KR20100124332A

KR20100124332A - 글리옥살라아제 ｉｉｉ 활성을 갖는 폴리펩티드, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 이들의 용도

Info

Publication number: KR20100124332A
Application number: KR1020107023082A
Authority: KR
Inventors: 프랑소와 보엘케르; 필립프 수카일
Original assignee: 메타볼릭 익스플로러
Priority date: 2008-03-18
Filing date: 2009-03-16
Publication date: 2010-11-26
Also published as: US20110014666A1; BRPI0909756A2; WO2009115497A1; TW201005094A; MX2010010122A; CN101978052A; WO2009115114A1; IL207648A0; RU2010140227A; CA2715737A1; JP2011515083A

Abstract

본 발명은 메틸글리옥살의 락트산으로의 단일 단계 전환에 대한 효소 활성(글리옥살라아제 III 활성으로 알려짐)을 갖는 신규한 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 가진 폴리뉴클레오티드 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 미생물에서 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현 수준을 변화시킴으로써 글리옥살라아제 III 활성을 조절하는 것에 관한 것이다. 본 발명은 또한 글리옥살라아제 III 활성이 조절된 미생물을 발효시켜 상품성 있는 화학물질, 특히 1,2-프로판디올, 아세톨, 및 락트산을 생성하는 것에 관한 것이다.

Description

글리옥살라아제 ＩＩＩ 활성을 갖는 폴리펩티드, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 이들의 용도 {POLYPEPTIDE HAVING GLYOXALASE III ACTIVITY, POLYNUCLEOTIDE ENCODING THE SAME AND USES THEREOF}

본 발명은 메틸글리옥살을 락트산으로 단일 단계로 전환시키는 효소 활성 (글리옥살라아제 III 활성으로 공지됨)을 갖는 신규한 폴리펩티드, 이러한 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드, 및 이들의 용도에 관한 것이다.

보다 특히, 본 발명은 이러한 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현 수준을 변화시켜, 미생물에서 글리옥살라아제 III 활성을 조절하는 것에 관한 것이다.

본 발명은 또한 글리옥살라아제 III 활성이 조절된 미생물을 발효시켜, 상품성 있는 화학물질, 특히 1,2-프로판디올, 아세톨 및 락트산을 생성하는 것에 관한 것이다.

글루코스의 이화작용은 몇몇 미생물에서, 일반적으로는 발효 조건 하에서 락테이트 형성을 초래할 수 있다. 유기체에 따라 D- 또는 L-락테이트가 형성될 수 있는데, D-락테이트는 에스케리키아 콜리(E. coli)에서 혼합 산 발효 도중 다른 생성물과 함께 형성되는 반면, D- 또는 L-락테이트는 락트산 세균의 발효에 의해 생성될 수 있다. 생성 경로는 글루코스로부터 피루베이트를 초래하는 해당 경로로부터 파생된다. 보조인자로서의 환원된 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (NADH)에 의존적인 가용성 락테이트 데히드로게나제에 의해, 피루베이트는 단일 반응으로 락테이트로 환원될 수 있다. 에스케리키아 콜리에서, ldhA 유전자에 의해 코딩되는 락테이트 데히드로게나제는 D-락테이트에 대해 특이적이다 (문헌 [Clark, 1997]). 락트산 세균에서, D- 또는 L-락테이트에 대해 특이적인 락테이트 데히드로게나제를 발견할 수 있다 (락토바실러스 델브루에키(Lactobacillus delbrueckii)에 있어서는 D-락테이트, 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus)에 있어서는 L-락테이트, 예를 들어 문헌 [Garvie, 1980] 참조).

몇몇 유기체에서, 또 다른 경로가 락테이트 생성을 담당할 수 있다. 이 경로는, 트리오스인 글리세르알데히드-3-포스페이트 (GA3P)를 피루베이트로 전환시키는 해당 경로의 하류 부분에 대한 대안으로서 종사할 수 있다는 점에서 메틸글리옥살 우회로라 불린다 (문헌 [Cooper, 1984]). 메틸글리옥살 우회로는, 프룩토스-1,6-비스포스페이트의 분해로 생성되는 두 번째 트리오스 포스페이트인 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)로부터 출발한다. DHAP는 메틸글리옥살 합성효소에 의해 메틸글리옥살 (MG)로 전환된다. 그 후, 세포에 대해 독성 화합물인 MG는 여러 시스템에 의해 D- 또는 L-락테이트로 전환되며, 생성된 락테이트는 D- 또는 L-락테이트 데히드로게나제에 의해 피루베이트로 추가로 변형될 수 있다. 발효성 락테이트 데히드로게나제와는 대조적으로, 이들 효소는 오직 호기성 조건 하에서만 활성화되는 플라빈-결합 막-결합 단백질이다 (문헌 [Garvie, 1980]). 에스케리키아 콜리에서 D- 및 L-락테이트 데히드로게나제는 각각 dld 및 lldD (또는 lctD) 유전자에 의해 코딩된다 (문헌 [Rule et al, 1985], [Dong et al, 1993]).

메틸글리옥살의 이화작용 루트는, 상기 화합물의 해독을 이해하기 위해서뿐만 아니라 1,2-프로판디올의 생성이라는 목적을 위해 세균에서 연구되어 왔다 (문헌 [Ferguson et al, 1998]). 메틸글리옥살로부터 락테이트의 생성을 초래할 수 있는 3가지 경로가 에스케리키아 콜리에서 규명되었다.

- 첫 번째 경로는 메틸글리옥살을 D-락테이트로 2단계로 전환시키는, 글루타티온 의존성 글리옥살라아제 I-II 시스템 (gloA 및 gloB 유전자에 의해 코딩됨)이다.

- 두 번째는 메틸글리옥살의 D-락테이트로의 1단계 전환을 촉매하는, 글루타티온 비의존성 글리옥살라아제 III 효소이다.

- 세 번째 시스템은 아세톨 또는 D- 또는 L-락트알데히드를 초래하는, 메틸글리옥살 환원효소에 의한 메틸글리옥살의 분해이다. L-락트알데히드는, 알데히드 데히드로게나제의 작용에 의해, 예를 들어 aldA 또는 aldB 유전자에 의해 코딩되는 효소에 의해 L-락테이트로 추가로 전환될 수 있다 (문헌 [Grabar et al, 2006]).

글리옥살라아제 III 시스템은 글리옥살라아제 I-II 시스템에 비해 덜 광범위하게 연구되어 왔다. 효소 글리옥살라아제 III은 1995년에 미쓰라(Misra) 등에 의해 에스케리키아 콜리에서 처음 언급되고 정제되었다. 상기 효소는, 상이한 특성을 가지며 글루타티온에 비의존적으로 메틸글리옥살의 D-락테이트로의 1단계 전환을 촉매할 수 있다는 점에서 글리옥살라아제 I과 상당히 상이하다. 상기 효소는 이후 몇몇 보고 (문헌 [MacLean et al, 1998], [Okado-Matsumoto and Fridovich, 2000], [Benov et al 2004])에서, 에스케리키아 콜리에서 글리옥살라아제 I 또는 글리옥살라아제 II에 비해 더 높은 활성을 갖는 것으로 언급되었다. 그전까지, 글리옥살라아제 III의 아미노산 서열은 결정되지 않았고, 상기 효소를 코딩하는 유전자도 공지되지 않았다.

C3 디알콜인 1,2-프로판디올 또는 프로필렌 글리콜은 널리 사용되는 화학물질이다. 상기 물질은 불포화 폴리에스테르 수지, 액체 세제, 냉각제, 항공기용 부동액 및 제빙액의 성분이다. 프로필렌 글리콜은, 프로필렌 유도체에 비해 더 유독한 것으로 인식되고 있는 에틸렌 유도체에 대한 대체물로서 1993년 내지 1994년 이래로 점점 더 많이 사용되어 왔다.

현재, 1,2-프로판디올은 다량의 물을 소비하는 프로필렌 옥시드 수화 방법을 이용하는 화학적 수단에 의해 생성된다. 프로필렌 옥시드는 2가지 방법 중 하나에 의해 생성될 수 있는데, 하나는 에피클로르히드린을 사용하고, 다른 하나는 과산화수소를 사용한다. 양쪽 루트 모두 강한 독성 물질을 사용한다. 추가로, 과산화수소 루트는 tert-부탄올 및 1-페닐 에탄올과 같은 부산물을 발생시킨다. 프로필렌의 생성이 수익성 있게 되기 위해서는 이들 부산물의 용도가 발견되어야만 한다. 화학적 루트는 일반적으로 라세미 1,2-프로판디올을 생성하는 반면, 2가지 입체이성질체인 (R)1,2-프로판디올 및 (S)1,2-프로판디올은 각각 특정 응용에서 관심 대상이 되고 있다 (예를 들어, 특수 화학물질 및 제약 제품을 위한 키랄 출발 물질).

아세톨 또는 히드록시아세톤 (1-히드록시-2-프로파논)은 C3 케토 알콜이다. 상기 생성물은 환원제로서 섬유 산업에서 건염 염색 방법에 사용된다. 이는 환경에 유해한 폐수 내의 황 함유량을 감소시키기 위해, 종래의 황 함유 환원제를 유리하게 대체할 수 있다. 또한, 아세톨은 화학 산업에 있어 출발 물질로서, 예를 들어 폴리올 또는 헤테로시클릭 분자를 만드는 데 사용된다. 또한, 이는 흥미로운 킬레이트 및 용매 특성을 보유하고 있다.

아세톨은 현재 주로 1,2-프로판디올의 촉매적 산화 또는 탈수에 의해 생성되고 있다. 글리세롤과 같은 재생가능한 공급원료로부터 출발하는 신규한 방법이 현재 제시되어 있다 (DE4128692 및 WO 2005/095536 참조). 현재, 화학적 방법에 의한 아세톨의 생성 비용이 그의 산업적 응용 및 시장을 축소시키고 있다.

1,2-프로판디올 및 아세톨의 생성을 위한 화학적 방법의 단점은 생물학적 합성을 매력적인 대안으로 만든다. 경제적으로 실행가능한 유일한 생물학적 루트는, 일부 미생물에서 발견되는, 일반 당 (예를 들어, 글루코스 또는 자일로스)으로부터의 1,2-프로판디올 천연 생성 경로를 이용한다. 글루코스는 해당 경로, 이어서 메틸글리옥살 우회로를 통해 대사되며, MG는 락트알데히트 또는 아세톨로 환원될 수 있다. 이어서, 이들 2가지 화합물은 1,2-프로판디올을 생성하는 2차 환원 반응을 거칠 수 있다. 상기 루트는 (R)-1,2-프로판디올의 천연 생산자, 예컨대 클로스 트리디움 스페노이데스(Clostridium sphenoides) 및 테르모안에어로박테르 테르모사카롤리티쿰(Thermoanaerobacter thermosaccharolyticum)에 의해 이용된다. 클로 스트리디움 스페노이데스는, 포스페이트 제한 조건 하에서 1.58 g/ℓ의 역가로 1,2-프로판디올을 생성하는 데 이용되어 왔다 (문헌 [Tran Din and Gottschalk, 1985]). 또한, 테르모안에어로박테르 테르모사카롤리티쿰도 1,2-프로판디올의 생성을 위해 연구되어 왔다 (문헌 [Cameron and Cooney, 1986], [Sanchez-Rivera et al, 1987]). 얻어진 최선의 성과는 9 g/ℓ의 역가, 및 0.2 g/g의 글루코스로부터의 수율이다. 그러나, 이들 유기체로 얻어지는 성과의 향상은 이용가능한 유전학적 도구의 부족으로 인해 제한되기 쉽다. 동일한 합성 경로가 에스케리키아 콜리에서 작용하며, 상기 유기체에서 1,2-프로판디올의 생성에 대한 연구가 카메론(Cameron) 그룹 (문헌 [Cameron et al, 1998], [Altaras and Cameron, 1999], [Altaras and Cameron, 2000]) 및 베네트(Bennett) 그룹 (문헌 [Huang et al, 1999], [Berrios-Rivera et al, 2003])에 의해 수행되어 왔다. 카메론 그룹에 의해 얻어진 최선의 결과는, 무산소 플라스크 배양에서, 소비된 글루코스 1 g당 0.2 g의 수율과 함께 1.4 g/ℓ의 1,2-프로판디올 생성이다. 무산소 유가(fed-batch) 발효기에 외삽하여 추정한 경우, 생성량은 글루코스로부터의 0.19 g/g의 수율과 함께 4.5 g/ℓ 1,2-프로판디올로, 카메론 등의 이론적 평가와는 거리가 멀었다. 또한, 동일한 접근으로, 그러나 더 낮은 역가 및 수율로 수득된 결과가 특허 US 6,087,140, US 6,303,352 및 WO 98/37204에 기재되어 있다. 베네트 그룹은 무산소 조건 하에 플라스크 배양에서 1.3 g/ℓ의 역가 및 0.12 g/g의 수율로 비슷한 결과를 얻은 반면, 미세호기(microaerobic) 배양으로는 0.13 g/g의 수율과 함께 1.4 g/ℓ의 역가를 얻었다.

1,2-프로판디올 및/또는 아세톨을 생성하는 균주를 얻기 위한 대안적인 방법은, "진화된 균주"가 더 좋은 특징을 갖는 목적하는 화합물을 생성하는 상태 쪽으로 "초기 균주"의 진화를 유도하는 것이다. 1,2-프로판디올의 생성을 위한 미생물의 "진화된 균주"를 얻는 상기 절차는 특허 출원 WO 2005/073364에 기재되어 있다. 바람직하게는, 상기 진화 방법 및 이어지는 발효 단계는 혐기성 조건 하에서 수행된다. 상기 기술은 선행 기술을 넘는 명백한 개선이다. 소비된 글루코스 1 g에 대해 0.35 g의 수율과 함께, 1.8 g/ℓ의 1,2-프로판디올 역가를 얻었다. 상기 방법의 개선은 특허 출원 WO 2008/116852 및 WO 2008/116849에 기재되었는데, 여기서 상기 기재된 절차에 따라 얻은 진화된 균주는 더욱 변형되어 각각 더 나은 1,2-프로판디올 생산자 또는 더 나은 아세톨 생산자가 얻어진다. 이러한 방법으로, 소비된 글루코스의 몰 수당 1 mol을 초과하는 1,2-프로판디올 수율 (0.42 g/g)을 얻을 수 있다. 1,2-프로판디올의 생성에 대해서는 WO 2008/116848에, 또는 아세톨의 생성에 대해서는 WO 2008/116851에 기재된 바와 같이 오직 순이론적 대사 공학에만 의지하는 균주 확립 전략에 의해, 동일한 성과를 얻을 수 있다.

D- 또는 L-락테이트는 1,2-프로판디올 생성 방법의 일반적인 불순물인 것으로 나타났다. 경쟁 경로는 발효성 락테이트 데히드로게나제 경로 및 글리옥살라아제 I - 글리옥살라아제 II 경로로 규명되었다. 이들 경로는 에스케리키아 콜리에서 ldhA 유전자의 결실 (문헌 [Berrios-Rivera et al, 2003]) 또는 에스케리키아 콜리에서 ldhA 및 gloA 유전자 둘 모두의 결실 (문헌 [Altaras and Cameron, 2000])를 통해 표적이 되었으며, 이에 따라 글루코스로부터 1,2-프로판디올의 수율이 증가하는 것으로 나타났다. L-락트알데히드의 산화를 통해 L-락테이트를 생성하는 또 다른 경로는, WO 2005/073364에서 ldhA 및 gloA 유전자에 더하여 aldA 및 aldB 유전자의 결실에 의해 제거되어 왔다. 그러나, 이들 4가지의 결실에도 불구하고, 락테이트는 특정 조건에서 여전히 생성되었다. 글리옥살라아제 III이 상기 생성을 담당하여, 1,2-프로판디올 생성 방법의 수율 및 선택성 둘 모두에 강한 영향을 미치는 것으로 나타났다.

락트산 또는 락테이트 및 이들의 유도체는 식품, 제약, 피혁 및 섬유 산업에서 넓은 응용 범위를 갖는다. 최근, 폴리락트산 (PLA)이 재생가능하고, 생분해성이며 환경친화적인 플라스틱으로서 개발되었으며, 그에 따라 락테이트에 대한 수요가 확대될 것으로 기대된다. 락테이트는 화학적 합성에 의해, 또는 생물학적 합성에 의해 생성될 수 있다. 그러나, 오직 생물학적 방법만이 원하는 입체이성질체인 D- 또는 L-락테이트를 높은 광학적 순도로 생성할 수 있는데, 이는 이들의 최종 용도 중 대부분에 대해 중요한 특징이다. PLA의 물리적 특성 및 생분해율은 키랄 기질인 D- 및 L-락테이트의 비율을 조작함으로써 조절될 수 있다. 따라서, 광학적으로 순수한 D- 및 L-락테이트의 생성을 위한 생물학적 방법의 이용가능성은 고품질의 중합체 합성을 위해 필수적이다.

락트산 세균은 락테이트의 천연 생산자이며, 일부는 D- 또는 L-형태에 특이적인 것으로 밝혀질 수 있다. 이들 세균은 전통적으로 특수 화학물질로서의 락테이트 생성을 위해 사용되어 왔다 (예를 들어, US 2004/0005677에서). 그러나, PLA 합성을 위한 상품성 있는 화학물질로서의 락테이트의 출현으로, 보다 효율적이고 비용-효과적인 방법이 필요하다. 미네랄 염 배지에서 생장할 수 있고, 다양한 상이한 당 기질을 사용하는 대안적인 생체촉매가 연구되고 있다. 효모 및 에스케리키아 콜리는 이러한 특징들과 함께 대사 공학을 위한 넓은 범위의 유전학적 도구의 이용가능성이 결합되어 있다. 락트산의 생성을 위한 이들 촉매의 사용은, 효모 균주에 대해서는 WO 03102201, WO 03102152 및 US 2005/0112737에, 그리고 에스케리키아 콜리 균주에 대해서는 EP 1760156 및 WO 2005/033324에 기재되어 있다.

미생물에서 D- 또는 L-락테이트의 합성은, NADH-의존성 락테이트 데히드로게나제에 의한 당의 이화작용에 의해 생성되는 피루베이트의 환원에 의지한다. 일반적으로, 효율적인 전환을 위한 조건은 다량의 NADH 공동-인자가 이용가능한 혐기 생활 하에 이루어진다. 락트산 세균은 락테이트를 유일한 발효 생성물로서 생성하는 동질성발효 대사를 위해 선택될 수 있다. 이는 효모 또는 에스케리키아 콜리에는 해당되지 않으며, 에탄올, 아세테이트, 포르메이트 또는 숙시네이트와 같은 여타 발효 생성물이 제거되어야 한다. 이는 상응하는 유전자를 결실시키는 유전자 조작에 의해 달성될 수 있다.

최근 수년간, 광학적으로 순수한 D-락테이트의 생성을 위한 에스케리키아 콜리의 대사 공학이 연구되어 왔다. 장(Chang) 등 (1999)은 아세테이트 생성 경로에 결함이 있는 pta 돌연변이체를 이용하여, 천연 락테이트 데히드로게나제의 사용에 의해 탄소 플럭스가 D-락테이트 생성 쪽으로 방향전환될 수 있음을 보였다. 그러나, 탄소 플럭스의 일부는 여전히 부산물, 특히 숙시네이트의 합성 쪽으로 전환된다. 각각 아세테이트, 숙시네이트, 에탄올 및 포르메이트의 합성을 방지하기 위해 아세테이트 키나제 (ackA), 푸마레이트 리덕타제 (frdABCD), 알콜/알데히드 데히드로게나제 (adhE) 및 피루베이트 포르메이트 리아제(lyase) (pflAB)를 코딩하는 유전자를 불활성화시킴으로써, 향상된 생체촉매가 조우(Zhou) 등 (2003a)에 의해 개발되었다. 이들 변형은 D-락테이트를 98%의 화학적 순도 및 99%를 초과하는 광학적 순도로 생성할 수 있는 균주를 초래하였다. ldhA 유전자를 다른 유기체 (락토바실러스 카제 이 (Lactobacillus casei), 스트렙토코쿠스 보비스 (Streptococcus bovis) 또는 페 디오코쿠스 아키딜락티키 (Pediococcus acidilactici))로부터의, L-락테이트의 생성에 특이적인 락테이트 데히드로게나제 유전자로 추가로 대체하여 L-락테이트 생성용 에스케리키아 콜리를 유전자 조작하는 동일한 접근법이, 동일한 저자 (문헌 [Chang et al, 1999], [Zhou et al, 2003b]) 및 디엔(Dien) 등 (2001)에 의해 사용되었다. ackA, frdABCD, adhE 및 pflAB 유전자에서 결실을 갖는 균주에 대해, 조우 등 (2003b)은 98%의 화학적 순도 및 99%를 초과하는 광학적 순도의 L-락테이트의 생성을 보고하였다. 또한, 이러한 전략은 EP 1760156에도 기재되어 있다.

잉그람(Ingram)의 팀에 의해 개발된 D- 및 L-락테이트 생산자 (문헌 [Zhou et al, 2003a and b])에서, 더 나은 락테이트 생성을 위한 균주의 개발 도중에 약한 키랄 오염이 관측되었다. 이 오염은, 상기 논의된 바와 같이 메틸글리옥살 우회로에서 D- 또는 L-락테이트의 생성으로부터 유래한 것으로 나타났다 (문헌 [Grabar et al, 2006]). 상기 오염은 mgsA 유전자 내에 결실을 갖는 균주를 유전자 조작하여 방지할 수 있다. 상기 연구는 락테이트의 생성을 위한 대안적인 비-발효성 경로로서의 메틸글리옥살 우회로를 부각시켰다. 상기 대안적인 생성 경로는 아직 락테이트의 생성을 위한 방법을 확립하는데 이용되지 않았다.

본 발명은 서열 1의 서열, 그의 단편 또는 상동 서열을 포함하는, 글리옥살라아제 III 효소 활성을 갖는 단리된 폴리펩티드에 관한 것이다.

본 발명은 또한 상기 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명자들은 글리옥살라아제 III 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 에스케리키아 콜리의 유전자에 대한 동정을 보고한다. 이 유전자는 이전에 동종이량체 단백질인 Hsp31을 코딩하는 yedU 유전자 (또한 hchA로도 알려져 있음)로 알려졌다(문헌 [Sastry et al, 2002]). 이 단백질은 후에 정제 및 결정화되었고, 그 구조는 여러 그룹에 의해 규명되었다(문헌 [Lee et al, 2003], [Quigley ey al, 2003] 및 [Zhao et al, 2003]). 여러 기능이 Hsp31과 관련지어졌는데, 즉, 단백질 오접힘(misfolding) 관리에서 활성인 분자 샤페론(문헌 [Malki et al, 2003]), 특이성이 넓은 아미노펩티다제 (문헌 [Malki et al, 2005]) 및 여러 디옥시게나제 및 히드록실라제에 존재하는 것으로서 금속 이온을 배위시킬 수 있는 2-His-1-카르복실레이트 모티프와 관련된 또 다른 가능성 있는 기능(문헌 [Zhao et al, 2003])이다. Hsp31과 글리옥살라아제 III 활성이 관련없다는 것은 문헌에 보고된 적이 없다.

본 발명은 나아가 숙주 세포에서 기능성인 조절 요소의 제어 하에 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트 및 상기 카세트 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 형질전환 벡터에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 활성이 약화되거나 또는 강화되어 있는 조절된 글리옥살라아제 III 효소 활성을 갖는 변형 미생물을 제공한다.

본 발명의 한 가지 목적은 글리옥살라아제 III 단백질을 코딩하는 에스케리키아 콜리 유래의 유전자에 대한 새로운 지식을 이용하여 약화된 글리옥살라아제 III 효소 활성을 갖는 미생물을 설계하는 것이다. 이 미생물은, 기존의 공지된 방법들과 비교하여 향상된 수율로 및 더 양호한 선택성으로 (즉 부산물이 더 적음) 글루코스를 1,2-프로판디올 또는 아세톨로 전환시킬 수 있다.

본 발명의 특정 실시양태에서, 약화된 글리옥살라아제 III 활성을 갖는 본 발명에 따른 미생물은 1,2-프로판디올 및/또는 아세톨의 생성을 강화하도록 추가로 변형된다. 부가적으로, 상기 미생물을 적절한 성장 배지에서 성장시키고, 1,2-프로판디올 및/또는 아세톨을 회수하는, 1,2-프로판디올 및/또는 아세톨의 제조 방법이 제공된다.

또한, 본 발명의 목적은 글리옥살라아제 III 단백질을 코딩하는 에스케리키아 콜리 유래의 유전자에 대한 새로운 지식을 이용하여 락테이트 생성에 유용한 미생물을 설계하는 것이다. 글리옥살라아제 III을 코딩하는 상기 유전자를 과발현시키면 완전한 호기성 조건 하에서 락테이트를 생성할 수 있는 균주가 생성되어, 상기 방법의 생산성이 증가된다. 상기 미생물을 적절한 성장 배지에서 성장시키고 락테이트를 회수하는, 락테이트의 제조 방법이 제공된다.

본 발명은 또한 미생물에서 본 발명의 폴리펩티드의 활성을 강화 또는 약화시키는, 미생물에서 글리옥살라아제 III 효소 활성을 조절하는 방법에 관한 것이다.

발명의 상세한 설명

본원에 사용된 하기 용어들은 특허청구범위 및 명세서를 해석하는데 사용될 수 있다.

본 발명에 따르면, "폴리펩티드"라는 용어는 펩티드 결합으로 연결된 둘 이상의 아미노산으로 된 서열을 포함하는 펩티드 또는 단백질을 지칭한다.

"단리된"이라는 용어는, 천연에서는 결합되어 있는 1종 이상의 성분으로부터 분리된 단백질 또는 DNA 서열을 지칭한다.

"글리옥살라아제 III"이라는 용어는 메틸글리옥살의 D-락테이트로의 단일 단계 전환을 촉매하는 효소 활성을 담당하는 폴리펩티드를 지칭한다. 이러한 효소 활성은 문헌 [E. coli] (Misra et al (1995))에 기재되어 있으며, 이러한 효소 활성을 측정하는 방법도 제공되었다.

"효소 활성" 및 "효소적 활성"이라는 용어는 상호교환가능하게 사용되는 것으로서, 특정 화학 반응 (예를 들어 글리옥살라아제 III 효소 활성에 있어서 메틸글리옥살의 D-락테이트로의 전환)을 촉매하는 효소의 능력을 지칭한다.

본 발명의 단리된 폴리펩티드는 글리옥살라아제 III 활성을 갖는 미생물로부터, 예를 들어 하기 실시예에 기재된 바와 같은 정제 절차를 이용함으로써 수득할 수 있다. 상기 폴리펩티드를 단리하는데 사용가능한 미생물에는, 이에 제한되는 것은 아니나, 에스케리키아 콜리가 있다.

"서열 1의 서열을 포함하는"이라는 용어는, 해당 폴리펩티드의 아미노산 서열이 서열 1에만 엄격히 제한되는 것이 아니라 추가의 아미노산을 함유할 수 있음을 의미한다. "서열 1의 단편"이라는 용어는, 해당 폴리펩티드의 서열이 서열 1보다 더 적은 아미노산을 포함하지만 여전히 글리옥살라아제 III 활성을 부여하기에 충분한 아미노산을 포함할 수 있음을 의미한다. 폴리펩티드가 하나 이상의 아미노산의 치환, 삽입, 결실 및/또는 부가에 의해 변형되면서도, 그의 효소 활성을 유지할 수 있다는 것은 당업계에 익히 공지되어 있다. 예를 들어, 주어진 위치에서 1개 아미노산을 단백질의 기능적 특성에 영향을 주지 않는 화학적으로 등가인 아미노산으로 치환시키는 것은 흔하다. 본 발명의 목적상, 치환은 하기 군 중 하나의 내부에서의 교환으로 정의된다.

비-극성 또는 약간 극성의 소형 지방족 잔기: Ala, Ser, Thr, Pro, Gly

극성의, 음으로 하전된 잔기 및 그의 아미드: Asp, Asn, Glu, Gln

극성의, 양으로 하전된 잔기: His, Arg, Lys

비-극성의 대형 지방족 잔기: Met, Leu, Ile, Val, Cys

대형 방향족 잔기: Phe, Tyr, Trp.

따라서, 하나의 음으로 하전된 잔기가 다른 것으로 (예컨대, 글루탐산이 아스파르트산으로) 또는 하나의 양으로 하전된 잔기가 다른 것으로 (예컨대, 리신이 아르기닌으로) 치환되는 결과를 가져오는 변화는 기능적으로 등가인 산물을 생성할 것으로 예상할 수 있다.

아미노산이 변형되는 위치 및 아미노산 서열 중 변형되는 아미노산의 수에는 특별한 제한이 없다. 당업자는 도입되더라도 해당 단백질의 활성에 영향을 주지 않는 변형을 인지할 수 있다. 예를 들어, 단백질의 N- 또는 C-말단 부분의 변형은 단백질의 활성을 변화시킬 것으로 예상되지 않는다.

"상동"이라는 용어는 상기 정의된 바와 같은 변형이 가해졌으나 여전히 본래의 효소 활성을 유지하는 폴리펩티드를 지칭한다.

본 발명의 특정 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 서열 1의 서열과의 동일성이 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상 및 더 바람직하게는 90% 이상이다.

2개의 단백질 서열 간의 동일성의 비율을 측정하는 방법은 당업자에 공지되어 있다. 예를 들어, 웹사이트 http://www.ebi.ac.uk/clustalw/ 상에서 이용가능한 소프트웨어 CLUSTALW를 이 웹사이트 상에 지시된 기본 매개변수와 함께 이용하여 서열들을 정렬한 후 측정할 수 있다. 이 정렬로부터, 동일한 위치의 동일한 잔기의 수를 잔기의 총 수와 비교하여 기록함으로써 동일성의 비율을 용이하게 계산할 수 있다. 대안적으로는, 예를 들어 웹사이트 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ 상에서 이용가능한 BLAST 프로그램을 이 웹사이트 상에 지시된 기본 매개변수와 함께 이용하여 자동 계산을 실시할 수 있다.

본 발명의 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 1의 서열로부터의 100개 이상의 인접 아미노산, 바람직하게는 서열 1에 나타난 서열 중의 150개 이상, 200개 이상, 250개 이상 또는 더 바람직하게는 280개 이상의 인접 아미노산을 포함한다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 1의 서열과 엄격히 동일한 폴리펩티드성 서열을 갖는다.

본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.

"폴리뉴클레오티드"라는 용어는, 단일 가닥 또는 이중 가닥이고, 임의로는 합성이거나, 비(非)-천연이거나, 또는 변경된 뉴클레오티드 염기를 함유하는, 리보뉴클레오티드 (또는 RNA)의 중합체 또는 데옥시리보뉴클레오티드 (또는 DNA)의 중합체를 지칭한다. DNA 형태의 단리된 폴리뉴클레오티드는 합성 DNA, 게놈 DNA 또는 cDNA의 하나 이상의 분절을 함유할 수 있다.

당해 폴리뉴클레오티드의 기원이 반드시 효소 활성이 본래 측정된 유기체인 것은 아니다. 당업자는 서열 2의 뉴클레오티드 서열을 포함한 탐침을 이용한 여러 가지 엄격성 조건 하에서의 혼성화를 이용하여 유전자 라이브러리를 스크리닝하여 상기와 같은 폴리뉴클레오티드를 탐색할 수 있다. 혼성화에 대한 상세한 프로토콜은 문헌 [Sambrook et al (1989)]에 개시되어 있다.

상기 폴리뉴클레오티드의 서열은 예를 들어 상기 정의된 BLAST 프로그램을 이용하여 서열 2의 뉴클레오티드 서열과의 상동성을 검색하여 데이터베이스로부터 추출할 수 있다.

본 발명의 바람직한 폴리뉴클레오티드는 서열 2의 뉴클레오티드 서열과 80% 이상 동일한 폴리뉴클레오티드이다. 본 발명의 더 바람직한 폴리뉴클레오티드는 서열 2의 뉴클레오티드 서열과 90% 이상 동일한 폴리뉴클레오티드이다. 본 발명의 더욱 더 바람직한 폴리뉴클레오티드는 서열 2의 뉴클레오티드 서열과 95% 이상 동일한 폴리뉴클레오티드이다.

특히, 서열 2의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 본 발명에 포함된다.

"코딩하다"라는 용어는 폴리뉴클레오티드가 전사 및 번역 기작을 통해 아미노산 서열을 생성하는 과정을 지칭한다. 이 과정은 DNA에서의 염기 서열 및 단백질에서의 아미노산 서열 간의 관계인 유전 암호에 의해 가능하게 된다. 유전 암호의 한 가지 주요한 특징은 축퇴성이 있는 것인데, 이는 하나의 아미노산이 염기 3개로 이루어진 집합 (하나의 "코돈") 둘 이상에 의해 코딩될 수 있음을 의미한다. 그 직접적인 결과는 상이한 폴리뉴클레오티드에 의해 동일한 아미노산 서열이 코딩될 수 있다는 것이다. 일례로, 유전 암호의 축퇴성에 의해 서열 2로부터 유래한 폴리뉴클레오티드 서열이 또한 서열 1의 폴리펩티드 서열을 코딩할 수도 있고, 그에 따라 이는 본 발명에서 고려된다. 유기체에 따라 코돈의 사용이 다를 수 있다는 것은 당업자에 익히 공지되어 있다. 동일 아미노산을 코딩하는 코돈 중에서, 일부는 주어진 미생물에 의해 바람직하게 사용될 수 있다. 따라서, 상기 유기체에서 해당 단백질의 발현을 최적화하기 위해 특정 미생물의 코돈 사용에 맞게 적합하게 된 폴리뉴클레오티드를 설계하는 것이 관심 대상일 수 있다.

본 발명은 또한 숙주 미생물에서 기능적인 조절 요소의 제어 하에 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트에 관한 것이다.

"발현"이라는 용어는 유전자의 산물인 상응하는 단백질의 생성을 초래하는 유전자 서열의 전사 및 번역을 지칭한다.

"발현 카세트"라는 용어는 폴리뉴클레오티드, 바람직하게는 적합한 숙주 유기체 내부에서 폴리뉴클레오티드에 함유된 유전자의 발현을 가능하게 하는 프로모터, 인핸서, 리보솜 결합 부위 또는 종결자와 같은 조절 요소에 연결된 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 그러한 조절 요소는 해당 유전자 자체의 조절 요소일 수 있으나, 또한 상기 유전자의 발현을 더욱 강하게 하는 변형 요소 또는 합성 요소일 수 있다. 예를 들어, 유전자의 본래적 프로모터를 더 강한 프로모터로 대체함으로써 더 강한 발현을 구현할 수 있다. 에스케리키아 콜리에 있어서 이러한 프로모터는 예를 들어 lac 프로모터, tac 프로모터, trc 프로모터 및 람다 cI 프로모터이다. 다른 유기체에 대해서도, 당업자는 더 적합한 프로모터를 선택할 수 있을 것이다.

"숙주 미생물"이라는 용어는 외래 유전자 또는 이종 유전자, 또는 그 자신의 유전자의 추가 복제물을 수용할 수 있고 이들 유전자를 발현시켜 활성인 단백질 산물을 생성할 수 있는 미생물을 지칭한다.

본 발명은 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 카세트를 포함하는 형질전환 벡터를 제공한다.

"형질전환"이라는 용어는 새로운 유전자 또는 기존의 유전자의 추가 복제물을 숙주 유기체 내로 도입하는 것을 지칭한다. 획득된 유전자는 염색체 DNA 내로 편입되거나 또는 염색체외 요소로서 도입될 수 있다. 일례로, 에스케리키아 콜리에서, DNA를 숙주 유기체 내로 전달시키는 방법은 전기천공법이다.

"형질전환 벡터"라는 용어는 폴리뉴클레오티드를 숙주 유기체에 도입하는데 사용되는 임의의 운반체를 지칭한다. 이러한 운반체는 예를 들어 사용되는 유기체에 따라 플라스미드, 파지 또는 당업계의 전문가에 알려져 있는 기타 요소일 수 있다. 형질전환 벡터는 통상 폴리뉴클레오티드 또는 발현 카세트 이외에 특정 숙주 세포의 형질전환을 용이하게 하는 다른 요소를 함유한다. 발현 벡터는 그에 내포된 유전자의 적절한 발현을 가능하게 하는 발현 카세트, 및 벡터의 숙주 유기체 내로의 복제를 가능하게 하는 추가적 요소를 포함한다. 발현 벡터는 숙주 유기체에서 단일 복제물로 존재하거나 또는 복수 개의 복제물로 존재할 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드의 활성이 약화 또는 강화되어 있는, 조절된 글리옥살라아제 III 활성을 갖는 변형 미생물을 제공한다.

"효소 활성의 약화"라는 용어는 관심 대상 효소의 활성이 임의의 변형 전의 동일한 미생물에서 관찰되는 활성과 비교하여 감소된 것을 지칭한다. 이러한 결과를 수득할 수 있는 다수의 수단이 당업자에 공지되어 있는데, 예를 들어 하기가 있다.

- 유전자 내로 돌연변이를 도입하여, 이 유전자의 발현 수준, 또는 코딩된 단백질의 활성 수준을 감소시킴.

- 유전자의 천연 프로모터를 낮은 강도의 프로모터로 대체하여, 발현을 저하시킴.

- 상응하는 전령 RNA 또는 단백질을 불안정하게 하는 요소를 사용함.

- 발현이 전혀 필요하지 않은 경우 유전자를 결실시킴.

"효소 활성 증가" 또는 "효소 활성 강화"란 임의의 변형 전의 동일한 미생물에서 측정한 본래의 활성에 비해 활성이 더 우수한 것을 의미한다. 상응하는 비(非)-변형 미생물은 고려 대상인 효소 활성을 제외하고는 변형 미생물과 동일한 특성을 가진 미생물이다. 유리하게는, 효소 활성은 상응하는 비(非)-변형 미생물의 본래적 활성과 비교하여 50% 이상, 바람직하게는 100% 이상 증가된다. 글리옥살라아제 III 활성을 측정하는 방법은 하기 실시예 1에 제시되어 있다.

본 발명에 따른 미생물은 세균, 효모 및 진균으로 이루어진 군 중에서 선택된다. 바람직하게는, 세균은 엔테로박테리아과(Enterobacteriaceae), 바실러스과(Bacillaceae), 클로스트리디움과(Clostridiaceae), 스트렙토마이세스과(Streptomycetaceae) 및 코리네박테리움과(Corynebacteriaceae)로 이루어진 군 중에서 선택된다. 더 바람직하게는, 세균은 에스케리키아 콜리(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 클로스트리디움 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum) 및 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)으로 이루어진 군 중에서 선택된다.

본 발명의 목적은, 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 본래적 유전자의 발현이 약화되어 있는, 약화된 글리옥살라아제 III 활성을 갖는 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명에 따른 "유전자 발현의 약화"라는 용어는 유전자 발현의 부분적인 억제 또는 완전한 억제를 나타내며, 그렇게 되면 "약화되어 있는" 것으로 부른다. 이러한 발현 억제는 유전자 발현의 저해, 유전자 발현에 필요한 프로모터 영역의 전부 또는 일부의 결실, 또는 유전자의 코딩 영역에서의 결실일 수 있다. 바람직하게는, 유전자의 약화는 본질적으로 해당 유전자의 완전한 결실이며, 상기 유전자는 본 발명에 따른 균주의 동정, 단리 및 정제를 용이하게 하는 선별 마커 유전자로 대체될 수 있다. 유전자를 상동 재조합 기술에 의해 불활성화하는 것이 바람직하다(문헌 [Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000]).

본 발명의 일 실시양태에서는, 약화된 글리옥살라아제 III 활성을 가진 미생물을 탄소 공급원으로부터의 1,2-프로판디올 및/또는 아세톨의 생성을 강화하도록 추가로 변형시킨다.

본 발명의 특정 실시양태에서는, 본 발명에 따른 미생물에서, 탄소 공급원으로부터의 1,2-프로판디올 및/또는 아세톨 생성 수율을 증가시키기 위해 우회 경로 또는 부산물 형성 경로에 관여하는 일부 효소 활성을 약화시킨다.

edd 및 eda 유전자에 의해 코딩되는, 엔트너-도도로프(Entner-Doudoroff) 경로에 관여하는 효소 활성의 약화. 엔트너-도도로프 경로는 해당과정에 더하여 글루코스를 글리세르알데히드-3-포스페이트 및 피루베이트로 분해하는 대안적 길을 제공한다. 엔트너-도도로프 경로가 약화되면, 대부분의 또는 최상의 경우 전부의 글루코스가 해당과정을 통해 분해되어 1,2-프로판디올의 생성에 이용되는 것이 보장된다.

메틸글리옥살의 락테이트로의 전환에 관여하는 효소, 즉, gloA 유전자에 의해 코딩되는 것으로서 메틸글리옥살로부터의 락토일 글루타티온의 합성을 촉매하는 글리옥살라아제 I, 및 aldA 및 aldB 유전자에 의해 코딩되는 것으로서 (S) 락트알데히드로부터의 (S) 락테이트의 합성을 촉매하는 락트알데히드 데히드로게나제의 약화. 이들 효소를 약화시키는 목적은 목적하는 생성물의 합성을 위해 전구체인 메틸글리옥살을 아껴두기 위함이다.

락테이트, 에탄올 및 포르메이트와 같은 부산물의 합성에 관여하는 효소, 즉, ldhA 유전자에 의해 코딩되는 것으로서 피루베이트로부터 락테이트의 합성을 촉매하는 락테이트 데히드로게나제, adhE 유전자에 의해 코딩되는 것으로서 아세틸-CoA로부터 에탄올의 합성을 촉매하는 알콜-알데히드 데히드로게나제, 및 pflA 및 pflB 유전자에 의해 코딩되는 것으로서 피루베이트로부터 아세틸-CoA 및 포르메이트의 합성을 촉매하는 피루베이트 포르메이트 리아제의 약화.

바람직하게는, 이들 유전자 중 하나 이상을 약화시킨다.

본 발명의 또 다른 특정 실시양태에서는, 트리오스 포스페이트 이소머라제 활성을 약화시킨다. 바람직하게는, 이 결과를 tpiA 유전자의 발현을 약화시켜 수득한다. 더 바람직하게는, tpiA 유전자를 결실시킨다. tpiA 유전자는 DHAP의 글리세르알데히드 3-포스페이트로의 전환을 촉매하는 효소 '트리오스 포스페이트 이소머라제'를 코딩한다. 이 유전자의 발현이 약화되면, 대사되는 글루코스의 절반이 1,2-프로판디올 및/또는 아세톨로 전환되는 것이 보장된다.

본 발명의 또 다른 특정 실시양태에서는, 글리세르알데히드 3 포스페이트 데히드로게나제 활성을 약화시킨다. GAPDH로도 불리는 글리세르알데히드 3-포스페이트 데히드로게나제는 글루코스의 피루브산으로의 해당성 전환에 관여하는 핵심 효소 중 하나이다. 이 효소의 약화는 GA3P의 일부가 1,2-프로판디올 및/또는 아세톨의 합성 쪽으로 방향 전환하는 결과를 가져온다. 그렇게 되면 글루코스에 대한 1,2-프로판디올의 수율은 1몰/몰을 초과할 수 있다. 유리하게는, 글리세르알데히드 3-포스페이트 데히드로게나제의 활성은 야생형 GADPH의 보통의 활성의 대략 30% 미만, 더 바람직하게는 10% 미만이다. 바람직하게는, GAPDH를 코딩하는 gapA 유전자의 발현을 약화시킨다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서는, 본 발명에 따른 미생물에서, 당 이입의 효율을 증가시킨다. GAPDH 반응에서 탄소 플럭스의 50% 초과의 감소가 일어나도록 gapA 유전자의 발현을 강하게 약화시키면 이입되는 글루코스 1몰당 1몰 미만의 PEP가 합성되는 결과가 일어난다. PEP는 단당류의 세포 내로의 이입에 보통 사용되는 당-포스포트랜스퍼라제 시스템 (PTS)에 필요한데, 그 이유는 이입이 PEP로부터 글루코스로의 인산기 전달에 의해 글루코스-6-포스페이트를 산출하는 것에 결합되어 있기 때문이다. 따라서, PEP의 양을 감소시키는 것은 당 이입에 부정적인 영향을 미칠 것이다.

본 발명의 특정 실시양태에서는, 당을 포스포에놀피루베이트와 무관한 당 이입 시스템에 의해 미생물 내로 이입시킬 수 있다. 인산화를 수반하지 않는 galP 유전자에 의해 코딩되는 갈락타제-양성자 공동수송체가 이용될 수 있다. 이 경우, 이입되는 글루코스는 glk 유전자에 의해 코딩되는 글루코스 키나제 활성에 의해 인산화되어야 한다. 이 경로를 촉진하기 위해, galP 및 glk 중에서 선택되는 1종 이상의 유전자의 발현을 증가시킨다. 그 결과로서, PTS는 불필요하게 되고, ptsG, ptsH, ptsI 또는 crr 중에서 선택되는 1종 이상의 유전자를 약화시킴으로써 이를 제거할 수 있다. 상기 4가지 유전자는 PTS 복합체의 상이한 기능적 도메인을 코딩하는데, ptsG는 효소 II의 B 및 C 2개의 소단위체를 코딩하고, ptsH는 HPr 단백질을 코딩하고, ptsI는 효소 I를 코딩하고, crr은 효소 II의 A 소단위체를 코딩한다.

본 발명의 또 다른 특정 실시양태에서는, 대사산물인 포스포에놀피루베이트의 이용률을 증가시켜 당-포스포트랜스퍼라제 시스템 (PTS)의 효율을 증가시킨다. gapA 활성의 약화 및 피루베이트로의 탄소 플럭스 감소로 인해, 본 발명의 변형된 균주에서의 PEP의 양이 제한될 수 있어, 세포 내로 수송되는 글루코스의 양의 감소를 이끌어낼 수 있다.

미생물 균주에서 PEP 이용률을 증가시키기 위해 사용될 수 있는 다양한 방법이 존재한다. 특히, 어떤 방법은 PEP → 피루베이트 반응을 약화시킨다. 바람직하게는, 상기 균주에서 피루베이트 키나제 효소를 코딩하는 pykA 및 pykF 중에서 선택되는 1종 이상의 유전자를 약화시켜, 이 결과를 수득한다. PEP 이용률을 증가시키는 또 다른 방법은 포스포에놀피루베이트 신타제의 활성을 증가시켜 이 효소에 의해 촉매되는 피루베이트 → PEP 반응을 촉진시키는 것이다. 이 효소는 ppsA 유전자에 의해 코딩된다. 따라서, 바람직하게는 미생물에서, ppsA 유전자의 발현을 증가시키는 것이 바람직하다. 두 가지 변형 모두가 미생물에 동시에 존재할 수 있다.

본 발명의 또 다른 특정 실시양태에서는, 부산물인 아세테이트의 합성에 관여하는 1종 이상의 효소를 약화시켜 아세테이트의 합성을 방지한다. 1,2-프로판디올의 생성을 최적화하기 위해서는 그러한 아세테이트 합성을 피하는 것이 바람직하다.

아세테이트의 생성을 방지하기 위해, 유리하게는 ackA, pta 및 poxB 중에서 선택되는 1종 이상의 유전자를 약화시킨다. 이들 유전자는 모두 상이한 아세테이트 생합성 경로에 관여하는 효소들을 코딩한다.

구체적으로 1,2-프로판디올의 생성에 있어서, 특정 효소 활성, 즉, 메틸글리옥살 신타제, 메틸글리옥살 리덕타제 및 1,2-프로판디올 데히드로게나제 활성을 증가시켜 상기 화합물의 형성을 유도하는 것이 유리할 수 있다. 유리하게는, 이들 효소 활성을 상응하는 비(非)-변형 미생물의 본래적 활성과 비교하여 50% 이상, 바람직하게는 100% 이상 증가시킨다.

특정 효소 활성의 증가를 달성하기 위해, 바람직하게는 이들 활성을 코딩하는 유전자, 즉, 메틸글리옥살 신타제를 코딩하는 mgsA 유전자, 메틸글리옥살 리덕타제를 코딩하는 yqhD, yafB, ydhF, ycdW, yqhE, yeaE, yghZ, yajO, tas , ydjG, 및 ydbC, 1,2-프로판디올 데히드로게나제를 코딩하는 gldA 또는 fucO를 과발현시킨다.

바람직하게는 mgsA, yqhD 및 gldA 유전자들의 과발현 조합을 사용한다.

관심 유전자의 과발현을 얻기 위한 다양한 방법을 당업자는 알고 있으며, 이는 예를 들어 다음과 같다:

1- 유전자의 본래적 프로모터를 관심 유전자의 보다 강한 수준의 발현을 유도하는 프로모터로 대체.

2- 상기 관심 유전자를 운반 및 발현하는 발현 벡터의 미생물로의 도입.

3- 미생물의 염색체로 관심 유전자의 추가 복제물의 도입.

증가된 효소 활성을 얻기 위한 또 다른 방식은 본래적 단백질보다 높은 활성을 나타내는 유전자 산물의 번역을 가능하게 하는 특이적 돌연변이를 관심 유전자로 도입하는 것이다.

혐기성 또는 미세호기성 조건 하에, 1,2-프로판디올로의 전구체의 환원을 위한 NADH의 이용률은 유리하게 증가한다. 이는 광범위한 조절자 ArcA (arcA 유전자에 의해 코딩됨)에 의해 매개되는 트리카르복실산 사이클에 대한 억제를 경감시킴으로써 얻어진다. 세포 내 NADH 농도는 유전자 ndh에 의해 코딩되는 NADH 데히드로게나제 II를 불활성화시킴으로써 증가될 수 있다. 따라서, 바람직하게는 arcA 및 ndh 중에서 선택되는 1종 이상의 유전자를 약화시킨다.

특히, 혐기성 또는 미세호기성 조건 하에, 피루베이트를 아세틸-coA로 전환시키는 피루베이트 데히드로게나제 복합체 (PDC)가 NADH에 의한 억제에 대해 낮은 민감도를 갖는 것이 유리하다. 보다 낮은 민감도는 야생형 효소의 민감도를 참조하여 규정된다. 이러한 특성은, 효소의 단백질 서열에서 알라닌 55를 발린 잔기로 대체하는 lpd 유전자 (PDC의 소단위체 리포아미드 데히드로게나제를 코딩함)에서의 특이적인 돌연변이에 의해 얻어질 수 있다.

바람직하게는, 주로 1,2-프로판디올을 생성하도록 고안된 미생물은 세균, 효모 또는 진균 중에서 선택된다. 더욱 바람직하게는, 상기 미생물은 엔테로박테리아과, 바실러스과, 클로스트리디움과, 스트렙토마이세스과 및 코리네박테리움과 중에서 선택된다. 더욱 더 바람직하게는, 상기 미생물은 에스케리키아 콜리 또는 클로스트리디움 아세토부틸리쿰이다.

구체적으로 아세톨의 생성의 경우 다음 화합물의 형성을 유도하는 특이적 효소 활성을 증가시키는 것이 유리할 수 있다: 메틸글리옥살 신타제 및 메틸글리옥살 리덕타제. 유리하게는, 상기 효소 활성은 상응하는 비-변형 미생물의 본래적 활성에 비해 50% 이상, 바람직하게는 100% 이상까지 증가한다.

특이적 효소 활성의 증가를 얻기 위해서, 바람직하게는 이들 활성을 코딩하는 하기 유전자를 과발현시킨다: mgsA 유전자 (메틸글리옥살 신타제를 코딩함), yqhD, yafB, ydhF, ycdW, yqhE, yeaE, yghZ, yajO, tas , ydjG 및 ydbC (모두 메틸글리옥살 리덕타제를 코딩함).

mgsA 및 yqhD 유전자의 과발현의 조합이 바람직하게는 이용된다.

또한, 아세톨의 생성의 경우, 아세톨로부터 1,2-프로판디올의 형성을 방지하는 것이 유리하다. 이러한 결과는 아세톨을 1,2-프로판디올로 전환하는 데 관여하는 1종 이상의 효소의 활성을 약화시킴으로써 달성될 수 있다. 바람직하게는, gldA 유전자의 발현을 약화시키고, 더욱 바람직하게는 gldA 유전자를 결실시킨다.

발현이 유리하게 약화될 수 있는 다른 유전자는 다음과 같다: ptsG, ptsH, ptsI , crr , edd, eda, gloA, aldA, aldB, ldhA, pflA, pflB, adhE, tpiA, gapA, pykA, pykF, ackA, pta, poxB.

발현이 유리하게 강화될 수 있는 다른 유전자는 다음과 같다: galP, glk , ppsA.

바람직하게는, 주로 아세톨을 생성하도록 고안된 미생물은 세균, 효모 또는 진균 중에서 선택된다. 더욱 바람직하게는, 상기 미생물은 엔테로박테리아과, 바실러스과, 스트렙토마이세스과 및 코리네박테리움과 중에서 선택된다. 더욱 더 바람직하게는, 상기 미생물은 에스케리키아 콜리 또는 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae )이다.

본 발명의 목적은 또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드가 과발현되는, 강화된 글리옥살라아제 III 활성을 갖는 미생물에 제공하는 것이다.

바람직하게는, 과발현은 본 발명의 벡터를 갖는 유기체를 형질전환시키거나, 또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 카세트를 유기체의 염색체로 통합함으로써 얻어진다.

발현 벡터에 내포되거나 또는 염색체로 통합된 유전자의 하나의 단일 복제물 또는 다중 복제물을 도입하여 과발현을 조절할 수 있다. 또한, 상이한 수준의 유전자 발현을 유도하는 다양한 종류의 프로모터가 사용될 수 있다.

신규 유전자의 삽입에 적합한 염색체 상의 위치는 당업계의 숙련자에 의해 선택될 수 있다. 이러한 위치 (또는 좌위)는 숙주 유기체의 필수적인 기능에 영향을 미치지 않아야 한다. 유전자의 숙주 유기체의 염색체로의 통합 방법은 예를 들어 삼브룩(Sambrook) 등의 문헌 (1989)에 개시되어 있다.

본 발명의 목적은, 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 본래적 유전자의 발현이 강화되어 있는, 강화된 글리옥살라아제 III 활성을 갖는 미생물을 제공하는 것이다. 이는 바람직하게는 본래적 유전자의 코딩 서열 상류에 강력한 프로모터를 도입함으로써 얻어진다.

또한, 유전자의 다른 조절 요소를 변형할 수 있다. 예를 들어, 유전자의 상류 영역 (출발 코돈, 리보솜 결합 부위)에서 이 분야의 숙련자에 의해 선택될 수 있는 적합한 돌연변이로 발현을 증가시킬 수 있다. 또한, 유도성 프로모터를 도입하여 목적하는 경우 유전자의 발현을 켜고/끌 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 강력한 프로모터는 본 발명에 따른 폴리펩티드를 코딩하는 본래적 유전자의 코딩 서열에 대해 상류에 존재한다.

본 발명은 또한, 락테이트의 생성을 강화하도록 추가 변형된, 강화된 글리옥살라아제 III 활성을 갖는 미생물에 관한 것이다.

본원에서 사용된 용어 "락테이트"는 D-락테이트 및 L-락테이트, 및 50/50 (라세미 혼합물), 75/25, 90/10 및 100/0과 같은 다양한 비율의 혼합물을 비롯한 이들의 혼합물을 나타낸다.

본 발명의 특정 실시양태에서, 상기 기재된 바와 같은 미생물에 변형을 도입하여, 특히 락테이트의 생성을 강화시킨다.

바람직하게는, 메틸글리옥살 신타제 활성을 증가시킨다. 바람직한 방법은 mgsA 유전자의 과발현이다. 또한, 하나 또는 여러 개의 돌연변이를 mgsA 유전자에 도입하여 사용된 배양 조건 하에 메틸글리옥살 신타제 활성을 증가시킬 수 있다.

발현을 유리하게 강화시킬 수 있는 다른 유전자는 다음과 같다: galP, glk, ppsA.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, edd 및 eda 유전자에 의해 코딩되는 엔트너-도도로프 경로의 1종 이상의 효소 활성이 약화된다. 바람직하게는, edd 또는 eda 유전자 중 하나 이상이 약화된다. 상술한 바와 같이, 엔트너-도도로프 경로는 해당 경로의 원치 않는 우회로로서 기능할 수 있다.

1,2-프로판디올 및/또는 아세톨의 생성의 경우, 메틸글리옥살 우회로로의 탄소 흐름의 방향 전환이 유리하다. 따라서, 바람직하게는 GAPDH 및 관련 특성 (당 이입의 유전자 조작 또는 PEP 재순환의 유전자 조작)의 약화가 도입된다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 미생물에서, 부산물 형성 경로에 관여하는 일부 효소 활성을 약화시켜 락테이트의 생성을 증가시킨다:

pflA 및 pflB 유전자에 의해 코딩되는, 피루베이트로부터의 아세틸-CoA 및 포르메이트의 합성을 초래하는 피루베이트 포르메이트 리아제 활성.

오페론 frdABCD에 의해 코딩되는, 푸마레이트로부터의 숙시네이트의 합성을 초래하는 푸마레이트 리덕타제 활성.

유전자 adhE에 의해 코딩되는, 아세틸-CoA로부터의 에탄올의 합성을 초래하는 알코올-알데히드 데히드로게나제 활성.

각각 pta 및 ackA 유전자에 의해 코딩되는, 아세틸-CoA로부터 2단계로의 아세테이트의 합성을 초래하는 포스포트랜스아세틸라제 및 아세테이트 키나제 활성.

poxB 유전자에 의해 코딩되는, 피루베이트로부터 1단계로의 아세테이트의 합성을 초래하는 피루베이트 옥시다제 활성.

바람직하게는, 활성의 약화는 상기 유전자 중 1종 이상의 약화에 의해 얻어진다.

메틸글리옥살 우회로로부터 기원하는 다른 가능한 부산물은 아세톨, 락트알데히드 및 1,2-프로판디올이다. 이들 부산물의 형성을 방지하기 위해서, 1종 이상의 메틸글리옥살 리덕타제 활성을 약화시킨다. 이는 바람직하게는 yqhD, yafB, yqhE, ydhF, ycdW, yeaE, yghZ, yajO, tas, ydjG, ydbC 및 gldA 중에서 선택되는, 메틸글리옥살 리덕타제 활성을 코딩하는 1종 이상의 유전자를 약화시킴으로써 구현된다.

생성된 D-락테이트가 추가 대사되지 않는 것이 유리하다. 따라서, 본 발명의 또 다른 실시양태에서, D-락테이트를 사용하는 1종 이상의 효소 활성을 약화시킨다. 바람직하게는, dld 유전자를 약화시킨다.

또한, L-락테이트의 추가 대사를 방지하는 것이 유리하다. 바람직하게는, L-락테이트를 사용하는 1종 이상의 효소의 발현 또는 활성을 약화시킨다. 더욱 바람직하게는, lldD 유전자를 약화시킨다.

락테이트의 생성을 돕기 위해서 발현이 유리하게 약화될 수 있는 다른 유전자는 다음과 같다: ptsG, ptsH, ptsI , crr , gloA, aldA, aldB, gapA, pykA, pykF, tpiA.

바람직하게는, 락테이트를 생성하도록 고안된 미생물은 세균, 효모 또는 진균 중에서 선택된다. 더욱 바람직하게는, 미생물은 엔테로박테리아과, 바실러스과, 스트렙토마이세스과 및 코리네박테리움과 중에서 선택된다. 더욱 더 바람직하게는, 미생물은 에스케리키아 콜리, 바실러스 서브틸리스 또는 코리네박테리움 글루타미쿰 종으로부터이다.

본 발명은, 미생물에서 본 발명의 폴리펩티드의 활성을 강화 또는 약화시키는, 미생물에서 글리옥살라아제 III 효소 활성을 조절하는 방법을 제공한다.

바람직하게는, 상기 방법에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 과발현시켜 글리옥살라아제 III 효소 활성을 강화시킨다.

바람직하게는, 상기 방법에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 발현을 약화시켜 글리옥살라아제 III 효소 활성을 약화시킨다.

본 발명은 또한, 본 발명에 따른 미생물을 탄소 공급원을 포함하는 적절한 배양 배지에서 성장시키고, 생성된 1,2-프로판디올 및/또는 아세톨을 회수하는, 1,2-프로판디올 및/또는 아세톨의 제조 방법에 관한 것이다. 1,2-프로판디올의 생성은 호기성, 미세호기성 또는 혐기성 조건 하에 수행된다. 아세톨의 생성은 호기성 또는 미세호기성 조건 하에, 바람직하게는 호기성 조건 하에 수행된다.

"탄소 기질" 또는 "탄소 공급원"이라는 용어는 미생물에 의해 대사될 수 있는 임의의 탄소 공급원을 의미하고, 여기서 상기 기질은 하나 이상의 탄소 원자를 함유한다. 본 발명자는 특히 재생가능하고, 저렴하며, 발효가능한 탄소 공급원, 예를 들어 단당류, 올리고당류, 다당류, 단일-탄소 기질, 및 폴리올, 예컨대 글리세롤을 지칭한다. 화학식 (CH₂O)_n의 당류는 또한 -오스(ose) 또는 "단순당"으로 지칭되는데, 단당류로는 프룩토스, 글루코스, 갈락토스 및 만노스가 있다. 다른 탄소 공급원은 이당류, 삼당류, 올리고당류 및 다당류이다. 이당류로는 사카로스 (수크로스), 락토스 및 말토스가 있다. 전분 및 헤미셀룰로스는 "복합당"으로도 알려져 있는 다당류이다.

유리하게는, 회수된 1,2-프로판디올 및/또는 아세톨을 추가 정제한다.

본 발명은 또한, 본 발명에 따른 미생물을 탄소 공급원을 함유한 적합한 성장 배지에서 성장시키고, 락테이트를 회수하는, 락테이트의 제조 방법에 관한 것이다. 락테이트의 생성은 호기성, 미세호기성 또는 혐기성 조건 하에, 바람직하게는 호기성 조건 하에 수행된다.

유리하게는, 회수된 락테이트를 추가 정제한다.

발효 공정에 대한 배양 조건은 당업자들에 의해 용이하게 규정될 수 있다. 특히, 20℃ 내지 55℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃, 및 바람직하게는 클로스트리디움 아세토부틸리쿰의 경우에 약 35℃, 및 에스케리키아 콜리 및 클렙시엘라 뉴모니아의 경우에 약 37℃의 온도에서 세균을 발효시킨다.

상기 방법은 회분식 방법, 유가식 방법 또는 연속 방법으로 수행될 수 있다.

"호기성 조건 하에"란 기체를 액체상으로 용해시켜 배양물에 산소를 제공하는 것을 의미한다. 이는 (1) 산소 함유 기체 (예를 들어, 공기)를 액체상에 살포하거나 또는 (2) 배양 배지를 함유하는 용기를 진탕하여 상부 공간에 함유된 산소를 액체상으로 이동시킴으로써 수행될 수 있었다. 혐기성 조건 대신 호기성 조건 하의 발효 이점은 전자 수용체로서의 산소의 존재가 세포 과정을 위한 ATP 형태의 보다 많은 에너지를 생성하는 균주의 능력을 개선시킨다는 점이다. 따라서, 균주는 그의 일반적인 대사가 개선된다.

미세호기성 조건은 적은 분율의 산소 (예를 들어, 0.1 내지 10%의 산소를 함유하고, 질소에 의해 100%가 되는 기체 혼합물 사용)가 액체상에 용해되어 있는 배양 조건으로 정의된다.

혐기성 조건은 배양 배지에 제공되는 산소가 없는 배양 조건으로 정의된다. 엄밀히, 혐기성 조건은 질소와 같은 불활성 기체를 배양 배지로 살포하여 미량의 다른 기체를 제거함으로써 얻어진다. 니트레이트가 전자 수용체로 사용되어 균주에 의한 ATP 생성을 개선하고, 그의 대사를 개선할 수 있다.

본 발명에 따른 용어 "적절한 성장 배지"는 미생물의 성장에 적합하게 된 공지된 분자 조성의 배지, 예를 들어 1종 이상의 탄소 공급원을 함유하는, 사용된 세균에 적합하게 된 공지된 지정 조성의 무기 배양 배지를 나타낸다. 따라서, 특히, 에스케리키아 콜리 또는 클렙시엘라 뉴모니아에 대한 무기 성장 배지는 M9 배지 (Anderson, 1946, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 32:120-128), M63 배지 (Miller, 1992; A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) 또는 쉐퍼(Schaefer) 등 (1999, Anal . Biochem. 270: 88-96)에 의해 정의된 바와 같은 배지와 동일하거나 유사한 조성의 배지일 수 있다.

에스케리키아 콜리 또는 클렙시엘라 뉴모니아의 배양에 사용되는 탄소 공급원은 바람직하게는 단순 탄소 공급원이고, 아라비노스, 프룩토스, 갈락토스, 글루코스, 락토스, 말토스 공급원 또는 자일로스일 수 있다. 특히 바람직한 단순 탄소 공급원은 글루코스이다.

본 발명은 에스케리키아 콜리와 관련하여 상기, 하기 및 실시예에 기재되어 있다. 따라서, 본 발명에 따라 최초 균주 및 진화 균주에 대해 약화, 결실 또는 과발현될 수 있는 유전자는 주로 에스케리키아 콜리로부터의 유전자의 명칭을 이용하여 정의된다. 그러나, 이러한 명칭은 본 발명에 따라 보다 일반적인 의미를 갖고, 다른 미생물 내 상응하는 유전자를 모두 포함시킨다. 에스케리키아 콜리로부터의 유전자의 진뱅크(GenBank) 참조번호를 이용하여, 당업자들은 에스케리키아 콜리 이외에 다른 유기체 내 동등한 유전자를 결정할 수 있다.

상동 서열 및 그의 상동성 백분율의 확인 수단은 당업자에 익히 공지되어 있으며, 특히 웹사이트 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ 상에서 상기 웹사이트 상에 지시된 기본 매개변수와 함께 사용될 수 있는 BLAST 프로그램을 포함한다. 얻어진 서열을, 예를 들어 프로그램 CLUSTALW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)를 상기 웹사이트 상에 지시된 기본 매개변수와 함께 사용하여 활용(정렬)할 수 있다.

PFAM 데이터베이스 (정렬 및 은닉 마코브 모델(hidden Markov model)의 단백질족 데이터베이스　http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)는 단백질 서열의 정렬의 거대 집합물이다. 각각의 PFAM은 다중 정렬을 시각화하고, 단백질 도메인을 살펴보고, 유기체들 중의 분포를 평가하고, 다른 데이터베이스에 접근하고, 공지된 단백질 구조를 시각화하는 것을 가능하게 한다.

COG (단백질의 이종상동성(orthologous) 군의 집단 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)는 14종의 주요 계통발생주를 나타내는 66개의 완전 서열분석된 단일세포 게놈으로부터 유래된 단백질 서열을 비교하여 얻어진다. 각각의 COG는 오래 보존된 도메인의 확인을 가능하게 하는 3종 이상의 계통발생주로부터 규정된다.

참조문헌 (본원에서 언급된 순서대로임)

도 1: SDS 4-15% 구배 폴리아크릴아미드 겔
레인 1: 글리옥살라아제 활성을 함유하는 겔 여과 컬럼의 분획,
레인 2: 분자량 마커.

실시예

실시예 1: 에스케리키아 콜리 PG0016 에서의 글리옥살라아제 III 활성의 정제 및 코딩 유전자의 동정

1. PG0016 균주 구축

1.1. 변형된 균주 에스케리키아 콜리 MG1655 lpd ^* , Δ tpiA , Δ pflAB , Δ adhE, ldhA :: km , Δ gloA , Δ aldA , Δ aldB , Δ edd 의 구축.

클로람페니콜 내성 카세트를 하기 프로토콜 1에 따라 균주 에스케리키아 콜리 MG1655 lpd ^* , ΔtpiA , ΔpflAB , ΔadhE , ldhA ::Km, ΔgloA , ΔaldA , ΔaldB , Δedd::Cm에서 제거하였다 (WO2005073364 참조).

프로토콜 1: 내성 카세트의 제거 (FRT 시스템)

클로람페니콜 및/또는 카나마이신 내성 카세트를 하기 기법에 따라 제거하였다. 클로람페니콜 및/또는 카나마이신 내성 카세트의 FRT 부위에서 작동하는 FLP 재조합효소를 갖는 플라스미드 pCP20을 전기천공법에 의해 균주에 도입하였다. 42℃에서 연속 배양한 후, 항생제 내성 카세트의 소실을 하기 표 1에 주어진 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR 분석으로 확인하였다.

균주에서 미리 이루어진 변형의 존재를 하기 표 1에 주어진 올리고뉴클레오티드를 사용하여 확인하였다.

얻어진 균주를 에스케리키아 콜리 MG1655 lpd ^* , ΔtpiA , ΔpflAB , ΔadhE , ldhA::Km, ΔgloA , ΔaldA , ΔaldB , Δedd라 명명하였다.

<표 1>

내성 카세트의 삽입 또는 내성 카세트의 소실을 확인하는 데 사용되는 올리고뉴클레오티드

1.2. 변형된 균주 에스케리키아 콜리 MG1655 lpd ^* , Δ tpiA , Δ pflAB , Δ adhE, Δ ldhA :: cm , Δ gloA , Δ aldA , Δ aldB , Δ edd 의 구축.

카나마이신 내성 카세트를 제거하고, ldhA 유전자를 불활성화시키기 위해서, 하기 프로토콜 2에 따라 클로람페니콜 내성 카세트를 관심 유전자의 대부분을 결실한 ldhA 유전자에 삽입하였다.

프로토콜 2: 재조합을 위한 PCR 산물의 도입 및 재조합체의 선택 (FRT 시스템).

유전자 또는 유전자간 영역의 대체를 위해서 하기 표 2에서 선택 및 제시된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 플라스미드 pKD3으로부터의 클로람페니콜 내성 카세트 또는 플라스미드 pKD4로부터의 카나마이신 내성 카세트를 증폭시켰다 (Datsenko, K.A. & Wanner, B.L. (2000)). 이어서, 수득한 PCR 산물을, 발현된 시스템 λ 레드 (γ, β, 엑소)가 상동 재조합을 매우 선호하는 플라스미드 pKD46을 갖는 수용자 균주에 전기천공법에 의해 도입하였다. 이어서, 항생제-내성 형질전환주를 선택하고, 내성 카세트의 삽입을 표 1에 제시된 적절한 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR 분석으로 확인하였다.

균주의 다른 변형을 표 1에 제시된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 확인하였다.

생성된 균주를 에스케리키아 콜리 MG1655 lpd ^* , ΔldhA::Cm, ΔtpiA , ΔpflAB, ΔadhE , ΔgloA , ΔaldA , ΔaldB , Δedd 또는 PG0016라 명명하였다.

<표 2>

PCR 산물과의 재조합에 의한 염색체 영역의 대체에 사용되는 올리고뉴클레오티드

2 - 글리옥살라아제 III 활성 분석

글리옥살라아제 III 효소 활성을 에스케리키아 콜리 세포-무함유 추출물에서 시험관내 측정하였다. 원심분리에 의해 수거한 바이오매스를 100 mM 인산칼륨 완충액 (pH 7.6), 10% 수크로스, 1 mM DTT, 0.1 mM PLP, 1 mM EDTA 및 프로테아제 억제제 칵테일 (로슈(Roche))에 재현탁시키고, 30초 간격으로 30초의 사이클 4회 동안 얼음 상에서 초음파 처리하였다 (브랜슨(Branson) 초음파기, 70W). 원심분리 후, 조질의 추출물에 해당하는 상등액을 에코노-팩(Econo-Pac) 10 DG 컬럼 (바이오래드(BioRad))을 사용하여 탈염시켰다. 탈염된 상등액 내 단백질 농도를 브래드포드(Bradford) 비색 분석으로 측정하였다 (Bradford, 1976).

탈염된 추출물 100 μL를 37℃에서 5분 또는 30분 동안 50 mM 인산칼륨 (pH 8) 및 5 mM 메틸글리옥살을 함유하는 반응 혼합물 중에서 총 부피 250 μL로 인큐베이션하였다. 인큐베이션 시간 후, -20℃의 아세톤 1 ml를 첨가하고, 또한 총 부피 1.5 mL 중 1.5 M 농도의 내부 표준물 L-세린[1-13C] 100 μL를 첨가하였다. 반응 혼합물을 -20℃에서 30분 동안 인큐베이션하고, 10000 g에서 5분 동안 원심분리하였다. 상등액을 -80℃에서 동결시키고, 밤새 동결 건조시켰다. 다음 날, 히드록실아민 20% (피리딘 중에서 희석됨) 0.5 ml를 첨가하여 건조된 샘플을 실릴화하고, 30℃에서 1시간 30분 동안 인큐베이션한 후, tert-부틸디메틸실릴트리플루오로아세트아미드 (TBDMSTFA) 0.5 ml 및 피리딘 0.5 ml를 첨가하고, 60℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 샘플을 GC-MS (아질런트(Agilent) GC6890-MS5973, 컬럼 배리안(Varian) DB5MS)로 분석하고, 5분 및 30분 후에 글리옥살라아제 III 효소에 의해 생성된 락테이트의 양을 락테이트의 표준 곡선 (0 내지 33 μM)을 이용하여 측정하였다. 조질의 추출물 중 총 활성 (nmole/분)을 5분 내지 30분 사이에 생성된 락테이트의 양을 이용하여 계산하였다. 단백질 농도를 이용하여 비활성 (nmole/분/mg (mUI/mg))을 측정하였다.

3 - PG0016 균주에서 글리옥살라아제 III 활성의 정제

균주 PG0016을 1.4 l의 작업 부피를 가진 21 회분식 발효조에서 배양하였다. 배양 배지는 효모 추출물로 보충된 10 g/l 글루코스를 함유한 최소 배지에 기초하였다. 배양 온도를 37℃에서 일정하게 유지시키고, NH₄OH 용액을 이용하여 pH를 6.8로 영구적으로 조정하였다. 교반 속도를 산소 요구량에 따라 조정하였다. 용해된 산소의 농도를 기체 제어기를 사용하여 30 내지 40%의 포화 값으로 유지시켰다. 광학 밀도가 2의 값에 도달할 때, 배양을 중지하고, 원심분리하여 바이오매스를 회수하였다.

모든 크로마토그래피 컬럼을 실온에서 구동시켰다. 정제 단계 사이에 분획물을 -80℃에서 저장하였다.

단계 1: 세포- 무함유 추출물의 제조

PG0016 에스케리키아 콜리 바이오매스 320 mg을 48 ml의 100 mM 인산칼륨 완충액 (pH 7.6), 10% 수크로스, 1 mM DTT, 0.1 mM PLP, 1 mM EDTA 및 프로테아제 억제제 칵테일에 재현탁시켰다. 세포를 30초 간격으로 30초의 사이클 4회 동안 얼음 상에서 초음파 처리하였다 (브랜슨 초음파기, 70W). 현탁액을 교반하면서 실온에서 30분 동안 DNase I (100 U/ml) 및 1 mM MgCl₂로 처리하였다. 12000 g에서 30분 동안 원심분리하여 세포 잔해를 제거하였다. 조질의 추출물을 에코노-팩 10 DG 컬럼 (바이오래드)을 사용하여 탈염시켰다.

상기 탈염된 추출물의 글리옥살라아제 III 비활성은 33 mUI/mg이었다.

단계 2: 황산암모늄 침전

조질의 추출물을 40% 황산암모늄의 농도에서 침전시켰는데, 고체 황산암모늄 (226 g/l)을 교반하면서 조질의 추출물에 첨가하였다. 실온에서 15분 동안 인큐베이션한 후, 샘플을 4℃에서 30분 동안 12000 g에서 원심분리하고, 펠렛을 폐기하였다. 상기 상등액의 글리옥살라아제 III 비활성은 102 mUI/mg이었다.

단계 3: 소수성 크로마토그래피

아크타(Akta) 정제기 (지이 헬스케어(GE Healthcare))를 사용하여, 40% 황산암모늄 상등액을 5 ml 하이트랩 페닐HP(HiTrap PhenylHP) 컬럼 (지이 헬스케어) (20 mM 트리스 완충액 (pH 7.5), 10% 수크로스, 1 mM DTT, 1.2 M 황산암모늄으로 평형을 유지시킴) 상에 로딩하였다. 이어서, 상기 컬럼을 10배 컬럼 부피의 동일한 완충액으로 세척하였다. 단백질을 20배 컬럼 부피의 1.2 M에서 0 M까지의 황산암모늄의 선형 감소 구배를 이용하여 용출시켰다. 용출 후, 상기 컬럼을 10배 컬럼 부피의 20 mM 트리스 완충액 (pH 7.5), 10% 수크로스로 세척하였다. 컬럼의 유속은 2.5 ml/분이었고, 분획물 2.5 ml를 수집하였다.

하이트랩 페닐HP 컬럼으로부터의 분획물을 글리옥살라아제 III 활성에 대해 분석하였다. 단백질을 0.4 내지 0.2 M 황산암모늄으로 용출시켰다. 가장 활성인 분획물의 글리옥살라아제 III 비활성은 150 내지 540 mUI/mg이었다. 가장 활성인 분획물을 모으고, 20 mM 트리스 (pH 8), 1 mM DTT, 10% 수크로스에 대해 투석하였다.

단계 4: 음이온 크로마토그래피 pH 8

투석된 풀(pool)을 1 ml 리소스 Q(Resource Q) 컬럼(지이 헬스케어) (20 mM 트리스 완충액 (pH 8), 1 mM DTT, 10% 수크로스로 평형을 유지시킴)에 적용시켰다. 이어서, 상기 컬럼을 10배 컬럼 부피의 동일한 완충액으로 세척하였다. 단백질을 20배 컬럼 부피의 0 M에서 0.5 M까지의 NaCl의 선형 구배를 이용하여 용출시켰다. 상기 컬럼을 10배 컬럼 부피의 20 mM 트리스 (pH 8), 1 mM DTT, 10% 수크로스, 1 M NaCl로 세척하였다. 컬럼의 유속은 1 ml/분이었고, 분획물 0.5 ml를 수집하였다. 리소스 Q 컬럼으로부터의 분획물을 글리옥살라아제 III 활성에 대해 분석하였다. 단백질을 190 mM NaCl로 용출시켰다. 가장 활성인 분획물을 겔 여과로 농축시켰다. 상기 분획물의 글리옥살라아제 III 비활성은 1594 mUI/mg이었다.

단계 5: 겔 여과

리소스 Q 컬럼으로부터의 농축된 분획물을 슈퍼덱스(Superdex) 200 10/300 GL 컬럼 (지이 헬스케어) (50 mM 인산칼륨 완충액 (pH 7), 150 mM NaCl로 평형을 유지시킴) 상에 로딩하였다. 컬럼의 유속은 0.5 ml/분이었고, 분획물 0.5 ml를 수집하였다. 분획물을 글리옥살라아제 활성에 대해 분석하였다. 단백질을 완충액 14.5 ml로 용출시켰다. 컬럼의 눈금에 따라, 상기 용출 부피는 약 60 kDa의 단백질에 해당하였다.

글리옥살라아제 III 비활성이 4718 mUI/mg인 가장 활성인 분획물을 SDS 4-15% 구배 폴리아크릴아미드 겔에 적용시키고, 거기에서 영동시켰다. 상기 겔 (도면 참조)은 약 30 kDa에서 주요 밴드를 나타내었다.

<표 3>

4 - 글리옥살라아제 III 활성을 코딩하는 유전자의 동정

30 kDa의 단백질에 해당하는 겔의 영역을 멸균 피펫 팁을 사용하여 절단하였다. 이어서, 상기 겔 플러그를 질량분석법에 의한 단백질의 동정에 사용하였다.

샘플을 트립신 소화시키고, CapLC-Q-TOF2 (워터스(Waters)) 상에서 나노 LC/MS/MS 로 및 MALDI MX (워터스) 상에서 MALDI로 분석하였다. 에스케리키아 콜리의 단백질 데이터 뱅크를 이용하는 소프트웨어 프로테인링스 글로벌 서버(ProteinLynx Global Server) (워터스) 및 마스코트(Mascot) (매트릭스 사이언스(Matrix Science))를 사용하여 후보 단백질을 동정하였다. 두 분석 모두에서, 유의한 점수로 동정되는 단 하나의 단백질이 존재하였고, 이 단백질은 Hsp31 (등록번호 P31658)로도 지칭되는 31 kDa의 단백질 HchA였다. 해당 유전자는 hchA 또는 yedU로도 지칭되었다.

실시예 2: 에스케리키아 콜리 에서의 글리옥살라아제 III 활성의 조절

1 - 에스케리키아 콜리 에서의 yed U 유전자의 파괴 및 글리옥살라아제 III 활성의 소실의 확인

1.1. 항생제 내성 카세트가 부재하는 균주 PG0016 의 구축

클로람페니콜 내성 카세트를 프로토콜 1에 따라 균주 에스케리키아 콜리 MG1655 lpd ^* , Δt p iA, Δ pflAB , Δ adhE , Δ ldhA::Cm, Δ gloA , Δ aldA , Δ aldB , Δ edd (PG0016)에서 제거하였다.

얻어진 균주 에스케리키아 콜리 MG1655 lpd ^* , Δ tpiA , Δ pflAB, Δ adhE , Δ ldhA, ΔgloA, Δ aldA , Δ aldB , Δ edd는 PG0021로 명명하였다.

1.2. 변형된 균주 에스케리키아 콜리 MG1655 Δ yed U :: Cm 의 구축

클로람페니콜 항생제 내성 카세트를 삽입하고, 표 2에서 나타낸 올리고뉴클레오티드와 함께 프로토콜 2에서 기재된 기법을 사용하여 관심 유전자의 대부분을 결실시켜, 균주 에스케리키아 콜리 MG1655에서 유전자 yedU를 불활성화시켰다. 얻어진 균주는 에스케리키아 콜리 MG1655 ΔyedU::Cm으로 명명하였다.

1.3. 변형된 균주 PG0021 Δ yedU :: cm 의 구축

균주 에스케리키아 콜리 MG1655 lpd ^* , ΔtpiA , Δ pflAB , Δ adhE , Δ ldhA, Δ gloA , ΔaldA, Δ aldB , Δ edd (PG0021)에서의 클로람페니콜 내성 카세트에 의한 유전자의 대체에 의한 유전자 yedU의 결실을 파지 P1로의 형질도입 기법에 의해 수행하였다.

프로토콜 3 : 유전자의 결실을 위한 파지 P1로의 형질도입

수용자 에스케리키아 콜리 균주에서의 내성 카세트 (카나마이신 또는 클로람페니콜)로의 유전자의 대체에 의한 선택된 유전자의 결실을 파지 P1로의 형질도입 기법에 의해 수행하였다. 프로토콜은 (i) 결실되는 단일 유전자를 갖는 균주 MG1655에서의 파지 용해물의 제조 단계; 및 (ii) 상기 파지 용해물에 의한 수용자 균주의 형질도입 단계의 2 단계였다.

파지 용해물의 제조

- LB 10 ml + Cm 30 μg/ml + 글루코스 0.2％ + CaCl₂ 5 mM에 결실되는 단일 유전자를 갖는 균주 MG1655의 밤샘 배양물 100 μl를 시딩한다.

- 진탕시키면서 37℃에서 30분 동안 인큐베이션한다.

- 야생형 균주 MG1655 (대략 1×10⁹ 파지/ml)에서 제조된 파지 용해물 P1 100 μl를 첨가한다.

- 모든 세포가 용해될 때까지 37℃에서 3시간 동안 진탕시킨다.

- 클로로포름 200 μl를 첨가하고, 볼텍싱한다.

- 4500 g에서 10분 동안 원심분리시켜 세포 잔해물을 제거한다.

- 상등액을 멸균 튜브내로 옮기고, 클로로포름 200 μl를 첨가한다.

- 용해물을 4℃에서 저장한다.

형질도입

- LB 배지에서 에스케리키아 콜리 수용자 균주의 밤샘 배양물 5 ml를 1500 g에서 10분 동안 원심분리한다.

- 2.5 ml의 MgSO₄ 10 mM, CaCl₂ 5 mM에서 세포 펠렛을 현탁시킨다.

- 대조 튜브: 세포 100 μl

결실되는 단일 유전자를 갖는 균주 MG1655의 파지 P1 100 μl

- 튜브 시험: 세포 100 μl + 결실되는 단일 유전자를 갖는 균주 MG1655의 파지 P1 100 μl

- 진탕하지 않고 30℃에서 30분 동안 인큐베이션한다.

- 각 튜브에 100 μl의 시트르산 나트륨 1 M을 첨가하고, 볼텍싱한다.

- LB 1 ml를 첨가한다.

- 진탕하면서 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한다.

- 7000 rpm에서 3분 동안 튜브를 원심분리한 후 LB + Cm 30 μg/ml 접시에 플레이팅한다.

- 37℃에서 밤새 인큐베이션한다.

이어서, 항생제 내성 형질전환체를 선택하고, 표 1에서 나타낸 적절한 올리고뉴클레오티드를 이용한 PCR 분석에 의해 결실물의 삽입을 확인하였다.

균주의 다른 변형을 표 1에서 나타낸 올리고뉴클레오티드로 확인하였다.

얻어진 균주는 에스케리키아 콜리 MG1655 lpd ^* , ΔldhA, ΔtpiA , Δ pflAB , Δ adhE , ΔgloA, Δ aldA , Δ aldB , Δ edd , Δ yedU::cm (PG0021 Δ yedU::cm)로 명명하였다.

1.4. 균주 PG0021 Δ yed U :: Cm 의 바이오매스의 생성 및 활성 분석

균주 PG0021 Δ yedU::Cm 및 대조 균주 PG0021을, 10 g/l 글루코스를 함유하고 MOPS로 완충된 최소 배지를 갖는 500 ml 배플 삼각 플라스크(baffled Erlenmyer flask)에서 호기성 조건 하에 37℃에서 배양하였다. 배양 시작시 pH를 6.8로 조정하였다. 플라스크를 오비탈 진탕기 (orbital shaker)에서 200 rpm으로 진탕시켰다. 550 nm에서 측정된 배양물의 광학 밀도가 5 유닛 초과에 도달할 경우 바이오매스를 원심분리에 의해 수확하였다. 세포-무함유 추출물을 제조하였으며, 앞서 기재된 것과 같이 글리옥살라아제 III 활성 분석을 실시하였다.

모 균주 PG0021의 글리옥살라아제 III 활성은 24 mUI/mg인 반면, 균주 PG0021 ΔyedU의 글리옥살라아제 III 활성은 4 mUI/mg였다. yedU 유전자의 결실은 균주 PG0021의 글리옥살라아제 III 활성을 대부분 파괴하였다.

2 - 에스케리키아 콜리 에서의 yedU 유전자의 과발현 및 글리옥살라아제 III 활성 증가의 확인

2.1. 플라스미드 pME101 의 구축

저 복제 (low copy) 벡터로부터의 trc 프로모터의 제어 하에서의 yedU 유전자의 발현을 위해, 플라스미드 pME101을 다음과 같이 구축하였다. 플라스미드 pCL1920 (문헌 [Lerner & Inouye, 1990, NAR 18, 15 p 4631] - 진뱅크 AX085428)을 올리고뉴클레오티드 PME101F 및 PME101R을 사용하여 PCR 증폭시키고, lacI 유전자 및 trc 프로모터를 내포한 벡터 pTrc99A (아머샴 파마시아 바이오테크 (Amersham Pharmacia Biotech; 뉴저지주 피스카타웨이)로부터의 BstZ17I-XmnI 단편을 상기 증폭된 벡터에 삽입하였다.

PME101F (서열 29):

PME101R (서열 30):

2.2. 플라스미드 pME101 - yed U 의 구축

하기 올리고뉴클레오티드를 사용하여 에스케리키아 콜리 MG1655의 게놈 DNA로부터 유전자 yedU를 PCR 증폭시켰다.

yedUF2, 34개 염기로 이루어짐 (서열 31):

- 유전자 yedU의 서열(2033857-2033884)에 상동성인 영역 (밑줄친 문자); 및

- 제한 부위 BspHI (진한색 문자)를 갖는다.

yedUR2, 28개 염기로 이루어짐 (서열 32):

- 유전자 yedU의 서열 (2034815-2034797)에 상동성인 영역 (밑줄친 문자); 및

- 제한 부위 SmaI (진한색 문자)을 갖는다.

PCR 증폭된 단편을 제한 효소 BspHI 및 SmaI로 절단하고, 벡터 pME101의 NcoI/SmaI 부위에 클로닝하였다. 얻어진 플라스미드는 pME101-yedU로 명명하였다.

플라스미드 pME101-yedU를 전기천공에 의해 균주 에스케리키아 콜리 MG1655에 도입하였다. 얻어진 균주는 에스케리키아 콜리 MG1655 (pME101- yedU )로 명명하였다.

2.3. 균주 에스케리키아 콜리 MG1655 pME101 - yedU 의 바이오매스의 생성 및 활성 분석

에스케리키아 콜리 균주 MG1655 (pME101-yedU) 및 대조 균주 에스케리키아 콜리 MG1655를 500 ml 배플 삼각 플라스크 내의 10 g/l 글루코스를 함유하고 MOPS로 완충된 최소 배지에서 호기성 조건 하에 37℃에서 배양하였다. pH를 6.8로 조절하고, 배양의 시작 시에 100 μM IPTG를 첨가하였다. 플라스크를 오비탈 진탕기에서 200 rpm으로 진탕시켰다. 550 nm에서 측정된 배양물의 광학 밀도가 7 유닛 초과에 도달할 때 바이오매스를 원심분리에 의해 수확하였다. 세포-무함유 추출물을 제조하였으며, 글리옥살라아제 III 활성 분석을 앞서 기재된 것과 같이 실시하였다.

MG1655 균주의 글리옥살라아제 III 활성은 8 mUI/mg인 반면, yedU를 과발현하는 MG1655 균주의 글리옥살라아제 III 활성은 142 mUI/mg였다. 글리옥살라아제 III 활성은 yedU 유전자의 과발현에 의해 18배 증가하였다.

3 - YedU 에 의해 생성된 락테이트의 이성질체의 측정

3.1. YedU 단백질의 정제

하기 올리고뉴클레오티드를 사용하여 에스케리키아 콜리 MG1655의 게놈 DNA로부터 유전자 yedU를 증폭시켜 플라스미드 pETTOPO-yedU를 구축하였다.

yedU pET F, 29개 염기로 이루어짐 (서열 33)

- 유전자 yedU의 서열 (2033859-2033883)에 상동성인 영역 (이탤릭체 진한 문자); 및

- pETTOPO에서 배향 클로닝을 위한 영역 (밑줄친 문자)을 갖는다.

yedU pET R, 21개 염기로 이루어짐 (서열 34)

- 유전자 yedU의 서열 (2034690-2034692)에 상동성이며, 정지 코돈에 상응하는 영역 (이탤릭체 진한 문자); 및

- 유전자 yedU의 하류 영역의 서열 (2034693-2034710)에 상동성인 영역 (밑줄친 문자)을 갖는다.

PCR 증폭된 단편을 시판 벡터 pETTOPO (인비트로겐(Invitrogen)) 내로 클로닝하였다. 얻어진 플라스미드는 pETTOPO-yedU로 명명하였다. 플라스미드 pETTOPO-yedU를 전기천공에 의해 단백질 과발현을 위해 최적화된 시판 균주 에스케리키아 콜리 BL21 star (인비트로겐)에 도입하였다. 얻어진 균주는 에스케리키아 콜리 BL21 star pETTOPO-yedU로 명명하였다.

에스케리키아 콜리 균주 BL21 star pETTOPO-yedU 및 대조 균주 에스케리키아 콜리 BL21 star를 2.5 g/l 글루코스를 함유한 50 ml LB 배지를 갖는 500 ml 배플 삼각 플라스크에서 호기성 조건 하에 37℃에서 배양하였다. 플라스크를 오비탈 진탕기에서 200 rpm으로 진탕시켰다. 배양물의 광학 밀도 (OD, 550 nm에서 측정됨)가 0.8 OD 유닛에 도달할 때 온도를 25℃로 감소시켰다. OD가 2.4 유닛에 도달할 때 배양물을 500 μM IPTG로 유도하였다. 배양물의 OD가 3.5 유닛을 초과할 때 바이오매스를 원심분리에 의해 수확하였다. 세포-무함유 추출물을 제조하였으며, 앞서 기재된 것과 같이 글리옥살라아제 III 활성 분석을 실시하였다. BL21 star 대조 균주의 글리옥살라아제 III 활성은 측정할 수 없었으나 (정량 수준 미만임), 반면 균주 BL21 star pETTOPO-yedU의 글리옥살라아제 III 활성은 192 mUI/mg였다. 이러한 조질의 추출물로부터 YedU를 앞서 기재된 프로토콜에 따라 정제하였다 (실시예 1 참조). YedU 단백질 180 μg을 얻었다.

정제된 YedU 단백질 35 μg을 사용하여 앞서 기재된 것과 같이 글리옥살라아제 III 활성 분석을 수행하였다. 기질인 메틸글리옥살과 효소인 YedU의 반응 이후 형성된 락테이트의 이성질체를 동정하고, 정량하였다. D-락테이트 데히드로게나제 (D-LDH) 또는 L-락테이트 데히드로게나제 (L-LDH)의 존재 하에 NAD+에 의한 D-락테이트의 피루베이트로의 산화를 기초로 한 효소 - 분광광도 키트 (엔지테크(Enzytec)™ 유체 D 및 L-락트산), 또는 키랄 컬럼 (키렉스(Chirex) (D)-페니실라민 150×4.6 mm, 가드 컬럼 키렉스 (D)-페니실라민 30×4.6 mm)을 사용한 HPLC 방법의 두 가지 분석 방법 중 하나를 사용하였으며, 이는 D 및 L-락테이트의 분리를 가능하게 하였다. 결과를 하기 표 4에 제시한다.

<표 4>

a - GCMS에 의한 락테이트의 정량

b - 효소 키트로의 D 및 L-락테이트의 정량

c - HPLC에 의한 키랄 컬럼으로의 D 및 L-락테이트의 정량

GC MS 또는 효소 키트를 사용한 락테이트의 정량은 유사하였다. 키랄 컬럼을 이용한 경우, 측정된 락테이트의 양은 나머지 두 기법을 이용하여 측정한 양에 비해 많았다. 이러한 차이는 상기 정량이 일정 범위의 D 및 L-락테이트의 농도를 사용하지 않고 D 및 L-락테이트의 단 하나의 농도를 사용하여 수행된 것에 기인한 것으로 설명될 수 있다.

사용된 방법에 관계없이, YedU는 메틸글리옥살을 라세미 혼합물에 가까운 D 및 L-락테이트의 혼합물로 전환시킬 수 있었던 것으로 나타났다.

실시예 3: yed U 유전자의 결실을 갖는 에스케리키아 콜리 균주로의 1,2- 프로판디올 및 아세톨의 개선된 생성

1 - 변형된 균주 에스케리키아 콜리 MG1655 lpd ^* Δ tpiA Δ pflAB Δ adhE Δ ldhA ΔgloA Δ aldA Δ aldB Δ edd Δ yedU :: Cm 의 구축

상기 균주의 구축은 이미 실시예 2에 기재하였다.

2 - yed U 유전자에서의 결실을 갖는 균주 및 결실 없는 동일한 균주로의 1,2- 프로판디올 및 아세톨의 생성

yedU 유전자에서의 결실을 갖는 앞서 구축된 균주 (Δ yedU 균주) 및 결실 없는 균주 (대조 균주)를 탄소 공급원으로서 글루코스를 함유한 하기 주어진 배지에서 미세호기성 조건 (배지 21 ml가 충전된 70 ml 밀폐된 삼각 플라스크) 하에 25시간 동안 배양하였다. 플라스크를 오비탈 진탕기에서 200 rpm으로 진탕시켰다.

<표 5>

배양을 37℃에서 수행하였으며, 배양 배지를 MOPS로 완충시켜 pH를 유지시켰다. 배양의 종료시, 발효 브로스 내의 1,2-프로판디올, 아세톨, 락테이트 및 잔류 글루코스를 HPLC에 의해 분석하였으며, 글루코스에 대한 1,2-프로판디올 + 아세톨 및 락테이트의 수율을 계산하였다. 결과는 하기 표에 제시되어 있다.

<표 6>

n은 동일한 실험의 반복 횟수이다.

제시된 값은 n회 반복에 대해 얻어진 값의 평균 및 표준 편차이다.

실시예 4: yed U 유전자를 과발현하는 에스케리키아 콜리 균주에서의 미세호기성 조건 하에서의 락테이트의 생성

1 - 변형된 균주 에스케리키아 콜리 MG1655 lpd ^* Δ tpiA Δ pflAB Δ adhE Δ ldhA ΔgloA Δ aldA Δ aldB Δ edd Δ yqhD :: Km pME101 - VB01 - yedU 또는 pME101 - yedU 의 구축

균주 에스케리키아 콜리 MG1655 lpd ^* Δ tpiA Δ pflAB Δ adhE Δ ldhA Δ gloA Δ aldA ΔaldB Δ edd Δ yqhD::Km의 구축은 특허 출원 WO 2008/116853에 이미 기재되었다.

플라스미드 pME101-VB01은 특허 출원 WO 2008/116848에서 제시된 설명에 따라 구축하였다.

하기 올리고뉴클레오티드를 사용하여 에스케리키아 콜리 MG1655의 게놈 DNA로부터 유전자 yedU을 PCR 증폭하였다:

yedUF3, 34개 염기로 이루어짐 (서열 35):

- 유전자 yedU의 서열 (2033857-2033884)에 상동성인 영역 (밑줄친 문자); 및

- 제한 부위 BspHI (진한색 문자)를 갖는다.

yedUR3,　24개 염기로 이루어짐 (서열 36):

- 유전자 yedU의 서열 (2034727-2034715 및 2034708-2034704)에 상동성인 영역 (밑줄친 문자); 및

- 제한 부위 SnaBI (진한색 문자)를 갖는다.

PCR 증폭된 단편을 제한 효소 BspHI 및 SnaBI로 절단하고, 벡터 pME101-VB01의 NcoI/SnaBI 부위 내로 클로닝하였다. 얻어진 플라스미드는 pME101-VB01-yedU로 명명하였다.

플라스미드 pME101-yedU의 구축은 실시예 2에 이미 기재하였다.

플라스미드 pME101-VB01-yedU 또는 pME101-yedU를 변형된 균주 에스케리키아 콜리 MG1655 lpd ^* Δ tpiA Δ pflAB Δ adhE Δ ldhA Δ gloA Δ aldA Δ aldB Δ edd Δ yqhD::Km에 도입하였다.

얻어진 균주는 각각 에스케리키아 콜리 MG1655 lpd ^* Δ tpiA Δ pflAB Δ adhE Δ ldhA ΔgloA Δ aldA Δ aldB Δ edd Δ yqhD::Km pME101-VB01-yedU (균주 1) 또는 에스케리키아 콜리 MG1655 lpd ^* Δ tpiA Δ pflAB Δ adhE Δ ldhA Δ gloA Δ aldA Δ aldB Δ edd Δ yqhD::Km pME101-yedU(균주 2)로 명명하였다.

2 - yedU 유전자가 과발현된 균주 및 과발현되지 않은 균주로의 락테이트의 생성

yedU 유전자가 과발현된 앞서 구축된 균주 (균주 1 및 균주 2) 및 과발현되지 않은 균주 (대조 군주)를 탄소 공급원으로서 글루코스를 함유한 배지 PG01_MC_V01 (실시예 3 참조)에서 미세호기성 조건 (배지 21 ml가 충전된 70 ml 밀폐된 삼각 플라스크) 하에 46시간 동안 배양하였다. 플라스크를 오비탈 진탕기에서 200 rpm으로 진탕시켰다. 37℃에서 배양을 수행하였으며, 배양 배지를 MOPS로 완충시켜 pH를 유지시켰다. yedU 유전자의 발현을 유도하기 위해 배양의 시작시 균주 1 및 균주 2의 배양물을 100 μM IPTG로 유도하였다. 배양의 종료시, 발효 브로스에서의 락테이트 및 잔류 글루코스를 HPLC에 의해 분석하고, 글루코스에 대한 락테이트의 수율을 계산하였다. 결과는 하기 표에 제시되어 있다.

<표 7>

n은 동일한 실험의 반복 횟수이다.

SEQUENCE LISTING <110> METABOLIC EXPLORER VOELKER, FRANCOIS SOUCAILLE, PHILIPPE <120> Polypeptide having glyoxalase III activity, polynucleotide encoding the same and uses thereof <130> D25736 <150> PCT/EP2009/053093 <151> 2009-03-16 <150> PCT/EP2008/053224 <151> 2008-03-18 <160> 36 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 283 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 1 Met Thr Val Gln Thr Ser Lys Asn Pro Gln Val Asp Ile Ala Glu Asp 1 5 10 15 Asn Ala Phe Phe Pro Ser Glu Tyr Ser Leu Ser Gln Tyr Thr Ser Pro 20 25 30 Val Ser Asp Leu Asp Gly Val Asp Tyr Pro Lys Pro Tyr Arg Gly Lys 35 40 45 His Lys Ile Leu Val Ile Ala Ala Asp Glu Arg Tyr Leu Pro Thr Asp 50 55 60 Asn Gly Lys Leu Phe Ser Thr Gly Asn His Pro Ile Glu Thr Leu Leu 65 70 75 80 Pro Leu Tyr His Leu His Ala Ala Gly Phe Glu Phe Glu Val Ala Thr 85 90 95 Ile Ser Gly Leu Met Thr Lys Phe Glu Tyr Trp Ala Met Pro His Lys 100 105 110 Asp Glu Lys Val Met Pro Phe Phe Glu Gln His Lys Ser Leu Phe Arg 115 120 125 Asn Pro Lys Lys Leu Ala Asp Val Val Ala Ser Leu Asn Ala Asp Ser 130 135 140 Glu Tyr Ala Ala Ile Phe Val Pro Gly Gly His Gly Ala Leu Ile Gly 145 150 155 160 Leu Pro Glu Ser Gln Asp Val Ala Ala Ala Leu Gln Trp Ala Ile Lys 165 170 175 Asn Asp Arg Phe Val Ile Ser Leu Cys His Gly Pro Ala Ala Phe Leu 180 185 190 Ala Leu Arg His Gly Asp Asn Pro Leu Asn Gly Tyr Ser Ile Cys Ala 195 200 205 Phe Pro Asp Ala Ala Asp Lys Gln Thr Pro Glu Ile Gly Tyr Met Pro 210 215 220 Gly His Leu Thr Trp Tyr Phe Gly Glu Glu Leu Lys Lys Met Gly Met 225 230 235 240 Asn Ile Ile Asn Asp Asp Ile Thr Gly Arg Val His Lys Asp Arg Lys 245 250 255 Leu Leu Thr Gly Asp Ser Pro Phe Ala Ala Asn Ala Leu Gly Lys Leu 260 265 270 Ala Ala Gln Glu Met Leu Ala Ala Tyr Ala Gly 275 280 <210> 2 <211> 852 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 2 atgactgttc aaacaagtaa aaatccgcag gtcgatattg ctgaagataa tgcattcttc 60 ccttcagaat attcgcttag ccaatatacc agtcctgtct ctgatcttga tggcgtggac 120 tatccaaaac cttatcgcgg taaacataaa attctggtga tcgccgcgga cgaacgttat 180 ttgccgaccg ataacggaaa actgttctcg accggtaacc atccgattga aacgttgctg 240 ccgttgtatc atctccatgc tgcaggtttc gaattcgaag tggcgaccat ttccggtctg 300 atgaccaagt ttgaatactg ggctatgccg cacaaagatg aaaaagtaat gccattcttt 360 gagcagcata aatcgttgtt ccgcaatccg aagaaactcg cggatgttgt tgccagcctc 420 aacgctgata gcgaatatgc agcaatcttt gttcctggtg gtcatggcgc acttattggt 480 ttacctgaaa gccaggacgt ggctgccgct ttacagtggg caatcaaaaa tgaccgtttt 540 gttatctccc tttgccacgg cccggcggct tttctggcgc ttcgccacgg cgataaccca 600 ctgaatggtt attccatttg cgcattccca gacgccgcag acaaacaaac gccagagatt 660 ggctatatgc cgggtcatct cacctggtac ttcggcgaag aactgaagaa aatgggcatg 720 aatatcatta atgacgacat caccgggcga gtacataagg accgtaaact tctcaccggc 780 gacagtcctt ttgcagcgaa tgcgttgggt aaactggcgg cgcaggaaat gctggcagct 840 tacgcgggtt aa 852 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 3 ggtgatgata gttatcgccg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 4 cgtgccatcg acagcagtcc 20 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 5 agacattaaa aatatacgtg cagctacccg 30 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 6 gtgaaagctg acaacccttt tgatctttta 30 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 7 ggctcattgc accaccatcc ag 22 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 8 gaaaagacgc gctgacaata cgcc 24 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 9 gccatcagca ggcttagccg 20 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 10 gggtattgtg gcatgtttaa ccg 23 <210> 11 <211> 31 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 11 gaagtggtcg atgccgggat tgaagaatgg g 31 <210> 12 <211> 31 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 12 gggttacgtt tcagtgaggc gcgttctgcg g 31 <210> 13 <211> 31 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 13 tgcagcggcg cacgatggcg acgttccgcc g 31 <210> 14 <211> 31 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 14 cacgatgacg accattcatg cctatactgg c 31 <210> 15 <211> 40 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 15 catatttccc tcaaagaata taaaaaagaa caattaacgc 40 <210> 16 <211> 31 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 16 tatgttcatg cgatggcgca ccagctgggc g 31 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 17 ccccggaatc agaggaatag tccc 24 <210> 18 <211> 29 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 18 gggtagactc cattactgag gcgtgggcg 29 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 19 gccatcagca ggcttagcgc 20 <210> 20 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 20 gggtattgtg gcatgtttaa ccg 23 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 21 ggcacaataa catcaaccag c 21 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 22 gccggaaaca ttgaagagct gg 22 <210> 23 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 23 ggcgtctcgc catacaacaa acgcacatcg ggc 33 <210> 24 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 24 gggctttgcc gacaccttct tcgttcttg 29 <210> 25 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 25 gaaactcgcc gtttatagca caaaacagta cgacaagaag tacctgcaac aggtgaacga 60 gtcctttggc tttgagctgg tgtaggctgg agctgcttcg 100 <210> 26 <211> 101 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 26 ttaaaccagt tcgttcgggc aggtttcgcc tttttccaga ttgcttaagt tttgcagcgt 60 agtctgagaa atactggtca gcatatgaat atcctcctta g 101 <210> 27 <211> 103 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 27 atgactgttc aaacaagtaa aaatccgcag gtcgatattg ctgaagataa tgcattcttc 60 ccttcagaat attcgcttag ccgtgtaggc tggagctgct tcg 103 <210> 28 <211> 101 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 28 ttaacccgcg taagctgcca gcatttcctg cgccgccagt ttacccaacg cattcgctgc 60 aaaaggactg tcgccggtga gcatatgaat atcctcctta g 101 <210> 29 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 29 ccgacagtaa gacgggtaag cctg 24 <210> 30 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 30 agcttagtaa agccctcgct ag 22 <210> 31 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 31 catgtcatga ctgttcaaac aagtaaaaat ccgc 34 <210> 32 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 32 ctacccgggc atagggcttc agtacgcc 28 <210> 33 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 33 caccatgact gttcaaacaa gtaaaaatc 29 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 34 ttaacccgcg taagctgcca g 21 <210> 35 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 35 catgtcatga ctgttcaaac aagtaaaaat ccgc 34 <210> 36 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 36 cattcaaacg taatacgtat taac 24

Claims

서열 1의 서열, 그의 단편 또는 상동 서열을 포함하는, 글리옥살라아제 III 효소 활성을 갖는 단리된 폴리펩티드.
제1항에 있어서, 서열 1의 서열과의 동일성이 70% 이상인 서열을 포함하는 폴리펩티드.
제1항에 있어서, 서열 1의 서열로부터의 100개 이상의 인접 아미노산을 포함하는 폴리펩티드.
제1항에 있어서, 서열 1의 서열로 이루어진 폴리펩티드.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
제5항에 있어서, 서열 2의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
숙주 미생물 내에서 기능성인 조절 요소의 제어 하에 제5항 또는 제6항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트.
제7항의 카세트 또는 제5항 또는 제6항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 형질전환 벡터.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 폴리펩티드의 활성이 약화 또는 강화되어 있는, 조절된 글리옥살라아제 III 효소 활성을 갖는 변형 미생물.
제9항에 있어서, 세균, 효모 및 진균으로 이루어진 군 중에서 선택되는 미생물.
제10항에 있어서, 세균이 엔테로박테리아과(Enterobacteriaceae), 바실러스과(Bacillaceae), 스트렙토마이세스과(Streptomycetaceae) 및 코리네박테리움과(Corynebacteriaceae)로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 미생물.
제11항에 있어서, 에스케리키아 콜리(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 클로스트리디움 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum) 및 코리 네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 미생물.
제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 코딩하는 본래적 유전자의 발현이 약화되어 있는, 약화된 글리옥살라아제 III 효소 활성을 갖는 미생물.
제13항에 있어서, 1,2-프로판디올 및/또는 아세톨의 생성을 강화하도록 추가로 변형된 미생물.
제14항에 있어서, 1,2-프로판디올 생성을 강화하는 하기 변형 및 이들의 조합 중 하나 이상을 포함하는 미생물.
· ptsG , ptsH, ptsI, crr , edd, eda, gloA, aldA, aldB, ldhA, pflA, pflB, adhE, tpiA, gapA, pykA, pykF, ackA, pta, poxB, arcA 및 ndh 유전자 중 1종 이상의 발현의 약화.
· galP, glk , ppsA, mgsA, yqhD, yafB, ydhF, ycdW, yqhE, yeaE, yghZ, yajO, tas, ydjG, ydbC, gldA, fucO 유전자 중 1종 이상의 발현의 강화.
· lpd 유전자에 의해 코딩되는 단백질에서 알라닌 55의 발린으로의 대체를 초래하는 점 돌연변이를 갖도록 lpd 유전자를 변형시킴.
제14항에 있어서, 아세톨 생성을 강화하는 하기 변형 및 이들의 조합 중 하나 이상을 포함하는 미생물.
· ptsG, ptsH, ptsI, crr , edd, eda, gloA, aldA, aldB, ldhA, pflA, pflB, adhE, tpiA, gapA, pykA, pykF, ackA, pta, poxB 및 gldA 유전자 중 1종 이상의 발현의 약화.
· galP, glk , ppsA, mgsA, yqhD, yafB, ydhF, ycdW, yqhE, yeaE, yghZ, yajO, tas, ydjG, ydbC 유전자 중 1종 이상의 발현의 강화.
제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 제5항 또는 제6항의 폴리뉴클레오티드가 과발현되는, 강화된 글리옥살라아제 III 효소 활성을 갖는 미생물.
제17항에 있어서, 제8항의 벡터로 형질전환된 미생물.
제17항에 있어서, 제5항 또는 제6항의 폴리뉴클레오티드 또는 제7항의 카세트가 그의 염색체 내로 통합되어 있는 미생물.
제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 코딩하는 본래적 유전자의 발현이 강화되어 있는, 강화된 글리옥살라아제 III 활성을 갖는 미생물.
제20항에 있어서, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 코딩하는 본래적 유전자의 코딩 서열의 상류에 강력한 프로모터를 포함하는 미생물.
제17항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 락테이트의 생성을 강화하도록 추가로 변형된 미생물.
제22항에 있어서, 락테이트 생성을 강화하는 하기 변형 및 이들의 조합 중 하나 이상을 포함하는 미생물.
· ptsG, ptsH, ptsI, crr , edd, eda, gloA, aldA, aldB, pflA, pflB, frdABCD, adhE, gapA, pykA, pykF, ackA, pta , poxB, yqhD, yafB, ydhF, ycdW, yqhE, yeaE, yghZ, yajO, tas, ydjG, ydbC, gldA, lldD, dld 및 tpiA 유전자 중 1종 이상의 발현의 약화.
· galP, glk , ppsA 및 mgsA 유전자 중 1종 이상의 발현의 강화.
미생물에서 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 폴리펩티드의 활성을 강화 또는 약화시키는, 미생물에서 글리옥살라아제 III 효소 활성을 조절하는 방법.
제24항에 있어서, 제5항 또는 제6항의 폴리뉴클레오티드를 과발현시킴으로써 글리옥살라아제 III 효소 활성을 강화시키는 것인 방법.
제24항에 있어서, 제5항 또는 제6항의 폴리뉴클레오티드의 발현을 약화시킴으로써 글리옥살라아제 III 효소 활성을 약화시키는 것인 방법.
제13항 내지 제16항 중 어느 한 항의 미생물을 탄소 공급원을 포함하는 적절한 배양 배지에서 성장시키고, 1,2-프로판디올 및/또는 아세톨을 회수하는, 1,2-프로판디올 및/또는 아세톨의 제조 방법.
제27항에 있어서, 회수된 1,2-프로판디올 및/또는 아세톨을 정제하는 것인 방법.
제17항 내지 제23항 중 어느 한 항의 미생물을 탄소 공급원을 포함하는 적절한 배양 배지에서 성장시키고, 락테이트를 회수하는, 락테이트의 제조 방법.
제29항에 있어서, 회수된 락테이트를 정제하는 것인 방법.