CN102994577B - 微生物细胞转化法生产丙酮醇的方法 - Google Patents

微生物细胞转化法生产丙酮醇的方法 Download PDF

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本发明公开了一种微生物细胞转化法生产丙酮醇的方法，包括如下步骤：以选自大肠杆菌（Escherichia coli）Lin43 CGSC 5511及其基因工程菌中的一种为菌种，制备静息细胞；制备含甘油的转化液；在所述含甘油的转化液中加入所述静息细胞转化，即得所述丙酮醇。本发明利用大肠杆菌lin43 CGSC 5511代谢甘油时能产生大量丙酮醛的特性，对其进行基因工程改造，敲除其丙酮醛主要脱毒途径上的基因gloA，同时过表达丙酮醛醛酮还原酶基因，然后采用静息细胞法转化甘油生产丙酮醇，本发明所使用的反应体系简单，条件温和，周期短，副产物少，可采用生物柴油工业的副产物甘油为原料，是一条简单、快速、高效的生产丙酮醇的途径。

Description

微生物细胞转化法生产丙酮醇的方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体地说，是关于一种微生物细胞转化甘油生产丙酮醇的方法。
背景技术
丙酮醇又名羟基丙酮、乙酰甲醇等，是一种重要的化工原料，可用于有机合成中间体，主要用于合成消化系统的H2阻滞药西咪替丁的中间体4-甲基咪唑、喹诺酮类抗菌药左旋氧氟沙星的中间体(s)-(+)-2-氨基丙醇、外消旋组氨酸的中间体4-羟甲基咪唑、维生素H、无溃疡毒副作用的解热镇痛药阿司匹林丙酮酯、手性中间体(1)-(-)-1，2-丙二醇及其它精细化学品，还可用作生化试剂和食品添加剂等，例如在纺织业的瓮染工艺中作为还原剂，可以代替传统含硫还原剂，以减少废水中对环境有害的硫含量。
丙酮醇目前主要采用一溴丙酮酯化/醇解法和1,2--丙二醇的氧化法生产。相对而言，前者反应条件较温和，生产设备较简单，产品收率和纯度较高。但存在着原料一溴丙酮价格高、生产过程中有溴污染、反应副产物的分离复杂、废液处理排放费用高等问题;后者原料成本低并可连续或半连续化生产，但也存在着反应条件苛刻、设备要求高以及产品收率低等问题。此外，美国专利USP6191308B1和USP6107525还报道了一种合成方法，涉及了在均相或多相催化剂作用下由醛或酮与醇或原酸酯反应生成缩醛或缩酮、由缩醛或缩酮生成烯醚、烯醚在有机或无机过酸作用下被氧化为带羰基保护基团的α-羟基酮或醛、以及带羰基保护基团的α-羟基酮或醛最后水解为α羟基酮或醛等步骤。但该方法存在着诸如反应步骤多、流程长、条件较为苛刻、目标产物收率低、且副产物分离和排放导致操作成本升高等问题。
上述制备丙酮醇的三种方法均以石油基产品为原料，而随着能源危机的日益加剧，目前羟基丙酮的生产正面临着原料价格升高而导致成本上涨的严峻挑战，开发以非石油路线产品为原料制备丙酮醇的工艺成为必然。
目前世界上已有为数不多的文献报道了采用生物质资源制备丙酮醇。世界专利WO9928481报道，利用糖和淀粉作起始原料，酶作催化剂生产丙酮醇和1，2-丙二醇，其中1，2-丙二醇的产率低于0.2g/l，而丙酮醇的产率更远远低于1，2-丙二醇。D.C.Cameron以及C.L.Cooney1986年报道，利用Clostridium thermosaccharolyticum在D-葡萄糖以及D-木糖培养基中产丙酮醇达到1.47g/L,但其主要产物为7.9g/L的1,2-丙二醇。美国专利US20110201070报道，经过基因工程改造的大肠杆菌MG1655，丙酮醇的最大产量为1.40g/L。二者为目前用微生物代谢发酵产丙酮醇得到的最大产量。
甘油是生产生物柴油过程中的主要副产品之一，其含量约占生物柴油10%左右。随着越来越多的生物柴油和生物酒精装置的投产，市场上生物甘油将大大过剩。因此，以甘油为原料制备羟基丙酮，可以降低生物柴油的生产成本，具有广阔的发展前景。
发明内容
本发明的目的在于针对现有微生物发酵生产丙酮醇存在的问题，提供一种新的微生物细胞转化甘油生产丙酮醇的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明提供一种微生物细胞转化法制备丙酮醇的方法，包括如下步骤：
A、以选自大肠杆菌（Escherichia coli）Lin43CGSC5511及其基因工程菌中的一种为菌种，制备静息细胞；
B、制备含甘油的转化液；
C、在所述含甘油的转化液中加入所述静息细胞转化，即得所述丙酮醇。
优选地，步骤A中，所述菌种中的gloA基因被敲除。
优选地，所述菌种含yqhD或其它同功能的醛酮还原酶基因被过表达。
优选地，步骤A中，所述制备静息细胞具体为：将所述菌种接种于培养基，培养一定时间后低温离心收集菌体沉淀，用磷酸盐缓冲液洗涤，即得所述静息细胞。
优选地，步骤B中，所述含甘油的转化液是在磷酸缓冲液加入甘油和非甘油碳源而制得的，所述含甘油的转化液中甘油的浓度为10～60g/L，非甘油碳源的浓度为2～20g/L。
优选地，所述非甘油碳源包括琥珀酸或葡萄糖。
优选地，步骤C中，在每升所述含甘油的转化液中所述静息细胞的加入量为5～20g。
优选地，步骤C中，所述转化的温度为25～42℃，时间为6～40小时。
本发明具有如下有益效果：
（1）利用大肠杆菌lin43的特点，在含甘油的培养基中可以大量生成丙酮醛；通过敲除丙酮醛脱毒途径中的关键基因gloA，可防止丙酮醛转化为乳酸；利用过表达丙酮醛醛酮还原酶基因，如yqhD等，迅速将丙酮醛转化为丙酮醇。
（2）由于菌体特性，静息细胞加入甘油后可以快速大量利用甘油，而静息细胞转化可人为地调节和控制转化液中菌体细胞浓度以提高产物丙酮醇浓度，本发明中丙酮醇最大浓度达到4g/L以上，是所有专利以及文献中报道的得到的最大产量。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
本发明中，“静息细胞”是指将在生长培养基上培养至一定时间后的微生物细胞，用适当的方法收集并用缓冲液进行洗涤，去除了营养成分的微生物细胞。其中，所述微生物选自大肠杆菌（Escherichia coli）Lin43，其编号为CGSC5511（The coliGenetic Stock Center，Yale University）以及它们的基因工程菌。此大肠杆菌能利用甘油产生大量的丙酮醛。并且其中的主要丙酮醛脱毒基因gloA被敲除，同时过表达yqhD或其他同功能的醛酮还原酶基因。
以下实施例中，丙酮醇的测定采用高效液相色谱（HPLC）分析方法，高效液相色谱的操作条件如下：
色谱型号：Phenomenex Rezex ROA-Organic Acid
色谱柱：ROA-Organic Acid H+（300X7.8mm）
色谱工作站：安捷伦
流动相：5mM H2SO4
流速：0.5ml/min
进样量：10μl。
检测器:RI
柱温：60℃
检测温度：55℃
以下实施例中，基因工程菌的构建方法为：利用P1噬菌体转导的方法，以大肠杆菌BW25113ΔgloA为供体菌，将E.coli Lin43菌株（J.Bacteriol.,1971,108:137-144）中gloA基因敲除，得到E.coli Lin43ΔgloA::Kan，得到此gloA基因被敲除的菌株后，将过表达基因yqhD的质粒pCA24N-yqhD转化进入E.coli Lin43ΔgloA::Kan菌株中得到E.coli Lin43ΔgloA::Kan/pCA24N-yqhD菌株。
实施例1
本实施例的微生物细胞转化法生产丙酮醇的方法，具体如下：
步骤一、取250 ml三角瓶，种子培养基装液量50ml，加入卡那霉素至终浓度为50μg/L，加入氯霉素至终浓度为30μg/L，用接种环接入用平板保存的E.coli Lin43ΔgloA::Kan/pCA24N-yqhD菌种，培养温度为37℃，放入恒温摇床中以180rpm的转速培养。
该种子培养基配方（g/L）：蛋白胨10；酵母粉5；氯化钠10，2mol/L KOH调pH至7.0，121℃灭菌20分钟。
步骤二、取1L三角瓶，菌体培养基装液体300ml，接入步骤一培养得到的种子液，接种量为5～10%，培养温度为37°C，放入恒温摇床中以180rpm的转速好氧培养。
待菌体长至OD600=0.3～0.6的浓度时，加入终浓度为1mM的IPTG诱导质粒表达基因yqhD。
诱导表达3小时后，菌液于4℃，6000rpm离心5min，得到菌体沉淀。用pH为7.0的0.02M磷酸盐缓冲液洗涤沉淀三次，经过洗涤后得到的微生物细胞即为转化用的静息细胞。
该菌体培养基配方（g/L）：NaH2PO44.1；K2HPO411,1；(NH4)2SO42.6；MgSO40.036；FeSO41.5×10-4；ZnCl21.3×10-4；CaCl21.1×10-3；琥珀酸钠2；酪氨酸水解物0.04。
步骤三、250ml三角瓶中装入含有10g/L甘油以及2g/L琥珀酸的0.02M磷酸缓冲液，加入5g/L的静息细胞，25℃、180rpm的恒温摇床中培养，40h后上清液中丙酮醇浓度可达4.2g/L。
实施例2
本实施例的微生物细胞转化法生产丙酮醇的方法，具体如下：
步骤一、取250ml三角瓶，种子培养基装液量50ml，加入卡那霉素至终浓度为50μg/L，加入氯霉素至终浓度为30μg/L，用接种环接入用平板保存的E.coli Lin43ΔgloA::Kan/pCA24N-yqhD菌种，培养温度为37℃，放入恒温摇床中以180rpm的转速培养。
该种子培养基配方（g/L）:蛋白胨10；酵母粉5；氯化钠10，2mol/L KOH调pH至7.0，121℃灭菌20分钟。
步骤二、取1L三角瓶，培养基装液体300ml，接入步骤一培养得到的种子液，接种量为5～10%，培养温度为37°C，放入恒温摇床中以180rpm的转速好氧培养。
待菌体长至OD600=0.3～0.6的浓度时，加入终浓度为1mM的IPTG诱导质粒表达基因yqhD。
诱导表达3小时后，菌液于4℃，6000rpm离心5min，得到菌体沉淀。用pH为7.00的磷酸盐缓冲液洗涤沉淀三次，经过洗涤后得到的微生物细胞即为转化用的静息细胞。
菌体培养基配方（g/L）：NaH2PO44.1；K2HPO411,1；(NH4)2SO42.6；MgSO40.036；FeSO41.5×10-4；ZnCl21.3×10-4；CaCl21.1×10-3；琥珀酸钠2；酪氨酸水解物0.04。
步骤三、250ml三角瓶中装入含有60g/L甘油以及20g/L葡萄糖的磷酸缓冲液，加入20g/L的静息细胞，42℃、180rpm的恒温摇床中培养，6h后上清液中丙酮醇浓度可达4.4g/L。
实施例3
本实施例的微生物细胞转化法生产丙酮醇的方法，具体如下：
步骤一、取250ml三角瓶，种子培养基装液量50ml，加入卡那霉素至终浓度为50μg/L，加入氯霉素至终浓度为30μg/L，用接种环接入用平板保存的E.coli Lin43ΔgloA::Kan/pCA24N-yqhD菌种，培养温度为37℃，放入恒温摇床中以180rpm的转速培养。
种子培养基配方（g/L）:蛋白胨10；酵母粉5；氯化钠10，2mol/L KOH调pH至7.0，121℃灭菌20分钟。
步骤二、取1L三角瓶，菌体培养基装液体300ml，接入步骤一培养得到的种子液，接种量为5～10%，培养温度为37°C，放入恒温摇床中以180rpm的转速好氧培养。
待菌体长至OD600=0.3～0.6的浓度时，加入终浓度为1mM的IPTG诱导质粒表达基因yqhD。
诱导表达3小时后，菌液于4℃，6000rpm离心5min，得到菌体沉淀。用pH为7.0的0.02M磷酸盐缓冲液洗涤沉淀三次，经过洗涤后得到的微生物细胞即为转化用的静息细胞。
菌体培养基配方（g/L）：NaH2PO44.1；K2HPO411,1；(NH4)2SO42.6；MgSO40.036；FeSO41.5×10-4；ZnCl21.3×10-4；CaCl21.1×10-3；琥珀酸钠2；酪氨酸水解物0.04。
步骤三、250ml三角瓶中装入含有30g/L甘油以及10g/L琥珀酸的0.02M磷酸缓冲液，加入12g/L的静息细胞，37℃、180rpm的恒温摇床中培养，25h后上清液中丙酮醇浓度可达4.5g/L。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (3)

1.一种微生物细胞转化法制备丙酮醇的方法，其特征在于，包括如下步骤：
A、以大肠杆菌(Escherichia coli)Lin43CGSC 5511的基因工程菌为菌种，制备静息细胞；
所述基因工程菌中，菌种中的gloA基因被敲除，yqhD基因被过表达；
B、制备含甘油的转化液；
C、在所述含甘油的转化液中加入所述静息细胞转化，即得所述丙酮醇；
步骤B中，所述含甘油的转化液是在磷酸缓冲液加入甘油和非甘油碳源而制得的，所述含甘油的转化液中甘油的浓度为10～60g/L，非甘油碳源的浓度为2～20g/L；所述非甘油碳源包括琥珀酸或葡萄糖；
步骤C中，在每升所述含甘油的转化液中所述静息细胞的加入量为5～20g。
2.如权利要求1所述的微生物细胞转化法制备丙酮醇的方法，其特征在于，步骤A中，所述制备静息细胞具体为：将所述菌种接种于培养基，培养一定时间后低温离心收集菌体沉淀，用磷酸盐缓冲液洗涤，即得所述静息细胞。
3.如权利要求1所述的微生物细胞转化法制备丙酮醇的方法，其特征在于，步骤C中，所述转化的温度为25～42℃，时间为6～40小时。
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