KR20100015809A

KR20100015809A - １,２―프로판디올의 생산에 유용한 대사적으로 조작된 미생물

Info

Publication number: KR20100015809A
Application number: KR1020097022122A
Authority: KR
Inventors: 필리프 수카유; 프랑소와 보엘케르; 라이너 피게
Original assignee: 메타볼릭 익스플로러
Priority date: 2007-03-23
Filing date: 2008-03-21
Publication date: 2010-02-12
Also published as: AR066195A1; TW200909585A; IL200720A0; BRPI0809039A2; EP2139985A1; US20100261239A1; CN101679940A; CA2679987A1; WO2008116848A1; MX2009010219A; JP2010521190A

Abstract

본 발명은 - 디히드록시아세톤 포스페이트로부터 1,2-프로판디올로의 생합성 경로의 개선된 활성, 및 - 글리세르알데히드 3-포스페이트 데히드로게나제의 감쇠된 활성을 특징으로 하는, 탄소 공급원으로부터 1,2-프로판디올을 생산하는데 유용한 미생물에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 본 발명에 따른 미생물을 이용하여 발효에 의해 1,2-프로판디올을 생산하는 방법에 관한 것이다.

1,2-프로판디올, 미생물 발효, 물질대사 조작

Description

１,２―프로판디올의 생산에 유용한 대사적으로 조작된 미생물 {METABOLICALLY ENGINEERED MICROORGANISM USEFUL FOR THE PRODUCTION OF 1,2-PROPANEDIOL}

본 발명은 물질대사가 조작된 미생물 및 1,2-프로판디올의 제조에 있어서의 그의 용도에 관한 것이다.

C3 디알콜인 1,2-프로판디올 또는 프로필렌 글리콜은 널리 사용되는 화학물질이다. 이는 불포화 폴리에스테르 수지, 액체 세제, 냉각제, 부동제 및 비행기용 제빙액의 성분이다. 프로필렌 글리콜은 1993-1994년부터, 프로필렌 유도체보다 독성이 강한 것으로 알려져 있는 에틸렌 유도체의 대체물로서 점증적으로 사용되었다.

현재, 1,2-프로판디올은 다량의 물이 소모되는 프로필렌 옥시드 수화 공정을 이용한 화학적 방법에 의해 제조된다. 프로필렌 옥시드는 2가지 공정, 즉 에피클로르히드린을 이용한 공정 및 히드로퍼옥시드를 이용한 공정 중 하나에 의해 제조될 수 있다. 두 경로 모두에서 독성이 높은 물질이 사용된다. 또한, 히드로퍼옥시드 경로는 tert-부탄올 및 1-페닐 에탄올과 같은 부산물을 생성한다. 프로필렌의 제조가 유익하기 위해서는 이들 부산물이 유용해야 한다. 일반적으로, 화학적 경로에서는 라세미 1,2-프로판디올이 생성되며, 두 입체이성질체, 즉 (R)1,2-프로 판디올 및 (S)1,2-프로판디올은 각각, 특정 용도에 유익하다.

1,2-프로판디올의 화학적 제조 방법의 단점은 생물학적 합성법을 매력적인 대체법으로 만든다. 하기 2가지 경로는 당으로부터 미생물에 의해 1,2-프로판디올을 천연적으로 생산하는 것을 특징으로 한다.

제1 경로에서, 6-데옥시 당 (예를 들어, L-람노스 또는 L-푸코스)은 디히드록시아세톤 포스페이트 및 (S)-락트알데히드로 분해되고, 이는 추가로 (S)-1,2-프로판디올로 환원될 수 있다 (문헌 [Badia et al., 1985]). 이 경로는 이. 콜라이 (E. coli)에서 실용적이지만, 데옥시헥소스의 상승된 비용으로 인해 경제적으로 가능한 공정을 달성할 수 없다.

제2 경로는, 당분해 (glycolysis) 경로 및 이어서 메틸글리옥살 경로를 통한 통상적인 당 (예를 들어, 글루코스 또는 크실로스)의 대사이다. 디히드록시아세톤 포스페이트는 메틸글리옥살로 전환되고, 이는 락트알데히드 또는 아세톨로 환원될 수 있다. 이후, 상기 두 화합물은 2차 환원 반응을 통해 1,2-프로판디올을 생성할 수 있다. 이러한 경로는 (R)-1,2-프로판디올의 천연 생산자, 예컨대 클로스트리듐 스페노이데스 (Clostridium sphenoides) 및 써모안에어로박터 써모사카롤리티쿰 (Thermoanaerobacter thermosaccharolyticum)에 의해 이용된다. 클로스트리듐 스페노이데스는 포스페이트 제한 조건 하에 1.58 g/L의 역가로 1,2-프로판디올을 생성하는 데 사용되었다 (문헌 [Tran Din and Gottschalk, 1985]). 또한, 1,2-프로판디올의 제조를 위해 써모안에어로박터 써모사카롤리티쿰이 연구되었다 (문헌 [Cameron and Cooney, 1986]; [Sanchez-Rivera et al., 1987]). 얻어진 최대 성과 는 9 g/L의 역가 및 글루코스 1 g 당 0.2 g의 수율이었다. 그러나, 상기 유기체에 의해 얻어지는 성과의 개선은 이용가능한 유전자 도구의 부족으로 인해 제한되는 경향이 있다.

카메론(Cameron) 등 (1998)은 당을 1,2-프로판디올로 전환시키는 물질대사 조작을 위한 플랫폼(platform)으로서 이. 콜라이 (E. coli)의 용도를 조사해왔다. 그들의 이론상 분석은 실제 생산 수율의 상한이 (성장을 위한 질량 균형 및 에너지 생산을 고려하였을때) 배양 조건에 따라 현저하게 상이함을 보여주었다. 혐기성 조건 하에서는, 환원된 보조인자를 재활용하기 위해 부산물로서 아세테이트가 생산될 것이고, 최대 수율은 글루코스 1 몰당 1,2-프로판디올 1 몰로 제한될 것이다 (0.42 g/g). 호기성 조건 하에서는, 최종 전자 수용체로서 산소를 이용하는 호흡 사슬에 의해 보조인자의 재활용이 보장될 것이고, 부산물의 생산없이 1,2-프로판디올을 생산하는 것이 가능할 수 있다. 이러한 조건 하에서, 수율은 최대 1.42 몰/몰 (0.6 g/g)에 달할 수 있다. 1,2-프로판디올의 최대 역가를 고려하여, 카메론 등은 생성물과 부산물 독성에 대한 그의 의존 관계를 논의하였다. 1,2-프로판디올은 1,3-프로판디올에 비해 독성이 현저히 낮고, 이. 콜라이는 1,2-프로판디올 100 g/l로 0.5 h^-1의 잔여 성장 속도를 나타낸다. 성장이 억제되는 것은 성장을 매우 억제시키는 것으로 알려진 부산물 아세테이트로 인한 것으로 여겨진다. 1,2-프로판디올을 높은 역가 및 수율로 생산하기 위한 혐기성 공정의 개발에 있어서는 아세 테이트 문제가 다루어져야 할 것이다. 아세테이트를 덜 억제성이고 동일계내에서 쉽게 제거되는 아세톤으로 전환시키는 것은 이미 제안되어 있다 (WO 2005/073364).

카메론 그룹 (카메론 등, 1998, 알타라스(Altaras)와 카메론, 1999, 알타라스와 카메론, 2000) 및 베네트 그룹 (후앙(Huang) 등, 1999, 베리오스-리베라(Berrios-Rivera) 등, 2003)은 단일 탄소 공급원을 사용하는 1,2-프로판디올 생산자를 얻기 위해 이. 콜라이의 유전자 변형에 대한 여러 연구를 수행하였다. 이들 연구는 한편으로는 디히드록시아세톤 포스페이트로부터 1,2-프로판디올의 경로에서의 하나 또는 수 개의 효소적 활성의 발현에, 그리고 다른 한편으로는 숙주 균주에서의 NADH 및 탄소 소모 경로의 제거에 의존한다. 카메론 그룹이 얻은 최상의 결과는 혐기성 플라스크 배양시 소모된 글루코스 1 g 당 0.2 g의 수율로 1,2-프로판디올 1.4 g/l가 생성된 것이다. 혐기성 유가식 (fed-batch) 발효기에 대해 외삽하여 추론할 경우, 그들의 이론상 기대치와는 다르게 글루코스로부터 0.19 g/g의 수율로 1,2-프로판디올 4.5 g/l가 생산되었다. 이러한 성과는 락테이트 데히드로게나제 (ldhA)를 코딩하는 유전자가 결손된 균주에서 이. 콜라이의 메틸글리옥살 신타제 유전자 (mgs), 이. 콜라이의 글리세롤 데히드로게나제 유전자 (gldA) 및 이. 콜라이의 1,2-프로판디올 옥시도리덕타제 유전자 (fucO)의 과발현에 의해 얻어진다. 동일한 접근법으로 얻었지만 역가 및 수율이 낮은 결과가 또한 특허 US 6,087,140, US 6,303,352 및 WO 98/37204에 기술되어 있다.

베네트 그룹은 또한, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum)으로부터의 mgs 유전자 및 이. 콜라이로부터의 gldA 유전자의 과발 현을 위해 ldhA를 결여시킨 이. 콜라이 숙주 균주를 사용하였다. 혐기성 조건 하에서의 플라스크 배양으로 역가는 1.3 g/l 및 수율은 0.12 g/g이었고, 미호기성 배양으로 역가는 1.4 g/l 및 수율은 0.13 g/g이었다.

이 시점에서의 이와 같은 모든 결과들은 티. 설모사카롤리티쿰 (T. thermosaccharolyticum) 종으로 얻은 결과보다 좋지 않았다.

이. 콜라이에서 당분해 경로를 통한 글루코스의 이화작용은 프럭토스 1,6 비포스페이트의 절단 이후에 2 가지의 트리오스 포스페이트 분자, 즉 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP) 및 글리세르알데히드 3 포스페이트를 산출시킨다. 이들 2 가지의 트리오스 포스페이트 분자는 트리오스 포스페이트 이소머라제 활성에 의해 상호전환될 수 있다. 일반적으로 DHAP는 GA3P로 전환되고, 글루코스 기원의 2개의 GA3P는 추가로 이화되는 것으로 인식되어 있다.

소위 GAPDH라고도 부르는 글리세르알데히드 3-포스페이트 데히드로게나제는 글루코스를 피루브산으로 당분해적으로 전환시키는데 관여하는 핵심 효소 중 하나이다. GAPDH는 다음과 같은 반응을 촉매한다:

글리세르알데히드 3-포스페이트 + 포스페이트 + NAD ⁺ → 1,3-비포스포글리세레이트 + NADH + H ⁺

이 효소를 코딩하는 유전자가 1983년 이. 콜라이에서 클로닝되었고 (문헌 [Branlant et al., Gene, 1983]), "gap"으로 명명되었다. 이후에, 동일한 효소적 활성을 갖는 생성물을 코딩하는 또다른 유전자가 동정되었고, gapB로 명명되었다 (문헌 [Alefounder et al., Microbiol, 1987]). gapA 및 gapB 유전자를 결실시킨 이. 콜라이 균주의 특성은 gapB는 당분해에 필수적이지 않지만 gapA는 당분해에 본질적인 것임을 보여주었다 (문헌 [Seta et al., J. Bacter., 1997]). gapA 유전자가 하향 조절된 미생물이 글루코스로부터 발효에 의한 1,3-프로판디올의 생산에 관한 특허 출원 WO 2004/033646에 보고되어 있다.

본 출원의 발명자들은 1,2-프로판디올의 수율을 증가시키기 위해 다음 2 가지 인자를 조합하는 것이 요구됨을 보여준다:

- 1,2-프로판디올의 생합성 경로의 개선된 활성, 및

- GAPDH 활성의 감쇠.

또한, 본 발명자들은 세포내 포스포에놀피루베이트 농도를 증가시키는 것 또는 대안의 당 수송 시스템을 사용하는 것이 미생물의 발효에 의한 1,2-프로판디올의 생산을 추가로 증대시킬 수 있음을 증명한다.

<발명의 간단한 설명>

본 발명은

a) 디히드록시아세톤 포스페이트로부터 1,2-프로판디올로의 생합성 경로의 개선된 활성, 및

b) 글리세르알데히드 3-포스페이트 데히드로게나제의 감쇠된 활성

을 특징으로 하는, 탄소 공급원으로부터 1,2-프로판디올을 생산하는데 유용한 미생물에 관한 것이다.

DHAP로부터 1,2-프로판디올로의 생합성 경로의 개선된 활성은 상기 생합성 경로에 관여하는 1종 이상의 효소의 활성을 증가시키는 것에 의해 얻어진다. 이는 상기 효소를 코딩하는 유전자의 발현, 특히 mgsA, yqhD, yafB, ycdW, yqhE, yeaE, yghZ, yajO, tas, ydjG, ydbC, gldA 및 fucO 중에서 선택된 1종 이상의 유전자의 발현을 증가시키는 것에 의해 얻어질 수 있다. 바람직하게는, mgsA, yqhD 및 gldA의 3종의 유전자의 발현을 증가시킨다.

본 발명의 추가의 측면에서는, edd 또는 eda 유전자를 결실시키거나 또는 둘 다를 결실시켜 엔트너-두도로프 (Entner-Doudoroff) 경로를 제거한다. 추가로, 메틸글리옥살로부터 락테이트의 합성에 관여하는 효소 (예컨대 gloA, aldA, aldB), 피루베이트로부터 락테이트의 합성에 관여하는 효소 (ldhA), 포르메이트의 합성에 관여하는 효소 (pflA, pflB), 에탄올의 합성에 관여하는 효소 (adhE) 및 아세테이트의 합성에 관여하는 효소 (ackA, pta, poxB)를 코딩하는 유전자를 결실시켜 원치않는 부산물의 합성을 감쇠시킨다.

이용가능한 글리세르알데히드 3 포스페이트의 일부를 효소인 트리오스 포스페이트 이소머라제의 작용을 통해 1,2-프로판디올을 합성하는 방향으로 재설정하기 위해 글리세르알데히드 3 포스페이트의 활성을 감쇠시킨다. 이로서 글루코스에 대한 1,2-프로판디올의 수율은 1 몰/몰을 초과할 수 있다. 그러나, 포스포에놀피루베이트 (PEP)의 생산이 감소됨으로 인해 PEP-의존적 당 도입 시스템이 부정적인 영향을 받을 것이다. 따라서, 본 발명의 일 측면에서는, galP에 의해 코딩된 것과 같은 PEP에 의존하지 않는 당 도입을 이용하거나 또는 당-포스포트랜스퍼라제 시스템에 더 많은 PEP를 제공함으로써 당 도입 효율을 증가시킨다. 이는 피루베이트 키나제 (pykA 및 pykF 유전자에 의해 코딩됨)와 같은 PEP를 소모하는 경로를 제거하고/하거나, 예를 들어 PEP 신타제를 코딩하는 ppsA 유전자를 과발현시키는 것에 의해 PEP의 합성을 촉진시킴으로써 얻어진다.

부가적으로, 피루베이트를 아세틸-CoA로 전환시키는 효소를 혐기성 조건 하에서 발견되는 고농도의 NADH에 내성을 갖게 하는 것이 유익하다. 이는 lpd 유전자에서의 특정 돌연변이에 의해 얻어질 수 있다. 마지막으로, 아세톨이 1,2-프로판디올로 환원되는데 NADH가 사용될 수 있도록 arcA 및 ndh 유전자를 결실시킬 수 있다.

1,2-프로판디올을 제조하는데 사용되는 미생물은 박테리아, 효모 및 진균 중에서 선택되지만, 주로 에셰리키아 콜라이 (Escherichia coli) 또는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 종에서 선택된다.

또한, 본 발명의 목적은 변형된 미생물을 적절한 성장 배지에서 배양하고, 생산된 1,2-프로판디올을 회수 및 정제하는 것에 의한 1,2-프로판디올의 생산 공정을 제공하는 것이다.

본 명세서에 포함되어 그 일부를 구성하는 첨부된 도면은 본 발명을 예시하며, 발명의 상세한 설명과 함께 본 발명의 원리를 설명한다.

도 1은 탄수화물로부터의 1,2-프로판디올 생산 시스템 개발에 있어서 중추 물질대사의 유전자 조작을 도시한다.

본원에서 사용된 하기 용어는 청구의 범위 및 명세서의 해석을 위해 사용될 수 있다.

본 발명에 따르면, 용어 "배양", "성장" 및 "발효"는 상호 교환적으로 사용되며 단일 탄소 공급원을 함유하는 적절한 성장 배지에서의 박테리아의 성장을 의미한다.

본 발명에 따르면, 용어 "탄소 공급원"은 미생물의 정상적인 성장을 지원하기 위해 당업자가 사용할 수 있는 임의의 탄소 공급원을 의미하며, 6탄당, 5탄당, 단당류, 이당류, 올리고당류, 전분 또는 그의 유도체, 헤미셀룰로스, 글리세롤 및 이들의 조합일 수 있다.

용어 "1,2-프로판디올을 생산하는데 유용한"이란 미생물이 바람직하게는 발효에 의해 상기 관심 생성물을 생산하는 것을 의미한다. 발효는 호기성, 미호기성 또는 혐기성 조건 하에서 수행될 수 있는 고전적인 공정이다.

문구 "효소의 활성의 감쇠"란 임의의 변형 이전의 최초 균주에서의 활성에 비해 변형된 균주에서의 관심 효소의 활성이 감소된 것을 말한다. 당업자는 이러한 결과를 얻기 위한 수많은 방법들을 알고 있다. 가능한 예로는 다음과 같은 것이 있다:

- 돌연변이를 유전자에 도입하여 이 유전자의 발현 수준 또는 코딩된 단백질의 활성 수준을 감소시킨다.

- 유전자의 천연 프로모터를 낮은 강도의 프로모터로 대체하여 저수준의 발현을 일으킨다.

- 상응하는 전령 RNA 또는 단백질을 불안정화시키는 요소를 사용한다.

- 발현이 전혀 필요하지 않다면, 그 유전자를 결실시킨다.

용어 "발현"은 유전자의 상응하는 단백질 생성물을 산출시키는 유전자 서열의 전사 및 판독을 말한다.

유익하게는, 글리세르알데히드 3-포스페이트 데히드로게나제의 활성이 동일한 조건 하에서 비변형된 균주에서 관찰되는 활성에 비해 30％ 미만이고, 보다 바람직하게는 10％ 미만이다.

용어 "디히드록시아세톤 포스페이트로부터 1,2-프로판디올로의 생합성 경로의 개선된 활성"이란 이 경로에 관여하는 1종 이상의 효소적 활성이 개선된 것을 의미한다 (이하 참조).

유익하게는, 본 발명의 미생물은 디히드록시아세톤 포스페이트로부터 1,2-프로판디올로의 생합성 경로에 관여하는 1종 이상의 효소의 활성을 증가시키도록 유전적으로 변형된다.

바람직하게는, 효소의 활성의 증가는 그러한 효소를 코딩하는 유전자의 발현을 증가시키는 것에 의해 얻어진다.

관심 유전자를 과발현시키기 위해, 당업자는 다음과 같은 상이한 방법들을 알고 있다:

- 내생적 프로모터를 보다 강한 프로모터로 대체.

- 상기 관심 유전자를 운반하는 발현 벡터를 미생물로 도입.

- 관심 유전자의 추가 복제물을 염색체로 도입.

현재 몇몇 기술들이 DNA를 박테리아 균주에 도입하는데 사용되고 있다. 바람직한 기술은 전기 천공법이며, 이는 당업자들에게 널리 알려져 있다.

유익하게는, mgsA, yafB, yeaE, yghZ, yqhE, yqhD, ydhF, ycdW, yajO, ydjG, ydbC, tas, gldA 및 fucO로부터 선택된 1종 이상의 관심 유전자를 과발현시킨다.

mgsA 유전자는 DHAP의 메틸글리옥살로의 전환을 촉매하는 메틸글리옥살 신타제를 코딩한다. yafB, yeaE, yghZ, yqhE, yqhD, ydhF, ycdW, yajO, ydjG, ydbC, tas 유전자는 메틸글리옥살을 아세톨로 전환시킬 수 있는 효소적 활성을 코딩한다. gldA 유전자는 아세톨의 1,2-프로판디올로의 전환을 촉매하는 글리세롤 데히드로게나제를 코딩한다. fucO 유전자는 락트알데히드의 1,2-프로판디올로의 전환을 촉매하는 1,2-프로판디올 옥시도리덕타제를 코딩한다.

바람직한 미생물은 3종의 특정 관심 유전자, 즉 mgsA, yqhD 및 gldA를 과발현시키는 변형을 갖는다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 미생물에서 엔트너-두도로프 경로에 관여하는 1종 이상의 유전자를 감쇠시킨다. 엔트너-두도로프 경로는 글루코스를 당분해 이외에도 글리세르알데히드-3-포스페이트 및 피루베이트로 분해시키는 다른 길을 제공한다. 엔트너-두도로프 경로를 감쇠시키는 것은 최대의 또는 가장 바람직하게는 모든 글루코스가 당분해를 통해 분해되어 1,2-프로판디올을 생산하는데 사용되는 것을 보장한다.

특히 이 경로의 2종의 유전자 중 1종 이상, 즉 edd 또는 eda를 감쇠시킨다.

본 발명에 따르면, 용어 "유전자 발현의 감쇠"는 유전자의 발현을 부분적으로 또는 완전히 억제하여 "감쇠시키는" 것을 의미한다. 이러한 발현의 억제는 유전자 발현의 저해, 유전자의 활성화 메카니즘의 억제, 유전자 발현을 위해 필요한 프로모터 영역의 전부 또는 일부의 결실, 또는 유전자 코딩 영역의 결실일 수 있다. 바람직하게는, 유전자의 감쇠는 본질적으로 그 유전자의 완전한 결실로서, 유전자는 본 발명에 따른 균주의 동정, 단리 및 정제를 용이하게 하는 선택 마커 유전자에 의해 대체될 수 있다. 유전자는 문헌 [Datsenko, K.A. & Wanner, B.L. (2000) "One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 6640-6645]에 기재되어 있는 상동 재조합 기술에 의해 바람직하게 불활성화된다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 미생물에서, 메틸글리옥살을 락테이트로 전환시키는데 관여하는 1종 이상의 효소를 감쇠시킨다. 이러한 감쇠의 목적은 이용가능한 메틸글리옥살이 세포 기관에 의해 1,2-프로판디올을 합성하는데 본질적으로 사용되도록 하기 위함이다 (도 1 참조).

메틸글리옥살을 락테이트로 전환시키는데 관여하는 유전자는 특히

- 글리옥살라제 활성을 갖는 효소를 코딩하는 유전자, 예컨대 메틸글리옥살로부터 락토일 글루타티온의 합성을 촉매하는 글리옥살라제 I을 코딩하는 gloA 유전자;

- ((S) 락트알데히드로부터 (S) 락테이트의 합성을 촉매하는) 락트알데히드 데히드로게나제를 코딩하는 aldA 및 aldB 유전자이다.

이들 유전자의 1종 이상의 발현을 최초 균주에서 유익하게 감쇠시킨다. 바람직하게는 gloA 유전자를 완전히 결실시킨다.

본 발명의 미생물에서, 락테이트, 에탄올 및 포르메이트와 같은 부산물의 합성에 관여하는 1종 이상의 효소를 감쇠시키는 것이 바람직하다.

특히, 피루베이트로부터 락테이트의 합성을 촉매하는 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 ldhA 유전자, 및 아세틸-CoA로부터 에탄올의 합성을 촉매하는 알콜-알데히드 데히드로게나제를 코딩하는 adhE 유전자를 감쇠시키는 것이 유익하다.

이와 유사하게, 미생물이 피루베이트 데히드로게나제 복합체를 이용하게 하여 아세틸-CoA 및 포르메이트 대신에 피루베이트로부터 아세틸-CoA, CO₂ 및 NADH를 생산하게 하는 것이 가능하다. 이는 피루베이트 포르메이트 리아제를 코딩하는 pflA 및 pflB 유전자를 감쇠시키는 것에 의해 달성될 수 있다.

본 발명의 다른 특정 실시양태에서는, 부산물인 아세테이트의 합성에 관여하는 1종 이상의 효소를 감쇠시킴으로써 아세테이트의 합성을 방지한다. 1,2-프로판디올의 생산을 최적화하기 위해서는 아세테이트가 합성되는 것을 피하는 것이 바람직하다.

아세테이트의 생산을 방지하기 위해, 유익하게는 ackA, pta 및 poxB 중에서 선택된 1종 이상의 유전자의 발현을 감쇠시킨다. 이들 유전자는 모두 상이한 아세테이트 생합성 경로에 관여하는 효소를 코딩한다 (도 1 참조).

바람직하게는, 본 발명에 따른 미생물에서 당 도입 효율을 증가시킨다. GAPDH 반응에서 탄소 유동량이 50％를 초과하여 감소되도록 gapA 유전자의 발현을 강력하게 감쇠시키는 것은 도입되는 글루코스 1 몰당 1 몰 미만의 포스포에놀피루베이트 (PEP)가 합성되게 할 것이다. PEP는 세포에 단일 당을 도입시키는데 정상적으로 사용되는 당-포스포트랜스퍼라제 시스템 (PTS)에 요구되며, 당 도입은 PEP로부터 글루코스로의 인-전이와 연결되어 글루코스-6-포스페이트를 산출한다. 따라서, PEP의 양을 감소시키는 것은 당 도입에 부정적인 영향을 미칠 것이다.

본 발명의 특정 실시양태에서, 당은 포스포에놀피루베이트에 의존하지 않는 당 도입 시스템에 의해 미생물에 도입될 수 있다. 인산화에 관여하지 않는 galP 유전자에 의해 코딩되는 갈락토스-양성자 공동수송체 (symporter)가 사용될 수 있다. 이러한 경우, 도입된 글루코스는 glk 유전자에 의해 코딩되는 글루코스 키나제에 의해 인산화되어야 한다. 상기 경로를 촉진하기 위해서는, galP 및 glk로부터 선택된 1종 이상의 유전자의 발현을 증가시킨다. 그 결과, PTS가 없어도 무방해지며 (dispensable), 이는 ptsH, ptsI 또는 crr로부터 선택된 1종 이상의 유전자를 감쇠시킴으로써 제거될 수 있다.

본 발명의 또다른 특정 실시양태에서, 당-포스포트랜스퍼라제 시스템 (PTS)의 효율은 대사물질인 포스포에놀피루베이트의 이용률을 증가시킴으로써 증가된다. gapA 활성의 감쇠 및 피루베이트로의 하위 탄소 유동량의 감쇠로 인해 본 발명의 변형 균주에서의 PEP 양이 제한될 수 있으며, 이에 따라 세포로 수송되는 글루코스의 양이 감소된다.

미생물 균주에서 PEP의 이용률을 증가시키기 위해 이용될 수 있는 다양한 방법이 존재한다. 특히, 한 방법은 PEP → 피루베이트 반응을 감쇠시키는 것이다. 우선적으로는, 피루베이트 키나제 효소를 코딩하는 pykA 및 pykF로부터 선택된 1종 이상의 유전자를 상기 균주에서 감쇠시켜 상기 결과를 달성한다. PEP의 이용률을 증가시키기 위한 또다른 방법은 포스포에놀피루베이트 신타제 효소의 활성을 증가시킴으로써, 포스포에놀피루베이트 신타제가 촉매하는 피루베이트 → PEP 반응을 촉진하는 것이다. 상기 효소는 ppsA 유전자에 의해 코딩된다. 따라서, 우선적으로는 미생물에서, ppsA 유전자의 발현을 증가시킨다. 상기 두 변형은 미생물에서 동시에 존재할 수 있다.

특히 혐기성 또는 미호기성 조건 하에서, 피루베이트를 아세틸-CoA로 전환시키는 피루베이트 데히드로게나제 복합체 (PDC)가 NADH에 의한 저해에 덜 민감한 것이 유익하다. 덜 민감하다는 것은 변형되지 않은 효소의 민감도에 대해 상대적으로 정의된다. 그러한 특성은 효소의 단백질 서열에서 알라닌 55가 발린 잔기로 대체시키는 (PDC의 리포아미드 데히드로게나제 서브유닛을 코딩하는) lpd 유전자에 특정 돌연변이를 도입하는 것에 의해 얻어질 수 있다.

혐기성 또는 미호기성 조건 하에서, 전구체를 1,2-프로판디올로 환원시키는데 있어서 NADH의 이용률이 유익하게 증가된다. 이는 광역 조절자 ArcA (arcA 유전자에 의해 코딩됨)에 의해 매개되는 트리카르복실산 회로에 대한 억제를 완화시키는 것에 의해 얻어진다. 세포에서의 NADH 농도는 또한 ndh 유전자에 의해 코딩되는 NADH 데히드로게나제 II를 불활성화시키는 것에 의해 증가될 수 있다. 따라서, 바람직하게는, arcA 및 ndh 중에서 선택된 1종 이상의 유전자를 감쇠시킨다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 미생물을 박테리아, 효모 및 진균 중에서 선택한다. 보다 바람직하게는, 미생물을 엔테로박테리아세아 (Enterobacteriaceae), 바실라세아 (Bacillaceae), 클로스트리디아세아 (Clostridiaceae), 스트렙토마이세타세아 (Streptomycetaceae) 및 코리네박테리아세아 (Corynebacteriaceae)로 이루어진 군으로부터 선택한다. 보다 더 바람직하게는, 미생물은 에셰리키아 콜라이 또는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰이다.

본 발명의 또다른 목적은 단일 탄소 공급원을 함유하는 적절한 성장 배지에서 상기한 바와 같은 미생물을 성장시키고, 생산된 1,2-프로판디올을 회수함으로써 1,2-프로판디올을 제조하는 방법이다. 1,2-프로판디올의 생산은 호기성, 미호기성 또는 혐기성 조건 하에 수행된다.

발효 과정을 위한 배양 조건은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 특히, 박테리아는 20 내지 55 ℃, 바람직하게는 25 내지 40 ℃의 온도, 바람직하게는 씨. 아세토부틸리쿰 (C. acetobutylicum)의 경우에 약 35 ℃, 이. 콜라이의 경우에 약 37 ℃에서 발효된다.

상기 공정은 뱃치 공정, 유가식 공정 또는 연속식 공정으로 수행될 수 있다.

"호기성 조건 하에"란, 산소 기체를 액체 상에 용해시킴으로써 산소를 배양물에 공급하는 것을 의미한다. 이는 (1) 산소-함유 기체 (예를 들어, 공기)를 액체 상에 살포하거나, (2) 배양 배지를 함유하는 용기를 흔들어서 두부 공간에 함유된 산소를 액체 상에 전달함으로써 달성될 수 있다. 혐기성 조건이 아닌 호기성 조건 하에서의 발효의 이점은, 전자 수용체로서의 산소의 존재가 균주의 능력을 개선시켜 세포 과정을 위한 ATP 형태의 에너지가 더 많이 생성된다는 점이다. 따라서, 균주는 개선된 전체 물질대사를 갖게 된다.

미호기성 조건은 낮은 백분율의 산소 (예를 들어, 0.1 내지 10％의 산소 (질소에 의해 100％가 달성됨)를 함유하는 기체의 혼합물이 사용됨)가 액체 상에 용해된 배양 조건으로서 정의된다.

혐기성 조건은 배양 배지에 산소가 전혀 제공되지 않은 배양 조건으로서 정의된다. 극혐기성 조건은 질소와 같은 불활성 기체를 배양 배지에 살포하여 미량의 다른 기체를 제거함으로써 달성된다. 균주에 의한 ATP 생성을 개선하고 그의 물질대사를 개선하기 위해 니트레이트가 전자 수용체로서 사용될 수 있다.

본 발명에 따르면, 용어 "적절한 성장 배지"는 미생물의 성장을 위해 개조된 공지의 분자적 조성의 배지를 의미한다. 예로서, 사용되는 박테리아에 대하여 개조된, 1종 이상의 탄소 공급원을 함유하는 공지된 설정 조성의 미네랄 배양 배지를 들 수 있다. 특히, 이. 콜라이용 미네랄 성장 배지는 M9 배지 (문헌 [Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 32:120-128]), M63 배지 (문헌 [Miller, 1992; A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York]), 또는 문헌 [Schaefer et al., 1999, Anal. Biochem. 270:88-96]에 정의된 것과 같은 배지, 특히 하기 기재된 최소 배양 배지 (MPG로 지칭됨)와 동일하거나 유사한 조성의 배지일 수 있다:

배지의 pH는 수산화나트륨으로 7.4로 조정한다.

^* 미량 성분 용액 : 시트르산 4.37 g/L, MnSO₄ 3 g/L, CaCl₂ 1 g/L, CoCl₂, 2H₂O 0.1 g/L, ZnSO₄, 7H₂O 0.10 g/L, CuSO₄, 5H₂O 10 mg/L, H₃BO₃ 10 mg/L, Na₂MoO₄ 8.31 mg/L.

본 발명의 특정 실시양태에서는, 아라비노스, 프럭토스, 갈락토스, 글루코스, 락토스, 말토스, 수크로스 또는 크실로스일 수 있는 단일 탄소 공급원을 함유하는 배지 중에서 성장시킨 이. 콜라이 균주를 이용하여 이 방법을 수행한다. 특히 바람직한 단일 탄소 공급원은 글루코스이다.

본 발명의 다른 특정 실시양태에서는, 단일 또는 복합 탄소 공급원을 함유하는 배지 중에서 성장시킨 씨. 아세토부틸리쿰 균주를 이용하여 이 방법을 수행한다.

따라서, 성장 배지는 클로스트리디아 성장 배지 (CGM, 문헌 [Wiesenborn et al., Appl. Environm. Microbiol., 54:2717-2722]), 또는 문헌 [Monot et al., Appl. Environm. Microbiol., 44:1318-1324] 또는 [Vasconcelos et al., J. Bacteriol., 176:1443-1450]이 제공하는 미네랄 성장 배지와 동일하거나 유사한 조성의 배지일 수 있다.

씨. 아세토부틸리쿰의 배양에 사용되는 탄소 공급원은 단일 또는 복합 탄소 공급원이다. 단일 탄소 공급원은 아라비노스, 프럭토스, 갈락토스, 글루코스, 락토스, 말토스, 수크로스 또는 크실로스일 수 있다. 특히 바람직한 단일 탄소 공급원은 글루코스이다. 복합 탄소 공급원은 전분 또는 헤미셀룰로스일 수 있다. 특히 바람직한 복합 탄소 공급원은 전분이다.

유익하게는, 회수된 1,2-프로판디올을 추가로 정제한다. 당업자는 1,2-프로판디올을 회수 및 정제하는 수많은 방법들을 알고 있다.

본 발명은 상기, 하기 및 실시예에서 이. 콜라이에 대해 기술하고 있다. 따라서, 본 발명에 따른 최초 및 진화된 균주에서 감쇠, 결실 또는 과발현될 수 있는 유전자는 주로 이. 콜라이로부터의 유전자의 명칭을 사용하여 정의된다. 그러나, 이러한 정의는 본 발명에 따라 보다 일반적인 의미를 가지며, 다른 미생물에서의 상응하는 유전자를 포괄한다. 당업자는 이. 콜라이로부터의 유전자에 대한 진뱅크 (GenBank) 관리번호를 이용하여 이. 콜라이 이외의 다른 유기체에서 동등한 유전자를 결정할 수 있다.

상동성 서열 및 그의 상동성 (％)의 확인 방법은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 특히 웹사이트 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ 상에서 이 웹사이트에 명시된 디폴트 파라미터와 함께 이용될 수 있는 BLAST 프로그램이 포함된다. 얻어진 서열은, 예를 들어 CLUSTALW 프로그램 (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)을 상기 웹사이트에 명시된 디폴트 파라미터와 함께 이용하여 조사 (정렬)할 수 있다.

PFAM 데이타베이스 (정렬된 서열 및 은닉 마르코프 모델에 대한 단백질 군 데이타베이스, http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)는 정렬된 단백질 서열들의 거대한 모음집이다. 각 PFAM을 이용하여 다수의 정렬을 가시화하고, 단백질 도메인을 보고, 유기체 사이의 분포를 평가하고, 다른 데이타베이스로의 접근을 획득하고, 공지된 단백질 구조를 가시화할 수 있다.

COG (단백질의 병렬상동 (orthologous) 군의 클러스터, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)는, 44개의 주요 계통발생학적 계통을 나타내는 66개의 전장 서열화된 단일세포 게놈으로부터 유래된 단백질 서열들을 비교함으로써 얻어진다. 각 COG는 3개 이상의 계통으로부터 정의되며, 이에 따라 선조 (ancient) 보존 도메인을 식별할 수 있다.

실시예 1: 이. 콜라이 MG1655 Ptrc16-gapA::cm (pME101VB01-yqhD-mgsA-gldA), 이. 콜라이 MG1655 Ptrc16-gapA::cm (pME101VB01-yafB-mgsA-gldA) 및 이. 콜라이 MG1655 Ptrc16-gapA::cm (pME101VB01-yqhE-mgsA-gldA)의 변형 균주의 구축

1,2-프로판디올의 생산을 증가시키기 위해, trc 프로모터를 이용하여 플라스미드 pME101VB01로부터 상이한 조합의 유전자를 발현시켰다.

a) 변형된 이. 콜라이 균주 MG1655 (pME101VB01-yqhD-mgsA-gldA), MG1655 (pME101VB01-yafB-mgsA-gldA) 및 MG1655 (pME101VB01-yqhE-mgsA-gldA)의 구축

플라스미드 pME101VB01의 구축

플라스미드 pME101로부터 플라스미드 pME101VB01를 유래시키고, 드문 제한 엔도뉴클레아제 NheI, SnaBI, PacI, BglII, AvrII, SacII 및 AgeI에 특이적인 인식 부위 서열을 함유하는 다중 클로닝 부위에 이어 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 ATCC 824의 adc 전사 종결인자를 보유시켰다.

소량 복제 벡터로부터의 발현을 위해 플라스미드 pME101을 다음과 같이 구축하였다. 올리고뉴클레오티드 PME101F 및 PME101R과, lacI 유전자를 보유하는 pTrc99A 벡터 (아멀샴 파마시아 바이오테크(Amersham Pharmacia Biotech, 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)로부터의 BstZ17I-XmnI 단편을 이용하여 플라스미드 pCL1920 (문헌 [Lerner & Inouye, 1990, NAR 18, 15 p 4631 - GenBank AX085428)을 PCR 증폭시키고, 증폭된 벡터에 trc 프로모터를 삽입하였다.

PME101F (서열 1):

ccgacagtaagacgggtaagcctg

PME101R (서열 2):

agcttagtaaagccctcgctag

다중클로닝 부위 및 adc 전사 종결인자를 포함하는 합성 이중-사슬 핵산 링커를 이용하여 pME101VB01을 생성하였다. NcoI 또는 HindIII 소화된 제한 부위의 측면에 상보적인 두 개의 100 염기의 올리고뉴클레오티드를 어닐링시켰다. 상기 100-염기쌍 생성물을 NcoI/HindIII 소화된 플라스미드 pME101에 서브클로닝하여 pME101VB01을 생성하였다.

100개의 염기로 이루어진 pME101VB01 1 (서열 3):

catgggctagctacgtattaattaaagatctcctagggagctcaccggtTAAAAATAAGAGTTACCTTAAATGGTAACTCTTATTTTTTTAggcgcgcca

100개의 염기로 이루어진 pME101VB01 2 (서열 4):

agcttggcgcgccTAAAAAAATAAGAGTTACCATTTAAGGTAACTCTTATTTTTAaccggtgagctccctaggagatctttaattaatacgtagctagcc

[상기 서열은

- 다중클로닝 부위에 상응하는 영역 (밑줄친 소문자 부분) 및

- 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 ATCC 824 pSOL1 (NC_001988)의 adc 전사 종결인자 (서열 179847 내지 179814)에 상응하는 영역 (대문자 부분)

을 포함함]

1,2-프로판디올의 생합성 경로의 상이한 유전자 조합의 발현을 위한 플라스미드의 구축 (pME101VB01-yqhD-mgsA-gldA, pME101VB01-yafB-mgsA-gldA 및 pME101VB01-yqhE-mgsA-gldA)

표 1에 나타낸 올리고뉴클레오티드를 이용하여 이. 콜라이 MG1655의 게놈 DNA로부터 상이한 유전자를 PCR 증폭시켰다.

PCR 증폭된 단편을 표 1에서 언급한 제한 효소로 절단하고, 플라스미드 pME101VB01의 제한 부위에 클로닝하였다. 다음과 같은 플라스미드가 제조되었다: pME101VB01-yqhD-mgsA-gldA, pME101VBO1-yafB-mgsA-gldA 및 pME101VB01-yqhE-mgsA-gldA.

이어서, 상기 플라스미드를 이. 콜라이 균주 MG1655에 도입하였다.

b) 변형된 이. 콜라이 균주 MG1655 Ptrc16-gapA::cm의 구축

225 pb의 상류 gapA 서열을 FRT-CmR-FRT 및 조작된 프로모터로 대체함으로써 이. 콜라이 균주 MG1655에서 천연 gapA 프로모터를 합성 단 Ptrc16 프로모터 (서열 15: gagctg ttgacg attaatcatccggctcg aataat gtgtgg)로 대체하였다. 사용된 기술은 문헌 [Datsenko, K.A. & Wanner, BX. (2000)]에 기재되어 있다.

프로토콜 1에 따라 천연 gapA 프로모터를 대체하는데 사용한 2종의 올리고뉴클레오티드를 표 2에 나타내었다.

프로토콜 1: 재조합을 위한 PCR 생성물의 도입 및 재조합체의 선택

유전자 또는 유전자간 영역을 대체하기 위해 선택된 올리고뉴클레오티드 (하기 표 2에 나타냄)를 이용하여 플라스미드 pKD3으로부터 클로람페니콜 내성 카세트 또는 플라스미드 pKD4로부터 카나마이신 내성 카세트를 증폭시켰다 (문헌 Datsenko, K.A. & Wanner, B.L. (2000)]). 이어서, 얻어진 PCR 생성물을 플라스미드 pKD46을 보유하는 수용자 균주에 전기천공법으로 도입하였다 (여기서, 발현된 Red (exo)는 상동 재조합을 매우 촉진시킴). 이어서, 항생제-내성 형질전환체를 선택하고, 표 3에 나타낸 적절한 올리고뉴클레오티드를 이용한 PCR 분석에 의해 내성 카세트의 삽입 여부를 조사하였다.

생성된 균주를 이. 콜라이 MG1655 Ptrc16-gapA::cm으로 명명하였다.

3종의 플라스미드를 이. 콜라이 균주 MG1655 Ptrc16-gapA::cm에 개별적으로 도입하였다.

실시예 2: 1,2-프로판디올을 높은 수율로 생산할 수 있는 이. 콜라이 MG1655 Ptrc16-gapA, Δedd-eda, ΔgloA, ΔpykA, ΔpykF (pME101VB01-yqhD-mgsA-gldA), (pJB137-PgapA-ppsA), 이. 콜라이 MG1655 Ptrc16-gapA, Δedd-eda, ΔgloA, ΔpykA, ΔpykF (pME101VB01-yafB-mgsA-gldA), (pJB137-PgapA-ppsA) 및 이. 콜라이 MG1655 Ptrc16-gapA, Δedd-eda, ΔgloA, ΔpykA, ΔpykF (pME101VB01-yqhE-mgsA-gldA), (pJB137-PgapA-ppsA)의 변형 균주의 구축

edd-eda 유전자는, 프로토콜 1에 기재된 기술 (표 2에 나타낸 올리고뉴클레오티드 사용)을 이용하여 카나마이신 항생제 내성 카세트를 삽입하고 관련 유전자의 대부분을 결실시킴으로써 이. 콜라이 균주 MG1655에서 불활성화시켰다. 얻어진 균주를 MG1655 Δedd-eda::km으로 명명하였다.

이와 같이 결실된 것을 프로토콜 2에 따라 이. 콜라이 균주 MG1655 Ptrc16-gapA::cm으로 전달하였다.

프로토콜 2: 유전자의 결실을 위한, 파지 P1을 이용한 형질도입

파지 P1을 이용한 형질도입 기술에 의해, 수용자인 이. 콜라이 균주에서 선택된 유전자를 내성 카세트 (카나마이신 또는 클로람페니콜)로 대체하여 상기 유전자를 결실시켰다. 이 프로토콜은 두 단계, 즉 (i) 1개 유전자가 결실된 균주 MG1655 상에서 파지 용해물을 제조하는 단계; 및 (ii) 상기 파지 용해물로 수용자 균주를 형질도입시키는 단계로 구성되었다.

파지 용해물의 제조

- 10 mL의 LB + Cm 30 ㎍/mL + 글루코스 0.2％ + CaCl₂ 5 mM에 1개 유전자가 결실된 균주 MG1655의 철야 배양물 100 ㎕를 시딩하였다.

- 37℃에서 30분간 진탕하면서 인큐베이션하였다.

- 야생형 균주 MG1655 상에서 제조된 파지 용해물 P1 100 ㎕ (대략 1 × 10⁹개 파지/mL)를 첨가하였다.

- 모든 세포가 용해될 때까지 3시간 동안 37℃에서 진탕시켰다.

- 200 ㎕의 클로로포름을 첨가하고, 볼텍싱하였다.

- 10분간 원심분리 (4500 g)하여 세포 파편을 제거하였다.

- 상청액을 멸균 튜브에 옮기고, 200 ㎕의 클로로포름을 첨가하였다.

- 용해물을 4℃에서 저장하였다.

형질도입

- LB 배지 중의 이. 콜라이 수용자 균주의 철야 배양물 5 mL를 10분간 원심분리하였다 (1500 g).

- 세포 펠렛을 2.5 mL의 10 mM MgSO₄ 및 5 mM CaCl₂에 현탁시켰다.

- 대조군 튜브: 세포 100 ㎕

1개의 유전자가 결실된 균주 MG1655의 파지 P1 100 ㎕

- 튜브 시험: 세포 100 ㎕ + 1개의 유전자가 결실된 균주 MG1655의 파지 P1 100 ㎕

- 30℃에서 30분간 진탕 없이 인큐베이션하였다.

- 각 튜브에 1 M 나트륨 시트레이트 100 ㎕를 첨가하고, 볼텍싱하였다.

- 1 mL의 LB를 첨가하였다.

- 37℃에서 1시간 동안 진탕하면서 인큐베이션하였다.

- 튜브를 3분간 7000 rpm으로 원심분리한 후, LB + Cm 30 ㎍/mL 디쉬 상에 플레이팅하였다.

- 밤새 37℃에서 인큐베이션하였다.

이어서, 항생제-내성 형질전환체를 선택하고, 적절한 올리고뉴클레오티드를 이용한 PCR 분석에 의해 결실된 것이 삽입되었는지 조사하였다.

생성된 균주를 이. 콜라이 MG1655 Ptrc16-gapA::cm, Δedd-eda::km으로 명명하였다. 이어서, 프로토콜 3에 따라 항생제 내성 카세트를 제거하였다.

프로토콜 3: 내성 카세트의 제거

다음의 기술에 따라 클로람페니콜 및/또는 카나마이신 내성 카세트를 제거하였다. 클로람페니콜 및/또는 카나마이신 내성 카세트의 FRT 부위에서 작용하는 FLP 재조합효소를 운반하는 플라스미드인 pCP20을 전기천공법에 의해 재조합 균주에 도입하였다. 42℃에서의 계대 배양 이후에, 표 3에 나타낸 올리고뉴클레오티드를 이용한 PCR 분석에 의해 항생제 내성 카세트의 소실을 조사하였다.

표 2에 나타낸 올리고뉴클레오티드를 이용하여 프로토콜 1에 따라 균주 MG1655 ΔgloA::cm을 제조하고, 이와 같이 결실된 것을 프로토콜 2에 따라 미리 제조해 둔 균주로 전달하였다. 생성된 균주를 이. 콜라이 MG1655 Ptrc16-gapA, Δedd-eda, ΔgloA::cm으로 명명하였다.

pykA 유전자는, 표 2에 나타낸 올리고뉴클레오티드를 이용하여 프로토콜 1에 따라 카나마이신 항생제 내성 카세트를 삽입하여 이전 균주에서 불활성화시켰다. 생성된 균주를 이. 콜라이 MG1655 Ptrc16-gapA, Δedd-eda, ΔgloA::cm, ΔpykA::km으로 명명하였다.

이어서, 프로토콜 3에 따라 항생제 내성 카세트를 제거하였다.

pykF 유전자는, 표 2에 나타낸 올리고뉴클레오티드를 이용하여 프로토콜 1에 따라 클로람페니콜 항생제 내성 카세트를 삽입하여 불활성화시켰다. 생성된 균주를 이. 콜라이 MG1655 Ptrc16-gapA, Δedd-eda, ΔgloA, ΔpykA, ΔpykF::cm으로 명명하였다.

각 단계에서, 표 3에 나타낸 올리고뉴클레오티드를 이용하여 앞서 형성된 모든 결실이 존재하는지를 조사하였다.

포스포에놀피루베이트의 생산을 증가시키기 위해, 플라스미드 pJB137로부터 gapA 프로모터를 이용하여 ppsA 유전자를 발현시켰다. 플라스미드 pJB137-PgapA-ppsA를 구축하기 위하여, 다음의 올리고뉴클레오티드를 이용하여 이. 콜라이 MG1655의 게놈 DNA로부터 ppsA 유전자를 PCR 증폭시켰다.

1. 65개의 염기로 이루어진 gapA-ppsAF (서열 64)

ccttttattcactaacaaatagctggtggaatatATGTCCAACAATGGCTCGTCACCGCTGGTGC

[상기 서열은

- 웹사이트 http://genolist.pasteur.fr/Colibri/의 기준 서열인, ppsA 유전자 (1785136 내지 1782758)의 서열 (1785106-1785136)에 상동인 영역 (대문자 부분), 및

- gapA 프로모터 (1860794-1860761)에 상동인 영역 (소문자 부분)

을 포함함]

2. 43개의 염기로 이루어진 ppsAR (서열 65)

aatcgcaagcttGAATCCGGTTATTTCTTCAGTTCAGCCAGGC

[상기 서열은

- ppsA 유전자 영역 (1785136 내지 1782758)의 서열 (1782758-1782780)에 상동인 영역 (대문자 부분), 및

- HindIII 제한 부위 (밑줄친 부분)

를 포함함]

동시에, 다음의 올리고뉴클레오티드를 이용하여 이. 콜라이 gapA 유전자의 gapA 프로모터 영역을 증폭시켰다.

1. 65개의 염기로 이루어진 gapA-ppsAR (서열 66)

GCACCAGCGGTGACGAGCCATTGTTGGACATatattccaccagctatttgttagtgaataaaagg

[상기 서열은

- ppsA 유전자 (1785136 내지 1782758)의 서열 (1785106-1785136)에 상동인 영역 (대문자 부분), 및

- gapA 프로모터 (1860794-1860761)에 상동인 영역 (소문자 부분)

을 포함함]

2. 33개의 염기로 이루어진 gapAF (서열 67)

ACGTCCCGGGcaagcccaaaggaagagtgaggc

[상기 서열은

- gapA 프로모터 (1860639-1860661)에 상동인 영역 (소문자 부분) 및

- SmaI 제한 부위 (밑줄친 부분)

를 포함함]

이어서, 올리고뉴클레오티드 ppsAR 및 gapAF를 이용하여 양 단편을 융합시켰다 (문헌 [Horton et al. 1989 Gene 77:61-68]). PCR 증폭된 단편을 HindIII 및 SmaI 제한 효소로 절단하고, pJB137 벡터 (EMBL 기탁 번호: U75326)의 HindIII/SmaI 부위 내로 클로닝하여, pJB137-PgapA-ppsA 벡터를 생성하였다.

상이한 pME101VB01 플라스미드 및 pJB137-PgapA-ppsA를 이. 콜라이 균주 MG1655 Ptrc16-gapA, Δedd-eda, ΔgloA, ΔpykA, ΔpykF에 도입하였다. 수득된 균주를 각각 이. 콜라이 MG1655 Ptrc16-gapA, Δedd-eda, ΔgloA, ΔpykA, ΔpykF, pME101VB01-yqhD-mgsA-gldA, pJB137-PgapA-ppsA (균주 1), 이. 콜라이 MG1655 Ptrc16-gapA, Δedd-eda, ΔgloA, ΔpykA, ΔpykF, pME101VB01-yafB-mgsA-gldA, pJB137-PgapA-ppsA (균주 2) 및 이. 콜라이 MG1655 Ptrc16-gapA, Δedd-eda, ΔgloA, ΔpykA, ΔpykF, pME101VB01-yqhE-mgsA-gldA, pJB137-PgapA-ppsA (균주 3)로 명명하였다.

실시예 3: 글루코스 1몰 당 1몰을 초과하는 수율로 1,2-프로판디올을 생산할 수 있는 이. 콜라이 MG1655 Ptrc16-gapA, Δedd-eda, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB, ΔldhA, ΔpflAB, ΔadhE, ΔackA-pta, ΔpoxB, ΔpykA, ΔpykF (pME101VB01-yqhD-mgsA-gldA), (pJB137-PgapA-ppsA), 이. 콜라이 MG1655 Ptrc16-gapA, Δedd-eda, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB, ΔldhA, ΔpflAB, ΔadhE, ΔackA-pta, ΔpoxB, ΔpykA, ΔpykF (pME101VB01-yafB-mgsA-gldA), (pJB137-PgapA-ppsA) 및 이. 콜라이 MG1655 Ptrc16-gapA, Δedd-eda, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB, ΔldhA, ΔpflAB, ΔadhE, ΔackA-pta, ΔpoxB, ΔpykA, ΔpykF (pME101VB01-yqhE-mgsA-gldA), (pJB137-PgapA-ppsA)의 변형 균주의 구축

표 2에 나타낸 올리고뉴클레오티드를 이용하여 프로토콜 1에 따라 균주 MG1655 ΔaldA::km, MG1655 ΔaldB::cm, MG1655 ΔpflAB::km, MG1655 ΔadhE::cm, MG1655 ΔackA-pta::cm을 제조하고, 이와 같이 결실된 것들을 프로토콜 2에 따라 미리 제조해 둔 균주로 전달하였다. 필요하다면, 프로토콜 3에 따라 항생제 내성 카세트를 제거하였다.

ldhA 유전자 및 poxB 유전자는, 표 2에 나타낸 올리고뉴클레오티드를 이용하여 프로토콜 1에 따라 클로람페니콜 항생제 내성 카세트를 삽입하여 미리 제조해 둔 균주에서 불활성화시켰다. 필요하다면, 프로토콜 3에 따라 항생제 내성 카세트를 제거하였다.

생성된 균주를 이. 콜라이 MG1655 Ptrc16-gapA, Δedd-eda, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB, ΔldhA, ΔpflAB, ΔadhE, ΔackA-pta, ΔpoxB, ΔpykA, ΔpykF로 명명하였다.

상이한 pME101VB01 플라스미드 및 pJB137-PgapA-ppsA를 이. 콜라이 균주 MG1655 Ptrc16-gapA, Δedd-eda, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB, ΔldhA, ΔpflAB, ΔadhE, ΔackA-pta, ΔpoxB, ΔpykA, ΔpykF에 도입하였다. 수득된 균주를 각각 이. 콜라이 MG1655 Ptrc16-gapA, Δedd-eda, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB, ΔldhA, ΔpflAB, ΔadhE, ΔackA-pta, ΔpoxB, ΔpykA, ΔpykF, pME101VB01-yqhD-mgsA-gldA, pJB137-PgapA-ppsA, 이. 콜라이 MG1655 Ptrc16-gapA, Δedd-eda, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB, ΔldhA, ΔpflAB, ΔadhE, ΔackA-pta, ΔpoxB, ΔpykA, ΔpykF, pME101VB01-yafB-mgsA-gldA, pJB137-PgapA-ppsA 및 이. 콜라이 MG1655 Ptrc16-gapA, Δedd-eda, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB, ΔldhA, ΔpflAB, ΔadhE, ΔackA-pta, ΔpoxB, ΔpykA, ΔpykF, pME101VB01-yqhE-mgsA-gldA, pJB137-PgapA-ppsA로 명명하였다.

실시예 4: 호기성 조건 하에서의 1,2-프로판디올 생산에 대한 상이한 균주의 비교

실시예 2에 기재한 바와 같이 얻은 균주 (균주 1, 2 및 3) 및 대조군 균주 (대조군 1: MG1655 pME101VB01-yqhD-mgsA-gldA, 대조군 2: MG1655 pME101VB01-yafB-mgsA-gldA, 대조군 3: MG1655 pME101VB01-yqhE-mgsA-gldA 및 대조군 4: MG1655 Ptrc16-gapA, Δedd-eda, ΔgloA, ΔpykA, ΔpykF)를 탄소 공급원으로서 글루코스를 함유하는 최소 배지에서 호기성 조건 하에 삼각 플라스크 검정법으로 배양하였다. 배양은 34℃ 또는 37℃에서 수행하고, 배양 배지를 MOPS로 완충시킴으로써 pH를 유지시켰다. 배양이 끝났을 때, 발효액 중의 1,2-프로판디올, 아세톨 및 잔류 글루코스를 HPLC에 의해 분석하고, 글루코스로부터의 1,2-프로판디올의 수율 및 글루코스로부터의 1,2-프로판디올 + 아세톨의 수율을 계산하였다. 이어서, 발효기 유가식 배양을 위한 최상의 균주를 선택하였다.

실시예 5: 최상의 균주를 이용한, 유가식 배양에서의 1,2-프로판디올의 생산

상기 실험에서 선택된 최상의 균주를 유가식 프로토콜을 이용하여 2 l 발효기에서 배양하였다.

배양 온도를 37℃로 일정하게 유지시키고, NH₄OH 용액을 이용하여 pH를 6.5 내지 8의 값으로 영속적으로 조정하였다. 교반 속도는 뱃치 상(batch phase)일 동안에는 200 내지 300 rpm으로 유지시키고, 유가식 상(fed-batch phase)의 후반부에 최대 1000 rpm으로 증가시켰다. 용해된 산소의 농도는 기체 제어기를 이용하여 30 내지 40％ 포화 값으로 유지시켰다. 광학 밀도가 3 내지 5의 값에 이르면, 유가식 배양을 0.3 내지 0.5 ml/h의 처음 유속으로 시작하여, 최대 2.5 내지 3.5 ml/h의 유속값으로 점진적으로 증가시켰다. 이 시점에서의 유속을 24 내지 48시간 동안 일정하게 유지시켰다. 유가 배지는 글루코스를 300 내지 500 g/l의 농도로 함유하는 최소 배지에 기초하였다.

SEQUENCE LISTING <110> METABOLIC EXPLORER <120> METABOLICALLY ENGINEERED MICROORGANISM USEFUL FOR THE PRODUCTION OF 1,2-PROPANEDIOL <130> D25261 <150> PCT/IB2007/001675 <151> 2007-03-23 <160> 67 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 1 ccgacagtaa gacgggtaag cctg 24 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 2 agcttagtaa agccctcgct ag 22 <210> 3 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 3 catgggctag ctacgtatta attaaagatc tcctagggag ctcaccggtt aaaaataaga 60 gttaccttaa atggtaactc ttattttttt aggcgcgcca 100 <210> 4 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 4 agcttggcgc gcctaaaaaa ataagagtta ccatttaagg taactcttat ttttaaccgg 60 tgagctccct aggagatctt taattaatac gtagctagcc 100 <210> 5 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 5 cgatgcacgt catgaacaac tttaatctgc acaccccaac ccg 43 <210> 6 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 6 ctagctagcg gcgtaaaaag cttagcgggc ggcttcgtat atacggcggc tgacatccaa 60 cgtaatgtcg tgattttcg 79 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 7 cgtacgtact gtaggaaagt taactacgg 29 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 8 gaagatcttt acttcagacg gtccgcgag 29 <210> 9 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 9 gacctaggct ctaaaggagc aattatgg 28 <210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 10 cgagctctta ttcccactct tgcagg 26 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 11 catgccatgg ctatccctgc atttggttta 30 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 12 ctagctagct taatcccatt caggagccag 30 <210> 13 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 13 catgccatgg ctaatccaac cgttattaag c 31 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 14 ctagctagct tagccgccga actggtcagg 30 <210> 15 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic promoter <400> 15 gagctgttga cgattaatca tccggctcga ataatgtgtg g 41 <210> 16 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 16 agtcatatat tccaccagct atttgttagt gaataaaagc cacacattat tcgagccgga 60 tgattaatag tcaacagctc tgtaggctgg agctgcttcg 100 <210> 17 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 17 gctcacatta cgtgactgat tctaacaaaa cattaacacc aactggcaaa attttgtccc 60 atatgaatat cctccttag 79 <210> 18 <211> 102 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 18 cgcgcgagac tcgctctgct tatctcgccc ggatagaaca agcgaaaact tcgaccgttc 60 atcgttcgca gttggcatgc ggtgtaggct ggagctgctt cg 102 <210> 19 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 19 gcttagcgcc ttctacagct tcacgcgcca gcttagtaat gcggtcgtaa tcgcccgctt 60 ccagcgcatc tgccggaacc catatgaata tcctccttag 100 <210> 20 <211> 101 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 20 atgcgtcttc ttcataccat gctgcgcgtt ggcgatttgc aacgctccat cgatttttat 60 accaaagtgc tgggcatgaa gtgtaggctg gagctgcttc g 101 <210> 21 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 21 ttagttgccc agaccgcgac cggcgtcttt ctcttcgatt aactcaattt tgtaaccgtc 60 cggatcttcc acaaacgcga catatgaata tcctccttag 100 <210> 22 <211> 102 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 22 atgtcagtac ccgttcaaca tcctatgtat atcgatggac agtttgttac ctggcgtgga 60 gacgcatgga ttgatgtggt agtgtaggct ggagctgctt cg 102 <210> 23 <211> 101 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 23 ttaagactgt aaataaacca cctgggtctg cagatattca tgcaagccat gtttaccatc 60 tgcgccgcca ataccggatt tcatatgaat atcctcctta g 101 <210> 24 <211> 101 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 24 tcagaacagc cccaacggtt tatccgagta gctcaccagc aggcacttgg tttgctggta 60 atgctccagc atcatcttgt gtgtaggctg gagctgcttc g 101 <210> 25 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 25 atgaccaata atcccccttc agcacagatt aagcccggcg agtatggttt ccccctcaag 60 ttaaaagccc gctatgacaa catatgaata tcctccttag 100 <210> 26 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 26 gaaactcgcc gtttatagca caaaacagta cgacaagaag tacctgcaac aggtgaacga 60 gtcctttggc tttgagctgg tgtaggctgg agctgcttcg 100 <210> 27 <211> 101 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 27 ttaaaccagt tcgttcgggc aggtttcgcc tttttccaga ttgcttaagt tttgcagcgt 60 agtctgagaa atactggtca gcatatgaat atcctcctta g 101 <210> 28 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 28 ccggacatcc tgcgttgccg taaatctggt gttctgaccg gtctgccaga tgcatatggc 60 cgtggccgta tcatcggtga catatgaata tcctccttag 100 <210> 29 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 29 gatgcactat aagatgtgtt aaaaacgctg tagcagaatg aagcgcggaa taaaaaagcg 60 gcaactcaat aaagttgccg tgtaggctgg agctgcttcg 100 <210> 30 <211> 101 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 30 atggctgtta ctaatgtcgc tgaacttaac gcactcgtag agcgtgtaaa aaaagcccag 60 cgtgaatatg ccagtttcac tcatatgaat atcctcctta g 101 <210> 31 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 31 caataacgaa tgatagcaat tttaagtagt taggaggtga aaaatgctgt caaaaggcgt 60 attgtcagcg cgtcttttca tgtaggctgg agctgcttcg 100 <210> 32 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 32 cgagtaagtt agtactggtt ctgaactgcg gtagttcttc actgaaattt gccatcatcg 60 atgcagtaaa tggtgaagag tgtaggctgg agctgcttcg 100 <210> 33 <211> 97 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 33 gctgctgtgc agactgaatc gcagtcagcg cgatggtgta gacgatatcg tcaaccagtg 60 cgccacggga caggtcgcat atgaatatcc tccttag 97 <210> 34 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 34 ccttagccag tttgttttcg ccagttcgat cacttcatca ccgcgtccgc tgatgattgc 60 gcgcagcata tacaggctgc atatgaatat cctccttag 99 <210> 35 <211> 102 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 35 cggttgcagc ttatatcgcc aaaacactcg aatcggcagg ggtgaaacgc atctggggag 60 tcacaggcga ctctctgaac ggtgtaggct ggagctgctt cg 102 <210> 36 <211> 101 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 36 cgcggcgggt gccaacgttg tacgtatgaa cttttctcac ggctcgcctg aagatcacaa 60 aatgcgcgcg gataaagttc gtgtaggctg gagctgcttc g 101 <210> 37 <211> 101 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 37 cgccgcatcc ggcaacgtac ttactctacc gttaaaatac gcgtggtatt agtagaaccc 60 acggtactca tcacgtcgcc ccatatgaat atcctcctta g 101 <210> 38 <211> 98 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 38 cccatccttc tcaacttaaa gactaagact gtcatgaaaa agaccaaaat tgtttgcacc 60 atcggaccga aaaccgaatg taggctggag ctgcttcg 98 <210> 39 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 39 ggacgtgaac agatgcggtg ttagtagtgc cgctcggtac cagtgcacca gaaaccataa 60 ctacaacgtc acctttgtgc atatgaatat cctccttag 99 <210> 40 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 40 gccacagccg gaatcatact tggtttggg 29 <210> 41 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 41 cgtcaacacc aacttcgtcc catttcagg 29 <210> 42 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 42 gggtagactc cattactgag gcgtgggcg 29 <210> 43 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 43 ccacatgata ccgggatggt gacg 24 <210> 44 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 44 gaagtggtcg atgccgggat tgaagaatgg g 31 <210> 45 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 45 gggttacgtt tcagtgaggc gcgttctgcg g 31 <210> 46 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 46 tgcagcggcg cacgatggcg acgttccgcc g 31 <210> 47 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 47 cacgatgacg accattcatg cctatactgg c 31 <210> 48 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 48 catatttccc tcaaagaata taaaaaagaa caattaacgc 40 <210> 49 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 49 tatgttcatg cgatggcgca ccagctgggc g 31 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 50 gccatcagca ggcttagcgc 20 <210> 51 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 51 gggtattgtg gcatgtttaa ccg 23 <210> 52 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 52 agacattaaa aatatacgtg cagctacccg 30 <210> 53 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 53 gtgaaagctg acaacccttt tgatctttta 30 <210> 54 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 54 ggctcattgc accaccatcc ag 22 <210> 55 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 55 gaaaagacgc gctgacaata cgcc 24 <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 56 gcatgggtaa acttaaggcg 20 <210> 57 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 57 taatcaccaa cgtatcgggc 20 <210> 58 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 58 cgcggcttgg tcgggtaacg g 21 <210> 59 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 59 tcgggctatt taaccgttag tgcc 24 <210> 60 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 60 ggcaattacc ctcgacgtac cgg 23 <210> 61 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 61 ccgatggatg atctgttaga ggcgg 25 <210> 62 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 62 gcgtaacctt ttccctggaa cg 22 <210> 63 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 63 gcgttgctgg agcaacctgc cagc 24 <210> 64 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 64 ccttttattc actaacaaat agctggtgga atatatgtcc aacaatggct cgtcaccgct 60 ggtgc 65 <210> 65 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 65 aatcgcaagc ttgaatccgg ttatttcttc agttcagcca ggc 43 <210> 66 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 66 gcaccagcgg tgacgagcca ttgttggaca tatattccac cagctatttg ttagtgaata 60 aaagg 65 <210> 67 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 67 acgtcccggg caagcccaaa ggaagagtga ggc 33

Claims

ㆍ 디히드록시아세톤 포스페이트로부터 1,2-프로판디올로의 생합성 경로의 개선된 활성, 및

ㆍ 글리세르알데히드 3-포스페이트 데히드로게나제의 감쇠된 활성

을 특징으로 하는, 탄소 공급원으로부터 1,2-프로판디올을 생산하는데 유용한 미생물.
제1항에 있어서, 디히드록시아세톤 포스페이트로부터 1,2-프로판디올로의 생합성 경로에 관여하는 1종 이상의 효소의 활성을 증가시키도록 유전적으로 변형된 미생물.
제2항에 있어서, 1종 이상의 효소의 활성의 증가는 상기 효소를 코딩하는 유전자의 발현을 증가시키는 것에 의해 얻어지는 것인 미생물.
제3항에 있어서, mgsA, yafB, yeaE, yghZ, yqhE, yqhD, ydhF, ycdW, yajO, ydjG, ydbC, tas, gldA 및 fucO로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 유전자의 발현이 증가된 것인 미생물.
제4항에 있어서, 3종의 유전자 mgsA, yqhD 및 gldA의 발현이 증가된 것인 미 생물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 엔트너-두도로프(Entner-Doudoroff) 경로에 관여하는 1종 이상의 효소의 활성이 감쇠된 것인 미생물.
제6항에 있어서, edd 및 eda 유전자 중 1종 이상의 유전자의 발현이 감쇠된 것인 미생물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 메틸글리옥살을 락테이트로 전환시키는데 관여하는 1종 이상의 효소의 활성이 감쇠된 것인 미생물.
제8항에 있어서, gloA, aldA 및 aldB 중 1종 이상의 유전자의 발현이 감쇠된 것인 미생물.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 락테이트, 포르메이트 또는 에탄올의 합성에 관여하는 1종 이상의 효소의 활성이 감쇠된 것인 미생물.
제10항에 있어서, ldhA, pflA, pflB 및 adhΕ 중 1종 이상의 유전자의 발현이 감쇠된 것인 미생물.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 아세테이트의 합성에 관여하는 1종 이상의 효소의 활성이 감쇠된 것인 미생물.
제12항에 있어서, ackA, pta 및 poxB 중 1종 이상의 유전자의 발현이 감쇠된 것인 미생물.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 당 도입 효율이 증가된 것인 미생물.
제14항에 있어서, 포스포에놀피루베이트에 의존하지 않는 당 도입 시스템을 이용하는 것인 미생물.
제15항에 있어서, galP 및 glk 중에서 선택된 1종 이상의 유전자의 발현이 증가된 것인 미생물.
제14항에 있어서, 당-포스포트랜스퍼라제 시스템의 효율이 대사물질인 포스포에놀피루베이트의 이용률을 증가시키는 것에 의해 개선된 것인 미생물.
제17항에 있어서, 1종 이상의 피루베이트 키나제 효소의 활성이 감쇠된 것인 미생물.
제18항에 있어서, pykA 및 pykF 중에서 선택된 1종 이상의 유전자의 발현이 감쇠된 것인 미생물.
제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 포스포에놀피루베이트 신타제 활성이 증가된 것인 미생물.
제20항에 있어서, ppsA 유전자의 발현이 증가된 것인 미생물.
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 피루베이트의 아세틸-CoA로의 물질대사를 촉진하는 효소가 비변형된 효소에 비해 NADH에 의한 저해에 대해 덜 민감성인 미생물.
제22항에 있어서, lpd 유전자가 알라닌 55를 발린으로 대체시키는 점 돌연변이를 갖는 것인 미생물.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, arcA 및 ndh 중에서 선택된 1종 이상의 유전자의 발현이 감쇠된 것인 미생물.
제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아, 효모 및 진균으로 이 루어진 군으로부터 선택된 미생물.
제25항에 있어서, 엔테로박테리아세아 (Enterobacteriaceae), 바실라세아 (Bacillaceae), 클로스트리디아세아 (Clostridiaceae), 스트렙토마이세타세아 (Streptomycetaceae) 및 코리네박테리아세아 (Corynebacteriaceae)로 이루어진 군으로부터 선택된 미생물.
제26항에 있어서, 에셰리키아 콜라이 (Escherichia coli) 또는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 (Clostridium acetobutylicum)인 미생물.
제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 미생물을 탄소 공급원을 함유하는 적절한 성장 배지에서 성장시키고, 생산된 1,2-프로판디올을 회수함으로써 1,2-프로판디올을 제조하는 방법.
제28항에 있어서, 미생물이 에셰리키아 콜라이이고, 탄소 공급원이 단일 탄소 공급원인 방법.
제28항에 있어서, 미생물이 클로스트리듐 아세토부틸리쿰이고, 탄소 공급원이 복합 탄소 공급원인 방법.
제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 회수된 1,2-프로판디올을 추가로 정제하는 것인 방법.