CN101641444A - 用于产生1，2-丙二醇和丙酮醇的微生物和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及丙酮醛还原酶活性增加的修饰的微生物，和其用于制备1，2－丙二醇和/或丙酮醇的用途。具体地，这种增加的丙酮醛还原酶活性通过增加来自微生物的特定基因的表达而获得。本发明还涉及通过发酵丙酮醛还原酶活性增加的微生物而产生1，2－丙二醇和/或丙酮醇的方法。
Description
引言
本发明涉及修饰的微生物及其用于制备1，2-丙二醇和/或丙酮醇的用途。
1，2-丙二醇或丙二醇，即C3二醇，是广泛使用的化学品。它是用于飞机的抗冻和除冰流体、液体洗涤剂、冷却剂、不饱和聚酯树脂的组分。自从1993-1994年以来，丙二醇越来越多地用作乙烯衍生物的替代物，所述乙烯衍生物被认为比丙烯衍生物的毒性更强。
目前使用消耗大量水的环氧丙烷水合工艺通过化学手段产生1，2-丙二醇。环氧丙烷可以由两种方法中的任一种产生，一种使用表氯醇(epichlorhydrin)，另一种使用氢过氧化物。两条途径都使用高毒性物质。此外，氢过氧化物途径产生副产物如叔丁醇和1-苯基乙醇。为使丙烯生产成为有利可图的，必须使用这些副产物。化学途径通常产生消旋的1，2-丙二醇，而两种立体异构体(R)1，2-丙二醇和(S)1，2-丙二醇中每种对于某些应用是感兴趣的(例如专门的化学和药物产品的手性起始材料)。
丙酮醇或羟基丙酮(1-羟基-2-丙酮)是C3酮醇。这种产物在纺织业的瓮染(vat dyeing)工艺中作为还原剂。它能有利地替代传统的含硫还原剂，以减少废水中对环境有害的硫含量。丙酮醇也是化学工业的起始材料，用于例如产生多元醇或杂环分子。它还具有有趣的螯合和溶剂性质。
丙酮醇目前主要通过1，2-丙二醇的脱水或催化氧化来产生。现在提出由可再生物料如甘油出发的新工艺(参见DE4128692和WO 2005/095536)。当前，化学工艺产生丙酮醇的生产成本减少了它的工业应用和市场。
用于产生1，2-丙二醇和/或丙酮醇的化学方法的缺点使生物合成成为具有吸引力的替代方法。已表征了两种途径用于通过微生物由糖天然产生这些产物。
在第一个途径中，将6-脱氧糖(例如L-鼠李糖或L-岩藻糖)裂解成磷酸二羟基丙酮和(S)-乳醛，其能进一步还原至(S)-1，2-丙二醇(Badia等，1985)。此途径在大肠杆菌中有功能，但是因为脱氧己糖的高成本，不能得到经济上可行的工艺。
第二个途径是通过糖酵解途径，然后是丙酮醛途径来代谢普通糖(例如葡萄糖或木糖)。将磷酸二羟基丙酮转化成丙酮醛，后者可以还原成乳醛或丙酮醇。然后这两个化合物可以进行第二次还原反应，得到1，2-丙二醇。此途径由(R)-1，2-丙二醇的天然生产菌使用，如楔形梭菌(Clostridium sphenoides)和热解糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter thermosaccharolyticum)。已经使用楔形梭菌产生1，2-丙二醇，在磷酸盐受限条件下效价(titer)为1.58g/l(Tran Din和Gottschalk，1985)。也已经研究热解糖热厌氧杆菌用于产生1，2-丙二醇(Cameron和Cooney，1986，Sanchez-Rivera等，1987)。获得的最佳性能是9g/l的效价和0.2g/g由葡萄糖的得率。然而，用这些生物获得的性能的改进可能由于缺少可用的遗传工具而受到限制。
现有技术
大肠杆菌具有天然产生1，2-丙二醇和丙酮醇的基因能力。1，2-丙二醇的生物合成途径由糖酵解中间产物磷酸二羟基丙酮开始。这种代谢中间产物能被由mgsA基因编码的丙酮醛合酶转化成丙酮醛(Cooper，1984，
等，1998)。丙酮醛是毒性极强的亲电子试剂，能与大分子如DNA、RNA和蛋白质的亲核中心反应。它在非常低的浓度(0.3至0.7mM)能抑制细胞生长并引起细胞死亡。为此，已经研究了将丙酮醛脱毒的现有途径(Ferguson等，1998)。已经在细菌特别是在大肠杆菌中鉴定了三条途径。
-第一条途径是谷胱甘肽依赖型乙二醛酶I-II系统(由gloA和gloB基因编码)，其可以两个步骤将丙酮醛转化成D-乳酸。
-第二条途径是不依赖谷胱甘肽的乙二醛酶III酶，其催化丙酮醛转化成D-乳酸。
-第三个系统包含通过丙酮醛还原酶来降解丙酮醛。
最后一个系统与1，2-丙二醇的产生相关。丙酮醛是在C1携带醛，在C2携带酮的C3酮醛。这两个位置可以还原成醇，分别得到丙酮醇(或羟基丙酮)，其为非手性分子，和乳醛，其为能以L-或D-形式存在的手性分子(参见图1)。随后这3个分子(丙酮醇，L-乳醛和D-乳醛)可以在其他位置被还原以得到手性的1，2-丙二醇。
在大肠杆菌中优选使用的途径目前尚未明确建立。丙酮醛还原酶，优先使用NADPH作为辅因子，经过纯化并在大肠杆菌中部分表征(Saikusa等，1987)。这个反应的产物显示为乳醛。Misra等(1996)描述了两种丙酮醛还原酶活性的纯化，这两种酶活性给出相同的产物丙酮醛。一种NADH依赖的活性可为醇脱氢酶活性，而NADPH依赖的活性可为非特异性的醛还原酶。Altaras和Cameron(1999)证明了由大肠杆菌的gldA基因编码的甘油脱氢酶(GldA)在将丙酮醛还原成(R)-乳醛的过程中有活性，并且在将丙酮醇转化成1，2-丙二醇的过程中也有活性。
从大肠杆菌克隆基因yghZ，表达并表征蛋白质(Grant，2003)。它以NADPH为辅因子，对丙酮醛表现出了高度特异的活性，但是未表征反应产物。过表达时，这个基因赋予对丙酮醛毒性的抗性。
Ko等(2005)系统地研究了大肠杆菌的9个醛-酮还原酶，作为将丙酮醛转化成为丙酮醇的候选酶。他们发现，4个纯化的酶，YafB、YqhE、YeaE和YghZ能在NADPH存在时将丙酮醛转化成丙酮醇。根据他们的研究，丙酮醛还原酶YafB、YeaE和YghZ在脱毒方面与体内的丙酮醛代谢最为相关。DiLuccio等(2006)显示大肠杆菌的基因ydjG的产物在存在NADH时对丙酮醛有活性，但没有进行反应产物的表征。
已经由Cameron小组(Cameron等，1998，Altaras和Cameron，1999，Altaras和Cameron，2000)和Bennett小组(Huang等，1999，Berrios-Rivera等，2003)进行了几项大肠杆菌基因修饰的研究，以获得使用简单碳源的1，2-丙二醇产生菌。这些研究依赖从磷酸二羟基丙酮到1，2-丙二醇的途径中编码酶活性的一个或多个基因的表达。Cameron等(1998)显示编码大鼠晶状体(rat lens)醛糖还原酶的基因或者gldA基因的过表达导致产生少于0.2g/l 1，2-丙二醇。可通过共-表达两个大肠杆菌基因(mgsA和gldA)来获得此效价(titer)的改进。通过这个组合，可获得0.7g/l 1，2-丙二醇的效价(Altaras和Cameron，1999)。当在大肠杆菌中表达完全的1，2-丙二醇途径时，获得效价和得率上的进一步改进(Altaras和Cameron，2000)。已经在缺乏编码乳酸脱氢酶(ldhA)的基因的菌株中过表达三个基因mgsA、gldA和fucO。通过此组合，由Cameron小组获得的最好结果是在厌氧摇瓶培养中产生1.4g/l 1，2-丙二醇，得率为0.2g/g消耗的葡萄糖。当外推至厌氧补料批式发酵罐中时，产生4.5g/l 1，2-丙二醇，得率为0.19g/g葡萄糖。在专利US 6,087,140，US 6,303,352和WO 98/37204中还描述了用同样的方法获得产量和得率更低的结果。Bennett小组还也使用缺乏ldhA的大肠杆菌宿主菌株过表达来自丙酮丁醇梭菌的mgs基因和来自大肠杆菌的gldA基因。在厌氧条件下的摇瓶培养给出1.3g/l的产量和0.12g/g的得率，而微需氧培养给出1.4g/l的产量和0.13g/g的得率。
在这一阶段，所有这些结果都未能超过用热解糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter thermosaccharolyticum)获得的结果。
至今为止，尚未描述来自微生物(特别是来自大肠杆菌)的将丙酮醛转化成丙酮醇的内源活性的用途。
发明概述
本发明涉及丙酮醛还原酶活性增加的修饰的微生物，及其用于制备1，2-丙二醇和/或丙酮醇的用途。丙酮醛还原酶是来自微生物的基因的产物。通过过表达将丙酮醛变为丙酮醇的转化中涉及的一个或多个基因来获得丙酮醛还原酶活性的增加，所述基因优选选自yqhD、yafB、ycdW、yqhE、yeaE、yghZ、yajO、tas、ydjG和ydbC。
在本发明的另一个方面，也通过过表达mgsA基因而增加丙酮醛合酶的活性。
在本发明的另一个方面，通过缺失edd和/或eda基因而消除Entner-Doudoroff途径。此外，通过削弱编码涉及从丙酮醛合成乳酸的酶的基因(如gloA、aldA、aldB)、由丙酮酸(ldhA)、甲酸(pflA、pflB)、乙醇(adhE)和乙酸(ackA、pta、poxB)合成乳酸的酶的基因的表达而削弱不期望副产物的合成。
优选地，一半葡萄糖代谢成磷酸二羟基丙酮，并最终通过缺失tpiA基因而代谢成为1，2-丙二醇和/或丙酮醇。任选地，具有有活性的tpiA基因，降低3磷酸甘油醛的活性，从而使部分可用的3磷酸甘油醛重定向于1，2-丙二醇和/或丙酮醇的合成。在本发明的一个方面，增加了糖输入的效率，通过使用不依赖磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的糖输入(如由galP编码的)，或者通过将更多的PEP提供给糖-磷酸转移酶系统，来增加糖输入的效率。这可以通过消除消耗PEP的途径如丙酮酸激酶(由pykA和pykF基因编码)和/或通过促进PEP的合成，例如通过过表达编码PEP合酶的ppsA基因来获得。
特别地，对于1，2-丙二醇的产生，可以任选地修饰微生物，以增加将磷酸二羟基丙酮转化成1，2-丙二醇的其他酶，如甘油脱氢酶(由gldA编码)和1，2-丙二醇氧化还原酶(由fucO编码)。此外，对于将丙酮酸转化成乙酰-CoA的酶有价值的是成为对厌氧条件下存在的高浓度NADH是有抗性的。这能通过在lpd基因中的特定突变而获得。最后，为了节省NADH用于将丙酮醇还原成1，2-丙二醇，可以缺失arcA和ndh基因。用于制备1，2-丙二醇的微生物选自细菌、酵母和真菌中，但是优选为大肠杆菌或丙酮丁醇梭菌。本发明提供通过在包含简单或复杂碳源的适当生长培养基中培养修饰的微生物，和回收并纯化产生的1，2-丙二醇来生产1，2-丙二醇的方法。
特定地，对于丙酮醇的产生，削弱或缺失编码甘油脱氢酶的基因，防止1，2-丙二醇的形成。用于制备丙酮醇的微生物从细菌、酵母和真菌中选择，但优选为大肠杆菌或肺炎克雷伯氏菌。本发明的另一个目的是通过在包含简单碳源的适当的生长培养基中培养所述修饰的微生物，并通过回收和纯化所产生的丙酮醇来生产丙酮醇的方法。
附图简述
并入和构成本说明一部分的附图例示了本发明，并与说明一起，用于解释本发明的原理。
图1描绘从糖出发的1，2-丙二醇产生系统的开发中中心代谢(centralmetabolism)的遗传工程。
图2显示在pH 7，在阴离子交换色谱上三个蛋白质YQHD、YDHF和GLDA的洗脱谱。
发明详述
本发明涉及用于从碳源产生1，2-丙二醇和/或丙酮醇的修饰的微生物，其中所述微生物以增加的丙酮醛还原酶活性为特征，所述酶由来自微生物的一个或多个基因编码。
如本文所使用的，下述术语可以用于解释权利要求和说明。
根据本发明，术语“培养”、“生长”和“发酵”可互换使用，表示细菌在包含简单碳源的适当生长培养基中的生长。
术语“修饰的微生物”表示微生物如细菌、酵母或真菌，其已经经过修饰，增加了丙酮醛还原酶活性。这样的修饰包括用遗传元件转化微生物的通常手段，包括基因置换和导入载体用于表达与丙酮醛还原有关的基因。还包括在普通的诱导突变的条件下微生物的随机或定向突变。还包括微生物的进化方法，如WO 2004/076659中公开的进化方法。
术语“用于产生”表示微生物通过发酵产生目的产物。发酵是可以在需氧、微需氧或厌氧条件下进行的经典方法。
根据本发明的术语“碳源”表示碳的任何来源，其可以由本领域技术人员用来支持微生物的正常生长，并且其可以是己糖、戊糖、单糖、二糖、寡糖、淀粉或其衍生物，半纤维素，甘油和它们的组合。
“增加的酶活”表示活性超过野生型酶的活性，后者如在任何修饰之前在相同的微生物中所测定的。相应的未修饰的微生物是除对丙酮醛还原酶活性进行修饰之外，与修饰的微生物具有相同特性的微生物。可以通过普通方法如Misra等(Molecular and Cellular Biochemistry 156：117-124(1996))或Ko等(J.Bacteriol.187：5782-5789(2005))中公开的方法测量丙酮醛还原酶活性。
有利地，与相应的未修饰的微生物的丙酮醛还原酶活性相比较，丙酮醛还原酶活性增加至少50％，优选至少100％。
优选地，通过过表达与丙酮醛还原有关的至少一个基因而获得丙酮醛还原酶活性的增加。
术语“表达”指基因序列的转录和翻译，其可以产生相应的蛋白质，基因产物。
为了获得目的基因的过表达，本领域的技术人员了解不同的方法，例如：
1.用诱导所述目的基因更强表达水平的启动子替代基因的天然启动子。
可以通过用已知能在所选微生物中诱导强力基因表达的启动子替代基因的天然启动子，获得更强的表达水平。对于大肠杆菌，这样的启动子是例如启动子Ptrc，Ptac、Plac、λ启动子cI或本领域的专家了解的其他启动子。对于微生物的其他菌种，本领域的那些技术人员能确定可以使用的启动子。
2.通过下述方式向微生物中导入多个拷贝的与丙酮醛还原有关的所述目的基因：
-导入携带和表达所述目的基因的表达载体。
-向微生物的染色体中导入基因的额外拷贝。
在本发明的特定实施方案中，下述基因中至少一个过表达：yqhD、yafB、ydhF、ycdW、yqhE、yeaE、yghZ、yajO、tas、ydjG和ydbC。所述基因编码能将丙酮醛转化成丙酮醇的酶。优选地，yqhD基因单独或与其他基因组合过表达。
在本发明的另一个实施方案中，将丙酮醛活性增加的微生物进一步修饰。
优选地，根据本发明的微生物提供增加的丙酮醛合酶活性。有利地，这可以通过增加基因mgsA的表达而获得，该基因编码在DHAP变为丙酮醛的转化中有关的丙酮醛合酶。
获得这种增加的酶活的另一个方法是向mgsA基因导入特定的突变，翻译得到与天然蛋白质相比较表现出更高活性的基因产物。
优选地，在根据本发明的微生物中，与Entner-Doudoroff途径有关的至少一个基因削弱。Entner-Doudoroff途径提供糖酵解之外的备选途径，以将葡萄糖降解成3-磷酸甘油醛和丙酮酸。Entner-Doudoroff途径的削弱确保大多数或最好是全部葡萄糖通过糖酵解降解，并且用于产生1，2-丙二醇。
优选地，下述基因中至少一个的表达被削弱：edd、eda
术语“酶活性的削弱”指与进行任何修饰之前的进化菌株中观察到的活性相比，目的酶的活性降低。本领域的技术人员了解多种方法获得这一结果，例如：
-向基因中导入突变，降低该基因的表达水平，或者降低编码蛋白质的活性水平。
-由低强度的启动子替代基因的天然启动子，得到更低的表达。
-使用使相应信使RNA或蛋白质不稳定的元件。
-如果需要根本不表达则缺失基因。
根据本发明，术语“削弱基因的表达”表示部分或全部抑制基因的表达，即所谓“削弱的”。对表达的这种抑制可以是抑制基因的表达，缺失基因表达所需的全部或部分启动子区域，或者缺失基因的编码区域。优选地，基因的削弱本质上是基因的完全缺失，所述基因可以由选择标记基因替代，所述选择标记基因可以促进根据本发明的菌株的鉴定、分离和纯化。优选通过Datsenko，K.A.和Wanner，B.L.(2000)“One-step inactivation of chromosomalgenes in Escherichia coli K-12 using PCR products”.Proc.Natl.Acad.Sci.USA97：6640-6645所述的同源重组技术使基因失活。
在本发明的另一个实施方案中，在将丙酮醛变为乳酸的转化中有关的至少一个酶的活性被削弱。这种削弱的目的在于可用的丙酮醛被合成1，2-丙二醇所必需的细胞机制使用(参见图1)。
在丙酮醛变为乳酸的转化中有关的基因具体为：
-编码乙二醛酶I的gloA基因，其催化从丙酮醛合成乳酰谷胱甘肽；
-编码乳醛脱氢酶的aldA和aldB基因(催化从(S)乳醛合成(S)乳酸)。
在微生物中有利地削弱了这些基因中的一个或多个。优选削弱或完全缺失gloA基因。
在本发明的微生物中，优选的是削弱与副产物如乳酸、乙醇和甲酸合成有关的至少一个酶。
具体地，有利地削弱编码乳酸脱氢酶的基因ldhA，其催化由丙酮酸合成乳酸，和编码醇-醛脱氢酶的基因adhE，其催化由乙酰-CoA合成乙醇。
相似地，可能迫使微生物使用丙酮酸脱氢酶复合物由丙酮酸产生乙酰-CoA、CO2和NADH，而不是乙酰-CoA和甲酸。这可以通过削弱编码丙酮酸甲酸裂合酶的基因pflA和pflB而实现。
在本发明的另一个特定的实施方案中，通过削弱涉及副产物乙酸合成的至少一个酶而防止合成乙酸。优选避免这样的乙酸合成以优化1，2-丙二醇的产生。
为了防止产生乙酸，有利地削弱了选自ackA、pta和poxB中的至少一个基因，这些基因都编码涉及不同的乙酸生物合成途径的酶(参见图1)。
在本发明的特定实施方案中，削弱磷酸丙糖异构酶活性。优选地，通过削弱tpiA基因的表达而实现这个结果。tpiA基因编码酶“磷酸丙糖异构酶”，其催化DHAP转化成3-磷酸甘油醛(参见图1)。这个基因的表达的削弱确保将一半代谢的葡萄糖转化成1，2-丙二醇和/或丙酮醇。
在本发明的特定实施方案中，削弱了3-磷酸甘油醛脱氢酶的活性。3-磷酸甘油醛脱氢酶，也称作GAPDH，是与葡萄糖变为丙酮酸的糖酵解转化有关的关键酶。酶的削弱使部分GA3P重定向于1，2-丙二醇和/或丙酮醇的合成。因而1，2-丙二醇对于葡萄糖的得率可大于1摩尔/摩尔。有利地，3-磷酸甘油醛脱氢酶的活性小于野生型GADPH通常活性的约30％，更优选地小于10％。
优选地，削弱编码GAPDH的gapA基因的表达。
优选地，在根据本发明的微生物中，增加糖输入的效率。gapA基因表达的强力削弱使GAPDH反应中碳流量降低超过50％，这将导致每摩尔输入的葡萄糖合成小于1摩尔的PEP。通常用于将简单糖输入细胞的糖-磷酸转移酶系统(PTS)需要PEP，因为输入与从PEP到葡萄糖的磷酸转移耦合，所述过程得到6-磷酸葡萄糖。因此，减少PEP的量将对糖输入产生负面影响。
在本发明的特定实施方案中，可以通过不依赖磷酸烯醇丙酮酸的糖输入系统将糖输入微生物。可以利用由不涉及磷酸化的galP基因编码的半乳糖-质子同向转运体。在这种情况下，输入的葡萄糖必须由glk基因编码的葡萄糖激酶磷酸化。为了促进这一途径，增加选自galP和glk的至少一个基因的表达。结果为PTS变得不必要，而且可以通过削弱选自ptsH、ptsI或crr的至少一个基因的表达而消除。
在本发明的另一个特定的实施方案中，通过增加代谢物PEP的可用性而增加糖磷酸转移酶系统(PTS)的效率。由于削弱了gapA活性和朝向丙酮酸的碳流量降低，所以本发明的修饰菌株中PEP的量受到限制，导致转运至细胞中的葡萄糖量降低。
存在各种可以用于增加微生物菌株中PEP可用性的方法。具体地，一种方法是削弱反应PEP→丙酮酸。优选地，选自pykA和pykF的至少一个基因的表达在所述菌株中削弱以获得这一结果，所述基因编码丙酮酸激酶。另一种方法是增加PEP的可用性，利于反应丙酮酸→PEP，所述反应由磷酸烯醇丙酮酸合酶催化，可以通过增加酶的活性而实现。这个酶由ppsA基因编码。因此，在微生物中优选增加ppsA基因的表达。两种修饰可以同时存在于微生物中。
在本发明的特定实施方案中，设计修饰的微生物，主要产生1，2-丙二醇。通过将丙酮醇和其他前体(例如乳醛)转化成1，2-丙二醇可以获得这一结果。这包括：
-增加甘油脱氢酶活性。优先地，增加gldA基因的表达。
-增加1，2-丙二醇氧化还原酶活性，优选通过增加基因fucO的表达。
特别是在厌氧或微需氧条件下，有利的是，将丙酮酸转化成乙酰-CoA的丙酮酸脱氢酶对于NADH的抑制的灵敏度较低。术语“低灵敏度”定义为参照未修饰酶的灵敏度。具体地，这些特性可以通过如下方法获得：向lpd基因(编码PDC的硫辛酰胺脱氢酶亚基)中导入特定突变，使酶的蛋白质序列中的丙氨酸55由缬氨酸替代。
在厌氧或微需氧条件下，将用于还原前体产物1，2-丙二醇的NADH的可用性有利地增加，这可以通过减轻全局调控子ArcA(由arcA基因编码)介导的对三羧酸循环的抑制而实现。细胞中NADH的浓度也可以通过失活由基因ndh编码的NADH脱氢酶II而增加。因此，优选地，选自arcA和ndh的至少一个基因的表达被削弱。
优选地，设计的主要产生1，2-丙二醇的微生物选自细菌，酵母和真菌。更优选地，微生物选自肠杆菌科，芽孢杆菌科，梭菌科，链霉菌科和棒杆菌科。甚至更优选地，微生物来自大肠杆菌菌种或者来自丙酮丁醇梭菌菌种。
在本发明的另一个特定实施方案中，设计修饰的微生物，主要产生丙酮醇。优选地，这个结果可以通过削弱涉及丙酮醇转化成为1，2-丙二醇的至少一个酶的活性而实现。优选地，削弱gldA基因的表达。
有利地，设计的主要产生丙酮醇的微生物选自细菌，酵母和真菌。更优选地，微生物选自肠杆菌科，芽孢杆菌科，链霉菌科和棒杆菌科。甚至更优选地，微生物来自大肠杆菌菌种或者来自肺炎克雷伯氏菌菌种。
本发明还涉及用于制备1，2-丙二醇的方法，其中根据本发明的微生物在包含碳源的适当的生长培养基中生长，并且回收产生的1，2-丙二醇。在需氧、微需氧或厌氧条件下进行1，2-丙二醇的产生。
在一个实施方案中，大肠杆菌种属的微生物在包含简单碳源的适当的生长培养基中生长。
在另一个实施方案中，丙酮丁醇梭菌种属的微生物在包含简单或复杂碳源的适当的生长培养基中生长。
有利地，将回收的1，2-丙二醇进一步纯化。
本发明还涉及用于制备丙酮醇的方法，其中根据本发明的微生物在包含简单碳源的适当的生长培养基中生长，并且回收产生的丙酮醇。在需氧、微需氧或厌氧条件下进行丙酮醇的产生，优选在需氧条件下。
有利地，将回收的丙酮醇进一步纯化。
发酵过程的培养条件可以由本领域的技术人员容易地确定。具体地，细菌在20℃-55℃的温度发酵，优选在25℃-40℃，并且对于丙酮丁醇梭菌优选在约35℃，而对于大肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌在约37℃。
这个过程可以以分批过程、补料分批过程或连续过程进行。
“在需氧条件下”表示通过将气体溶于液相而向培养物供氧。这可以通过下述方式获得：(1)将含氧气体(例如空气)鼓泡入液相，或(2)震荡包含培养基的容器，以将液上空间包含的氧传递入液相。在需氧条件而不是厌氧条件下发酵的优势是氧作为电子受体的存在改进了菌株以ATP形式为细胞过程产生更多能量的能力。因此菌株的普通代谢得到了改进。
微需氧条件定义为这样的培养条件：其中低百分比的氧(例如使用包含0.1-10％氧的气体混合物，用氮补至100％)溶于液相中。
厌氧条件定义为不向培养基供氧的培养条件。可以通过向培养基中鼓泡惰性气体如氮气，去除痕量的其他气体而获得严格厌氧条件。可以使用氮气作为电子受体以改进菌株的ATP生产，并改进其代谢。
根据本发明，术语“适当的生长培养基”表示已知分子组成，适合微生物生长的培养基。例如适合所用细菌的组成已知的无机培养基，其中包含至少一种碳源。具体地，因此用于大肠杆菌或肺炎克雷伯氏菌的无机生长培养基可以与M9培养基(Anderson，1946，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 32：120-128)、M63培养基(Miller，1992；A Short Course in B acterial Genetics：A LaboratoryManual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)或如Schaefer等(1999，Anal.Biochem.270：88-96)所定义的培养基有相同或相似的组成，并且具体地，命名为MPG的基本培养基如下所述：
| K2HPO4 | 1.4g/l |
| 氮川三乙酸 | 0.2g/l |
| 痕量元素溶液＊ | 10ml/l |
| (NH4)2SO4 | 1g/l |
| NaCl | 0.2g/l |
| NaHCO3 | 0.2g/l |
| MgSO4 | 0.2g/l |
| 葡萄糖 | 20至100g/l |
| NaNO3 | 0.424g/l |
| 硫胺素 | 10mg/l |
| FeSO4，7H2O | 50mg/l |
| 酵母提取物 | 4g/l |
用氢氧化钠将培养基的pH调至7.4。
*痕量元素溶液：柠檬酸4.37g/L，MnSO4 3g/L，CaCl2 1g/L，CoCl2，2H2O0.1g/L，ZnSO4，7H2O 0.10g/L，CuSO4，5H2O 10mg/L，H3BO3 10mg/L，Na2MoO4 8.31mg/L。
对于大肠杆菌或肺炎克雷伯氏菌，使用的碳源优选为简单碳源，可以是阿拉伯糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、麦芽糖蔗糖或木糖。特别优选的简单碳源是葡萄糖。
因此对于丙酮丁醇梭菌，生长培养基可以与梭菌生长培养基(CGM，Wiesenborn等，Appl.Environm.Microbiol.，54：2717-2722)或由Monot等(Appl.Environm.Microbiol.，44：1318-1324)或Vasconcelos等(J.Bacteriol.，176：1443-1450)给出的无机生长培养基组成相同或相似。
对于丙酮丁醇梭菌，使用的碳源为简单或复杂碳。简单碳源可以是阿拉伯糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖或木糖。特别优选的简单碳源是葡萄糖。复杂碳源可以是淀粉或半纤维素。特别优选的复杂碳源是淀粉。
本发明在上文、下文和实施例中针对大肠杆菌描述。因此对于本发明的初始和进化菌株可以削弱、缺失或过表达的基因主要使用来自大肠杆菌的基因的名称(denomination)来定义。然而，这种指定根据本发明具有更一般的意义，并覆盖了其他微生物中相应的基因。使用来自大肠杆菌的基因的GenBank参考符号(reference)，本领域的那些技术人员能确定大肠杆菌之外的其他生物体中的等同基因。
鉴定同源序列和它们的百分比同源性的方法是本领域的技术人员公知的，并且具体包括可以在网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/上以网站上指示的默认参数使用的BLAST程序。获得的序列可以使用例如程序CLUSTALW(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)以这些网站上指示的默认参数进行研究(比对)。
PFAM数据库(比对和隐藏的Markov模型的蛋白质家族数据库，http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)是蛋白质序列比对的大集合。每个PFAM能够显示多重比对，查看蛋白质域，评价生物体之间的分布，访问其他数据库并显示已知的蛋白质结构。
通过比较源自代表了44个主要的系统发生系的66个完全测序单细胞基因组的蛋白质序列而获得COG(蛋白质直向同源组的簇，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)。每个COG由至少三个系定义，从而能够鉴定古老的保守的域。
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实施例
实施例1：恒化培养的菌株大肠杆菌MG1655 lpd*，ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::km，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，Δedd中与丙酮醛还原有关的酶的提取、纯化和鉴定
a)与丙酮醛还原有关的NADH-或NADPH-依赖型酶的纯化方法
设计用来纯化与丙酮醛还原有关的NADH-或NADPH-依赖性酶的整体纯化方法由五个步骤组成。在每个步骤，由酶活性实验检测靶标酶。测量两种酶活性：1)NADPH-依赖性的丙酮醛还原，2)NADH-依赖性丙酮醛还原。
1)从大肠杆菌MG1655 lpd*ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::km，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，Δedd(对于菌株的构建参见WO 2005/073364)的恒化培养物收集微生物生物质，所述培养在严格厌氧或微需氧条件下进行。
2)通过离心收获细胞，用50mM HEPES缓冲液pH 7.5和5mM DTT洗涤两次，重悬于相同的缓冲液中，然后在-20℃保存。
3)通过声处理破碎细胞(0℃，在厌氧条件下，四个30秒的循环，每次循环之间间隔2分钟，存在蛋白酶抑制剂)。通过离心消除细胞碎片，通过硫酸链霉素处理将存在于细胞匀浆中的核酸沉淀，或者通过酶处理(Benzonase)使其水解(表I)。
表1.对细胞匀浆进行Benzonase或硫酸链霉素(粗体)处理对与丙酮醛还原有关的酶活性的影响。
| 评价的活性 | 比活性U/mg | 总酶活U |
| NADPH-依赖的丙酮醛还原 | 0.130.043 | 0.0950.120 |
| NADH-依赖的丙酮醛还原 | 0.2850.149 | 0.2090.408 |
根据表1，硫酸链霉素处理更加有效，得到更高的比活性。使得可以去除污染物(核酸和不期望的蛋白质)，同时保持目的酶的生物活性。
4)将硫酸链霉素处理的细胞匀浆离心，并使其通过连至AKTA纯化系统的阴离子交换色谱柱(Ressource Q，Amersham Bioscience)，所述柱用50mMHEPES缓冲液和5mM DTT平衡。在pH 7或7.5或8进行蛋白质分离。通过连续KCl梯度(2％)洗脱蛋白质，并作为单独级分收集。
5)将包含酶活性的洗脱级分汇集并施加于疏水相互作用色谱柱(Hitrapphenyl sepharose，Amersham Biosciences)，所述柱用50mM HEPES缓冲液和5mM DTT平衡。
如果需要，可以加入最后一步凝胶渗透色谱。
在每个步骤后确定得率和纯化因子。在最后一步纯化后，在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离活性组分中残余的蛋白质。通过关联级分活性与点迹(spot)大小而鉴定目的蛋白质。切除蛋白质点，洗涤并用特定的蛋白酶消化(胰蛋白酶消化)，并进行质谱(LC-MS/MS和MALDI)鉴定。
b)在厌氧条件下生长的菌株大肠杆菌MG1655 lpd*，ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::km，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，Δedd中与丙酮醛还原有关的酶的鉴定
在pH 7使用阴离子交换色谱进行纯化过程，然后用疏水相互作用色谱，鉴定出两个可还原丙酮醛的依赖NADPH的酶：由yqhD基因编码的YQHD(42KDa)和由ydhF基因编码的YDHF(33KDa)(图2)。发现第三种在依赖NADH和NADPH的丙酮醛还原中有活性的酶(由gldA基因编码的甘油脱氢酶)。
当在pH 8进行阴离子交换色谱，然后是疏水相互作用色谱，和凝胶渗透色谱的最后步骤时，鉴定出另一个可还原丙酮醛的依赖NADPH的酶：由dkgB(yafB)基因编码的2，5-二酮-D-葡糖酸还原酶B(29KDa)。
c)在微需氧条件下生长的菌株大肠杆菌MG1655 lpd*，ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::km，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，Δedd中与丙酮醛还原有关的酶的鉴定
由所设计的在pH 7.5使用阴离子交换色谱的纯化过程，鉴定出由ycdW基因编码的称为YCDW的36KDa蛋白质，所述蛋白质催化依赖NADPH的丙酮醛的还原。
当在pH 7.5进行阴离子交换色谱，然后是疏水相互作用色谱时，鉴定出另外两个依赖NADPH催化丙酮醛还原的酶：由yqhD基因编码的YQHD(42KDa)(已从在厌氧条件下生长的细胞中纯化)和由dkgA(yqhE)基因编码的2，5-二酮-D-葡糖酸还原酶A(31KDa)。
实施例2：在菌株大肠杆菌MG1655 lpd*，ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ΔldhA::cm，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，Δedd中导入缺失ΔyqhD、ΔyafB、ΔydhF和ΔycdW，以评价所述基因是否涉及丙酮醛还原
a)构建修饰的菌株大肠杆菌MG1655 lpd*，ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::Km，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，Δedd
根据操作规程1，消除菌株大肠杆菌MG1655lpd*，ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::km，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，Δedd::cm中的氯霉素抗性盒。
操作规程1：抗性盒的消除
根据下述技术消除氯霉素和/或卡那霉素抗性盒。通过电穿孔将携带在氯霉素和/或卡那霉素抗性盒的FRT位点发挥作用的FLP重组酶的质粒pCP20导入菌株。在42℃系列培养后，用表2中给出的寡核苷酸通过PCR分析，检查抗生素抗性盒是否丢失。
使用表2给出的寡核苷酸检查菌株中先前建立的修饰是否存在。
将获得的菌株命名为大肠杆菌MG1655 lpd*，ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::km，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，Δedd。
表2.用于检查抗性盒的插入或抗性盒的丢失的寡核苷酸
| 区域名称 | 寡核苷酸名称 | SEQ ID | 与染色体区域同源的区域 |
| tpiA基因(缺失) | cdhYIIQ | N°1N°2 | 参见WO2005073364 |
| pflAB基因 | pflABFpflABR | N°3N°4 | 参见WO2005073364 |
| adhE基因 | ychGfadhECr | N°5N°6 | 参见WO2005073364 |
| ldhA基因(盒插入) | hsIJCldhAC2 | N°7N°8 | 参见WO2005073364 |
| gloA基因 | NemACdRnt Cr | N°9N°10 | 参见WO2005073364 |
| aldA基因 | Ydc F C fgapCCr | N°11N°12 | 参见WO2005073364 |
| aldB基因 | aldB C fYiaYCr | N°13N°14 | 参见WO2005073364 |
| edd基因 | Eda dZwfr | N°15N°16 | 参见WO2005073364 |
| ldhA基因(缺失) | ldhAFldhAR | N°17N°18 | 1439724至14397431441029至1441007 |
| yqhD基因 | yqhDFyqhDR | N°19N°20 | 3153060至31530923154817至3154789 |
| yafB基因 | yafBFyafBR | N°21N°22 | 228785至228804230296至230276 |
| ydhF基因 | ydhFFydhFR | N°23N°24 | 1722394至17224231723920至1723890 |
| ycdW基因 | ycdWFycdWR | N°25N°26 | 1096789至10968091098297至1098277 |
| gapA启动子(Ptrc16-gapA) | yeaAFgapAR | N°27N°28 | 1860259-18602871861068-1861040 |
| edd和eda基因 | eddFedaR | N°29N°30 | 1932996-19329681929754-1929777 |
| pykA基因 | pykAFpykAR | N°31N°32 | 1935338至19353601937425至1937401 |
| pykF基因 | pykFFpykFR | N°33N°34 | 1753371至17533921755518至1755495 |
b)大肠杆菌MG1655 lpd*，ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ΔldhA::cm，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，Δedd修饰菌株的构建
为了消除卡那霉素抗性盒和失活ldhA基因，根据操作规程2，向缺失大部分基因的ldhA基因中插入氯霉素抗性盒。
操作规程2：导入用于重组和重组体选择的PCR产物
使用表3中选择和给出的用于替代基因或基因间区域的寡核苷酸，从质粒pKD3扩增氯霉素抗性盒或从质粒pKD4扩增卡那霉素抗性盒(Datsenko，K.A.和Wanner，B.L.(2000))。然后通过电穿孔将获得的PCR产物导入携带质粒pKD46的受体菌株，所述质粒中表达的系统λRed(γβ，exo)对同源重组极为有利。然后选择对抗生素有抗性的转化体，并用表2中给出的适当的寡核苷酸，通过PCR分析，检查抗性盒的插入。
用表2中给出的寡核苷酸检查菌株的其他修饰。
将得到的菌株命名为大肠杆菌MG1655 lpd*，ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ΔldhA::cm，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，Δedd。
表3.用于通过用PCR产物重组而在大肠杆菌MG1655中替代染色体区域的寡核苷酸
| 区域名称 | 寡核苷酸名称 | SEQ ID | 与染色体区域同源的区域 |
| ldhA基因 | DldhAF | N°35 | 1440865-1440786 |
| DldhAR | N°36 | 1439878-1439958 | |
| yqhD基因 | DyqhDFDyqhDR | N°37N°38 | 3153369-31534483154532-3154452 |
| yafB基因 | DyafBFDyafBR | N°39N°40 | 229167-229245229966-229887 |
| ydhF基因 | DydhFFDydhFR | N°41N°42 | 1722760-17228401723656-1723576 |
| ycdW基因 | DycdWFDycdWR | N°43N°44 | 1097074-10971501098047-1097969 |
| gapA启动子(Ptrc16-gapA) | Ptrc-gapAFPtrc-gapAR | N°45N°46 | 1860478-18605361860762-1860800 |
| edd和eda基因 | DeddFDedaR | N°47N°48 | 1932582-19325011930144-1930223 |
| gloA基因 | GLOAD fGLOA D R | N°49N°50 | 1725861-17259401726268-1726189 |
| pykA基因 | DpykAFDpykΔR | N°51N°52 | 1935756-19358361937055-1937135 |
| pykF基因 | DpykFFDpykFR | N°53N°54 | 1753689-17537661755129-1755051 |
c)修饰菌株大肠杆菌MG1655 lpd*，ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ΔldhA，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，Δedd，ΔyqhD的构建
通过使用操作规程2中所述技术，用表3中给出的寡核苷酸插入卡那霉素抗生素抗性盒并缺失相关基因的大部分而使菌株大肠杆菌MG1655 lpd*，ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ΔldhA::cm，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，Δedd中的yqhD基因失活。
将得到的菌株命名为大肠杆菌MG1655 lpd*，ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ΔldhA::cm，ΔgloA，ΔldA，ΔaldB，Δedd，ΔyqhD::km。
使用表2中给出的寡核苷酸检查菌株中的其他修饰。
然后根据操作规程1消除氯霉素和卡那霉素抗性盒。
将获得的菌株命名为大肠杆菌MG1655 lpd*，ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ΔldhA，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，Δedd，ΔyqhD。
d)修饰菌株大肠杆菌MG1655lpd*，ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ΔldhA，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，Δedd，ΔyafB的构建
通过使用操作规程2中所述技术，用表3中给出的寡核苷酸插入卡那霉素抗生素抗性盒并缺失相关基因的大部分而使菌株大肠杆菌MG1655中的yafB基因失活。将得到的菌株命名为大肠杆菌MG1655ΔyafB::km。
通过用噬菌体P1转导的技术，进行由卡那霉素抗性盒进行基因置换而缺失菌株大肠杆菌MG1655 lpd*，ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ΔldhA::cm，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，Δedd中的基因yafB。
操作规程3：用噬菌体P1转导而缺失基因
通过用噬菌体P1转导的技术，由抗性盒(卡那霉素或氯霉素)进行基因置换而缺失受体大肠杆菌菌株中的所选基因。操作规程为两个步骤：(i)用单一基因缺失制备菌株MG1655的噬菌体裂解物和(ii)由这一噬菌体裂解物转导受体菌株。
噬菌体裂解物的制备
-用单一基因缺失的菌株MG1655的100μl过夜培养物接种10ml LB+Cm 30μg/ml+葡萄糖0.2％+CaCl25mM。
-在37℃震荡温育30分钟。
-加入由野生型菌株MG1655制备的100μl噬菌体裂解物P1(约1×109个噬菌体/ml)。
-在37℃震荡3小时直至细胞裂解。
-加入200μl氯仿，并漩涡震荡。
-在4500g离心10分钟，去除细胞碎片。
-将上清液转移至无菌管中，并加入200μl氯仿。
-在4℃保存裂解物。
转导
-将LB培养基中大肠杆菌受体菌株的5ml过夜培养物在1500g离心10分钟。
-将细胞沉淀(pellet)悬浮于2.5ml MgSO4 10mM，CaCl25mM中。
-对照管：100μl细胞
包含单一基因缺失的菌株MG1655的100μl噬菌体P1
-测试管(tube test)：100μl细胞+包含单一基因缺失的菌株MG1655的100μl噬菌体P1
-在30℃无震荡温育30分钟。
-在每个管中加入100μl 1M柠檬酸钠，并漩涡震荡。
-加入1ml LB。
-在37℃震荡温育1小时。
-在7000rpm将管离心3分钟后涂布于LB+Cm 30μg/ml的平板上。
-37℃过夜培养。
然后选择抗生素抗性转化体，并用表1中给出的适当的寡核苷酸，通过PCR分析检查缺失的插入。
用表2中给出的寡核苷酸检查菌株的其他修饰。
将得到的菌株命名为大肠杆菌MG1655lpd*，ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ΔldhA::cm，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，Δedd，ΔyafB::km。
然后根据操作规程1消除氯霉素和卡那霉素抗性盒。
将获得的菌株命名为大肠杆菌MG1655 lpd*，ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ΔldhA，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，Δedd，ΔyafB。
e)修饰菌株大肠杆菌MG1655lpd*，ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ΔldhA，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，Δedd，ΔydhF的构建
通过使用操作规程2中所述技术，用表3中给出的寡核苷酸插入卡那霉素抗生素抗性盒并缺失相关基因的大部分而使菌株大肠杆菌MG1655 lpd*，ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ΔldhA::cm，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，Δedd中的基因ydhF失活。将得到的菌株命名为大肠杆菌MG1655 lpd*，ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ΔldhA::cm，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，Δedd，ΔydhF::km。
用表2中给出的寡核苷酸检查菌株中的其他修饰。
根据操作规程1消除氯霉素或卡那霉素抗性盒。
将获得的菌株命名为大肠杆菌MG1655 lpd*，ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ΔldhA，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，Δedd，ΔydhF。
f)修饰菌株大肠杆菌MG1655 lpd*，ΔtpiA，ΔplfAB，ΔadhE，ΔldhA，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，Δedd，ΔycdW的构建
通过使用操作规程2中所述技术，用表3中给出的寡核苷酸插入卡那霉素抗性盒并缺失相关基因的大部分而使菌株大肠杆菌MG1655中的ydhW基因失活。将得到的菌株命名为大肠杆菌MG1655ΔycdW::km。
使用操作规程3中所述噬菌体P1转导技术，由卡那霉素抗性盒进行基因置换而缺失菌株大肠杆菌MG1655 lpd*，ΔtpiA，ΔplfAB，ΔadhE，ΔldhA::cm，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，Δedd中的基因ycdW。
由菌株MG1655ΔycdW::km获得噬菌体P1的裂解物，并使用这种噬菌体裂解物转导菌株大肠杆菌MG1655 lpd*，ΔtpiA，.ΔplfAB，ΔadhE，ΔldhA::cm，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，Δedd。
将得到的菌株命名为大肠杆菌MG1655 lpd*，ΔtpiA，.ΔpflAB，ΔadhE，ΔldhA::cm，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，Δedd，ΔycdW::km。
用表2中给出的寡核苷酸检查菌株的其他修饰。
然后根据操作规程1消除氯霉素和卡那霉素抗性盒。
将获得的菌株命名为大肠杆菌MG1655 lpd*，ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ΔldhA::cm，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，Δedd，ΔydcW。
f)在编码已鉴别的丙酮醛还原酶的基因中包含缺失的菌株的培养
在微需氧条件下，在MPG培养基中，在pH 6.7和37℃，在锥形瓶中培养携带缺失ΔyqhD、ΔyafB、ΔydhF和ΔycdW的四株菌株。
在培养72h后，通过HPLC测定培养物上清液中的丙酮醇和1，2-丙二醇的产量。结果示于表4中。
表4：在编码丙酮醛还原酶的基因中包含缺失的菌株的1，2-丙二醇和丙酮醇生产(每个数值是来自两次不同培养的两个数值的平均值)
| 产物(mM) | ΔydhF菌株 | ΔycdW菌株 | ΔyafB菌株 | ΔyqhD菌株 | 对照菌株 |
| 1，2-丙二醇 | 10.7 | 16.3 | 8.1 | 0 | 16.7 |
| 丙酮醇 | 9.3 | 11.1 | 7.2 | 0 | 11.3 |
| 总和 | 20.0 | 27.4 | 15.3 | 0 | 28.0 |
结果显示，鉴别的所有丙酮醛还原酶都涉及丙酮醛变为丙酮醇和进一步变为1，2-丙二醇的转化。yqhD的缺失导致强的生长抑制，这可能是由于丙酮醛的积累而引起的。yafB和ydhF的缺失也对丙酮醇和1，2-丙二醇的产生具有大的影响。
实施例3：大肠杆菌MG1655(pME101VB01-yqhD-mgsA-gldA)、大肠杆菌MG1655(pME101VB01-yafB-mgsA-gldA)和大肠杆菌MG1655(pME101VB01-yqhE-mgsA-gldA)的修饰菌株的构建
为了增加1，2-丙二醇的产生，使用trc启动子由质粒pME101VB01表达不同组合的基因。
a)质粒pME101VB01的构建
质粒pME101VB01衍生自质粒pME101，并且携带多克隆位点，其中包含对下述罕见限制性内切酶特异性的识别位点序列：NheI、SnaBI、PacI、BglII、AvrII、SacII和AgeI，然后是丙酮丁醇梭菌ATCC824的adc转录终止子。
为了由低拷贝载体表达，如下构建质粒pME101：使用寡核苷酸PME101F和PME101R PCR扩增质粒pCL1920(Lerner和Inouye，1990，NAR 18，15p4631-GenBank AX085428)，并将来自携带lacI基因和trc启动子的载体pTrc99A(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，N.J)的BstZ 17I-XmnI片段插入扩增的载体中。
PME101F(SEQ ID NO 55)：
ccgacagtaagacgggtaagcctg
PME101R(SEQ ID NO 56)：
agcttagtaaagccctcgctag
使用合成的双链核酸接头产生pME101VB01，所述接头包含多克隆位点和adc转录终止子。将两个互补的100个碱基的寡核苷酸退火，所述寡核苷酸的侧翼为用NcoI和HindIII消化的限制性位点。将100个碱基对的产物亚克隆进用NcoI/HindIII消化的质粒pME101，以产生pME101VB01。
pME101VB011，由100个碱基组成(SEQ ID NO：57)
catgggctagctacgtattaattaaagatctcctagggagctcaccggtTAAAAATAAGAGTTACCTTAAATGGTAACTCTTATTTTTTTAggcgcgcca
pME101VB012，由100个碱基组成(SEQ ID NO：58)
agcttggcgcgccTAAAAAAATAAGAGTTACCATTTAAGGTAACTCTTATTTTTAaccggtgagctccctaggagatctttaattaatacgtagctagcc
具有：
-对应于多克隆位点的区域(带下划线的小写字母)
-对应于丙酮丁醇梭菌ATCC 824pSOL1(NC_001988)的adc转录终止子(序列179848至179814)的区域(大写字母)。
b)用于表达1，2-丙二醇的生物合成途径中基因的不同组合的质粒(pME101VB01-yqhD-mgsA-gldA、pME101VB01-yafB-mgsA-gldA和pME101VB01-yqhE-mgsA-gldA)的构建
使用表1中给出的寡核苷酸从基因组大肠杆菌MG1655PCR扩增不同的基因。
表5.用于扩增1，2-丙二醇途径的基因的寡核苷酸
| 基因名称 | 寡核苷酸名称 | SEQ ID | 与基因同源的区域 | 限制性位点 |
| yqhD | yqhDR2yqhDF2 | N°59N°60 | 3153369-31534003154544-3154475 | 加入BspHI去除BspHI加入NheI |
| mgsA | mgsAFmgsAR | N°61N°62 | 1026268-10262481025780-1025800 | 加入SnaBI加入BglII |
| gldA | gldAFgldAR | N°63N°64 | 4136631-41366124135512-4135530 | 加入AvrII加入SacI |
| yafB | yafB F2yafB R | N°65N°66 | 229167-229190229970-229950 | 加入NcoI加入NheI |
| yqhE | yqhE FyqhE R | N°67N°68 | 3154641-31546613155464-3155444 | 加入NcoI加入NheI |
用表5中所述限制性酶剪切PCR扩增的片段，并克隆进质粒pME101VB01的限制性位点。构建下述质粒：pME101VB01-yqhD-mgsA-gldA、pME101VB01-yafB-mgsA-gldA和pME101VB01-yqhE-mgsA-gldA。
然后将质粒导入菌株大肠杆菌MG1655。
实施例4：能以高产量产生1，2-丙二醇的大肠杆菌MG1655 Ptrc16-gapA，Δedd-eda，ΔgloA，ΔpykA，ΔpykF(pME101VB01-yqhD-mgsA-gldA)，(pJB137-PgapA-ppsA)、大肠杆菌MG1655 Ptrc16-gapA，Δedd-eda，ΔgloA，ΔpykA，ΔpykF(pME101VB01-yafB-mgsA-gldA)，(pJB137-PgapA-ppsA)和大肠杆菌MG1655Ptrc16-gapA，Δedd-eda，ΔgloA，ΔpykA，ΔpykF(pME101VB01-yqhE-mgsA-gldA)，(pJB137-PgapA-ppsA)的修饰菌株的构建
使用操作规程2中所述的技术，用表3中给出的寡核苷酸，用FRT-CmR-FRT和工程改造的启动子替代225bp的上游gapA序列，从而用合成的短Ptrc16启动子(SEQ ID NO 69：gagctgttgacgattaatcatccggctcgaataatgtgtgg)替代菌株大肠杆菌MG1655中的天然gapA启动子。
用表2中给出的寡核苷酸，通过PCR分析检查抗性盒的插入。
将得到的菌株命名为大肠杆菌MG1655 Ptrc16--gapA::cm。
使用操作规程2中所述技术，用表3给出的寡核苷酸，通过插入卡那霉素抗生素抗性盒和缺失相关基因的大部分而使菌株大肠杆菌MG1655中的基因edd-eda失活。将获得的菌株命名为大肠杆菌MG1655Δedd-eda::km。
根据操作规程3，将缺失转移进菌株大肠杆菌MG1655Ptrc16-gapA::cm。
将得到的菌株命名为大肠杆菌MG1655Ptrc16-gapA::cm，Δedd-eda::km。
然后根据操作规程1消除抗生素抗性盒。
根据操作规程2，用表3中给出的寡核苷酸，构建菌株MG1655ΔgloA::cm，并根据操作规程3将缺失转移进先前构建的菌株中。将得到的菌株命名为大肠杆菌MG1655Ptrc16-gapA，Δedd-eda，ΔgloA::cm。
根据操作规程2中所述技术，用表3给出的寡核苷酸，通过插入卡那霉素抗生素抗性盒和缺失相关基因的大部分而使先前的菌株中的基因pykA失活。将得到的菌株命名为大肠杆菌MG1655Ptrc16-gapA，Δedd-eda，ΔgloA::cm，ΔpykA::km。
然后根据操作规程1消除抗生素抗性盒。
根据操作规程2中所述技术，用表3给出的寡核苷酸，通过插入氯霉素抗生素抗性盒而使基因pykF失活。将得到的菌株命名为大肠杆菌MG1655Ptrc16-gapA，Δedd-eda，ΔgloA，ΔpykA，ΔpykF::cm。
然后根据操作规程1消除抗生素抗性盒。
在每个步骤，使用表3中给出的寡核苷酸检查先前构建的所有缺失是否存在。
为了增加磷酸烯醇丙酮酸的产生，使用gapA启动子由质粒pJB137表达ppsA基因。为了构建质粒pJB137-PgapA-ppsA，使用下述寡核苷酸从大肠杆菌MG1655的基因组DNA PCR扩增基因ppsA。
1.gapA-ppsAF，由65个碱基组成(SEQ ID NO：70)
ccttttattcactaacaaatagctggtggaatatATGTCCAACAATGGCTCGTCACCGCTGGTGC
具有：
-与基因ppsA(1785136至1782758)的序列(1785106-1785136)同源的区域(大写字母)，网站http://genolist.pasteur.fr/Colibri/上的参照序列，和
-与gapA启动子(1860794-1860761)同源的区域(小写字母)
2.ppsAR，由43个碱基组成(SEQ ID NO：71)
aatcgcaagcttGAATCCGGTTATTTCTTCAGTTCAGCCAGGC
具有：
-与基因ppsA(1785136至1782758)的区域的序列(1782758-1782780)同源的区域(大写字母)
-限制性位点HindIII(带下划线的字母)
同时使用下述寡核苷酸扩增大肠杆菌基因gapA的gapA启动子区域：
1.gapA-ppsAR，由65个碱基组成(SEQ ID NO：72)
GCACCAGCGGTGACGAGCCATTGTTGGACATatattccaccagctatttgttagtgaataaaagg
具有：
-与基因ppsA(1785136至1782758)的序列(1785106-1785136)同源的区域(大写字母)，和
-与gapA启动子(1860794-1860761)同源的区域(小写字母)。
2.gapAF，由33个碱基组成(SEQ ID NO：73)
ACGTCCCGGGcaagcccaaaggaagagtgaggc
具有：
-与gapA启动子(1860639-1860661)同源的区域(小写字母)。
-限制性位点SmaI(带下划线的字母)
然后使用寡核苷酸ppsAR和gapAF将两个片段融合(Horton等，1989Gene77：61-68)。用限制性酶HindIII和SmaI剪切PCR扩增的片段，并克隆进载体pJB137(EMBL登录号U75326)的HindIII/SmaI位点，得到载体pJB137-PgapA-ppsA。
将不同的pME101VB01质粒和pJB137-PgapA-ppsA导入菌株大肠杆菌MG1655Ptrc16-gapA，Δedd-eda，ΔgloA，ΔpykA，ΔpykF。将获得的菌株分别命名为大肠杆菌MG1655Ptrc16-gapA，Δedd-eda，ΔgloA，ΔpykA，ΔpykF，pME101VB01-yqhD-mgsA-gldA，pJB137-PgapA-ppsA(菌株1)，大肠杆菌MG1655 Ptrc16-gapA，Δedd-eda，ΔgloA，ΔpykA，ΔpykF，pME101VB01-yafB-mgsA-gldA，pJB137-PgapA-ppsA(菌株2)和大肠杆菌MG1655 Ptrc16-gapA，Δedd-eda，ΔgloA，ΔpykA，ΔpykF，pME101VB01-yqhE-mgsA-gldA，pJB137-PgapA-ppsA(菌株3)。
实施例5：在需氧条件下不同菌株1，2-丙二醇生产的比较。
在需氧条件下，在锥形瓶实验中，在以葡萄糖作为碳源的基本培养基中培养如实施例4中所述获得的菌株(菌株1、2和3)和对照菌株(对照1：MG1655pME101VB01-yqhD-mgsA-gldA，对照2：MG1655 pME101VB01-yafB-mgsA-gldA，对照3：MG1655pME101VB01-yqhE-mgsA-gldA和对照4：MG1655Ptrc16-gapA，Δedd-eda，ΔgloA，ΔpykA，ΔpykF)。在34℃或37℃进行培养，并通过用MOPS缓冲培养基而保持pH。在培养结束时，通过HPLC分析发酵液中的1，2-丙二醇、丙酮醇和残余的葡萄糖，并计算1，2-丙二醇对葡萄糖的得率和1，2-丙二醇+丙酮醇对葡萄糖的得率。
| 菌株 | 1，2-丙二醇效价(g/l) | 丙酮醇效价(g/l) | 1，2-丙二醇得率(g/g葡萄糖) | 1，2-丙二醇+丙酮醇得率(g/g葡萄糖) |
| 对照1 | 0.02 | 0 | 0.004 | 0.004 |
| 对照2 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 对照3 | 0.01 | 0 | 0.002 | 0.002 |
| 对照4 | 0.05 | 0.34 | 0 | 0.04 |
| 菌株1 | 2.25 | 1.40 | 0.14 | 0.23 |
| 菌株2 | 1.64 | 1.31 | 0.10 | 0.18 |
| 菌株3 | 0.77 | 0.47 | 0.06 | 0.10 |
序列表
<110>代谢探索者公司(METABOLIC EXPLORER)
<120>用于产生1，2-丙二醇和丙酮醇的微生物和方法
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<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>1
ggtgatgata gttatcgccg 20
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>2
cgtgccatcg acagcagtcc 20
<210>3
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>3
agacattaaa aatatacgtg cagctacccg 30
<210>4
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>4
gtgaaagctg acaacccttt tgatctttta 30
<210>5
<211>22
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>5
ggctcattgc accaccatcc ag 22
<210>6
<211>24
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>6
gaaaagacgc gctgacaata cgcc 24
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>7
gccatcagca ggcttagccg 20
<210>8
<211>23
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>8
gggtattgtg gcatgtttaa ccg 23
<210>9
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>9
gaagtggtcg atgccgggat tgaagaatgg g 31
<210>10
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>10
gggttacgttt cagtgaggc gcgttctgcg g 31
<210>11
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>11
tgcagcggcg cacgatggcg acgttccgcc g 31
<210>12
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>12
cacgatgacg accattcatg cctatactgg c 31
<210>13
<211>40
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>13
catatttccc tcaaagaata taaaaaagaa caattaacgc 40
<210>14
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>14
tatgttcatg cgatggcgca ccagctgggc g 31
<210>15
<211>24
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>15
ccccggaatc agaggaatag tccc 24
<210>16
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>16
gggtagactc cattactgag gcgtgggcg 29
<210>17
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>特异性引物
<400>17
gccatcagca ggcttagcgc 20
<210>18
<211>23
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>特异性引物
<400>18
gggtattgtg gcatgtttaa ccg 23
<210>19
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>特异性引物
<400>19
ggcgtctcgc catacaacaa acgcacatcg ggc 33
<210>20
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>特异性引物
<400>20
gggctttgcc gacaccttct tcgttcttg 29
<210>21
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>特异性引物
<400>21
cctgacccca tgccgaactc 20
<210>22
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>特异性引物
<400>22
cccgcttccc tcaatacctg g 21
<210>23
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>特异性引物
<400>23
gtggatcaag atgcccgcct gcggattccg 30
<210>24
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>特异性引物
<400>24
cccgtccaga gcccgtgccg gggaatttgc c 31
<210>25
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>特异性引物
<400>25
ggcggtgagg gggggattcg 20
<210>26
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>特异性引物
<400>26
ccccatcaac cactcgcggc c 21
<210>27
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>特异性引物
<400>27
gccacagccg gaatcatact tggtttggg 29
<210>28
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>特异性引物
<400>28
cgtcaacacc aacttcgtcc catttcagg 29
<210>29
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>29
gggtagactc cattactgag gcgtgggcg 29
<210>30
<211>24
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>30
ccacatgata ccgggatggt gacg 24
<210>31
<211>23
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>31
ggcaattacc ctcgacgtac cgg 23
<210>32
<211>25
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>32
ccgatggatg atctgttaga ggcgg 25
<210>33
<211>23
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>33
ggcaattacc ctcgacgtac cgg 23
<210>34
<211>25
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>34
ccgcctctaa cagatcatcc atcgg 25
<210>35
<211>100
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>特异性引物
<400>35
gaaactcgcc gtttatagca caaaacagta cgacaagaag tacctgcaac aggtgaacga 60
gtcctttggc tttgagctgg tgtaggctgg agctgcttcg 100
<210>36
<211>101
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>特异性引物
<400>36
ttaaaccagt tcgttcgggc aggtttcgcc tttttccaga ttgcttaagt tttgcagcgt 60
agtctgagaa atactggtca gcatatgaat atcctcctta g 101
<210>37
<211>100
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>特异性引物
<400>37
atgaacaact ttaatctgca caccccaacc cgcattctgt ttggtaaagg cgcaatcgct 60
ggtttacgcg aacaaattcc tgtaggctgg agctgcttcg 100
<210>38
<211>101
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>特异性引物
<400>38
ttagcgggcg gcttcgtata tacggcggct gacatccaac gtaatgtcat gattttcgcc 60
cagttgggtc atgccgtgct ccatatgaat atcctcctta g 101
<210>39
<211>99
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>特异性引物
<400>39
atggctatcc ctgcatttgg tttaggtact ttccgtctga aagacgacgt tgttatttca 60
tctgtgataa cggcgcttgt gtaggctgga gctgcttcg 99
<210>40
<211>100
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>特异性引物
<400>40
tcccattcag gagccagacc ttccgggcta accaggcggt cgttgcaatc cagtgcggcg 60
atcgcttttt tatcttcggc catatgaata tcctccttag 100
<210>41
<211>101
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>特异性引物
<400>41
ttacggtacg tcgtacccca gtgccgcttt acggatacga aaccattgtt gacgggtcat 60
tttcagtgtt tctgcttcga ctgtaggctg gagctgcttc g 101
<210>42
<211>101
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>特异性引物
<400>42
atggttcagc gtattactat tgcgccgcaa ggcccggagt tttcccgttt tgtgatgggc 60
tactggcgat tgatggactg gcatatgaat atcctcctta g 101
<210>43
<211>101
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>特异性引物
<400>43
atgagaataa atttcgcaca acgcttttcg ggagtcagta tggatatcat cttttatcac 60
ccaacgttcg atacccaatg gtgtaggctg gagctgcttc g 101
<210>44
<211>99
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>特异性引物
<400>44
ttagtagccg cgtgcgcggt cgacttgccc gcagaccctc tccccttttt cgagctgggc 60
aatggtgcga gaaatgtacc atatgaatat cctccttag 99
<210>45
<211>100
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>特异性引物
<400>45
agtcatatat tccaccagct atttgttagt gaataaaagc cacacattat tcgagccgga 60
tgattaatag tcaacagctc tgtaggctgg agctgcttcg 100
<210>46
<211>79
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>特异性引物
<400>46
gctcacatta cgtgactgat tctaacaaaa cattaacacc aactggcaaa attttgtccc 60
atatgaatat cctccttag 79
<210>47
<211>102
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>47
cgcgcgagac tcgctctgct tatctcgccc ggatagaaca agcgaaaact tcgaccgttc 60
atcgttcgca gttggcatgc ggtgtaggct ggagctgctt cg 102
<210>48
<211>100
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>48
gcttagcgcc ttctacagct tcacgcgcca gcttagtaat gcggtcgtaa tcgcccgctt 60
ccagcgcatc tgccggaacc catatgaata tcctccttag 100
<210>49
<211>101
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>特异性引物
<400>49
atgcgtcttc ttcataccat gctgcgcgtt ggcgatttgc aacgctccat cgatttttat 60
accaaagtgc tgggcatgaa gtgtaggctg gagctgcttc g 101
<210>50
<211>100
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>特异性引物
<400>50
ttagttgccc agaccgcgac cggcgtcttt ctcttcgatt aactcaattt tgtaaccgtc 60
cggatcttcc acaaacgcga catatgaata tcctccttag 100
<210>51
<211>101
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>51
cgcggcgggt gccaacgttg tacgtatgaa cttttctcac ggctcgcctg aagatcacaa 60
aatgcgcgcg gataaagttc gtgtaggctg gagctgcttc g 101
<210>52
<211>101
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>52
cgccgcatcc ggcaacgtac ttactctacc gttaaaatac gcgtggtatt agtagaaccc 60
acggtactca tcacgtcgcc ccatatgaat atcctcctta g 101
<210>53
<211>101
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>53
cgcggcgggt gccaacgttg tacgtatgaa cttttctcac ggctcgcctg aagatcacaa 60
aatgcgcgcg gataaagttc gtgtaggctg gagctgcttc g 101
<210>54
<211>101
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>54
cgccgcatcc ggcaacgtac ttactctacc gttaaaatac gcgtggtatt agtagaaccc 60
acggtactca tcacgtcgcc ccatatgaat atcctcctta g 101
<210>55
<211>24
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>特异性引物
<400>55
ccgacagtaa gacgggtaag cctg 24
<210>56
<211>22
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>特异性引物
<400>56
agcttagtaa agccctcgct ag 22
<210>57
<211>100
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>特异性引物
<400>57
catgggctag ctacgtatta attaaagatc tcctagggag ctcaccggtt aaaaataaga 60
gttaccttaa atggtaactc ttattttttt aggcgcgcca 100
<210>58
<211>100
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>特异性引物
<400>58
agcttggcgc gcctaaaaaa ataagagtta ccatttaagg taactcttat ttttaaccgg 60
tgagctccct aggagatctt taattaatac gtagctagcc 100
<210>59
<211>79
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>特异性引物
<400>59
ctagctagcg gcgtaaaaag cttagcgggc ggcttcgtat atacggcggc tgacatccaa 60
cgtaatgtcg tgattttcg 79
<210>60
<211>43
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>特异性引物
<400>60
cgatgcacgt catgaacaac tttaatctgc acaccccaac ccg 43
<210>61
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>特异性引物
<400>61
cgtacgtact gtaggaaagt taactacgg 29
<210>62
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>特异性引物
<400>62
gaagatcttt acttcagacg gtccgcgag 29
<210>63
<211>28
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>特异性引物
<400>63
gacctaggct ctaaaggagc aattatgg 28
<210>64
<211>26
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>特异性引物
<400>64
cgagctctta ttcccactct tgcagg 26
<210>65
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>65
catgccatgg ctatccctgc atttggttta 30
<210>66
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>66
ctagctagct taatcccatt caggagccag 30
<210>67
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>67
catgccatgg ctaatccaac cgttattaag c 31
<210>68
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>68
ctagctagct tagccgccga actggtcagg 30
<210>69
<211>41
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成的启动子
<400>69
gagctgttga cgattaatca tccggctcga ataatgtgtg g 41
<210>70
<211>65
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>70
ccttttattc actaacaaat agctggtgga atatatgtcc aacaatggct cgtcaccgct 60
ggtgc 65
<210>71
<211>43
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>71
aatcgcaagc ttgaatccgg ttatttcttc agttcagcca ggc 43
<210>72
<211>65
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>72
gcaccagcgg tgacgagcca ttgttggaca tatattccac cagctatttg ttagtgaata 60
aaagg 65
<210>73
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>73
acgtcccggg caagcccaaa ggaagagtga ggc 33
Claims (50)
1.用于由碳源产生1，2-丙二醇和/或丙酮醇的修饰的微生物，其中所述微生物以增加的丙酮醛还原酶活性为特征，所述酶由来自微生物的一个或多个基因编码。
2.权利要求1的微生物，其中与相应的未修饰的微生物的丙酮醛还原酶活性相比，丙酮醛还原酶活性增加至少50％，优选至少100％。
3.根据权利要求1或2中任一项的微生物，其中通过过表达与丙酮醛还原有关的至少一个基因而增加丙酮醛还原酶活性。
4.权利要求3的微生物，其中通过将与丙酮醛还原有关的基因之一的天然启动子替代为诱导所述基因的更强表达水平的启动子而获得过表达。
5.权利要求3的微生物，其中通过将与丙酮醛还原有关的至少一个基因的多个拷贝导入微生物而获得过表达。
6.根据权利要求3-5中任一项的微生物，其中下述基因中至少一个过表达：yqhD、yafB、ydhF、ycdW、yqhE、yeaE、yghZ、yajO、tas、ydjG和ydbC。
7.根据权利要求1-6中任一项的微生物，其中丙酮醛合酶活性增加。
8.权利要求7的微生物，其中mgsA基因的表达增加。
9.权利要求7的微生物，其中mgsA基因包含特定突变。
10.根据权利要求1-9中任一项的微生物，其中与Entner-Doudoroff途径有关的至少一个酶的活性被削弱。
11.权利要求10的微生物，其中下述基因中至少一个的表达被削弱：edd、eda。
12.根据权利要求1至11中任一项的微生物，其中与丙酮醛转化成乳酸有关的至少一个酶的活性被削弱。
13.根据权利要求12的微生物，其中下述基因中至少一个的表达被削弱：gloA、aldA、aldB。
14.根据权利要求1至13中任一项的微生物，其中与乳酸、甲酸或乙醇合成有关的至少一个酶的活性被削弱。
15.根据权利要求14的微生物，其中下述基因中至少一个的表达被削弱：ldhA、pflA、pflB、adhE。
16.根据权利要求1至15中任一项的微生物，其中涉及乙酸合成的至少一个酶的活性被削弱。
17.根据权利要求16的微生物，其中下述基因中的至少一个的表达被削弱：ackA、pta、poxB。
18.根据权利要求1至17中任一项的微生物，其中磷酸丙糖异构酶的活性被削弱。
19.权利要求18的微生物，其中tpiA基因的表达被削弱。
20.根据权利要求1至17中任一项的微生物，其中3-磷酸甘油醛脱氢酶活性被削弱。
21.权利要求20的微生物，其中gapA基因的表达被削弱。
22.根据权利要求20或21的微生物，其中糖输入的效率增加。
23.根据权利要求22的微生物，其中使用不依赖磷酸烯醇丙酮酸的糖输入系统。
24.根据权利要求23的微生物，其中选自galP和glk中至少一个基因的表达增加。
25.根据权利要求20或21的微生物，其中通过增加代谢物“磷酸烯醇丙酮酸”的可用性来改进糖-磷酸转移酶系统的效率。
26.权利要求25的微生物，其中至少一种丙酮酸激酶的活性被削弱。
27.根据权利要求26的微生物，选自pykA和pykF中至少一个基因的表达被削弱。
28.权利要求25至27中任一项的微生物，其中磷酸烯醇丙酮酸合酶活性增加。
29.权利要求28的微生物，其中ppsA基因的表达增加。
30.根据权利要求1至29中任一项的微生物，其中甘油脱氢酶活性增加。
31.权利要求30的微生物，其中gldA基因的表达增加。
32.根据权利要求1至31中任一项的微生物，其中1，2-丙二醇氧化还原酶活性增加。
33.权利要求32的微生物，其中fucO基因的表达增加。
34.根据权利要求1至33中任一项的微生物，其中利于将丙酮酸代谢成乙酰-CoA的酶对NADH的抑制的敏感性低于未修饰的酶。
35.根据权利要求34的微生物，其中lpd基因具有导致丙氨酸55被缬氨酸替代的点突变。
36.根据权利要求1至35中任一项的微生物，其中选自arcA和ndh中的至少一个基因的表达被削弱。
37.根据权利要求1至36中任一项的微生物，其中微生物选自下组：细菌、酵母和真菌。
38.权利要求37的微生物，其中微生物选自下组：肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、芽孢杆菌科(Bacillaceae)、梭菌科(Clostridiaceae)、链霉菌科(Streptomycetaceae)和棒杆菌科(Corynebacteriaceae)。
39.权利要求38的微生物，其中微生物是大肠杆菌(Escherichia coli)或丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)。
40.根据权利要求1至29中任一项的微生物，其中丙酮醇变为1，2-丙二醇的转化中涉及的至少一个酶的活性被削弱。
41.权利要求40的微生物，其中gldA基因的表达被削弱。
42.根据权利要求40或41的微生物，其中微生物选自下组：细菌、酵母和真菌。
43.权利要求42的微生物，其中微生物选自下组：肠杆菌科、芽孢杆菌科、链霉菌科和棒杆菌科。
44.权利要求43的微生物，其中微生物是大肠杆菌或肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)。
45.用于制备1，2-丙二醇的方法，其中将根据权利要求1至39中任一项的微生物在包含碳源的适当生长培养基中培养，并回收产生的1，2-丙二醇。
46.根据权利要求45的方法，其中微生物来自大肠杆菌菌种，并且碳源是简单碳源。
47.根据权利要求45的方法，其中微生物来自丙酮丁醇梭菌菌种，并且碳源是复杂碳源。
48.根据权利要求45至47中任一项的方法，其中将回收的1，2-丙二醇进一步纯化。
49.用于制备丙酮醇的方法，其中将根据权利要求1至29或40至44中任一项的微生物在包含简单碳源的适当生长培养基中培养，并回收产生的丙酮醇。
50.根据权利要求49的方法，其中将回收的丙酮醇进一步纯化。
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