
葡萄糖在大肠杆菌中通过糖酵解途径分解代谢，在裂解1，6二磷酸果糖后，生成两个磷酸丙糖分子，磷酸二羟基丙酮(DHAP)和3-磷酸甘油醛。这两个磷酸丙糖分子可以通过磷酸丙糖异构酶活性而互相转化。通常认为DHAP转化成GA3P，并且来自葡萄糖的两个GA3P进一步分解代谢。
3-磷酸甘油醛脱氢酶，也称作GAPDH，是葡萄糖变为丙酮酸的糖酵解转化中涉及的关键酶之一。GAPDH催化下述反应：
  3-磷酸甘油醛+磷酸+NAD+→1，3-二磷酸甘油酸+NADH+H+
编码这个酶的基因于1983年在大肠杆菌中克隆(Branlant等，Gene，1983)并命名为“gap”。后来鉴定了编码具有相同酶活性的产物的另一个基因并命名为gapB(Alefounder等，Microbiol.，1987)。缺失gapA和gapB基因的大肠杆菌菌株的表征表明，虽然gapB不是必要的，但是gapA是糖酵解必需的(Seta等，J.Bacter.，1997)。具有下调的gapA基因的微生物在专利申请WO2004/033646中报道用于通过发酵由葡萄糖产生1，3-丙二醇。
本申请的发明人显示，需要2个因素的组合以获得1，2-丙二醇产率的增加：
-1，2-丙二醇的生物合成途径的活性提高(improved)，和
-GAPDH活性的削弱。
本发明人还证明，增加胞内磷酸烯醇丙酮酸浓度或者使用可替换的糖运输系统能进一步促进由微生物发酵进行的1，2-丙二醇生产。
发明描述
本发明涉及用于从碳源产生1，2-丙二醇的微生物，其中所述微生物的特征为：
a)从磷酸二羟基丙酮到1，2-丙二醇的生物合成途径的活性提高，和
b)3-磷酸甘油醛脱氢酶的活性削弱。
通过增加所述生物合成途径中涉及的至少一个酶的活性而获得由DHAP到1，2-丙二醇的生物合成途径的活性的提高。这可以通过增加编码所述酶的基因的表达，特别是增加选自如下的至少一个基因的表达来获得：mgsA、yqhD、yafB、ycdW、yqhE、yeaE、yghZ、yajO、tas、ydjG、ydbC、gldA和fucO。优选地，增加mgsA、yqhD和gldA三个基因的表达。
在本发明的另一个方面，通过缺失edd或eda基因或两者都缺失来消除Entner-Doudoroff途径。此外，通过缺失编码由丙酮醛合成乳酸中涉及的酶的基因(比如gloA、aldA、aldB)，由丙酮酸(ldhA)、甲酸(pflA，pflB)、乙醇(adhE)和乙酸(ackA、pta、poxB)合成乳酸中涉及的酶的基因，来削弱不期望的副产物的合成。
削弱3-磷酸甘油醛(脱氢酶)的活性，从而通过丙糖磷酸异构酶的作用将可用的3-磷酸甘油醛的一部分重定向至1，2-丙二醇的合成。然后1，2-丙二醇对葡萄糖的得率能够大于1摩尔/摩尔。然而，由于磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的生产减少，PEP-依赖的糖输入系统将受到负面影响。因此，在本发明的一个方面，通过使用与PEP无关的糖输入如由galP编码的，或者通过向糖磷酸转移酶系统提供更多的PEP，来增加糖输入的效率。这可以通过消除消耗PEP的途径像丙酮酸激酶(由pykA和pykF基因编码)，和/或通过促进PEP的合成，例如通过过表达编码PEP合酶的ppsA基因而获得。
此外，这对于可将丙酮酸转化成乙酰-CoA的酶抵抗厌氧条件下存在的高浓度NADH是有价值的。这可以通过在lpd基因中的特异性突变而获得。最后，为了节省(spare)NADH用于丙酮醇还原成为1，2-丙二醇，可以缺失arcA和ndh基因。
用于制备1，2-丙二醇的微生物选自细菌、酵母和真菌，但是优选来自大肠杆菌或丙酮丁醇梭菌菌种。
本发明的另一个目的是提供通过将修饰的微生物在合适的生长培养基中培养并通过回收和纯化产生的1，2-丙二醇来产生1，2-丙二醇的方法。
附图简述
并入并构成本说明的一部分的附图例示了本发明，并与说明书一起，用于解释本发明的原理。
图1描绘了由糖产生1，2-丙二醇的系统的开发中中央代谢的遗传工程。
发明详述
如本文所使用的，下述术语可以用于解释权利要求和说明书。
根据本发明，术语“培养”、“生长”和“发酵”可互换使用，以表示细菌在包含简单碳源的适当生长培养基中的生长。
根据本发明，术语“碳源”表示碳的任何来源，其可以由本领域技术人员使用以支持微生物的正常生长，并且其可以是己糖、戊糖、单糖、二糖、寡糖、淀粉或其衍生物、半纤维素、甘油，和它们的组合。
术语“用于产生1，2-丙二醇”表示微生物产生所述目标产物，优选通过发酵产生。发酵是能在需氧、微需氧或厌氧条件下进行的经典工艺。
短语“酶活性的削弱”指与进行任何修饰之前的初始菌株中的活性相比，修饰菌株中目的酶的活性降低。本领域的技术人员了解多种方法以获得此结果，可能的实例包括：
-向基因中导入突变，降低该基因的表达水平，或者降低编码蛋白质的活性水平。
-由低强度的启动子取代基因的天然启动子，得到更低的表达。
-使用使相应信使RNA或蛋白质不稳定的元件。
-如果期望完全不表达则缺失基因。
术语“表达”指基因序列的转录和翻译，其可以产生基因相应的蛋白质产物。
有利地，3-磷酸甘油醛脱氢酶的活性比在相同条件下在未修饰菌株中观察到的活性低30％，更优选低10％。
术语“由磷酸二羟基丙酮到1，2-丙二醇的生物合成途径的活性提高”指该途径涉及的至少一种酶活性提高(见下文)。
有利地，本发明的微生物经过遗传修饰以增加从磷酸二羟基丙酮到1，2-丙二醇的生物合成途径中涉及的至少一个酶的活性。
优选地，通过增加编码所述酶的基因的表达而获得酶活性的增加。
为了获得目标基因的过表达，本领域中的技术人员了解不同的方法，如：
-用更强的启动子替换内源启动子。
-向微生物导入携带所述目标基因的表达载体。
-向染色体中导入目标基因的额外拷贝。
本领域的技术人员了解几种目前用于将DNA导入细菌菌株的技术。优选的技术是电穿孔，其为本领域的技术人员所熟知。
有利地，将选自下组的至少一个目标基因过表达：mgsA、yafB、yeaE、yghZ、yqhE、yqhD、ydhF、ycdW、yajO、ydjG、ydbC、tas、gldA和fucO。
mgsA基因编码丙酮醛合酶，其催化DHAP转化成丙酮醛。基因yafB、yeaE、yghZ、yqhE、yqhD、ydhF、ycdW、yajO、ydjG、ydbC、tas编码能将丙酮醛转化成丙酮醇的酶活性。gldA基因编码甘油脱氢酶，其催化丙酮醇转化成1，2-丙二醇。fucO基因编码1，2-丙二醇氧化还原酶，其催化乳醛转化成1，2-丙二醇。
优选的微生物携带可导致特别感兴趣的三个基因mgsA、yqhD和gldA的过表达的修饰。
优选地，在根据本发明的微生物中，Entner-Doudoroff途径中涉及的至少一个基因被削弱。Entner-Doudoroff途径提供糖酵解之外将葡萄糖降解成为3-磷酸甘油醛和丙酮酸的另一种途径。Entner-Doudoroff途径的削弱确保大多数或最好是全部葡萄糖通过糖酵解而降解，并用于产生1，2-丙二醇。
具体地，这个途径的两个基因edd或eda中至少一个被削弱。
根据本发明，术语“基因表达的削弱”表示基因表达的部分或全部抑制，即所述的“削弱”。这种表达的抑制可以是抑制基因的表达，抑制基因的激活机制，缺失基因表达所需的全部或部分启动子区，或者缺失基因的编码区。优选地，基因的削弱基本上是基因的完全缺失，所述基因可以用促进本发明菌株的鉴定、分离和纯化的选择标记基因取代。优选通过Datsenko，K.A.和Wanner，B.L.(2000)“One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12usingPCR products”.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：6640-6645所述的同源重组技术使基因失活。
优选地，在根据本发明的微生物中，丙酮醛变成乳酸的转化中涉及的至少一个基因被削弱。此削弱的目的在于可用的丙酮醛被细胞机构(cellmachinery)使用，基本上用于合成1，2-丙二醇(参见图1)
丙酮醛变成乳酸的转化中涉及的基因具体为：
-编码乙二醛酶的基因，如编码乙二醛酶I的gloA基因，其催化从丙酮醛合成乳酰谷胱甘肽；
-编码乳醛脱氢酶的aldA和aldB基因(其催化从(S)乳醛合成(S)乳酸)。
在初始菌株中，有利地削弱了这些基因中一个或多个的表达。优选完全缺失gloA基因。
在本发明的微生物中，优选的是副产物(如乳酸、乙醇和甲酸)的合成中涉及的至少一个酶被削弱。
具体地，有利的是削弱编码乳酸脱氢酶的基因ldhA的表达，其催化由丙酮酸合成乳酸，并且削弱编码醇-醛脱氢酶的基因adhE的表达，其催化由乙酰-CoA合成乙醇。
相似地，可能迫使微生物使用丙酮酸脱氢酶复合物以从丙酮酸产生乙酰-CoA、CO2和NADH而不是乙酰-CoA和甲酸。这可以通过削弱编码丙酮酸甲酸裂合酶的基因pflA和pflB而实现。
在本发明的另一个特定的实施方案中，通过削弱乙酸合成中涉及的至少一个酶来防止副产物乙酸的合成。优选的是避免这样的乙酸合成，以优化1，2-丙二醇的产生。
为了防止产生乙酸，有利地削弱了选自ackA、pta和poxB中的至少一个基因的表达，所有这些基因都编码涉及不同的乙酸生物合成途径的酶(参见图1)。
优选地，在根据本发明的微生物中，增加糖输入的效率。gapA基因表达强力削弱使GAPDH反应中碳流量降低超过50％，这将导致每摩尔输入的葡萄糖合成小于1摩尔的磷酸烯醇丙酮酸(PEP)。PEP是通常用于向细胞中输入简单糖的糖-磷酸转移酶系统(PTS)所需要的，因为输入与从PEP转移磷酸到葡萄糖得到6-磷酸葡萄糖的磷酸转移偶联。因此降低PEP的量将对糖输入产生负面影响。
在本发明的一个特定实施方案中，可以通过不依赖于磷酸烯醇丙酮酸的糖输入系统将糖输入微生物。可以利用由galP基因编码的半乳糖-质子共运输体(symporter)，其不涉及磷酸化。在这种情况下，输入的葡萄糖必须由glk基因编码的葡萄糖激酶磷酸化。为了促进此途径，增加选自galP和glk中的至少一个基因的表达。结果，PTS变得不必要(dispensable)，而且可以通过削弱选自ptsH、ptsI或crr中的至少一个基因的表达而消除。
在本发明的另一个特定的实施方案中，通过增加代谢物磷酸烯醇丙酮酸的利用率而增加糖-磷酸转移酶系统(PTS)的效率。由于削弱了gapA活性和朝向丙酮酸的碳流量较低，所以本发明的修饰菌株中PEP的量受到限制，导致转运至细胞中的葡萄糖量较低。
存在多种可以用于增加微生物菌株中PEP利用率的方法。具体地，一种手段是削弱反应PEP→丙酮酸。优选地，在所述菌株中削弱选自编码丙酮酸激酶的pykA和pykF中的至少一个基因以获得这一结果。另一种增加PEP的利用率的方法是，通过增加磷酸烯醇丙酮酸合酶的活性来促成(favour)由所述酶催化的反应丙酮酸pyk→PEP。这个酶由ppsA基因编码。因此，优选在微生物中，优选增加ppsA基因的表达。两种修饰可以同时存在于微生物中。
特别是在厌氧或微需氧条件下，有利的是，将丙酮酸转化成乙酰-CoA的丙酮酸脱氢酶复合物(PDC)对于NADH的抑制具有低的敏感度。参照未修饰酶的敏感度确定更低的敏感度。这些特性可以通过如下方式获得：向lpd基因(编码PDC的硫辛酰胺脱氢酶亚基)中导入特定突变，使酶的蛋白质序列中的丙氨酸55替换为缬氨酸残基。
在厌氧或微需氧条件下，用于将前体还原成1，2-丙二醇的NADH的利用率得到有利地增加。这可以通过减轻由全局调控子ArcA(由arcA基因编码)介导的对三羧酸循环的抑制而获得。细胞中NADH的浓度也可以通过失活由基因ndh编码的NADH脱氢酶II而增加。因此，优选地，选自arcA和ndh的至少一个基因被削弱。
优选地，根据本发明的微生物选自细菌、酵母和真菌。更优选地，微生物选自下组：肠细菌科、芽孢杆菌科、梭菌科、链霉菌科和棒杆菌科。甚至更优选地，微生物是大肠杆菌或丙酮丁醇梭菌。
本发明的另一个目的是用于制备1，2-丙二醇的方法，其中微生物如先前所述的微生物在包含简单碳源的合适的生长培养基中生长，并回收产生的1，2-丙二醇。在需氧、微需氧或厌氧条件下进行1，2-丙二醇的生产。
发酵过程的培养条件可以由本领域的技术人员容易地确定。具体地，细菌在20℃-55℃，优选在25℃-40℃，并且对于丙酮丁醇梭菌优选在约35℃，对于大肠杆菌在约37℃的温度发酵。
这个方法可以以分批方法，补料-分批方法或连续方法进行。
“在需氧条件下”表示通过将气体溶于液相而向培养物供氧。这可以通过下述方式获得：(1)将含氧气体(例如空气)鼓泡入液相，或(2)震荡包含培养基的容器，以将液上空间包含的氧传递入液相。在需氧条件而不是厌氧条件下发酵的优势在于氧作为电子受体的存在改进了菌株以ATP形式为细胞过程产生更多能量的能力。因此菌株的普通代谢得到了改进。
微需氧条件定义为这样的培养条件：其中低百分比的氧(例如使用包含0.1-10％氧的气体混合物，用氮补至100％)溶于液相中。
厌氧条件定义为不向培养基供氧的培养条件。可以通过向培养基中鼓泡惰性气体如氮气，去除痕量的其他气体而获得严格厌氧条件。可以使用氮气作为电子受体以改进菌株的ATP生产，并改进其代谢。
根据本发明，术语“适当的生长培养基”表示适合微生物生长的分子组成已知的培养基。例如适合所用细菌的已知设定组成的无机培养基，其包含至少一种碳源。具体地，因此用于大肠杆菌的无机生长培养基可以与M9培养基(Anderson，1946，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 32：120-128)、M63培养基(Miller，1992；A Short Course in Bacterial Genetics：A Laboratory Manual andHandbook for Escherichia coli and Related Bacteria，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)或如Schaefer等(1999，Anal.Biochem.270：88-96)所定义的培养基有相同或相似的组成，并且具体地，命名为MPG的基本培养基如下所述：
K2HPO4   1.4g/l
氮川三乙酸   0.2g/l
痕量元素溶液＊   10ml/l
(NH4)2SO4   1g/l
NaCl   0.2g/l
NaHCO3   0.2g/l
MgSO4   0.2g/l
葡萄糖   20至100g/l
NaNO3   0.424g/l
硫胺素   10mg/l
FeSO4，7H2O   50mg/l
酵母提取物   4g/l
用氢氧化钠将培养基的pH调至7.4。
*痕量元素溶液：柠檬酸4.37g/L，MnSO4 3g/L，CaCl2 1g/L，CoCl2，2H2O0.1g/L，ZnSO4，7H2O 0.10g/L，CuSO4，5H2O 10mg/L，H3BO3 10mg/L，Na2MoO4 8.31mg/L。
在本发明的一个特定实施方案中，用在包含简单碳源的培养基中生长的大肠杆菌菌株进行所述方法，其中简单碳源可以是阿拉伯糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖或木糖。特别优选的简单碳源是葡萄糖。
在本发明的另一个特定的实施方案中，用在包含简单碳源或复杂碳源的培养基中生长的丙酮丁醇梭菌菌株进行所述方法。
因此生长培养基可以与梭菌生长培养基(CGM，Wiesenborn等，Appl.Environm.Microbiol.，54：2717-2722)或由Monot等(Appl.Environm.Microbiol.，44：1318-1324)或Vasconcelos等(J.Bacteriol.，176：1443-1450)提出的基本生长培养基具有相同或相似的组成。
用于丙酮丁醇梭菌培养的碳源是简单或复杂碳。简单碳源可以是阿拉伯糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖或木糖。特别优选的简单碳源是葡萄糖。复杂碳源可以是淀粉或半纤维素。特别优选的复杂碳源是淀粉。
有利地，进一步纯化回收的1，2-丙二醇。本领域的技术人员了解用于回收和纯化1，2-丙二醇的多种方法。
本发明在上文、下文和实施例中针对大肠杆菌描述。因此对于本发明的初始和进化菌株的可以削弱、缺失或过表达的基因主要使用来自大肠杆菌的基因的名称(denomination)来定义。然而，这种指定根据本发明具有更一般的意义，并覆盖了其他微生物中相应的基因。使用来自大肠杆菌的基因的GenBank参考符号(reference)，本领域的那些技术人员能确定大肠杆菌之外的其他生物体中的等同基因。
鉴定同源序列和它们的百分比同源性的方法是本领域的技术人员公知的，并且具体包括可以在网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/上以网站上指示的默认参数使用的BLAST程序。获得的序列可以使用例如程序CLUSTALW(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)以这些网站上指示的默认参数进行研究(比对)。
PFAM数据库(比对和隐藏的Markov模型的蛋白质家族数据库，http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)是蛋白质序列比对的大集合。每个PFAM能够显示多重比对，查看蛋白质域，评价生物体之间的分布，访问其他数据库并显示已知的蛋白质结构。
通过比较源自代表了44个主要的系统发生系的66个完全测序基因组的蛋白质序列而获得COG(蛋白质直向同源组的簇，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ COG/)。每个COG由至少三个系定义，从而能够鉴定古老的保守的域。
参考文献(按在本文中引用的顺序)
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实施例
实施例1：大肠杆菌MG1655 Ptrc16-gapA::cm(pME101VB01-yqhD-mgsA-gldA)、大肠杆菌MG1655 Ptrc16-gapA::cm(pME101VB01-yafB-mgsA-gldA)和大肠杆菌MG1655 Ptrc16-gapA::cm(pME101VB01-yqhE-mgsA-gldA)修饰菌株的构建：
为了增加1，2-丙二醇的产生，使用trc启动子由质粒pME101VB01表达基因的不同组合。
a)大肠杆菌MG1655(pME101VB01-yqhD-mgsA-gldA)、MG1655(pME101VB01-yafB-mgsA-gldA)和MG1655(pME101VB01-yqhE-mgsA-gldA)的修饰菌株的构建
质粒pME101VB01的构建
质粒pME101VB01衍生自质粒pME101，并且携带多克隆位点，其中包含对于罕见限制内切酶NheI、SnaBI、PacI、BglII、AvrII、SacII和AgeI特异性的识别位点序列，其后为丙酮丁醇梭菌ATCC824的adc转录终止子。
为了从低拷贝载体进行表达，如下构建质粒pME101。使用寡核苷酸PME101F和PME101R和来自载体pTrc99A(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，N.J)的携带lacI基因的BstZ17I-XmnI片段，对质粒pCL1920(Lerner& Inouye，1990，NAR 18，15p 4631-GenBank AX085428)进行PCR扩增，并将trc启动子插入到扩增的载体中。
PME101F(SEQ ID NO 1)：
ccgacagtaagacgggtaagcctg
PME101R(SEQ ID NO 2)：
agcttagtaaagccctcgctag
使用包含多克隆位点和adc转录终止子的合成双链核酸接头产生pME101VB01。将互补侧翼为(complement flanked by)NcoI或HindIII消化的限制性位点的两个100碱基的寡核苷酸退火。将100-碱基对产物亚克隆入用NcoI/HindIII消化的质粒pME101，以产生pME101VB01。
pME101VB011，由100个碱基组成(SEQ ID NO：3)：
catgggctagctacgtattaattaaagatctcctagggagctcaccggtTAAAAATAAGAGTTACCTTAAATGGTAACTCTTATTTTTTTAggcgcgcca
pME101VB012，由100个碱基组成(SEQ ID NO：4)：
agcttggcgcgccTAAAAAAATAAGAGTTACCATTTAAGGTAACTCTTATTTTTAaccggtgagctccctaggagatctttaattaatacgtagctagcc
具有：
-对应于多克隆位点的区域(带下划线的小写字母)
-对应于丙酮丁醇梭菌ATCC 824 pSOL1(NC_001988)的adc转录终止子(序列179847至179814)的区域(大写字母)。
用于表达1，2-丙二醇的生物合成途径的基因不同组合的质粒的构建(pME101VB01-yqhD-mgsA-gldA、pME101VB01-yafB-mgsA-gldA和pME101VB01-yqhE-mgsA-gldA)
使用表1给出的寡核苷酸从大肠杆菌MG1655的基因组DNA PCR扩增不同的基因。
表1.用于扩增1，2-丙二醇途径的基因的寡核苷酸
  基因名称   寡核苷酸名称   SEQ ID   与基因同源的区域   限制性位点
  yqhD   yqhDR2yqhDF2   N°5N°6   3153369-31534003154544-3154475   加入的BspHI去除的BspHI加入的NheI
  mgsA   mgsAFmgsAR   N°7N°8   1026268-10262481025780-1025800   加入的SnaBI加入的BglII
  gldA   gldAFgldAR   N°9N°10   4136631-41366124135512-4135530   加入的AvrII加入的SacI
  yafB   yafB F2yafB R   N°11N°12   229167-229190229970-229950   加入的NcoI加入的NheI
  yqhE   yqhE FyqhE R   N°13N°14   3154641-31546613155464-3155444   加入的NcoI加入的NheI
用表1中提及的限制性酶剪切PCR扩增的片段，并克隆入质粒pME101VB01的限制性位点。构建下述质粒：pME101VB01-yqhD-mgsA-gldA、pME101VB01-yafB-mgsA-gldA和pME101VB01-yqhE-mgsA-gldA。
将质粒导入菌株大肠杆菌MG1655中。
b)大肠杆菌MG1655 Ptrc16-gapA::cm的修饰菌株的构建
通过用FRT-CmR-FRT和工程改造的启动子取代上游gapA序列的225pb从而用合成的短Ptrc16启动子(SEQ ID NO 15：gagctgttgacgattaatcatccggctcgaataatgtgtgg)在菌株大肠杆菌MG1655中代替天然gapA启动子。使用的技术由Datsenko，K.A.& Wanner，B.L.(2000)描述。
根据操作规程1用于替换天然gapA启动子的两个寡核苷酸在表2中给出。
操作规程1：导入PCR产物用于重组和选择重组体
使用表2中选择和给出的用于替换基因或基因间区域的寡核苷酸从质粒pKD3扩增氯霉素抗性盒，或者从质粒pKD4扩增卡那霉素抗性盒(Datsenko，K.A.& Wanner，B.L.(2000)。然后将获得的PCR产物通过电穿孔导入携带质粒pKD46的受体菌株中，该质粒中表达的系统Red(..外源(exo))可极大促成同源重组。然后选择抗生素抗性转化体并用表3中给出的合适的寡核苷酸通过PCR分析检查抗性盒的插入。
将得到的菌株命名为大肠杆菌MG1655 Ptrc16-gapA::cm。
分别将这3个质粒导入菌株大肠杆菌MG1655 Ptrc16-gapA::cm。
表2.用于以PCR产物通过重组替换菌株大肠杆菌MG1655中染色体区域的寡核苷酸
  区域名称   寡核苷酸名称   SEQ ID   与染色体同源的区域
  gapA启动子(Ptrc 16-gapA)   Ptrc-gapAFPtrc 16-gapAR   N°16N°17   1860478-18605361860762-1860800
  edd和eda基因   DeddFDedaR   N°18N°19   1932582-19325011930144-1930223
  gloA基因   GLOAD fGLOA D R   N°20N°21   1725861-17259401726268-1726189
  aldA基因   AldA D faldAD r   N°22N°23   1486256-14863361487695-1487615
  aldB基因   AldB D faldBD r   N°24N°25   3752603-37526823754141-3754062
  ldhA基因   DldhAFDldhAR   N°26N°27   1440865-14407861439878-1439958
  pflAB基因   DpflBrDpflAf   N°28N°29   952315-952236949470-949549
  adhE基因   DadhErDadhEf   N°30N°31   1297344-12972641297694-1297773
  ackA-pta基因   DackAFDptaR   N°32N°33   2411494-24115732414906-2414830
  poxB基因   DpoxBFDpoxBR   N°34N°35   908557-908635910262-910180
  pykA基因   DpykAFDpykAR   N°36N°37   1935756-19358361755129-1755051
  pykF基因   DpykFFDpykFR   N°38N°39   1753689-17537661755129-1755051
表3.用于检查抗性盒的插入或抗性盒的丢失的寡核苷酸
  区域名称   寡核苷酸名称   SEQ ID   与染色体区域同源的区域
  gapA启动子(Ptrc16-gapA)   yeaAFgapAR   N°40N°41   1860259-18602871861068-1861040
  edd和eda基因   eddFedaR   N°42N°43   1932996-19329681929754-1929777
  gloA基因   NemAQdRnt Cr   N°44N°45   1725331至17253611726795至1726765
  aldA基因   Ydc F C fgapCCr   N°46N°47   1485722至14857521488225至1488195
  aldB基因   aldB C fYiaYCr   N°48N°49   3752056至37520953754674至3754644
  ldhA基因   ldhAFldhAR   N°50N°51   1439724至14397431441029至1441007
  pflAB基因   pflAB 1pflAB 2   N°52N°53   948462至948491953689至983660
  adhE   ychGfadhECr   N°54N°55   1294357to12943781297772至1297749
  ackA-pta基因   B2295YfcCR   N°56N°57   2410900至24109192415164至2415145
  poxB基因   poxBFpoxBR   N°58N°59   908475至908495910375至910352
  pykA基因   pykAFpykAR   N°60N°61   1935338至19353601937425至1937401
  pykF基因   pykFFpykFR   N°62N°63   1753371至17533921755518至1755495
实施例2：能以高产量产生1，2-丙二醇的大肠杆菌MG1655 Ptrc16-gapA，Δedd-eda，ΔgloA，ΔpykA，ΔpykF  (pME101VB01-yqhD-mgsA-gldA)，(pJB137-PgapA-ppsA)、大肠杆菌MG1655 Ptrc16-gapA，Δedd-eda，ΔgloA，ΔpykA，ΔpykF(pME101VB01-yafB-mgsA-gldA)，(pJB137-PgapA-ppsA)和大肠杆菌MG1655 Ptrc16-gapA，Δedd-eda，ΔgloA，ΔpykA，ΔpykF(pME101VB01-yqhE-mgsA-gldA)，(pJB137-PgapA-ppsA)修饰菌株的构建
使用操作规程1中所述的技术，用表2中给出的寡核苷酸，通过插入卡那霉素抗生素抗性盒并缺失相关基因的大部分而使菌株大肠杆菌MG1655中的基因edd-eda失活。将获得的菌株命名为MG1655Δedd-eda::km。
根据操作规程2将缺失转移至菌株大肠杆菌MG1655 Ptrc16-gapA::cm。
操作规程2：用噬菌体P1转导以缺失基因
通过用噬菌体P1转导的技术，通过由抗性盒(卡那霉素或氯霉素)代替受体大肠杆菌菌株中的基因而缺失所选的基因。操作规程有两个步骤，(i)在缺失单基因的菌株MG1655上制备噬菌体裂解物和(ii)用这个噬菌体裂解物转导受体菌株。
噬菌体裂解物的制备
-用单一基因缺失的菌株MG1655的100μl过夜培养物接种10ml LB+Cm 30μg/ml+葡萄糖0.2％+CaCl2 5mM。
-在37℃震荡培养30分钟。
-加入由野生型菌株MG1655制备的100μl噬菌体裂解物P1(约1×109个噬菌体/ml)。
-在37℃震荡3小时直至所有细胞裂解。
-加入200μl氯仿，并漩涡震荡。
-在4500g离心10分钟，以去除细胞碎片。
-将上清液转移至无菌管中，并加入200μl氯仿。
-在4℃保存裂解物。
转导
-将LB培养基中大肠杆菌受体菌株的5ml过夜培养物在1500g离心10分钟。
-将细胞沉淀悬浮于2.5ml MgSO4 10mM，CaCl2 5mM中。
-对照管：100μl细胞
包含单基因缺失的菌株MG1655的100μl噬菌体P1
-管测试：100μl细胞+包含单基因缺失的菌株MG1655的100μl噬菌体P1
-在30℃无震荡培养30分钟。
-在每个管中加入100μl柠檬酸钠，并漩涡震荡。
-加入1ml LB。
-在37℃震荡培养1小时。
-将管在7000rpm离心3分钟后涂布于LB+Cm 30μg/ml的平板上。
-在37℃过夜温育。
然后选择抗生素抗性转化体，并用合适的寡核苷酸通过PCR分析检查缺失的插入。
将得到的菌株命名为大肠杆菌MG1655 Ptrc16-gapA::cm，Δedd-eda::km。
然后根据操作规程3消除抗生素抗性盒。
操作规程3：抗性盒的消除
根据下述技术消除氯霉素和/或卡那霉素抗性盒。通过电穿孔将携带在氯霉素和/或卡那霉素抗性盒的FRT位点作用的FLP重组酶的质粒pCP20导入重组菌株。在42℃系列培养后，通过PCR分析用表3中给出的寡核苷酸检查抗生素抗性盒的丢失。
根据操作规程1，用表2中给出的寡核苷酸构建菌株MG1655ΔgloA::cm，并根据操作规程2将这个缺失转移至先前构建的菌株中。将得到的菌株命名为大肠杆菌MG1655 Ptrc16-gapA，ΔgloA::cm。
根据操作规程1，用表2中给出的寡核苷酸，通过插入卡那霉素抗生素抗性盒而失活先前菌株中的基因pykA。将得到的菌株命名为大肠杆菌MG1655 Ptrc16-gapA，
Figure A20088001710700212
ΔgloA::cm，ΔpykA::km。
然后根据操作规程3消除抗生素抗性盒。
根据操作规程1，用表2中给出的寡核苷酸，通过插入氯霉素抗生素抗性盒而失活先前菌株中的基因pykF。将得到的菌株命名为大肠杆菌MG1655Ptrc16-gapA，
Figure A20088001710700213
ΔgloA，ΔpykA，ΔpykF::cm。
然后根据操作规程3消除抗生素抗性盒。
在每个步骤，使用表3中给出的寡核苷酸检查先前建立的所有缺失是否存在。
为了增加磷酸烯醇丙酮酸的产生，使用gapA启动子由质粒pJB137表达基因ppsA。为了构建质粒pJB137-PgapA-ppsA，使用下述寡核苷酸从大肠杆菌MG1655的基因组DNAPCR扩增基因ppsA。
1.gapA-ppsAF，由65个碱基组成(SEQ ID NO 64)
ccttttattcactaacaaatagctggtggaatatATGTCCAACAATGGCTCGTCACCGCTGGTGC
具有：
-与基因ppsA(1785136至1782758)的序列(1785106-1785136)同源的区域(大写字母)，网站http://genolist.pasteur.frColibri/上的参照序列，和
-与gapA启动子(1860794-1860761)同源的区域(小写字母)。
2.ppsAR，由43个碱基组成(SEQ ID NO 65)
aatcgcaagcttGAATCCGGTTATTTCTTCAGTTCAGCCAGGC
具有：
-与基因ppsA(1785136至1782758)的序列(1782758-1782780)同源的区域(大写字母)
-限制性位点HindIII(带下划线的字母)。
同时使用下述寡核苷酸扩增大肠杆菌基因gapA的gapA启动子区域：
1.gapA-ppsAR，由65个碱基组成(SEQ ID NO 66)
GCACCAGCGGTGACGAGCCATTGTTGGACATatattccaccagctatttgttagtgaataaaagg
具有：
-与基因ppsA(1785136至1782758)的序列(1785106-1785136)同源的区域(大写字母)，和
-与gapA启动子(1860794-1860761)同源的区域(小写字母)。
2.ppsAF，由33个碱基组成(SEQ ID NO 67)
ACGTCCCGGGcaagcccaaaggaagagtgaggc
具有：
-与基因gapA启动子(1860639-1860661)同源的区域(小写字母)。
-限制性位点SmaI(带下划线的字母)。
随后使用寡核苷酸ppsAR和gapAF将两个片段融合(Horton等，1989 Gene77：61-68)。用限制性酶HindIII和SmaI剪切PCR扩增的片段，并克隆入载体pJB137(EMBL登录号U75326)的HindIII/SmaI位点中，产生载体pJB137-PgapA-ppsA。
将不同的pME101VB01质粒和pJB137-PgapA-ppsA导入菌株大肠杆菌MG1655Ptrc16-gapA，
Figure A20088001710700231
ΔgloA，ΔpykA，ΔpykF。将获得的菌株分别命名为大肠杆菌MG1655 Ptrc16-gapA，
Figure A20088001710700232
ΔgloA，ΔpykA，ΔpykF，pME101VB01-yqhD-mgsA-gldA，pJB137-PgapA-ppsA(菌株1)，大肠杆菌MG1655 Ptrc16-gapA，
Figure A20088001710700233
ΔgloA，ΔpykA，ΔpykF，pME101VB01-yafB-mgsA-gldA，pJB137-PgapA-ppsA(菌株2)和大肠杆菌MG1655 Ptrc16-gapA，
Figure A20088001710700234
ΔgloA，ΔpykA，ΔpykF，pME101VB01-yqhE-mgsA-gldA，pJB137-PgapA-ppsA(菌株3)。
实施例3：能以高于1摩尔/摩尔葡萄糖的得率产生1，2-丙二醇的大肠杆菌MG1655 Ptrc16-gapA，Δedd-eda，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，ΔldhA，ΔpflAB，ΔadhE，ΔackA-pta，ΔpoxB，ΔpykA，ΔpykF(pME101VB01-yqhD-mgsA-gldA)，(pJB137-PgapA-ppsA)、大肠杆菌MG1655 Ptrc16-gapA，Δedd-eda，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，ΔldhA，ΔpflAB，ΔadhE，ΔackA-pta，ΔpoxB，ΔpykA，ΔpykF(pME101VB01-yafB-mgsA-gldA)，(pJB137-PgapA-ppsA)和大肠杆菌MG1655Ptrc16-gapA，Δedd-eda，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，ΔldhA，ΔpflAB，ΔadhE，ΔackA-pta，ΔpoxB，ΔpykA，ΔpykF(pME101VB01-yqhE-mgsA-gldA)，(pJB137-PgapA-ppsA)修饰菌株的构建
根据操作规程1，用表2中给出的寡核苷酸构建菌株MG1655ΔaldA::km、MG1655ΔaldB::cm、MG1655ΔpflAB::km、MG1655ΔadhE::cm、MG1655ΔackA-pta::cm，并根据操作规程2将这些缺失转移至先前构建的菌株中。必要时，根据操作规程3消除抗生素抗性盒。
根据操作规程1，用表2中给出的寡核苷酸，通过插入氯霉素抗生素抗性盒而使先前构建的菌株中的基因ldhA和poxB失活。必要时，根据操作规程3消除抗生素抗性盒。
在每个步骤，使用表3中给出的寡核苷酸检查先前建立的所有缺失是否存在。
将得到的菌株命名为大肠杆菌MG1655 Ptrc16-gapA，
Figure A20088001710700241
ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，ΔldhA，ΔpflAB，ΔadhE，ackA-pta，ΔpoxB，ΔpykA，ΔpykF。
将不同的pME101VB01质粒和pJB137-PgapA-ppsA导入菌株大肠杆菌MG1655 Ptrc16-gapA，
Figure A20088001710700242
ΔgloA，
Figure A20088001710700243
ΔaldB，ΔldhA，ΔpflAB，ΔadhE，ΔackA-pta，ΔpoxB，ΔpykA，ΔpykF。将获得的菌株分别命名为大肠杆菌MG1655Ptrc16-gapA，
Figure A20088001710700244
ΔgloA，
Figure A20088001710700245
ΔaldB，ΔldhA，ΔpflAB，ΔadhE，ΔackA-pta，ΔpoxB，ΔpykA，ΔpykF，pME101VB01-yqhD-mgsA-gldA，pJB137-PgapA-ppsA，大肠杆菌MG1655 Ptrc16-gapA，
Figure A20088001710700246
ΔgloA，
Figure A20088001710700247
ΔaldB，ΔldhA，ΔpflAB，ΔadhE，ΔackA-pta，ΔpoxB，ΔpykA，ΔpyF，pME101VB01-yafB-mgsA-gldA，pJB137-PgapA-ppsA和大肠杆菌MG1655 Ptrc16-gapA，ΔgloA，
Figure A20088001710700249
ΔaldB，ΔldhA，ΔpflAB，ΔadhE，ΔackA-pta，ΔpoxB，ΔpykA，ΔpykF，pME101VB01-yqhE-mgsA-gldA，pJB137-PgapA-ppsA。
实施例4：在需氧条件下不同菌株的1，2-丙二醇生产的比较
在需氧条件下，在锥形瓶实验中，在以葡萄糖作为碳源的基本培养基中培养如实施例2中所述获得的菌株(菌株1、2和3)和对照菌株(对照1：MG1655pME101VB01-yqhD-mgsA-gldA，对照2：MG1655 pME101VB01-yafB-mgsA-gldA，对照3：MG1655 pME101VB01-yqhE-mgsA-gldA和对照4：MG1655Ptrc16-gapA，
Figure A200880017107002410
ΔgloA，ΔpykA，ΔpykF)。在34℃或37℃进行培养，并通过用MOPS缓冲培养基来保持pH。在培养结束时，通过HPLC分析发酵液中的1，2-丙二醇、丙酮醇和残余的葡萄糖，并计算1，2-丙二醇对葡萄糖的得率和1，2-丙二醇+丙酮醇对葡萄糖的得率。然后选择最佳菌株用于发酵罐补料分批培养。
  菌株   1，2-丙二醇效价(g/l)   丙酮醇效价(g/l)   1，2-丙二醇得率(g/g葡萄糖)   1，2-丙二醇+丙酮醇得率(g/g葡萄糖)
  对照1   0.02   0   0.004   0.004
  对照2   0   0   0   0
  对照3   0.01   0   0.002   0.002
  对照4   0.05   0.34   0   0.04
  菌株1   2.25   1.40   0.14   0.23
  菌株2   1.64   1.31   0.10   0.18
  菌株3   0.77   0.47   0.06   0.10
实施例5：用最佳菌株在补料分批培养中产生1，2-丙二醇
使用补料分批操作规程在21发酵罐中培养前面实验中选择的最佳菌株。
将培养的温度在37℃保持恒定，并使用NH4OH溶液将pH永久地调至6.5-8的值。在分批阶段中，搅拌速率保持在200-300rpm，并在补料分批阶段结束时，增加多至1000rpm。通过使用气体控制器，将溶氧的浓度保持在30-40％饱和度的值。当光密度达到三-五的值时，以0.3-0.5ml/h的初始流速开始补料分批培养，并逐渐增加至2.5-3.5ml/h的流速值。在此时使流速保持恒定24至48小时。分批培养的培养基基于包含浓度为300-500g/l的葡萄糖的基本培养基。
序列表
<110>代谢探索者公司(METABOLIC EXPLORER)
<120>用于产生1，2-丙二醇的代谢工程改造的微生物
<130>D25261
<150>PCT/IB2007/001675
<151>2007-03-23
<160>67
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>24
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>1
ccgacagtaa gacgggtaag cctg                                           24
<210>2
<211>22
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>2
agcttagtaa agccctcgct ag                                             22
<210>3
<211>100
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>3
catgggctag ctacgtatta attaaagatc tcctagggag ctcaccggtt aaaaataaga    60
gttaccttaa atggtaactc ttattttttt aggcgcgcca                         100
<210>4
<211>100
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>4
agcttggcgc gcctaaaaaa ataagagtta ccatttaagg taactcttat ttttaaccgg    60
tgagctccct aggagatctt taattaatac gtagctagcc                         100
<210>5
<211>43
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>5
cgatgcacgt catgaacaac tttaatctgc acaccccaac ccg                      43
<210>6
<211>79
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>6
ctagctagcg gcgtaaaaag cttagcgggc ggcttcgtat atacggcggc tgacatccaa    60
cgtaatgtcg tgattttcg                                                 79
<210>7
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>7
cgtacgtact gtaggaaagt taactacgg                                      29
<210>8
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>8
gaagatcttt acttcagacg gtccgcgag                                      29
<210>9
<211>28
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>9
gacctaggct ctaaaggagc aattatgg                                       28
<210>10
<211>26
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>10
cgagctctta ttcccactct tgcagg                                         26
<210>11
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>11
catgccatgg ctatccctgc atttggttta                                     30
<210>12
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>12
ctagctagct taatcccatt caggagccag                                     30
<210>13
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>13
catgccatgg ctaatccaac cgttattaag c                                   31
<210>14
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>14
ctagctagct tagccgccga actggtcagg                                     30
<210>15
<211>41
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成的启动子
<400>15
gagctgttga cgattaatca tccggctcga ataatgtgtg g                        41
<210>16
<211>100
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>16
agtcatatat tccaccagct atttgttagt gaataaaagc cacacattat tcgagccgga    60
tgattaatag tcaacagctc tgtaggctgg agctgcttcg                         100
<210>17
<211>79
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>17
gctcacatta cgtgactgat tctaacaaaa cattaacacc aactggcaaa attttgtccc    60
atatgaatat cctccttag                                                 79
<210>18
<211>102
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>18
cgcgcgagac tcgctctgct tatctcgccc ggatagaaca agcgaaaact tcgaccgttc    60
atcgttcgca gttggcatgc ggtgtaggct ggagctgctt cg                      102
<210>19
<211>100
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>19
gcttagcgcc ttctacagct tcacgcgcca gcttagtaat gcggtcgtaa tcgcccgctt    60
ccagcgcatc tgccggaacc catatgaata tcctccttag                         100
<210>20
<211>101
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>20
atgcgtcttc ttcataccat gctgcgcgtt ggcgatttgc aacgctccat cgatttttat    60
accaaagtgc tgggcatgaa gtgtaggctg gagctgcttc g                       101
<210>21
<211>100
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>21
ttagttgccc agaccgcgac cggcgtcttt ctcttcgatt aactcaattt tgtaaccgtc    60
cggatcttcc acaaacgcga catatgaata tcctccttag                         100
<210>22
<211>102
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>22
atgtcagtac ccgttcaaca tcctatgtat atcgatggac agtttgttac ctggcgtgga    60
gacgcatgga ttgatgtggt agtgtaggct ggagctgctt cg                      102
<210>23
<211>101
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>23
ttaagactgt aaataaacca cctgggtctg cagatattca tgcaagccat gtttaccatc    60
tgcgccgcca ataccggatt tcatatgaat atcctcctta g                       101
<210>24
<211>101
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>24
tcagaacagc cccaacggtt tatccgagta gctcaccagc aggcacttgg tttgctggta    60
atgctccagc atcatcttgt gtgtaggctg gagctgcttc g                       101
<210>25
<211>100
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>25
atgaccaata atcccccttc agcacagatt aagcccggcg agtatggttt ccccctcaag    60
ttaaaagccc gctatgacaa catatgaata tcctccttag                         100
<210>26
<211>100
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>26
gaaactcgcc gtttatagca caaaacagta cgacaagaag tacctgcaac aggtgaacga    60
gtcctttggc tttgagctgg tgtaggctgg agctgcttcg                         100
<210>27
<211>101
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>27
ttaaaccagt tcgttcgggc aggtttcgcc tttttccaga ttgcttaagt tttgcagcgt    60
agtctgagaa atactggtca gcatatgaat atcctcctta g                       101
<210>28
<211>100
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>28
ccggacatcc tgcgttgccg taaatctggt gttctgaccg gtctgccaga tgcatatggc    60
cgtggccgta tcatcggtga catatgaata tcctccttag                         100
<210>29
<211>100
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>29
gatgcactat aagatgtgtt aaaaacgctg tagcagaatg aagcgcggaa taaaaaagcg    60
gcaactcaat aaagttgccg tgtaggctgg agctgcttcg                         100
<210>30
<211>101
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>30
atggctgtta ctaatgtcgc tgaacttaac gcactcgtag agcgtgtaaa aaaagcccag    60
cgtgaatatg ccagtttcac tcatatgaat atcctcctta g                       101
<210>31
<211>100
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>31
caataacgaa tgatagcaat tttaagtagt taggaggtga aaaatgctgt caaaaggcgt    60
attgtcagcg cgtcttttca tgtaggctgg agctgcttcg                         100
<210>32
<211>100
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>32
cgagtaagtt agtactggtt ctgaactgcg gtagttcttc actgaaattt gccatcatcg    60
atgcagtaaa tggtgaagag tgtaggctgg agctgcttcg                         100
<210>33
<211>97
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>33
gctgctgtgc agactgaatc gcagtcagcg cgatggtgta gacgatatcg tcaaccagtg    60
cgccacggga caggtcgcat atgaatatcc tccttag                             97
<210>34
<211>99
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>34
ccttagccag tttgttttcg ccagttcgat cacttcatca ccgcgtccgc tgatgattgc    60
gcgcagcata tacaggctgc atatgaatat cctccttag                           99
<210>35
<211>102
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>35
cggttgcagc ttatatcgcc aaaacactcg aatcggcagg ggtgaaacgc atctggggag    60
tcacaggcga ctctctgaac ggtgtaggct ggagctgctt cg                      102
<210>36
<211>101
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>36
cgcggcgggt gccaacgttg tacgtatgaa cttttctcac ggctcgcctg aagatcacaa    60
aatgcgcgcg gataaagttc gtgtaggctg gagctgcttc g                       101
<210>37
<211>101
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>37
cgccgcatcc ggcaacgtac ttactctacc gttaaaatac gcgtggtatt agtagaaccc    60
acggtactca tcacgtcgcc ccatatgaat atcctcctta g                       101
<210>38
<211>98
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>38
cccatccttc tcaacttaaa gactaagact gtcatgaaaa agaccaaaat tgtttgcacc    60
atcggaccga aaaccgaatg taggctggag ctgcttcg                            98
<210>39
<211>99
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>39
ggacgtgaac agatgcggtg ttagtagtgc cgctcggtac cagtgcacca gaaaccataa    60
ctacaacgtc acctttgtgc atatgaatat cctccttag                           99
<210>40
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>40
gccacagccg gaatcatact tggtttggg                                      29
<210>41
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>41
cgtcaacacc aacttcgtcc catttcagg                                      29
<210>42
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>42
gggtagactc cattactgag gcgtgggcg                                      29
<210>43
<211>24
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>43
ccacatgata ccgggatggt gacg                                           24
<210>44
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR 引物
<400>44
gaagtggtcg atgccgggat tgaagaatgg g         31
<210>45
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>45
gggttacgtt tcagtgaggc gcgttctgcg g         31
<210>46
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>46
tgcagcggcg cacgatggcg acgttccgcc g         31
<210>47
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>47
cacgatgacg accattcatg cctatactgg c          31
<210>48
<211>40
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>48
catatttccc tcaaagaata taaaaaagaa caattaacgc 40
<210>49
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>49
tatgttcatg cgatggcgca ccagctgggc g          31
<210>50
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>50
gccatcagca ggcttagcgc               20
<210>51
<211>23
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>51
gggtattgtg gcatgtttaa ccg           23
<210>52
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>52
agacattaaa aatatacgtg cagctacccg    30
<210>53
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>53
gtgaaagctg acaacccttt tgatctttta    30
<210>54
<211>22
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>54
ggctcattgc accaccatcc ag            22
<210>55
<211>24
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>55
gaaaagacgc gctgacaata cgcc          24
<210>56
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Claims (31)

1.用于从碳源产生1，2-丙二醇的微生物，其中所述微生物的特征为：
-从磷酸二羟丙酮到1，2-丙二醇的生物合成途径的活性提高，和
-3-磷酸甘油醛脱氢酶的活性削弱。
2.根据权利要求1的微生物，其中所述微生物经过遗传修饰而增加从磷酸二羟丙酮到1，2-丙二醇的生物合成途径中涉及的至少一种酶的活性。
3.根据权利要求2的微生物，其中通过增加编码所述酶的基因的表达而获得至少一种酶的活性的增加。
4.根据权利要求3的微生物，其中选自下组的至少一个基因的表达增加：mgsA、yafB、yeaE、yghZ、yqhE、yqhD、ydhF、ycdW、yajO、ydjG、ydbC、tas、gldA和fucO。
5.根据权利要求4的微生物，其中三个基因mgsA、yqhD、和gldA的表达增加。
6.根据权利要求1至5中任一项的微生物，其中Entner-Doudoroff途径中涉及的至少一个酶的活性削弱。
7.根据权利要求6的微生物，其中下述基因中至少一个的表达削弱：edd、eda。
8.根据权利要求1至7中任一项的微生物，其中丙酮醛到乳酸的转化中涉及的至少一个酶的活性削弱。
9.根据权利要求8的微生物，其中下述基因中至少一个的表达削弱：gloA、aldA、aldB。
10.根据权利要求1至9的微生物，其中乳酸、甲酸或乙醇的合成中涉及的至少一个酶的活性削弱。
11.根据权利要求10的微生物，其中下述基因中至少一个的表达削弱：ldhA、pflA、pflB、adhE。
12.根据权利要求1至11中任一项的微生物，其中乙酸合成中涉及的至少一个酶的活性削弱。
13.根据权利要求12的微生物，其中下述基因中至少一个的表达削弱：ackA、pta、poxB。
14.根据权利要求1至13的微生物，其中糖输入的效率增加。
15.根据权利要求14的微生物，其中使用不依赖磷酸烯醇丙酮酸的糖输入系统。
16.根据权利要求15的微生物，其中选自galP和glk的至少一种基因的表达增加。
17.根据权利要求14的微生物，其中通过增加代谢物‘磷酸烯醇丙酮酸’的利用率而改进糖-磷酸转移酶系统的效率。
18.权利要求17的微生物，其中至少一种丙酮酸激酶的活性削弱。
19.根据权利要求18的微生物，其中选自pykA和pykF的至少一种基因的表达削弱。
20.根据权利要求17-19中任一项的微生物，其中磷酸烯醇丙酮酸合酶的活性增加。
21.根据权利要求20的微生物，其中ppsA基因的表达增加。
22.根据权利要求1-21中任一项的微生物，其中利于丙酮酸代谢成为乙酰-CoA的酶对于NADH的抑制的敏感度低于未修饰的酶。
23.根据权利要求22的微生物，其中lpd基因具有引起丙氨酸55被缬氨酸取代的点突变。
24.根据权利要求1至23中任一项的微生物，其中选自arcA和ndh的至少一种基因的表达削弱。
25.根据权利要求1至24中任一项的微生物，其中微生物选自下组：细菌、酵母和真菌。
26.根据权利要求25的微生物，其中微生物选自下组：肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、芽孢杆菌科(Bacillaceae)、梭菌科(Clostridiaceae)、链霉菌科(Streptomycetaceae)和棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)。
27.根据权利要求26的微生物，其中微生物是大肠杆菌(Escherichia coli)或丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)。
28.用于制备1，2-丙二醇的方法，其中根据权利要求1至27中任一项的微生物在包含碳源的合适的生长培养基中生长，并且回收产生的1，2-丙二醇。
29.根据权利要求28的方法，其中微生物是大肠杆菌，并且碳源是简单碳源。
30.根据权利要求28的方法，其中微生物是丙酮丁醇梭菌，并且碳源是复杂碳源。
31.根据权利要求28至30中任一项的方法，其中将回收的1，2-丙二醇进一步纯化。
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