JP2005304362A - 1,3−プロパンジオール及び/又は3−ヒドロキシプロピオン酸を製造する方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 Lactobacillus属細菌、Salmonella属細菌、Klebsiella属細菌、Listeria属細菌、Clostridium属細菌、Escherichia属細菌、Enterobacter属細菌、Caloramator属細菌、Acetobacterium属細菌、Brucella属細菌、Flavobacterium属細菌、Fusobacterium属細菌、Citrobacter属細菌及びPropionibacterium属細菌から選択される細菌において、グリセロールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子がノックアウトされたノックアウト細菌。
【選択図】 なし
Description
(1)Lactobacillus属細菌、Salmonella属細菌、Klebsiella属細菌、Listeria属細菌、Clostridium属細菌、Escherichia属細菌、Enterobacter属細菌、Caloramator属細菌、Acetobacterium属細菌、Brucella属細菌、Flavobacterium属細菌、Fusobacterium属細菌、Citrobacter属細菌及びPropionibacterium属細菌から選択される細菌においてグリセロールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子がノックアウトされたノックアウト細菌。
(2)pduオペロン及びホスホトランスアシラーゼをコードする遺伝子を有する細菌において、グリセロールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子がノックアウトされたノックアウト細菌。
(3)(1)又は(2)記載の細菌とグリセロールとを接触させることにより、1,3−プロパンジオール及び/又は3−ヒドロキシプロピオン酸を製造する方法。
(5)pduオペロンを有し、グリセロールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を含まない、(4)記載の形質転換体。
(a)配列番号41で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b)配列番号41で表されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつプロピオンアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
(a)配列番号42で表される塩基配列からなるDNA
(b)配列番号42で表される塩基配列の全部又は一部からなるDNAに対し相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつプロピオンアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
(a)配列番号43で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b)配列番号43で表されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつプロピオン酸キナーゼ活性を有するタンパク質。
(a)配列番号44で表される塩基配列からなるDNA
(b)配列番号44で表される塩基配列の全部又は一部からなるDNAに対し相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつプロピオン酸キナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
pduF グリセロール摂取促進因子(配列番号54)
orf1 エタノールアミン利用系のEutJ(配列番号55)
pocR 転写制御因子(配列番号56)
pduAB 多面小体構成タンパク質(配列番号57及び58)
pduCDE ジオールデヒドラターゼ(配列番号2、6、10)
pduGH ジオールデヒドラターゼ再活性化因子(配列番号20及び24)
pduJK 多面小体構成タンパク質(配列番号60及び59)
pduLM 不明(配列番号61及び62)
pduN 多面小体構成タンパク質(配列番号63)
pduOObis アデノシルトランスフェラーゼ(配列番号64及び65)
pduP プロピオンアルデヒドデヒドロゲナーゼ(配列番号42)
pduQ プロパンジオールオキシドレダクターゼ(配列番号14)
pduW プロピオン酸キナーゼ(配列番号44)
pduU 多面小体構成タンパク質(配列番号66)
orf2 チロシンホスファターゼ(配列番号67)
orf3 ホスホグリセレートムターゼ(配列番号68)
orf4 カドミウム耐性(輸送タンパク質)(配列番号69)
pduV 不明(配列番号70)
本発明の形質転換体は、上記4種の遺伝子又はその一部を適当なベクターに連結し、得られた組換えベクターを本発明の遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。「一部」とは、宿主中に導入された場合に各遺伝子がコードするタンパク質を発現することができる各遺伝子の一部分を指す。
本発明において、1,3−プロパンジオール及び3−ヒドロキシプロピオン酸の製造は、本発明の細菌又は形質転換体とグリセロールとを接触させ、反応生成物(培養菌体又は培養上清)中に1,3−プロパンジオール及び3−ヒドロキシプロピオン酸を蓄積させ、1,3−プロパンジオール及び3−ヒドロキシプロピオン酸を採取することにより実施できる。
合成オリゴヌクレオチドプライマー(フォワードプライマー:5'-ATGAAACGTCAAAAACGATTTGAAGAACTAGAAAAAC-3'(配列番号27)、リバースプライマー:5'-TTAGTTATCGCCCTTTAGCTTCTTACGACTTT-3'(配列番号28)を作成し、Lactobacillus reuteri JCM1112株のゲノムを鋳型にして、以下の条件でPCR反応を実施した。
10×Buffer KODplus 5
2mM dNTPs 5
25mM MgSO4 2
ゲノム 111ng/μl 1
KODplus 1
水 34
フォワードプライマー 20pM 1
リバースプライマー 20pM 1
反応系体積 計 50
フォワードプライマー:5'-ATGGGAGGCATAATTCCAATGGAAAAATA-3'(配列番号31)、リバースプライマー:5'-TTAACGAATTATTGCTTCGTAAACCATCTTC-3'(配列番号32)を作成し、Lactobacillus reuteri JCM1112株のゲノムを鋳型にして、実施例1と同様にPCR反応及びDNAシークエンスを実施した。その結果、配列番号14で示されるプロパンジオールオキシドレダクターゼ遺伝子の塩基配列を決定した。
フォワードプライマー:5'-ATGAATAGACAATTTGATTTCTTAATGCCAAG-3'(配列番号35)、リバースプライマー:5'-TTAGTAGATGCCATCGTAAGCCTTTT-3'(配列番号36)を作成し、Lactobacillus reuteri JCM1112株のゲノムを鋳型にして、実施例1と同様にPCR反応及びDNAシークエンスを実施した。その結果、配列番号18で示される1,3−プロパンジオールオキシドレダクターゼ遺伝子の塩基配列を決定した。
フォワードプライマー:5'-ATGGCAACTGAAAAAGTAATTGGTGTTGATATT-3'(配列番号37)、リバースプライマー:5'-TCACCTGTTTGCCATTTCCTTAAAAGGGATT-3'(配列番号38)を作成し、Lactobacillus reuteri JCM1112株のゲノムを鋳型にして、実施例1と同様にPCR反応及びDNAシークエンスを実施した。配列番号20で示されるグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子のラージサブユニットをコードする遺伝子、並びに配列番号24で示されるグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子のスモールサブユニットをコードする遺伝子の塩基配列を決定した。
フォワードプライマー:5'-ATGCAGATTAATGATATTGAAAGTGCTGTA-3'(配列番号47)、リバースプライマー:5'-TTAATACCAGTTACGTACTGAGAATCC-3'(配列番号48)を作成し、Lactobacillus reuteri JCM1112株のゲノムを鋳型にして、実施例1と同様にPCR反応及びDNAシークエンスを実施した。配列番号42で示されるプロピオンアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の塩基配列を決定した。
フォワードプライマー:5'-TTGATGTCAAAAAAAATACTTGCAATTAATTCTG-3'(配列番号49)、リバースプライマー:5'-TTATTGCTGAGTTACATTCATTACATCAC-3'(配列番号50)を作成し、Lactobacillus reuteri JCM1112株のゲノムを鋳型にして、実施例1と同様にPCR反応及びDNAシークエンスを実施した。配列番号44で示されるプロピオン酸キナーゼをコードする遺伝子の塩基配列を決定した。
(1)組み換え微生物の作成
5’-ATGGACCGCATTATTCAATCACCGGGTAAATACATCCAGGGCGCTGATGTGATTAATCGTTAACC-3’(プライマー1:配列番号71)をN末側に付加し、配列5’-CTGGGCGAATACCTGAAGCCGCTGGCAGAAC GCTGGTTAGTGGTGGGTGACAAATTTG-3’(プライマー2:配列番号72)を付加したアンピシリン耐性遺伝子(配列番号73)5μgとE.coli TOP10エレクトロコンピテントセル50μlの混合液を、Bio-Rad社製 Gene-Pulser IIを用いて、0.1 cmキュベットに移した。
この菌株1μlループ1掻き分を、クロラムフェニコール100μg/ml、アンピシリン50μg/mlを含む2培地5ml(グリセロール40g/l、硫酸アンモニウム 10g/l、KH2PO4 2g/l、K2HPO46g/l、酵母エキス40g/l、硫酸マグネシウム七水和物1g/l、消泡剤アデカノール20滴/l)で、37℃にて振とうしながら好気条件で、対数増殖後期(OD660=50)まで培養した。この培養液1mlをとり、再度500ml坂口フラスコに入れたクロラムフェニコール100μg/ml、アンピシリン50μg/mlを含む2培地100mlに植え継ぎ、37℃にて振とうしながら好気条件で、対数増殖後期(OD660=50)まで培養した。
グリセロールデヒドロゲナーゼの遺伝子を破壊するため、グリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子の配列(配列番号45)を解析し、開始コドンから830bp付近のKpnIサイトを選択し制限酵素サイトに破壊導入確認用の薬剤耐性マーカーを導入した。
ゲノム情報を元に以下のように、Lactobacillus reuteri JCM1112株のグリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子部分増幅用プライマーを作成した。
フォワードプライマー:5'-ATGGTTGAAGAATTTGGCTCACC-3'(配列番号51)
リバースプライマー:5'-TTACATACGACTATGGTGACAACG-3'(配列番号52)
PCRによる増幅の結果、目的の1112bpの断片が作成できたので、これを3'Aオーバーハング処理して更に精製し、インビトロジェンTOPO TAクローニングkitを用いたTAクローニングを行い、TOP10セルへと形質転換した。pCR4-TOPOベクターのTAクローニングサイトにLactobacillus reuteri JCM1112株のグリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子部が導入されたプラスミドを持つ形質転換体からプラスミド(pCR4-TOPO/Lb_GDH)を回収した。
既にインターネット上に公開されてるpIL253プラスミドの配列(http://www. ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=277339参照)を解析し、乳酸菌で薬剤耐性マーカーとして使用可能なエリスロマイシン耐性遺伝子とそのプロモーター、ターミネーター領域が含まれかつ両末端にKpnIサイトが存在するように配列番号46で表されるDNA断片を合成した。このDNA断片を以下の表1の組成で37℃、2時間、制限酵素処理を行い、精製回収し薬剤耐性マーカー配列とした。
a)直線化pCR4-TOPO/Lb_GDHの作成
以下の表2の組成で、37℃にて2時間制限酵素処理を行い、約4986bpの直線化プラスミドを回収した。
a)で作成した直線化プラスミドと2)で作成した薬剤耐性マーカー配列を、ライゲーション反応を行って連結し、E.coli TOP10セルに形質転換した。形質転換体の中から破壊導入断片を挿入配列として持つpCR4-TOPOプラスミド(hakai/ pCR4-TOPO)を選抜し、回収した。
b)で作成したhakai/ pCR4-TOPOをテンプレートに1)で使用したプライマーである
フォワードプライマー:5'-ATGGTTGAAGAATTTGGCTCACC-3'(配列番号51)
リバースプライマー:5'-TTACATACGACTATGGTGACAACG-3'(配列番号52)
を用いてPCRを行なったところ、2144bpの目的断片が増幅された。この断片を大量に精製及び濃縮し、平均5μg/μlの濃度に調製し、遺伝子破壊導入実験に用いた。
a)コンピテントセルの作成
以下の手順でコンピテントセルを作成した。
1. MRS培地10 ml×5に、終夜培養したL. reuteri菌液 各100mlを植菌し、OD600≒0.8まで培養した(試験管で培養を行った。ガスパックを使用した嫌気培養で約5〜5.5 h)。
2. 培養液×5本を50 mlファルコンチューブに移し、集菌後、滅菌蒸留水(室温) 30〜40 mlで3回洗浄した。
3. 滅菌蒸留水(室温) 800 mlで懸濁後、1.5 mlマイクロチューブに移し、集菌した。
4. 上清を廃棄後、30 % (wt/vol) PEG1500(dH2O) 250 mlで懸濁した。
5. 100 mlずつ分注し、−80℃で保存した。
6. 使用直前に溶解し、エレクトロポレーションに供した。
1. 供試プラスミド(5〜10 ml ; 2〜3 mg)を前記手法で作成したコンピテントセルに添加した。
2. 予め冷却しておいた0.2 cmキュベットに混合液を移した。
3. Gene pulserを2.5 kV, 25 mF, 200Ωにセットし、電気パルスを印加した。
4. すぐに、予め37℃で保温しておいたMRS brothをtotal 1 mlになるように添加し、37℃で1.5〜2 hインキュベートした。
5. MRS agar containing erythromycin (2 mg/ml)に塗抹し、37℃で24〜48 h嫌気培養した(ガスパックで嫌気培養を行った)。
b)の培養の結果生育してきたエリスロマイシン耐性株を選抜し、ゲノムを回収した。そのゲノムをテンプレートにPCRにてインサートの確認を行なった。薬剤耐性という形質と、ゲノム上での遺伝子の導入がPCRにて確認できた株を破壊導入株とした。
5)破壊株を用いた反応
対数増殖後期の菌体(Lactobacillus reuteri JCM1112株)ブロス10mlをpH8の50mMカリウムリン酸バッファ10mlで2回洗浄し、pH8の50mMカリウムリン酸バッファ10mlに再懸濁させ、氷冷しながら超音波にて菌体を破砕する。20,000×gで30分遠心し、上清を粗酵素液とした。この粗酵素液を適当に希釈し、アセチルCoAを加えたpH7.5のバッファに加え、37℃で反応させ、CoAの生成を定量した。その結果、CoAの生成が確認された。
また、Lactobacillus reuteri JCM1112株をゲノム解析した結果、ホスホトランスアシラーゼと相同性を持つorfが確認された。
Claims (10)
- Lactobacillus属細菌、Salmonella属細菌、Klebsiella属細菌、Listeria属細菌、Clostridium属細菌、Escherichia属細菌、Enterobacter属細菌、Caloramator属細菌、Acetobacterium属細菌、Brucella属細菌、Flavobacterium属細菌、Fusobacterium属細菌、Citrobacter属細菌及びPropionibacterium属細菌から選択される細菌において、グリセロールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子がノックアウトされたノックアウト細菌。
- pduオペロン及びホスホトランスアシラーゼをコードする遺伝子を有する細菌において、グリセロールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子がノックアウトされたノックアウト細菌。
- 請求項1又は2記載の細菌とグリセロールとを接触させることにより、1,3−プロパンジオール及び/又は3−ヒドロキシプロピオン酸を製造する方法。
- グリセロールデヒドラターゼ及び/又はジオールデヒドラターゼのラージサブユニットをコードする遺伝子、ミディアムサブユニットをコードする遺伝子及びスモールサブユニットをコードする遺伝子、グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子及び/又はジオールデヒドラターゼ再活性化因子のラージサブユニットをコードする遺伝子及びスモールサブユニットをコードする遺伝子、プロピオンアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、ホスホトランスアシラーゼをコードする遺伝子、プロピオン酸キナーゼをコードする遺伝子、並びに1,3−プロパンジオールオキシドレダクターゼをコードする遺伝子及び/又はプロパンジオールオキシドレダクターゼをコードする遺伝子を含み、グリセロールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を含まない、形質転換体。
- pduオペロンを有し、グリセロールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を含まない、請求項4記載の形質転換体。
- プロピオンアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードする遺伝子である請求項4又は5記載の形質転換体:
(a)配列番号41で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b)配列番号41で表されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつプロピオンアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。 - プロピオンアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、以下の(a)又は(b)のDNAを含む、請求項4又は5記載の形質転換体:
(a)配列番号42で表される塩基配列からなるDNA
(b)配列番号42で表される塩基配列の全部又は一部からなるDNAに対し相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつプロピオンアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。 - プロピオン酸キナーゼをコードする遺伝子が以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードする遺伝子である請求項4又は5記載の形質転換体:
(a)配列番号43で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b)配列番号43で表されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつプロピオン酸キナーゼ活性を有するタンパク質。 - プロピオン酸キナーゼをコードする遺伝子が、以下の(a)又は(b)のDNAを含む、請求項4又は5記載の形質転換体:
(a)配列番号44で表される塩基配列からなるDNA
(b)配列番号44で表される塩基配列の全部又は一部からなるDNAに対し相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつプロピオン酸キナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。 - 請求項4〜9のいずれか1項記載の形質転換体とグリセロールとを接触させることにより、1,3−プロパンジオール及び/又は3−ヒドロキシプロピオン酸を製造する方法。
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