KR101390085B1

KR101390085B1 - 글리세롤의 혐기성 발효

Info

Publication number: KR101390085B1
Application number: KR1020087023806A
Authority: KR
Inventors: 라몬 곤잘레즈
Original assignee: 라이스 유니버시티
Priority date: 2006-03-31
Filing date: 2007-03-30
Publication date: 2014-04-28
Also published as: CN101415830A; EP2002009A4; JP2012245012A; JP2009532037A; WO2007115228A2; CN101415830B; KR20080109787A; BRPI0709679B1; US20120107885A1; EP2002009A2; US8129157B2; MY146904A; WO2007115228B1; US20090186392A1; US8334119B2; WO2007115228A3; JP5242550B2; BRPI0709679A2

Abstract

본 발명은 세균이 글리세롤 기질 상에서 혐기적으로(발효에 의해) 성장하기에 적절한 배양 조건의 개발에 관한 것이다. 본 방법은 기능적 1,2-프로판디올 경로 및 기능적 II형 글리세롤 탈수소효소-디히드록시아세톤 키나제 경로를 갖는 세균을 높은 농도의 글리세롤, 중성 내지 약산성의 pH, 낮은 수준의 칼륨 및 인산염, 및 높은 수준의 CO₂를 함유하는 배양 배지에서 배양하여 글리세롤을 바람직한 생성물, 예컨대 에탄올, 수소, 포름산염, 숙신산염 또는 1,2-프로판디올로 전환시키는 것을 필요로 한다.

혐기 발효, 글리세롤, HA

Description

글리세롤의 혐기성 발효{ANAEROBIC FERMENTATION OF GLYCEROL}

종래 관련 출원

본 출원은 각기 전체적으로 본원에 참조 인용되는 종래 미국 가출원 제60/788,512호(2006년 3월 31일 출원) 및 제60/867,581호(2006년 11월 28일 출원)에 대한 우선권을 주장한다.

미연방 지원 연구에 관한 진술

본 발명은 부분적으로 정부 기금에 의해 지원을 받았을 수 있으며, 미정부는 본 발명에 있어 특정 권리를 가질 수 있다.

마이크로피시(microfiche) 부록에 대한 설명

해당없음

기술분야

본 발명은 세균이 글리세롤 기질 상에서 발효에 의해(즉, 전자 수용체의 부재 하에) 성장하기에 적절한 배양 조건의 개발에 관한 것이다. 본 발명은 특히 글리세롤을 보다 높은 가치의 생성물, 예컨대 에탄올, 수소, 포름산염, 숙신산염 및 1,2-프로판디올로 전환시킬 수 있는 방법 및 균주의 개발을 위한 용도를 가진다.

바이오디젤 생산에서 다량의 글리세롤이 부산물로서 생성되고, 글리세롤의 생산은 바이오디젤 생산의 거대한 전세계적 성장으로 인해 계속 증가할 것으로 예측된다. 현재 과잉량의 글리세롤로 인해, 이미 지난 2년간 그 가격이 ~10배 감소하게 되었다.

그러므로, 조질의 글리세롤은 부분적 이유로는 그 비용이 저렴하여, 발효 공정을 위한 주목받는 탄소원이 되었다. 글리세롤은 풍부할 뿐만 아니라, 셀룰로스성 당에 비해 더욱 환원된 상태로 있어서, 환원 동등물의 이용가능성에 의해 당으로부터의 생성이 제한되는 화학물질의 생산 수율이 확실하게 상당히 증가하게 된다. 글리세롤 내 탄소의 보다 높은 환원 상태의 장점을 이용함은, 혐기성 발효의 이용을 필요로 하게 된다(즉, 그렇지 않은 경우에는, 전자 수용체가, 연료 또는 환원된 화합물을 포함한 목적 생성물에 "부착"되는 대신에 전자를 "가져가게" 된다). 그러나, 발효 공정에서 글리세롤의 탄소원으로서의 잠재적 용도는 산업용 미생물, 예컨대 에쉐리키아 콜라이(Escherichia coli)(근대 생물과학의 편리 이용물)가 외부 전자 수용체의 부재 하에는 글리세롤을 발효시키지 못함에 의해 저해될 수 있다. 글리세롤 발효 능력은 극소수 유기체에 국한되고, 이들 유기체의 대부분은 병원성, 엄격한 혐기 조건의 필요, 변형을 위한 생리학적 지식 및 유전적 도구의 결여, 및 높은 영양 요건으로 인해 산업적 용도에 순응적이지 않다.

글리세롤은 효소 글리세롤 탈수소효소(GldA, gldA에 의해 코딩됨)에 의해 직접 산화되어, 디히드록시아세톤(DHA)을 발생시킬 수 있다. 그러나, II형 글리세롤 탈수소효소(glyDH-II)로 확인되는 GldA는 야생형 E. 콜라이(E. coli) 균주에서 잠재적(cryptic)이거나 발현되지 않는 것으로 사료된다. E. 콜라이 내 GldA의 활성 화는 glpK, glpR 및 glpD의 불활성화, 및 그에 이은 돌연변이유발 및 선택 절차를 필요로 하였고, 이에 따라 글리세롤을 대사하는 능력을 회복한 돌연변이체 균주가 초래되었다(Jin 등, 1983; Tanh 등, 1982a, b). 그러나, 이 돌연변이체 균주에서도, GldA는 E. 콜라이에게 글리세롤을 발효에 의해 대사하는 능력을 제공하지 않았다(Jin 등, 1983; Tanh 등, 1982a, b).

당업계에 필요한 것은, 전세계적 과잉량의 저렴한 글리세롤을 다른 공급원료 화학물질로 생물학적으로 전환시키는 방법이다. 본 방법은 글리세롤 내 탄소의 보다 높은 환원 상태를 이용하는 혐기성 발효에 기초할 경우, 특히 이로울 것이다. 혐기성 공정은 또한, 그와 상반된 호기성 공정이 보다 높은 자본 투자를 필요로 하고 보다 높은 조작 비용을 필요로 하기 때문에, 비용 이점을 제공하게 된다.

발명의 개시

본 발명자들은 E. 콜라이가 실제로 특정 조건 하에서 전자 수용체의 부재 하에 글리세롤을 발효할 수 있음을 발견하였다. 본 발명자들의 발견은 E. 콜라이 및 다른 장세균에 있어서의 글리세롤 발효를 위한 새 패러다임을 나타내고, 낮은 가치의 원료 글리세롤을 보다 높은 가치의 화학물질 및 연료로 전환시키기 위한 미생물적 기반을 개발할 수 있을 것이다.

pH, CO₂ 농도, 글리세롤 농도, 칼륨 농도, 인산염 농도 및 히드록시아세톤(HA) 농도가 글리세롤을 요망되는 화학적 전구체로 발효 대사하도록 제어되는 글리세롤 발효 방법이 기재되어 있다.

pH가 거의 중성이거나 약한 산성일 때, 향상된 글리세롤 발효가 수득될 수 있다. 한 바람직한 실시양태에서, pH는 5.5 내지 7.5, 더욱 바람직하게는 pH가 6.0 내지 6.5이며, 가장 바람직한 실시양태에서는 pH가 약 6.3이다.

CO₂ 농도는 불가피하게 pH와 연결되고, pH가 증가함에 따라, CO₂가 중탄산 HCO₃ ^-로 전환되기 때문에, 그 농도가 감소되게 된다. CO₂를 20 내지 30%로 증가시킴으로써, pH가 7.0 초과로 증가함에 따른 부정적 영향이 감축될 수 있다. pH 6.3 및 10% CO₂, 및 pH 7.5 및 20% CO₂에서 향상된 글리세롤 발효가 나타났다. 보다 높은 CO₂ 농도도 또한 유익하였다.

글리세롤 내 탄소의 환원 상태가 높은 경우, 산화환원 균형의 유지는, 글리세롤의 균체(cell mass)로의 도입이 환원 동등물의 순(net) 발생을 초래하기 때문에 매우 "까다롭게"된다. H₂는 수가지 반응들에서 전자 공여체로서 작용하고(예를 들어, 푸마르산염 환원효소), 이에 따라 산화환원 균형을 오프셋시킨다. 이는 H₂ 농도가 감소하는 경우에는 일어나지 않고, 글리세롤 발효가 최적으로 진행되게 된다. 상부 공간(headspace)을 증가시킴으로써, H₂를 희석하였고, 글리세롤 발효가 향상되었다. 상부 공간을 불활성 기체 또는 CO₂로 플러슁함으로써, 과잉 H₂를 제거하고, 또한 글리세롤 발효를 증가시킨다. 배양물에 기체를 분사(sparging)하거나 버블링함으로써, 대부분의 H₂를 제거하였고, 최량의 글리세롤 발효 조건을 제공하였다.

글리세롤 공급원료 농도가 높을 때, 예를 들어 5 또는 10 g/L 초과, 또는 심지어는 그 보다 높을 때(25 g/L, 50 g/L, 75 g/L, 100 g/L), 향상된 글리세롤 발효가 수득될 수 있다. 한 바람직한 실시양태에서, 글리세롤 농도는 100 g/L 초과이다.

낮은 칼륨 농도 및 낮은 인산염 농도로 향상된 글리세롤 발효가 수득될 수 있다. 칼륨 농도는 바람직하게 10 mM 미만, 더욱 바람직하게는 5 또는 2 mM 미만, 가장 바람직하게는 0.6 mM 미만이었다. 인산염 농도는 바람직하게 50 mM 미만, 더욱 바람직하게는 25 또는 10 mM 미만이었다. 더욱 바람직하게는 5 mM 미만, 가장 바람직하게는 1.3 mM 미만이었다. 낮은 인산염 및 칼륨은 글리세롤 탈수소효소-디히드록시아세톤 키나제, 및 산화환원-균형 조건을 가능하게 하는 1,2-PDO 경로의 조작을 양호하게 한다.

배양물을 HA(10, 20 또는 30 mM 이상)로 보충함으로써 배양 조건을 더욱 향상시켰다. 배양물을 HA로 보충한 경우, 트립톤 보충은 필요하지 않았다.

한 실시양태에서, CO₂, Ar 또는 N₂를 분사하면서, E. 콜라이를 37℃에서 pH 6.3 하에서의 10 g/L 글리세롤, 0.6 mM 칼륨 및 1.3 mM 인산염과 배양함으로써, 글리세롤 발효를 최적화하였다.

다른 실시양태들에서, 본 발명은 글리세롤을 탄소원으로 이용하여, 요망되는 최종 생성물, 예컨대 숙신산염, 에탄올, 포름산염 또는 수소, 및 1,2-PDO를 합성하는 것과 같은 특정 용도를 위해 사용될 수 있다.

도 1. 2 g/L 트립톤으로 보충된 최소 배지(MM) 내 E. 콜라이 MG1655에 의한 글리세롤 발효. 세포 성장(▲), 글리세롤 소비(■), 및 에탄올 축적(●), 숙신산염 축적(◆) 및 포름산염+아세트산염 축적(

).

도 2. Na⁺, K⁺, PO₄ ^3- 및 글리세롤 농도의 영향. Na⁺(34 mM), K⁺(128 mM) 및 PO₄ ^3-(98 mM)을 표시된 대로 배지에 첨가하였다. 달리 나타내지 않는 한, pH 7.5, 37℃, 10 g/L 글리세롤, 2 g/L 트립톤, 아르곤을 이용한 상부 공간 플러싱 하에 실험을 수행하였다. 글리세롤 발효(선) 및 세포 성장(막대)이 나와 있다: 막대 색상은 pH 6.3(회색) 또는 7.5(백색)를 가리킨다.

도 3. II형 glyDH를 갖는 E. 콜라이 및 기타 장세균 내 글리세롤 발효에 대한 새 패러다임. E. 콜라이에서 글리세롤을 해당(glycolytic) 중간체 DHAP로 전환시키기 위한 제안된 경로는 효소 GldA 및 DHAK로 이루어진다.

도 4. 글리세롤 발효 중의 에탄올(선)-H₂(고체 막대), 및 에탄올(선)-포름산(개방형 막대)의 동시 생성. (I) MG1655: pH 6.3, 아르곤; (II) AhycB: pH 7.5, 아르곤. HycB는 FHL 시스템의 한 필요 성분이다.

도 5. 글리세롤로부터의 숙신산의 생성: (I) MG1655: pH 6.3, 아르곤; (II) MG1655: pH 6.3, 10% CO₂, (III) MG1655: pH 7.5, 20% CO₂; 및 (IV) ΔdhaKLM(pZSKLcf): pH 7.5, 20% CO₂. 플라스미드 pZSKLcf는 C. 프레운디이(C. freundii) DHA 키나제 서브유닛 DhaKL를 발현한다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 세균을 이용하여 글리세롤을 발효시켜, 유용한 화학적 화합물을 생성시키는 신규 방법을 제공한다.

"잠재적(cryptic)" 유전자는 발현하지 않거나 유전자 발현을 위한 조건이 알려져 있지 않은 유전자이다.

"불균화하다(disproportionate)"는 산화시키는 것과 환원시키는 것이다.

본원에 상용되는 용어 "무력화(disruption)" 및 "무력화 균주"는, 본연의(native) 유전자 또는 프로모터가 돌연변이화되거나, 결실되거나, 간섭받거나 그 균주에 의해 코딩되는 효소의 활성을 감소시키는 방식으로 하향 제어되는 세포 균주를 가리킨다. 유전자는 전체 게놈 DNA 서열의 녹아웃 또는 제거에 의해 완전히(100%) 감소된다. 프레임 쉬프트(frame shift) 돌연변이, 조기 정지 코돈, 중요 잔기의 점 돌연변이, 또는 결실 또는 삽입 등의 사용으로, 활성 단백질의 전사 및/또는 번역을 완전히 방지함으로써 유전자 산물을 완전히(100%) 불활성화할 수 있다.

"이화(dissimilation)"은 유기체 물질을 분비된 화합물로 전환시키도록 하는 대사 공정이다.

용어 "외인성"은 단백질 또는 핵산이 기원의 종과 무관하게 유기체 또는 시스템 외로부터 도입된 비본연의(non-native) 분자임을 가리킨다. 예를 들어, 외인성 펩티드는 세포 배양물에 적용될 수 있거나; 외인성 RNA는 트랜스펙션된 재조합 DNA로부터 세포 내로 발현될 수 있거나; 본연의 유전자는 외인성 조절 서열의 제어 하에 있을 수 있다.

"발효"란, 외부 전자 수용체의 완전 부재 하, 즉 산소, 질산염 등의 부재 하에서의 탄소원의 대사 또는 이화를 의미한다.

"기능적 1,2-프로판디올 경로"란, 세균이 하나 이상의 상이한 경로에 의해 1,2-PDO를 만드는 데 필요한 유전자를 기능적으로 발현하는 것 (및 이에 따라 효소를 발현하는 것)을 의미한다. 예를 들어, 기능적 mgsA(메틸글리옥살 합성효소: MGS), yeaE, yghZ 및 yafB 유전자(알도-케토 환원효소: AKR), gldA(글리세롤 탈수소효소, GldA)가 각각 필요하다. 중요 구별점은, 소정의 유기체가 특정 경로의 유전자/효소를 가질 수 있으나, 그 경로가 잠재적이라는 것이다.

"기능적 II형 글리세롤 탈수소효소-디히드록시아세톤 키나제 경로"란, 세균이 글리세롤을 DHA를 경유하여 DHAP로 전환시킴으로써 외부 전자 수용체의 부재 하에 글리세롤로부터 DHA 포스페이트(DHAP)를 만드는 데 필요한 효소를 가짐을 의미한다. 예를 들어, 세균은 활성 GldA(gldA) 및 DHA 키나제(DHAK: dhaKLM)를 가져야 한다.

"기능적 F₀F₁ ATP 합성효소 경로"란, 세포가 ATP 합성을 양성자 펌프와 결부 시키는 데 필요한 효소 모두를 가짐을 의미한다. 예를 들어, 세균은 atpF 및 atpD를 포함한 기능적 atp 오페론을 가져야 한다.

"기능적 포름산염-수소 분해효소(FHL) 경로"란, 세균이 포름산염을 CO₂ 및 수소로 불균화하는 데 필요한 효소 모두, 예를 들어 활성 포름산염 탈수소효소(예를 들어, FDH-F: fdhF) 및 수소화효소 3(hyc 오페론)을 가짐을 의미한다.

"기능적 1,3-프로판디올 경로"란, 1,3-PDO를 만드는 데 필요한 유전자 또는 효소를 의미한다. 예를 들어, 글리세롤 탈수효소(GD) 및/또는 1,3-PDO 환원효소(1,3-PDOR)는 기능적 1,3-프로판디올 경로가 결핍된 세포 내에서 불활성이거나 부재한다.

"글리세롤"은 본원에 참고로 인용되는, NCBI^TM PubChem # 753 및 CAS Reg # 56-81-5에 기재되어 있다.

"과발현됨"이란, 유전자 (또는 단백질)가 야생형에 비해 증가된 활성을 가지도록 변형됨을 의미한다. 이는, 유전자의 더 많은 복사체를 세포에 부가하거나, 억제 서열을 결실시키고자 유전자를 돌연변이화하거나, 억제제를 제거하거나, 단백질을 활성을 증가시키도록 변화시킴으로써, 또는 기타 방법에 의해 행해질 수 있다.

본원에 사용되는 "재조합"은 유전자 조작된 (유전적으로 공학처리된) 물질과 관련되거나, 그 것으로부터 유래되거나, 그것을 함유하는 것이다.

"감소된 활성" 또는 "불활성화하다"는 적절한 대조 종에 비해 단백질 활성이 75% 이상 감소됨으로 본원에서 정의된다. 바람직하게는 활성의 80, 85, 90 또는 95% 이상의 감소가 달성되고, 가장 바람직한 실시양태에서는, 활성이 제거된다(100%). 단백질은 억제제로, 또는 돌연변이에 의해, 또는 발현 또는 번역의 억제에 의해, 또는 기타 방식에 의해 불활성화될 수 있다. "결손(null) 돌연변이체" 또는 "결손 돌연변이"란, 단백질 활성이 완전히 불활성화됨을 의미한다. 한 예에서, 대조 플라스미드는 관심 유전자 없이 삽입된다. 또 다른 예에서, 관심 유전자는 재조합에 의해 완전히 제거된다. 부가적으로, 관심 유전자는 불활성화, 돌연변이화, 또는 활성을 제거하는 절단(truncation)에 의해 제거될 수 있다.

용어 "숙신산염"과 "숙신산", 및 "포름산염"과 "포름산"은 본원에서 상호 혼용된다. 본원에서의 화학물질은 본원에 참조 인용되는 [NATIONAL LIBRARY OF MEDICINE

PUBCHEM^TM 데이터베이스(pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)]에서 찾아볼 수 있다. 세균 대사 경로는 본원에 참조 인용되는 [Principles of Biochemistry 제2판, Lehninger(1993) 저], 및 기타 많은 생화학 참고문헌에서 찾아볼 수 있다.

유전자 및 효소

*유전자*	(약어) 단백질명 (등록 번호)
adhE	아세트알데히드-CoA 탈수소효소(유전자은행 # NP_415757)
atpD	F₀F₁ ATP 합성효소 서브유닛 베타(유전자은행 # NP_418188)
atpF	F₀F₁ ATP 합성효소 서브유닛 B(유전자은행 # NP_418192)
cydA	사이토크롬 D 말단 산화효소, 서브유닛 I(유전자은행 # NP_415261)
cyoB	사이토크롬 D 유비퀴놀 산화효소, 서브유닛 I(유전자은행 # NP_414965)
dhaK	(DHAK) 디히드록시아세톤 키나제 서브유닛 K (유전자은행 # NP 415718의 N-말단 도메인)
dhaK	시트로박터 프레운디이로부터의 (DHAK) 디히드록시아세톤 키나제 서브유닛 I (유전자은행 # AAB48843)
dhaL	(DHAL) 디히드록시아세톤 키나제 서브유닛 L (유전자은행 # NP 415717의 C-말단 도메인)
dhaM	(DHAK) 디히드록시아세톤 키나제 서브유닛 M (NP 415716의 융합 포스포트랜스퍼라제 서브유닛)
fdhF	포름산염 탈수소효소-H, FDH (유전자은행 # NP 418503의 셀레노폴리펩티드 서브유닛)
fixA	(ETF) 전자 전달 플라보단백질(유전자은행 # NP_414583)
frdA	(Frd) 푸마르산염 환원효소(유전자은행 # NP_418578)
fucO	(FucO) L-1,2-프로판디올 산화환원효소(유전자은행 # NP_417279)
gldA	(GDHA) 글리세롤 탈수소효소(유전자은행 # NP_418380)
glpA	혐기성 sn-글리세롤-3-인산염 탈수소효소(유전자은행 # NP_416744)
glpD	호기성 sn-글리세롤-3-인산염 탈수소효소(유전자은행 # NP_417884)
hycB	포름산염 수소 분해효소(FHL) 착물의 수소화효소 3 파트 (유전자은행 # NP 417204의 Fe-S 서브유닛)
mgsA	메틸글리옥살 합성효소(유전자은행 # NP_415483)
pta	인산염 아세틸트랜스퍼라제(유전자은행 # NP_416800)
trkA	칼륨 이온 트랜스포터 외재성 막 성분(유전자은행 # NP417748)
yafB	2,5-디케토-D-글루콘산염 환원효소 B(유전자은행 # NP_414743)
yeaE	알도/케토 환원효소(유전자은행 # NP_754080)
yghZ	알도/케토 환원효소(유전자은행 # NP_417474)
dhaR	(dhaS 또는 dhaR) HTH-형 dhaKLM 오페론 전사 활성화제

실시예 1: 재료 및 방법

본원 전반에 걸쳐, 유전자 무력화 돌연변이체는 하기 명명법을 이용하여 칭해진다: 유전자1의 단일 무력화에 대해서는 Δ유전자1이거나, 이중 무력화에 대해서는 Δ유전자1Δ유전자2임.

야생형 E. 콜라이 K12 균주 MC4100(ATCC 35695), W3110(ATCC 27325), 야생형 E. 콜라이 B(ATCC 11303), 및 장세균 엔테로박터 클로아카에(Enterobacter cloacae) 아종 클로아카에(cloacae) NCDC 279-56(ATCC 13047), 부티아욱셀라 아그 레스티스(Buttiauxella agrestis)(ATCC 33994), 세라티아 플라이무티카(Serratia plymuthica)(ATCC 15928), 및 레미노렐라 리카르디이(Leminorella richardii)(ATCC 33998)를 미국 미생물 보존센터(AMERICAN TYPE CULTURE COLLECION)

에서 입수하였다. 단일 돌연변이체 재조합 균주 Δpta, ΔadhE, ΔcydA, ΔcyoB, ΔfrdA, ΔfixA, ΔglpA, ΔglpD, ΔmgsA, ΔyeaE, ΔyghZ, ΔyafB, ΔfucO, ΔatpF, ΔatpD, ΔpykF 및 ΔhycB는 E. 콜라이 게놈 프로젝트(위스콘신-매디슨 대학, www.genome.wisc.edu)에서 입수하거나, Datsenko 및 Wanner(2000)에 의해 기재된 방법을 이용하여 구축되었다. K12 균주 MG1655(F-람다-ilvG-rfb-50 rph-1)를 유전자 무력화 돌연변이체를 생성시키기 위한 야생형으로 사용하였다. 균주 ΔgldA, ΔdhaKLM 및 ΔfdhF를 MG1655 및 W3110(ATCC 27325) 모두에서 구축하였다. P1 파지 형질도입을 이용하여 단일 돌연변이를 조합함으로써 다유전 무력화를 달성하였다. 카나마이신 카세트를 제거한 후, 한 번에 하나의 돌연변이를 균주에 부가하였다.

플라스미드 pZSKLM(E. 콜라이 DHA 키나제 서브유닛 DhaKLM 발현), 및 pZSKLcf(시트로박터 프레운디이(Citrobacter freundii) DHA 키나제 서브유닛 DhaKL 발현)는 친절하게 B. Erni 박사(스위스 베른 대학(Bachler et al, 2005))에 의해 제공되었다. 효소 DHAK 및 GldA를 발현하는 플라스미드 pZSKLM_gldA는 다음과 같이 구축되었다. 리보좀내 결합 부위와 함께 gldA 유전자의 완전 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 PCR 증폭시켰다. PstI 및 MluI 부위를 프라이머를 통해 PCR 산물의 양 말단에 도입하여, 플라스미드 pSZKLM 내 dhaKLM 오페론의 다운스트 림의 gldA 유전자를 클로닝하는 것을 용이하게 하였다. 플라스미드 및 PCR 산물 모두를 PstI 및 MluI로 절단하고, 결찰시키며, DH5α에서 형질전환하여, 양성 콜로니에 대해 선별하였다. PCR을 통해 또한 코딩된 효소 활성의 특징분석을 통해 플라스미드의 성공적 구축을 입증하였다. 플라스미드를 E. 콜라이 균주로 형질전환하여, 적절한 항생제로 보충된 루리아 베르타니(Luria Bertani)(LB)에서 선택하였다.

클로닝, 플라스미드 단리, 파지 P1 형질도입, 전기천공 및 중합효소 사슬 반응(PCR)(Sambrook et al, 1989)을 위해, 표준 재조합 DNA 절차를 사용하였다. 균주를 -80℃에서 32.5% 글리세롤 스톡 내에 유지시켰다. 1.5% 아가를 함유한 LB 배지를 이용하여 플레이트를 제조하였다. 적절한 경우, 항생제 및 유도물질을 하기 농도로 포함시켰다: 100 ㎍/ml 암피실린, 30 ㎍/ml 클로르암페니콜, 50 ㎍/ml 카나마이신, 및 12.5 ㎍/ml 테트라사이클린, 0.001 내지 0.1 mM IPTG, 및 100 ng/ml 안하이드로테트라사이클린.

달리 명시되지 않는 한, K₂HPO₄ 대신에 0.03 내지 0.2% 트립톤, 5 μM 셀레나이트 및 1.32 mM Na₂HPO₄ 로 보충된 Neidhardt 등(1974)에 의해 고안된 최소 배지(MM)를 사용하였다. MOPS(3-(N-모르폴리노)프로판술폰산) 그 자체는 단지 관 내 수행된 실험(하기 참조) 또는 트립톤 보충을 이용하지 않은 실험에서만 포함되었다. 표시된 경우, 배지를 특정 농도의 하기 화합물들로 보충되었다: 일염기성 및 이염기성 인산나트륨 및 인산칼륨, 일염기성 및 이염기성 인산암모늄, 염화나트륨, 황산나트륨, 염화칼륨, 황산칼륨, L-아미노산, 뉴클레오티드 및 비타민. 달리 명시되지 않는 한, 모든 화학물질들은 시그마-알드리히(SIGMA-ALDRICH)

컴퍼니(미국 미주리주 세인트루이스 소재)로부터 입수되었다.

모든 실험들은 혐기성 조건 하에서, 또한 달리 명시되지 않는 한, 37℃에서 수행되었다. 관 내 실험은 배지로 완전히 충전되거나, 아르곤으로 연속 분사된(초기 pH 7.2) 밀봉 혐기성 관[헌게이트(HUNGATE)^TM 관: 벨코 글라스(BELLCO GLASS)

인코포레이티드(미국 뉴저지주 소재)]에서 수행하였다. 접종물 제조 기법과 함께 발효 시스템 및 혐기성 조건 하에서의 그것의 조작이 다른 문헌에 기재되었다(Dharmadi 등, 2006).

사용하기 전, (-80℃에서 글리세롤 스톡으로 저장된) 스톡 배양물을 LB 플레이트 상에 연속 스트리킹하고, CO₂ 기체 발생 키트[옥소이드(OXOID)

리미티드(영국 햄프셔 베이싱스토크 소재)]와 함께 옥소이드^TM 혐기성 병(jar) 내에서 37℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 단일 콜로니를 사용하여, 배지(10 g/L 트립톤, 5 g/L 효모 추출물 및 5 g/L 글리세롤로 보충된 MM)로 완전히 충전된 17.5 mL 헌게이트^TM 관을 접종하였다. ~0.4의 OD₅₅₀이 도달될 때까지 관을 37℃에서 인큐베이션하였다. 적절한 체적의, 이 활발히 성장하는 예비 배양물을 원심분리하였고, 펠렛을 세정하여, 이를 각 발효기 내 350 mL의 배지를 접종하기 위해 사용하였으며, 이 때 표적 출발 광학 밀도는 550 nm에서 0.05였다.

6개의 500 ml 작용 체적 용기를 가지고, 온도, pH 및 교반기 속도(200 rpm.)가 독립적으로 조절되는 식스포스(SIXFORS)^TM 다중발효 시스템[인포스(INFORS)

HT(스위스 보트밍겐 소재)]에서 실험을 수행하였다. 시스템을 완전 장착시켰고, 제조업자의 IRIS NT 소프트웨어를 이용하여 컴퓨터 제어하였다. 각 용기에 0℃ 냉각 메탄올-물 공급장치로 조작되는 응축기를 장착하여, 증발을 방지하였다. 상부 공간을 0.01 LPM에서 초고 순도의 아르곤[마태슨 트리-가스(MATHESON TRI-GAS)

인코포레이티드(미국 텍사스주 휴스톤 소재)]으로 플러싱함으로써 혐기성 조건을 유지시켰다. 산소-트랩[알테크 어소시에이츠(ALLTECH ASSOCIATES)

인코포레이티드(미국 일리노이즈주 디어필드 소재]을 사용하여, 기체 스트림으로부터 미량의 산소를 제거하였다. 멸균성을 유지하기 위해, 0.2-μm 및 0.45-μm HEPA 필터[밀리포어(MILLIPORE)

(미국 캘리포니아주 빌레리카 소재)]를 사용하여, 입구 라인 및 출구 라인을 각기 장착하였다.

550 nm에서 광학 밀도를 측정하여, 세포 농도(1 O.D.=0.34 g DW/L)의 평가값으로 사용하였다. 원심분리 후, HPLC 분석을 위해 상등액을 -20℃에서 저장하였다. 글리세롤, 락트산염, 아세트산염, 포름산염, 숙신산염 및 에탄올의 농도를 정량화하기 위해, 샘플을 HPX-87H 유기산 칼럼[바이오-래드(BIO-RAD)

(미국 캘리포니아주 헤르큘레스 소재)]이 장착된 시마즈 프로미넥스 실(SHIMADZU PROMINENCE SIL) 20^TM 시스템[시마드주 사이언티픽 인스트루먼츠(SHIMADZU SCIENTIFIC INSTRUMENTS)

인코포레이티드(미국 매를랜드주 콜롬비아 소재)]을 이용한 이온- 배제 HPLC로 분석하였다. 과거 기재된 접근법(Dharmadi 및 Gonzalez, 2005)을 이용하여, 피크 분리를 최적화하기 위한 작동 조건(이동상 내 30 mM H₂SO₄, 칼럼 온도 42℃)를 결정하였다. 기체 크로마토그래피를 이용하여 선택된 샘플에서 수소 생성을 측정하였다. 수소는 또한 (에탄올+아세트산염)의 몰양과 포름산염의 몰양 사이의 차이로서 계산될 수 있었다. 표준 물질로서 테트라메틸실란(TMS)을 이용하여, 하기 기재된 바와 같은 NMR(핵자기공명) 실험을 통해 1,2-PDO 농도를 결정하였다.

발효 생성물의 실체를 1D 1H(양성자) NMR 실험을 통해 확인하였다. 60 μl D₂O 및 1 μl의 600 mM NMR 내부 표준 물질 TSP(3-(트리메틸실릴)프로피온산-D4, 나트륨염)을 540 μl의 샘플에 첨가하였다. 이어서, 생성된 용액을 5 mm-NMR 관에 옮겼고, 1D 양성자 NMR 분광법을 펜타(PENTA)^TM 프로브가 장착된 배리언(VARIAN)

500 MHZ 이노바(INOVA)^TM 분광계에서 25℃에서 수행하였다. 하기 파라미터들을 사용하였다: 8,000 Hz 탐색(sweep) 폭; 2.8초 획득 시간(acquisition time); 256 획득; 6.3 μ 펄스 폭; 1.2 s 펄스 반복 지연; 및 2초 간의 전포화(presaturation). 소프트웨어 페릭스(FELIX)^TM 2001[어셀리이즈 소프트웨어(ACCELRYS SOFTWARE)

인코포레이티드(미국 매릴랜드주 벌링톤 소재)]을 이용하여, 생성된 스펙트럼을 분석하였다. 샘플을 대사물 표준 물질로 스파이킹한(2 mM 최종 농도) 분리된 실험들에서 수행된, 화학적 이동 및 J-커플링 값에 의해 피크를 확인하였다.

2D 1H-1H COSY(상관 분광법; COrrelation SpectroscopY) NMR 실험을 통해 샘 플의 추가 특징분석을 달성하였다. 펄스 서열의 바이오팩(BIOPACK)

스위트(배리언

인코포레이티드)의 일부인 wgdqfcosy 펄스 서열을 이용하여, 워터게이트 용매 억제를 이용한 이중-양자 여과 COSY 스펙트럼을 수득하였다. 하기 파라미터들을 사용하였다: 6,000 Hz 탐색 폭; 0.5초 획득 시간; t1 차원에서의 600 복합 점; 32 체류(transients); 5.5 μs 펄스 폭; 및 1 초 이완 지연.

50% U-¹³C-표지 글리세롤을 E. 콜라이에서 발효시킴으로써 단백질형성 바이오매스로의 글리세롤의 도입을 평가하였다. 3일(72시간) 후, 관을 회수하였고, 발효액을 원심분리하였다. 세포 펠렛을 9 g/L NaCl 용액으로 1회 세정하고, 다시 원심분리하였다. 리엑티-썸(REACCTI-THERM)^TM 가수분해 시스템[피어스(PIERCE)

(미국 일리노이즈주 로크포드 소재)]를 이용하여 24시간 동안 110℃에서 6 N 일정 비등 HCl을 이용하여, 생성된 세포 펠렛을 가수분해하였다. HCl을 제거하기 위해, 생성된 용액을, 센트리뱁(CENTRIVAP)^TM 시스템[라브콘코(LABCONCO)

코포레이션(미국 미조리주 칸사스시티 소재)]을 이용하여 2시간 동안 진공 하에 75℃에서 급속 증기화하였다. 건조된 샘플을 1 ml D₂O[캠브리지 이소토프 라보라토리즈(Cambridge Isotope Laboratories(미국 매사츄세츠주 캠브리지 소재)]에서 재구축하고, -80℃로 냉동시킨 후, 24시간 동안 4.5 L 프리존(FREEZONE)^TM 동결 건조 시스템(라브콘코

코포레이션)에서 동결건조시켰다. 이어서, 샘플을 600 μl D₂O에서 재구축하고, 여과하여, 세포 입상물을 제거하였다. 1 μl TSP 표준 물질을 샘플에 첨가하였고, 내용물을 NMR 관에 옮겼다. ¹³C 풍부도를 결정하기 위해, 샘플을 탄소⁵⁰ 상에서의 동반 90˚ 펄스를 이용하거나 이용하지 않고 1D 양성자 스핀 엔코를 이용하여 샘플을 분석하였다. 탄소 상의 90˚ 펄스를 ¹³C 탄소 원자에 다시 초점을 둠으로써, 양성자-탄소 스핀 커플링으로 인해 일어나는 ¹³C 위성을 억제하였다. 이 현상은 ¹²C 탄소 원자에 대해서는 일어나지 않았다. 이 실험들을 위해, 본 발명자들은 500 MHz 배리언 인노바^TM 분광계에서 상업적으로 이용가능한 펄스 서열 pwxcal을 이용하였다. 하기 파라미터들을 사용하였다: 8,000 Hz 탐색 폭; 2.7 초 획득 시간; 256 체류; 및 25℃에서 pwxl 0 및 90˚. 스펙트럼의 화학 이동 및 미세 구조에 기초하여 개별 아미노산을 확인하였다.

효소 검정을 수행하기 위해, ~0.7의 OD₅₅₀의 혐기성 배양물로부터의 세포를 원심분리(2분, 10,000×g)에 의해 회수하여, 9 g/리터 NaCl로 세정하였으며, -20℃에서 세포 펠렛으로 저장하였다. 세포를 0.2 ml의 각 완충액에 재현탁시켰고, 클로로포름과 보어텍스 혼합함으로써 투과화하였다(Tao 등, 2001). 50 mM 트리스ㆍHCl(pH 7.6), 2 mM MgCl₂, 500 μM NAD+, 10 mM 글리세롤 및 10 내지 100 μl 조질의 세포 추출물을 함유하는 혼합물 내에서 340 nm 및 25℃에서의 흡광도의 변화를 측정함으로써, 글리세롤 탈수소효소를 검정하였다. HA와의 글리세롤 탈수소효소 활성, 메티글리옥살 환원효소 활성, 알도-케토 환원효소 활성, 및 반응의 일차도 (단백질 농도 및 시간)를 모든 제제에 대해 확립하였다. 결과를 마이크로몰 분^-1 세포 단백질의 밀리그램^- ¹으로 표시하였고, 3개 이상의 세포 제제에 대해 평균을 냈다.

총 세포, 글리세롤, 또는 생성물 농도 대 세포 농도의 적분(ICC)을 플로팅하고, 이 플롯을 다항(polynomial) 함수에 맞춤으로써, 세포 성장(μ), 글리세롤 소비 및 생성물 합성에 대한 특정 속도를 평가하였다.

실시예 2: 글리세롤 발효 및 배지 조성의 영향

E. 콜라이 내 글리세롤 대사가 호흡 조건에만 국한되는 것으로 믿어지고 있으나, 본 발명자들은 이 유기체가 전자 수용체의 부재 하에 글리세롤을 대사할 수 있음을 발견하였다. 도 1은 2 g/L 트립톤으로 보충된 배지 내 야생형 균주 MG1655에 대한 전형적 발효 프로파일을 보여준다(부가적 상세 내용이 미국 가출원 제60/788,512호 및 제60/867,581호, 및 Gonzalez 등, 2007에 제공됨). 대략 1 내지 2 g/L의 글리세롤이 정치상 배양물의 배지 내에 발효되지 않은 상태로 남았다. 에탄올, 1,2-프로판디올(1,2-PDO), 및 숙신산, 아세트산 및 포름산이 상이한 NMR 기법을 이용하여 발효 생성물로서 확인되었다.

그 다음, 본 발명자들은 각종 파라미터들의 글리세롤 발효에 대한 영향을 확인하고자 하였다. 전형적 방법에 따라 세포 성장에 대해 칼륨, 인산염, 나트륨, 글리세롤, HA, pH 및 CO₂를 적정하였다.

E. 콜라이 내 글리세롤 대사의 과거 연구에서 사용된 전형적 배지는 높은 수 준의 인산염, 칼륨, 및 나트륨을 함유하였고, 이들의 주요 목적은 배양물의 pH를 7 내지 7.5로 조절하는 것이다. 이 배지는 처음에 Tanaka 등(1967)에 의해 보고되었고, 후속하여 E. 콜라이 내 글리세롤 대사의 연구에 있어 대부분의 연구원들에 의해 사용되었다. 본 발명자들은, 본인들의 배지를 상기와 같은 수준의 인산염, 칼륨, 및 나트륨(즉, 34 mM NaH₂PO₄ 및 64 mM K₂HPO₄)으로 보충함이 글리세롤 발효를 심각히 저해하였음(도 2)(알칼리성 pH에서 특히 유해한 효과)을 발견하였다. 나트륨이 아닌 칼륨 및 인산염이 음성적 영향에 대한 원인이었다(도 2). 본 발명자들의 실험에 있어 글리세롤 소비 패턴의 분석은, 상당량의 글리세롤이 배지에서 대사되지 않은 채 남았음(전형적으로 10 내지 30 mM)을 보여주었는데, 이는 글리세롤의 혐기성 발효를 제한하는 역치 농도의 존재를 제시한다. 흥미롭게도, 글리세롤 대사의 과거 연구는 또한 전형적으로 20 내지 30 mM 범위인 글리세롤 농도에서 수행되었다. 본 발명자들은 이제 글리세롤 발효 및 세포 성장이 높은 수준의 인산염 및 칼륨, 2 g/L의 글리세롤을 함유하는 배지를 이용하여, pH 7.5 및 37℃에서 발효를 수행할 때 완전히 저해됨을 알게 되었다(도 2).

조합해보건대, 본 발명자들의 결과는, E. 콜라이를 이용하여 글리세롤을 혐기적으로 발효하고자 하던 과거 시도들이, 그 실험들 모두가 글리세롤 발효에 음성적으로 영향을 미치는 조건 하에서 수행되었기 때문에 성공적이지 않았음을 명백히 입증한다. 그러한 조건에는 중성 내지 알칼리성 pH(7 내지 7.5), 높은 농도의 칼륨 및 인산염, 비교적 낮은 농도의 글리세롤, 37℃ 및 닫힌 용기가 포함된다. 후 자는, 본 발명자들이 수소의 축적 및 산화환원 균형에 대한 결과적 영향으로 인해 글리세롤 발효를 저해한 것으로 입증한 조건이다.

실시예 3: 글리세롤 발효의 경로 및 기작

장세균 내 글리세롤의 혐기성 발효는 오랫동안 활성 1,3-PDO 경로를 가진 종의 특권으로 간주되어 왔다. 그러나, 본 발명자들은 기능적 1,2-PDO 경로 및 glyDH-II-DHAK 경로가 존재하는 한, E. 콜라이가 1,3-PDO-비의존성 방식으로 글리세롤을 발효에 의해 대사할 수 있음을 입증하였다.

문헌 [Dharmadi, 등 (2006), Gonzalez 등, 2007, 및 미국 가출원 제60/867,581호 및 제60/788,512호(각기 참조 인용됨)]에 더욱 상세히 기재된 본 발명자들의 발견 사실에 기초하여, 본 발명자들은 하기와 같은 장세균 내 글리세롤 발효에 대한 새 패러다임을 제안한다: (i) 1,2-PDO 경로는 균체의 합성 중에 발생된 환원 동등물을 소비하기 위한 수단을 제공함으로써, 산화환원 균형 조건을 가능하게 하고, (ii) 산화환원-균형 경로를 통한 에탄올의 합성은 기질-수준 인산화를 통한 ATP 발생에 의해 에너지 요건을 이행함(도 3). 포름산염 수소-분해효소 및 F₀F₁-ATP아제 시스템의 활성은 또한 아마도 세포내 pH 및 CO₂ 공급을 유지하는 것을 도움으로써, 글리세롤의 발효 대사를 도모하는 것으로 밝혀졌다. 본 발명자들은, 글리세롤을 해당 중간체로 전환하는 경로가 두 효소(도 3), 즉 글리세롤 탈수소효소(glyDH) 및 DHA 키나제(DHAK)(여기에서, 전자는 기존에 알려지지 않은 생리학적 역할을 함)로 이루어짐을 보여주었다.

글리세롤^1,2의 발효 중의 세포 성장

균주	GldA 단백질	성장 속도 μM±SD³	성장 수율 Y_X _/S±SD⁴	1,2-PDO⁵ (mM)
W3110	glyDH-II	0.031±0.002	32.2±3.1	유
MG1655	glyDH-II	0.040±0.003	32.9±2.9	유
MC4100	glyDH-II	0.029±0.004	54.9±8.8	유
E. 콜라이 B	glyDH-II	0.036±0.002	34.1±2.7	유
E. 클로아카에	glyDH-II	0.022±0.002	30.9±2.8	유
L. 리카르디이	glyDH-III	ND	ND	ND
B. 아그레스티스	glyDH-IV	ND	ND	ND
S. 플라이무티카	무	ND	ND	ND

¹ 실험을 0.2% 트립톤 및 10 g/L의 글리세롤의 존재 하에서 수행하였다.

² NG: 관찰된 성장이 없음; ND: 검출된 것이 없음; SD: 표준 편차.

³ μM: 지수적 성장 동안의 계산된 최대 특이 성장 속도(h^-1).

⁴ Y_X/S: 소비된 글리세롤 당, 균체량의 증가분으로서 계산된 성장 수율(mg 세포/g 글리세롤).

⁵ 1,2-PDO의 합성이 기재된 바대로 NMR을 통해 확인됨.

다른 피험 균주(W3110, MC4100 및 E. 콜라이 B)도 또한 글리세롤을 발효시킬 수 있는 바(표 2), 균주 MG1655가 글리세롤을 발효시킬 수 있다는 본 발명자들의 발견 사실은 E. 콜라이 종의 일반 특성이다. 2개의 다른 glyDH, 즉 glyDH-III 및 glyDH-IV가 장내세균총의 구성원에서 확인되었으므로, 본 발명자들은 그것의 글리세롤의 혐기성 발효에서의 관련성을 연구하였다. E. 콜라이와 같이 glyDH-H(2)를 보유한 균주 엔테로박터 클로아카에(Enterobacter cloacae) NCDC 279-56만이 글리세롤을 발효시킬 수 있었다(표 2). 효모 삭카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)를 이용한 본 발명자들의 과거 결과는, 유사한 경로가 이 유기체에서 글리세롤 발효를 지지할 수 있음을 가리키는 것으로 보인다.

상기 경로는 글리세롤 발효에 대한 pH, 및 칼륨, 인산염 및 글리세롤의 농도의 관찰된 영향을 설명하기 위한 틀을 제공한다(실시예 2, 미국 가출원 제60/867,581호, 및 Gonzalez 등, 2007 참조). 예를 들어, 높은 수준의 인산염은 DHA 및 HA(상기 경로에서의 2가지 핵심적 중간체) 모두의 분해를 촉진하고, GldA 활성 및 HA에 의한 그것의 유도성에 음성적으로 영향을 미친다. 또한, 1,2-PDO 합성의 요인이 되는 핵심적 효소인 MG 합성효소는 높은 인산염 수준에 의해 억제된다. 높은 농도의 칼륨은 1,2-PDO의 합성에 있어 핵심적 중간체인 MG의 독성을 증가시킨다. 글리세롤에 대한 GldA의 낮은 친화도[Km은 3 내지 40 Mm임]는, 발효 대사를 위한 높은 농도의 글리세롤의 요건뿐만 아니라, 10 내지 30 mM 글리세롤이 배지에 대사되지 않은 채 남아있다는 본 발명자들의 관찰을 설명한다.

글리세롤 발효에 대한 pH의 영향도 또한 상기 경로에 대한 강한 영향과 관련될 수 있다(실시예 2, 미국 가출원 제60/867,581호, 및 Gonzalez 등, 2007 참조). GldA는 매우 알칼리성인 pH에서 보다 높은 산화 활성을 가지고, 중성 내지 알칼리성 조건에서 환원적 활성을 가지는 강한 pH 의존성을 나타낸다. 산성 조건은 glyDH의 활성을 감소시킬 뿐만 아니라, 1,2-PDO의 합성을 위해 필요한 MG-환원 활성도 또한 감소시킨다. 한편, 알칼리성 조건은 1,2-PDO의 합성에 있어 핵심적 중간체인 MG의 독성을 증가시킨다. 명백히, 세포내 pH는 핵심적 효소의 낮은 활성 및 MG 독성을 피하기 위해 주의하여 조절될 필요가 있다. 예를 들어, 세포외 pH 6.3이 명료히 MG 독성을 방지하나, 세포는 여전히 시스템의 pH가 glyDH 및 MGR/AKR 활성을 위해 허용가능한 수준 미만으로 떨어지는 것을 방지하도록 할 필요가 있다. 포름산을 CO₂ 및 H₂로 전환시킴으로써, FHL 시스템은 세포질 산성화를 방지하는 것으로 알려져 있는데, 이는 왜 FHL가 산성 조건 하에서 글리세롤 발효를 위해 필요한지를 설명한다. 그러나, FHL 활성은, 축적될 경우에 글리세롤 발효에 음성적으로 영향을 주는 과량의 수소를 발생시킬 수 있다. 알칼리성 조건에서, F₀F₁-ATP아제 시스템은 세포질의 알칼리화를 방지함으로써 MG 독성을 피하기 위해 필요할 수 있다.

실시예 4: 산업용 배지 내 글리세롤 발효의 생산성 및 실행가능성의 향상

글리세롤 발효의 향상에 대한 본 발명자들의 발견 사실에 대한 의미를 입증하기 위해, 본인들은 야생형 균주 MG1655에서의 발견된 트렁크 경로(GldA-DHAK)을 과발현시켰고, 세포 성장 및 글리세롤 발효 모두가 2배 초과로 증가함을 관찰하였다. 플라스미드 pZSdhaKLM_gldA를 이용하여 균주 MG1655를 형질전환함으로써, GldA-DHAK 경로의 증폭을 달성하였다. 생산성을 더욱 증가시키기 위해, GldA-DHAK 경로와 함께 해당 효소(예를 들어, 트리오스-인산염 이소머라제)의 합동 과발현이 필요할 수 있다. 또한, 배양 배지, 배양 시스템 및 작동 방식의 추가 최적화를 포함한 수가지 공정-기재의 향상이 이행 중에 있다.

산업적 수준에의 글리세롤 발효의 적용은 바이오디젤의 생성 중에 유래된 글리세롤의 사용을 필요로 할 것이다. 본 발명자들은 MG1655를 순수 글리세롤, 및 퓨쳐퓨얼 케미칼 컴퍼니(FutureFuel Chemical Company)에 의해 작동된 바이오디젤 플랜트로부터 입수된 글리세롤의 2개 샘플에 회수했을 때, 유사한 세포 성장 및 글리세롤 발효를 관찰하였다: 48시간 동안의 회수 후에, 세포는 4(순수), 3.9(정제) 및 3.8(조질) g/L의 글리세롤을 발효시켰고, 1.2(순수), 0.96(정제) 및 0.98(조질)의 광학 밀도에 도달하였다.

트립톤 보충물의 비용 효과적인 산업용 보충물로의 대체는, 상업적 성공을 위한 또 다른 핵심적 인자이다. 그러나, 본 발명자들은 이미 옥수수 침지액(corn steep liquor)(산업적 발효에서 사용되는 저렴한 보충물)를 이용한 배지 보충이 트립톤 보충으로 관찰되는 수준과 유사한 수준으로 글리세롤 발효를 지지함을 입증하였다(Dharmadi 등, 2006)

본 발명자들은 또한 보충하지 않은 최소 배지(0.36의 OD₅₅₀ 및 8.1 g/L의 발효 글리세롤)에서 성장할 수 있는 MG1655 돌연변이체를 수득하였다. 이 돌연변이체는 감소하는 양의 HA 또는 트립톤을 함유하는 배지에서 글리세롤을 발효할 수 있는 균주를 선택하는 다수회 실험을 통해 발생되었다(미국 가출원 제60/867,581호).

실시예 5: 글리세롤로부터의 생성물

본 발명자들은 또한 탄소원으로서의 글리세롤 및 상기 배지를 이용한 생성물 형성을 예시적으로 입증하였다. 예를 들어, 본 발명자들은 도 4에 에탄올 생성을 나타냈다. 본 발명자들의 결과는, 미소한(minor) 유전적 및 환경적 변형이 E. 콜라이가 글리세롤을 에탄올 및 H₂-CO₂(pH 6.3), 또는 에탄올 및 포름산염으로 전환시키기 위한 양호한 생체촉매가 됨(pH 7.5 및 FHL 시스템의 무력화)을 나타냈다. 이와 대조적으로, 당 발효를 통한 에탄올 생성은 H₂이나 포름산염 중 어느 것도 동시 생성되지 않는 가능성을 제공하게 되며, 이에 덜 효율적인 공정을 나타내게 된다. 에탄올-H₂ 및 에탄올-포름산염 수율의 추가 향상은 숙신산염 및 아세트산염 경로의 제거로부터 비롯될 것이다(frdA 및 pta 돌연변이: Gonzalez 등, 2007 및 미국 가출원 제60/867,581호). 산업용 배지의 생산성 및 용도의 향상은 실시예 4에서 상기 기재된 바와 같다.

또 다른 예는, 당으로부터의 그 생성이 환원 동등물의 이용가능성에 의해 제한되는 숙신산이다. 다행히도, 글리세롤로부터 숙신산의 합성은 산화환원-균형 경로를 통해 실행가능하다. 그러나, MG1655를 이용한 본 발명자들의 실험에서 글리세롤로부터의 숙신산염의 매우 낮은 생성이 관찰되었고, 이 때 글리세롤의 결과는 PEP-의존성 GldA-DHAK 경로를 통해 이화된다(즉, 낮은 PEP 이용능). 적절한 pH 및 CO₂ 농도를 사용함과 함께 E. 콜라이 PEP-의존성 DHAK를 C. 프레운디이 ATP-의존성 DHAK로 대체함으로써, 본 발명자들은 상기 배지를 이용하여 숙신산염 수율의 거의 10배 증가를 달성하였다(도 4). 숙신산염 수율의 추가 향상은 에탄올 및 아세트산염 경로의 제거로부터 비롯될 것이다(adhE 및 pta 돌연변이: Gonzalez 등, 2007 및 미국 가출원 제60/867,581호). 산업용 배지의 생산성 및 용도의 향상은, C. 프레운디이 ATP-의존성 DHAK가 본연의 DHAK 대신에 과발현될 것이라는 것을 제외하고는, 실시예 4에서 상기 기재된 바와 같다. 숙신산 경로를 더욱 강력하게 바람직하도록 하기 위해, 본 발명자들은 E. 콜라이 포스포에놀파이루베이트 카르복실라제(PEPC, 유전자 ppc에 의해 코딩됨), 및 E. 콜라이(pckA), 악티노바실러스 숙시노제네스(Actinobacillus succinogenes)(pckA) 또는 효소 데이터베이스 브렌다(BRENDA)(Schomburg 등, 2004)에 기재된 기타 미생물로부터의 포스포에놀파이루베이트 카르복시키나제(PEPCK)의 과발현을 제거하고 있다. 숙신산염 경로(PEPC와 달리 PEPCK는 ATP를 발생시킴)를 통한 보다 높은 에너지 생산은 보다 높은 생산성 및 수율을 초래하게 된다.

글리세롤에서의 탄소의 더욱 환원된 상태로부터 그 합성이 이익을 얻게 되는 또 다른 생성물은 1,2-PDO이다. GldA-DHAK 경로의 증폭은 생산성의 증가를 초래했을 뿐만 아니라, 1,2-PDO의 합성을 거의 20배 증가시켰는데, 즉 MG1655는 단지 0.026 mM의 1,2-PDO를 생성한 한편, 재조합 균주 MG1655(pZSdhaKLM_gldA)는 0.51 mM의 이 생성물을 축적시켰다. 이 결과는 아마도 1,2-PDO의 합성에 있어서의 GldA의 관여로 인한 것으로 보인다(Gonzalez 등, 2007).

본 발명자들은 이제 하기 기재된 바와 같은, 글리세롤로부터 높은 수준의 1,2-PDO를 생성시키기 위한 수가지 전략법을 모색하고 있다:

(1) E. 콜라이의 본연의 PEP-의존성 DHAK(dhaKLM)를 C. 프레운디이의 ATP-의존성 DHAK(dhaKL 서브유닛)로 교체함과 이를 본연의 글리세롤 탈수소효소(gldA) 병용 하에 과발현함.

(2) DHAP의 1,2-PDO로의 전환과 모두 관련된, 효소 메틸글리옥살 합성효소, 글리세롤 탈수소효소 및 메틸글리옥살 환원효소의 과발현(Gonzalez 등, 2007 및 미국 가출원 제60/867,581호).

(3) 수소전달효소의 과발현을 통해 NADH의 NADPH로의 전환을 향상시키거나, 글리세롤 탈수소효소, 글리세롤-3-P 탈수소효소, 글리세르알데히드 탈수소효소, 파이루베이트 탈수소효소 등을 포함한 중추적 대사 경로에서의 보조인자 효소 특이성을 공학처리함으로써, DHAP의 1,2-PDO로의 전환을 유도하는 NADPH의 이용능을 증가시킴. 대안적으로, 본연의 형태로 NADP를 보조인자로 사용하는 상기 효소들의 변이체가 다른 유기체로부터 클로닝되어, E. 콜라이에서 발현될 수 있다.

(4) 한 단계에서 글리세롤을 HA로 전환시키기 위해, 글리세롤 탈수효소(GD, 이는 본래 3-히드록시프로피온알데히드로 전환시킴으로써 글리세롤을 탈수시킴)를 공학처리함. 이어서, 본 발명자들이 배양 배지에 처음에 존재한 HA가 1,2-PDO로 화학양론적으로 전환된 실험에서 이미 입증한 바와 같이(미국 가출원 제60/867,581호), HA는 E. 콜라이 내에서 GldA 또는 기타 효소에 의해 1,2-PDO로 전환된다. 이 경로는 중간체로서 메틸글리옥살(매우 독성인 생성물)을 피하게 할 것이고, ATP가 소비되지 않아, 에너지 효율이 더 큰 글리세롤의 1,2-PDO로의 전환 경로를 나타내며, 이에 수율을 상당히 증가시키게 된다. 공학처리된 GD는, 다른 GD와는 달리 활성을 위해 조효소 B₁₂를 필요로 하지 않는 C. 부티리쿰 (C. butyricum ) GD(dhaB1)를 돌연변이유발함으로써 수득되고 있다. 본 발명자들은 또한 글리세롤을 HA로 전환시킬 수 있는 본연의 미생물 GD를 위한 연구를 수행하고 있다. 이 활성은 일단 발견되면, E. 콜라이에서 클로닝되어 발현될 것이다.

(5) 화학적(글리세롤에서 HA로) 및 생물학적(HA에서 1,2-PDO로) 병용 전략법. 글리세롤의 HA로의 탈수는 고체 촉매, 보통 정도의 온도(~200℃), 및 대기압을 이용한 공정(Crabtree 등, 2006)으로 효율적으로 달성되었다. 유일한 생성물은 HA 및 물이다. 본 발명자들은 글리세롤을 함유한 배지에서 E. 콜라이에 의해 HA를 1,2-PDO로 효율적으로 전환시킴을 입증하였다(Gonzalez 등, 2007 및 미국 가출원 제60/867,581호). 소비된 글리세롤의 양은 최소이고, HA의 1,2-PDO로의 화학양론적 전환이 매우 단기의 발효에서 달성된다.

상기 기재되어 있으면서 도 4 및 5에 나와 있는 결과는 글리세롤로부터의 연료 및 환원된 화학물질의 생산을 위한 기반을 개발하는 실행가능성을 명백히 입증한다. 글리세롤 발효를 통해 생성되는 것이 유리한 부가적 생성물에는 프로판올아미드, 프로피온산, 부탄올 등이 포함된다(Gonzalez 등, 2007). 이 공정들은 경제성을 크게 향상시킴으로써 진정한 생물학적 정제의 이행을 가능하게 하고, 생물학적 연료 산업을 개혁할 것이다.

참고문헌

독자의 편의를 위해 모든 참조문헌들이 여기에 열거되어 있다. 각 문헌은 전체적으로 참조 인용된다.

Claims

세균 세포를 혐기성 조건 하에 배지에서 배양하는 것을 포함하는, 글리세롤을 혐기적으로 발효시키는 방법으로, 여기에서,

상기 세균 세포는 기능적 1,3-프로판디올(1,3-PDO) 경로를 갖지 않고 1,3-PDO를 생성할 수도 없으나,

기능적 1,2-프로판디올(1,2-PDO) 경로를 가져서 1,2-PDO를 생성할 수 있고,

기능적 II형 글리세롤 탈수소효소-디히드록시아세톤 키나제 경로를 가져서 글리세롤을 디히드록시아세톤(DHA)으로 전환시키고 디히드록시아세톤 포스페이트(DHAP)로 전환시킬 수 있고,

기능적 F₀F₁-ATP아제 경로를 가져서 아데노신 트리포스페이트(ATP) 합성을 양성자 펌프와 결부시킬 수 있으며,

상기 배지는 탄소원으로서의 10 g/L 이상의 글리세롤, 10 mM 미만의 칼륨, 50 mM 미만의 인산염, 10% 이상의 CO₂, 및 pH 5.0 내지 7.5를 포함하는 것인,

글리세롤을 혐기적으로 발효시키는 방법.
제1항에 있어서, 배지가 히드록시아세톤(HA)으로 보충되나, 트립톤으로는 보충되지 않는 것인 방법.
제1항에 있어서, 배지가 30 mM HA로 보충된 것인 방법.
제1항에 있어서, 배지의 pH가 6.5 이하일 때, 세균 세포가 또한 기능적 포름산염-수소 분해효소(FHL) 경로를 가져서 포름산염을 CO₂ 및 수소로 불균화(disproportionation)할 수 있는 것인 방법.
제1항에 있어서, pH가 7.5일 때, CO₂가 20% 이상인 방법.
제1항에 있어서, 배지가 2 mM 이하의 칼륨 및 10 mM 이하의 인산염을 갖는 것인 방법.
제1항에 있어서, 배지가 1 mM 이하의 칼륨 및 5 mM 이하의 인산염을 갖는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 세균이 에탄올, 숙신산, 포름산, 수소, 1,2-PDO, 프로판올아미드, 프로피온산 및 부탄올로 이루어진 군으로부터 선택되는 생성물을 생성하는 것인 방법.
제8항에 있어서, 배지가 1 mM 이하의 칼륨 및 2 mM 이하의 인산염을 갖는 것인 방법.
제9항에 있어서, pH가 6.3이고, 배지에 불활성 기체가 분사되며(sparged), 상기 세균이 에탄올 및 수소를 생성하는 것인 방법.
제10항에 있어서, 본연의 글리세롤 탈수소효소가 과발현되고 본연의 디히드록시아세톤 키나제가 과발현되고, pta 및 frdA가 불활성화되며, 글리세롤이 조질의 글리세롤이고, 배지가 옥수수 침지액을 추가로 포함하지만 트립톤은 포함하지 않는 것인 방법.
제9항에 있어서, 세균 세포가 기능적 FHL 경로를 가지지 않아서 포름산염을 CO₂ 및 수소로 불균화할 수 없고, pH가 7이며, 배지에 불활성 기체가 분사되며, 상기 세균이 에탄올 및 포름산염을 생성하는 것인 방법.
제12항에 있어서, 본연의 글리세롤 탈수소효소가 과발현되고 본연의 디히드록시아세톤 키나제가 과발현되고, pta 및 frdA가 불활성화되며, 글리세롤이 조질의 글리세롤이고, 배지가 옥수수 침지액을 추가로 포함하지만 트립톤은 포함하지 않는 것인 방법.
제9항에 있어서, 상기 세균 세포가 본연의 디히드록시아세톤 키나제 서브유닛을 가지지 않고, C. 프레운디이(C. freundii)로부터의 디히드록시아세톤 키나제를 발현하며, 상기 세균이 숙신산염을 생성하는 것인 방법.
제14항에 있어서, 배지가 10 내지 20% CO₂를 포함하고, pH가 6 내지 7.5인 방법.
제15항에 있어서, 본연의 글리세롤 탈수소효소 및 C. 프레운디이 디히드록시아세톤 키나제가 과발현되고, 본연의 포스포에놀파이루베이트 카르복실라제가 불활성화되며, E. 콜라이(E. coli) 또는 A. 숙시노제네스(A. succinogenes)로부터의 포스포에놀파이루베이트 카르복시키나제가 과발현되고, pta 및 adhE가 불활성화되며, 글리세롤이 조질의 글리세롤이고, 배지가 옥수수 침지액을 추가로 포함하는 것인 방법.
제9항에 있어서, 본연의 글리세롤 탈수소효소 및 디히드록시아세톤 키나제가 과발현되고, 상기 세균이 1,2-PDO를 생성하는 것인 방법.
제17항에 있어서, 본연의 디히드록시아세톤 키나제가 C. 프레운디이 디히드록시아세톤 키나제에 의해 대체되고, 효소인 메틸글리옥살 합성효소, 글리세롤 탈수소효소 및 메틸글리옥살 환원효소가 모두 과발현되는 것인 방법.
제17항에 있어서, 글리세롤을 히드록시아세톤으로 전환시킬 수 있는 유전자 조작 또는 천연 발생 글리세롤 탈수효소가 과발현되는 것인 방법.
세균 세포를 혐기성 조건 하에 배지에서 배양하여 글리세롤을 1,2-PDO로 전환시키고, 상기 세포 또는 상기 배지로부터 1,2-PDO를 단리하는 것을 포함하는, 1,2-PDO를 생성하는 방법으로, 여기에서,

상기 세균 세포는 기능적 1,3-프로판디올(1,3-PDO) 경로를 갖지 않고 1,3-PDO를 생성할 수도 없으나,

기능적 1,2-프로판디올(1,2-PDO) 경로를 가져서 1,2-PDO를 생성할 수 있고,

기능적 II형 글리세롤 탈수소효소-디히드록시아세톤 키나제 경로를 가져서 글리세롤을 DHA로 전환시키고 DHAP로 전환시킬 수 있고,

기능적 F₀F₁-ATP아제 경로를 가져서 ATP 합성을 양성자 펌프와 결부시킬 수 있으며,

상기 배지는 탄소원으로서의 10 g/L 이상의 글리세롤, 10 mM 미만의 칼륨, 50 mM 미만의 인산염, 10% 이상의 CO₂, 및 pH 5 내지 7.5를 포함하는 것인,

1,2-PDO의 생성 방법.
제20항에 있어서, 본연의 포스포에놀파이루베이트(PEP)-의존성 디히드록시아세톤 키나제(DHAK)가 불활성화되고, ATP-의존성 DHAK 및 글리세롤 탈수소효소(gldA) 유전자가 과발현되는 것인 방법.
제21항에 있어서, 메틸글리옥살 합성효소, 글리세롤 탈수소효소 및 메틸글리옥살 환원효소 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 효소가 과발현되는 것인 방법.
제20항에 있어서, 글리세롤 키나제, NAD+/NADP+-의존성 글리세롤 탈수소효소, NAD+/NADP+-의존성 글리세롤-3-P 탈수소효소, NAD+/NADP+-의존성 글리세르알데히드 탈수소효소, NAD+/NADP+-의존성 파이루베이트 탈수소효소, NADH에서 NADPH로의 수소전달효소, 프로판디올 산화환원효소 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 효소가 과발현되는 것인 방법.
제20항에 있어서, 글리세롤을 HA로 전환시키는 유전자 조작 또는 본연의 글리세롤 탈수효소(GD)가 개별적으로 발현되거나 또는 글리세롤 탈수소효소 과발현과 함께 발현되는 것인 방법.
제20항에 있어서, 상기 배지가 HA를 포함하는 것인 방법.
제22항에 있어서, 알데히드/알코올 탈수소효소(adhE), 포스포아세틸트랜스퍼라제(pta), 푸마르산염 환원효소(frd) 유전자 및 이들의 조합물이 녹아웃된(knocked-out) 것인 방법.
제21항 내지 제24항 및 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세균 세포를 고성능 생체촉매를 선택하여 연속적 또는 순차적 배치(batch) 시스템에서 대사 진화(metabolic evolution)시키는 방법.
제27항에 있어서, 상기 대사 진화가 감소하는 양의 산소 또는 질산염 또는 산소와 질산염 둘다의 존재 하에 수행되는 것인 방법.
E. 콜라이를 혐기성 조건 하에 탄소원으로서의 10 g/L 이상의 글리세롤, 10 mM 미만의 칼륨, 50 mM 미만의 인산염, 10% 이상의 CO₂, 및 pH 5.0 내지 7.5를 포함하는 배지에서 배양하는 것을 포함하는, E. 콜라이 세포의 배양 방법.
장세균 세포를 혐기성 조건 하에 배지에서 배양하는 것을 포함하는, 글리세롤을 혐기적으로 발효시키는 방법으로, 여기에서,

상기 장세균 세포는 기능적 1,3-프로판디올(1,3-PDO) 경로를 갖지 않고 1,3-PDO를 생성할 수도 없으나,

기능적 1,2-프로판디올(1,2-PDO) 경로를 가져서 1,2-PDO를 생성할 수 있고,

기능적 II형 글리세롤 탈수소효소-디히드록시아세톤 키나제 경로를 가져서 글리세롤을 디히드록시아세톤(DHA)으로 전환시키고 디히드록시아세톤 포스페이트(DHAP)로 전환시킬 수 있고,

기능적 F₀F₁-ATP아제 경로를 가져서 아데노신 트리포스페이트(ATP) 합성을 양성자 펌프와 결부시킬 수 있으며,

상기 배지는 탄소원으로서의 10 g/L 이상의 글리세롤, 10 mM 미만의 칼륨, 50 mM 미만의 인산염, 10% 이상의 CO₂, 및 pH 5.0 내지 7.5를 포함하는 것인,

글리세롤을 혐기적으로 발효시키는 방법.