KR101093199B1

KR101093199B1 - 글리세롤 대사능력 및 숙신산 생산능력이 향상된 재조합 미생물 및 이를 이용한 숙신산의 제조방법

Info

Publication number: KR101093199B1
Application number: KR1020090011453A
Authority: KR
Inventors: 이상엽; 전용재; 송효학
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2009-02-12
Filing date: 2009-02-12
Publication date: 2011-12-12
Also published as: WO2010093150A2; KR20100092190A; WO2010093150A3

Abstract

본 발명은 글리세롤 대사능력 및 숙신산 생산능력이 향상된 재조합 미생물 및 이를 이용한 숙신산의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 저가의 글리세롤을 효율적으로 세포의 탄소원으로 사용하여 숙신산을 고농도로 생산할 수 있도록 개량된 재조합 미생물 및 이를 이용한 숙신산의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 재조합 미생물은 현재 화학공정으로 생산되고 있는 유용물질인 숙신산을 종래 화학공정을 대체하여 생산효율이 우수하면서 환경친화적인 생물공정을 통해 생산할 수 있게 함으로써 숙신산과 같은 목적 대사산물의 생산가격 절감을 가져올 수 있으므로 유용하다. 더욱이 본 발명에 따른 재조합 미생물은 종래 기술에서는 단순히 약간의 아세트산, 젖산, 포름산, 피루브산 등의 부산물의 저감효과만을 얻었던 것과 달리, 부산물의 생산 없이 100% 순수한 숙신산을 생산할 수 있게 하는 장점이 있다.

GlpF, GlpK, GlpABC, CRP, SldAB, DhaK 숙신산, 글리세롤, 숙신산 생산 균주

Description

글리세롤 대사능력 및 숙신산 생산능력이 향상된 재조합 미생물 및 이를 이용한 숙신산의 제조방법{Recombinant Microorganism Having Enhanced Glycerol Metabolism and Succinic Acid-Productivity and Method for Preparing Succinic Acid Using the Same}

본 발명은 글리세롤 대사능력 및 숙신산 생산능력이 향상된 재조합 미생물 및 이를 이용한 숙신산의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 저가의 글리세롤을 효율적으로 세포의 탄소원으로 사용하여 숙신산을 고농도로 생산할 수 있도록 개량된 재조합 미생물 및 이를 이용한 숙신산의 제조방법에 관한 것이다.

과도한 화석원료 물질의 사용으로 인한 고유가와 환경오염 등의 문제를 해결하기 위한 방안으로 재생가능한 원료물질을 이용한 에너지 및 화학물질 생산기술의 개발이 요구되고 있다. 특히 재생 가능한 식물유래 오일을 이용한 바이오디젤 생산이 주목받고 있으나, 상기의 공정은 바이오디젤 합성과정에서 전체무게의 약 10%에 해당하는 글리세롤이 부산물로 발생한다는 단점이 있다. 최근 들어 전 세계적인 바 이오디젤 생산 산업의 급격한 성장과 함께, 이의 부산물로 발생하는 글리세롤의 공급과잉으로 인하여 가격이 하락하고 있으며, 이의 적절한 처리방법의 개발도 요구되고 있다 (McCoy M, Chem . Eng . News ., 84:7, 2006). 이에 가격이 저렴하면서 환원력이 높은 글리세롤을 고가의 포도당을 대신할 탄소원으로 사용하여 미생물 발효를 위한 원료물질로 사용하거나, 화학물질을 생산하기 위한 기술의 개발이 주목되고 있다.

비록 글리세롤을 업테이크하여 이를 탄소원으로 사용할 수 있는 능력을 보유하지 않은 일부의 미생물들이 존재하지만, 글리세롤을 주 탄소원 혹은 보조 탄소원으로 사용할 수 있는 많은 종류의 미생물들이 보고되고 있다. 특히 화학구조식이 C₃H₈O₃인 글리세롤은 미생물 발효를 통한 바이오 기반 에너지 및 화학물질 생산에 있어서 탄소원으로 사용되는 포도당보다 환원력이 높아서, 높은 환원력을 요구하는 물질의 원료물질 대비 수율 및 생산성을 향상시킬 수 있다는 장점을 가지고 있다. 이에 대사특성 및 유전학적 연구가 가장 많이 진행된 대장균을 이용하여 글리세롤 사용에 관한 연구, 특히 글리세롤을 사용하여 보다 환원된 에너지 및 화학물질을 생산하는 연구가 활발히 진행되고 있다 (Dharmadi et al., Biotechnol . Bioeng ., 94:822, 2006).

E. coli K-12 MG1655 균주의 글리세롤 대사 관련 유전자로 알려진 glpF , glpK, 및 glpD를 함유하는 재조합 벡터를 개발하여 글리세롤을 탄소원으로서 사용하는 대사능력을 가지지 않는 Corynebacterium glutamicum에 도입함으로써, 글리세 롤을 탄소원으로 사용하여 lysine과 glutamate 등의 아미노산을 생산을 시도한 보고가 있다. (Doris Rittmann et al ., Appl . Environ . Microbiol ., 74(20):6216, 2008). 상기의 연구는 호기 조건하에서 진행되었으며, 연구에 사용된 GlpD는 대장균에서 호기조건에서만 작용한다고 알려진 단백질이다.

두 번째 가능한 경로는 글리세롤을 글리세롤 세포 내 수송 촉진자(glpF)에 의해 도입한 후, 세포 내에서 디하이드록시아세톤(DHA)로 분해하고, 이를 디하이드록시아세톤 포스페이트(DHAP)로 분해하여 해당경로로 향하는 경우이다. 현재까지, 디하이드록시아세톤 카이네이즈를 코딩하는 유전자인 dhaK를 함유하는 재조합 벡터를 개발하여 대장균에 도입하므로써 혐기조건에서 글리세롤 발효를 통해 숙신산 합성을 시도한 예(Ramon Gonzalez et al ., Metabolic Engineering , 10:234, 2008)가 있다. 하지만, 상기 대장균의 경우, dhaK 유전자를 결실시키고, C. freundii의 dhaKL를 함유하는 재조합 벡터를 도입한 MG1655균주에서 숙신산 생산을 제시하였으나, 숙신산 생산 수율이 낮고, 세포 성장 속도가 느린 단점이 낮으며, 포름산을 포함한 다른 발효 부산물을 생산한다는 단점이 있다.

현재까지 글리세롤 조절자(regulator)관련 효소인 cAMP receptor protein에 대하여 대장균에서 글로벌 조절자로서의 특정 부위와 결합으로 전사를 촉진하는 메커니즘을 규명하고, 다른 glycerol과 다른 탄소원들을 사용할 때 생기는 catabolite repression관련된 연구가 진행되었다(Hanamura A. et al ., Mol . Microbiol., 6(17):2489, 1992; Boris Gorke et al ., Nature Reviews Microbiology, 6:613, 2008). 하지만, 맨하이미아 속, 액티노바실러스 속의 루멘박 테리아 군에서의 crp 유전자의 기능 규명은 이루어 있지 않고, crp를 함유하는 재조합 벡터를 상기 숙주세포에 도입하였을 때 글리세롤을 탄소원으로 사용하여 혐기 조건에서 발효를 통한 숙신산 생산을 증가시킨 예는 보고된바 없다. 이는 대다수의 미생물들이 글리세롤을 세포 내로 수송한 후 이를 분해하여 해당과정으로 연결시키는데 관련된 효소들의 조절(repressor, activator)에 관련된 메커니즘을 완전히 가지고 있지 않고, 글리세롤 대사 경로가 전혀 없거나 혹은 불완전하게 가지고 있음으로 글리세롤을 탄소원으로 이용할 수 없기 때문이다. 비록 대장균의 crp 유전자의 연구는 많이 이루어져 있으나, 글리세롤을 분해하는 속도가 느리고, 숙신산과 같은 혐기 발효를 통해 생산되는 목적 대사산물을 효율적으로 생산할 수 없는 것으로 알려져 있다.

한편, 글리세롤을 탄소원으로 사용할 수 있는 대사능력을 가지는 Anaerobiospirillum succiniciproducens 균주를 글리세롤을 함유한 배지에서 배양함으로써 숙신산 생산수율 증대를 시도한 예가 보고된 바가 있으나 (한국등록특허 제10-0313134호), 이는 부산물로서 발생하는 초산의 생성이 억제된 결과이다. 또한, 상기 균주의 혐기성 발효 시 초산 이외에 부산물로서 생성되는 포름산, 피루브산, 에탄올 등의 억제에 관한 연구 (미국등록특허 US 5,143,834A)가 보고되었으나, 글리세롤 대사에 관계하는 유전자를 조작하여 글리세롤 대사능력이 향상된 재조합 균주를 제작하여 100% 순수한 숙신산 생산에 성공한 예는 보고된 바가 없다.

이에 본 발명자들은 균주의 글리세롤의 이용능을 향상시켜 숙신산 생산을 향상시키고자 예의 노력한 결과, 글리세롤 관련 유전자인 글리세롤-3-포스페이트 디 하이드로지네이즈 (glpABC) 또는 글리세롤 디하이드로지네이즈를 코딩하는 유전자(sldAB)를 숙신산 생성능을 가지는 숙주세포에 도입한 결과, 상기 글리세롤 관련 유전자의 도입이 숙주세포에서 글리세롤 대사능 및 숙신산 생성능의 향상을 가져옴을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 보다 빠르고 효율적으로 글리세롤을 탄소원으로 사용할 수 있는 글리세롤 대사능력이 향상된 재조합 미생물 및 이의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 미생물을 이용한 숙신산의 생산방법을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 숙신산 생성능을 가지는 미생물에, 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 또는 글리세롤 디하이드로지네이즈(glycerol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터가 도입되어 있는, 글리세롤 대사능력 및 숙신산 생산능력이 향상된 재조합 미생물을 제공한다.

본 발명은 또한, 숙신산 생성능을 가지는 미생물의 염색체에, 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 또는 글리세롤 디하이드로지네이즈(glycerol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자가 삽입되어 있는, 글리세롤 대사능력 및 숙신산 생산능력이 향상된 재조합 미생물을 제공한다.

본 발명은 또한, 숙신산 생성능을 가지는 미생물에, 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 또는 글리세롤 디하이드로지네이즈(glycerol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터를 도입하는 것을 특징으로 하는 글리세롤 대사능력 및 숙신산 생산능력이 향상된 재조합 미생물의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 숙신산 생성능을 가지는 미생물의 염색체에, 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 또는 글리세롤 디하이드로지네이즈(glycerol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자가 삽입하는 것을 특징으로 하는 글리세롤 대사능력 및 숙신산 생산능력이 향상된 재조합 미생물의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 재조합 미생물을 글리세롤을 탄소원으로 함유하는 배양배지에서 배양하는 단계; 및 상기 배양액으로부터 숙신산을 회수하는 단계를 포함하는 숙신산의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 또는 글리세롤 디하이드로지네이즈(glycerol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명은 보다 빠르고 효율적으로 글리세롤을 탄소원으로 사용하여 숙신산을 생산할 수 있는 글리세롤 대사능이 향상된 재조합 미생물 및 이를 이용한 숙신 산의 제조방법을 제공하는 효과가 있다.

본 발명은 종래 글리세롤을 탄소원으로 가장 큰 문제점으로 지적되는 느린 세포 내 수송과 대사작용을 보다 빠르게 증가시켜 저가의 글리세롤을 효율적으로 세포의 탄소원으로 사용하는 방안을 제시함과 동시에, 현재 화학공정으로 생산되고 있는 유용물질인 숙신산을 종래 화학공정을 대체하여 생산효율이 우수한 생물공정을 통해 생산할 수 있게 하여 숙신산과 같은 목적 대사산물의 생산가격 절감을 가져올 수 있으므로 유용하다. 더욱이 본 발명에 따른 재조합 미생물은 종래 기술에서는 단순히 약간의 아세트산, 젖산, 포름산, 피루브산 등의 부산물의 저감효과만을 얻었던 것과 달리, 부산물의 생산 없이 100% 순수한 숙신산을 생산할 수 있게 하는 장점이 있다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명에서는 숙신산 생성능을 가지는 미생물에, 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 또는 글리세롤 디하이드로지네이즈(glycerol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자를 도입한 결과, 상기 유전자가 도입된 숙주세포의 글리세롤 대사능과 숙신산 생성능의 향 상을 가져옴을 규명하였다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, 숙신산 생성능을 가지는 미생물에, 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 또는 글리세롤 디하이드로지네이즈(glycerol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터가 도입되어 있는, 글리세롤 대사능력 및 숙신산 생산능력이 향상된 재조합 미생물에 관한 것이다.

이때, 본원에서, "벡터(vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 게 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수 개에서 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용 하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다. 라이게이션 후에, 벡터는 적절한 숙주세포로 형질전환되어야 한다. 형질전환은 칼슘 클로라이드 방법 또는 전기천공법(electroporation) (Neumann, et al., EMBO J., 1:841, 1982) 등을 사용해서 용이하게 달성될 수 있다.

본 발명에 따른 유전자의 과발현을 위하여 사용되는 벡터는 당업계에 공지된 발현 벡터가 사용될 수 있다.

염기서열은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결(operably linked)"된다. 이것은 적절한 분자(예를 들면, 전사 활성화 단백질)가 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서(enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑 터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.

당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질전환 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 재조합벡터 내에 포함되게 된다. 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 재조합벡터는 진핵 발현 숙주 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함하여야만 한다.

상술한 재조합 벡터에 의해 형질전환된 숙주 세포는 본 발명의 또 다른 측면을 구성한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체 외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다.

물론 모든 벡터가 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다.

아울러, 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 또는 글리세롤 디하이드로지네이즈(glycerol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자는 숙주세포의 게놈에 도입되어 염색체 상 인자로서 존재하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 있어 상기 유전자를 숙주세포의 게놈 염색체에 삽입하여서도 상기와 같이 재조합 벡터를 숙주세포에 도입한 경우와 동일한 효과를 가질 것은 자명하다 할 것이다.

따라서, 본 발명은 다른 관점에서,숙신산 생성능을 가지는 미생물의 염색체에, 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 또는 글리세롤 디하이드로지네이즈(glycerol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자가 삽입되어 있는, 글리세롤 대사능력 및 숙신산 생산능력이 향상된 재조합 미생물에 관한 것이다.

본 발명에서 상기 유전자를 숙주세포의 염색체상에 삽입하는 방법으로는 통상적으로 알려진 유전자조작방법을 사용할 수 있으며, 일 예로는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 비바이러스성 벡터를 이용하는 방법을 들 수 있다.

본 발명자들은 한우의 반추위로부터 동정한 숙신산 생성 균주인 Mannheimia succiniciproducens MBEL55E (KCTC 0769BP)의 전체 유전정보 및 대사특성을 규명하였으며 (Hong et al ., Nature Biotechnol ., 22:1275, 2004), 본 발명의 일 실시예 에서는 상기 균주의 유전정보 및 대사특성을 바탕으로 다른 균주와의 유사성 비교방법을 통하여 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈(GlpABC,MS1993-1995)를 코딩하는 유전자 glpABC (MS1993-1995: 서열번호 1) 및 glpF, glpK, glpABC 오페론의 프로모터 특정부위에 전사 활성자로 기능하는 것으로 알려진 cAMP 수용체(cAMP receptor)를 코딩하는 유전자 crp (MS1934: 서열번호 2)를 분리하였다.

또한, 글리세롤을 탄소원으로 사용할 수 있는 대사능력을 가진 것으로 알려진 C. acetobutylicum ATCC824로부터 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈를 코딩하는 유전자인 glpA (CAC1322: 서열번호 3)를 분리하였고, E. coli K-12 MG1655로부터 글리세롤을 세포 내로 확산시키는 것을 촉진하는 효소인 글리세롤 업테이크 촉진자 (glycerol uptake faciitator)를 코딩하는 유전자인 glpF (B3927: 서열번호 4) 및 상기 글리세롤을 글리세롤-3-포스페이트로 전환시키는 효소인 글리세롤 카이네이즈 (glycerol kinase)를 코딩하는 유전자인 glpK (B3926: 서열번호 5)를 분리하였다. 또한, Gluconobacter oxydans로부터 역시 글리세롤 디하이드로지네이즈를 코딩하는 유전자인 sldAB (GOX0854, 0855: 서열번호 6) 및 디하이드록시아세톤 디하이드로지네이즈를 코딩하는 유전자 dhaK (GOX2222: 서열번호 7)을 분리하였다.

아울러 본 발명의 일 실시예에서는 상기 분리한 유전자를 이용하여, glpABC 유전자 (서열번호 1)를 포함하는 재조합 벡터 pFglpABC를 제작하여 이를 도입한 형질전환 균주 Mannheimia succiniciproducens MBEL55E/pFglpABC(JYJM01) 균주를 제조하였고, glpA 유전자를 포함하는 재조합 벡터 pEglpA를 도입하여 형질전환 균주 Mannheimia succiniciproducens PALK/pEglpA(JYJM02)를 제조하였다. 또한, glpA 및 crp 유전자를 포함하는 재조합 벡터인 pACRP를 제작하여 이를 도입한 형질전환 균주 Mannheimia succiniciproducens PALK/ACRP(JYJM03) (KCTC11458BP)를 제조하고, glpA , glpF 및 glpK유전자를 포함하는 재조합 벡터인 pAFK를 제조하여 이를 도입한 형질전환균주인 Mannheimia succiniciproducens PALK/AFK (JYJM04) (KCTC11459BP)를 제조하였으며, sldAB 및 dhaK 유전자를 포함하는 재조합 벡터인 pSDGOX를 제작하여 이를 도입한 형질전환균주인 Mannheimia succiniciproducens PALK/SDGOX(JYJM05) (KCTC11460BP)를 제조하였다. 상기 균주는 모두 2009년 1월 23일자에 한국생명공학연구원 생물자원센터 유전자은행에 상기 기탁번호로 기탁되었다.

본 발명의 다른 실시예에서는 상기 제조된 Mannheimia succiniciproducens MBEL55E/pFglpABC(JYJM01) 균주와 이의 모균주인 M. succiniciproducens MBEL55E를 대비하여 글리세롤 대사능력 및 숙신산 생산능력을 측정한 결과, 모균주에 비하여 본 발명에 따른 균주인 Mannheimia succiniciproducens MBEL55E/pFglpABC(JYJM01) 균주의 글리세롤 대사능력 및 숙신산 생산능력이 현저히 향상된 것으로 나타났으며, 이에 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈 유전자인 glpABC의 도입이 숙신산을 생산하는 숙주세포를 글리세롤 대사능력 및 숙신산 생산능력이 향상되도록 형질전환시킴을 확인하였다. 아울러, 이와 달리 다른 글리세롤 대사 관련 유전자인 글리세롤 업테이크 촉진자를 코딩하는 유전자인 glpF나 글리세롤 카이네이즈인 glpK의 단독 도입은 오히려 숙주세포에 부정적인 영향을 가져오는 것으로 나타났다. 이에 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈 유전자의 도입이 글리세롤 대 사능력 및 숙신산 생산능력 향상에 필수적이며 단순히 글리세롤 대사관련 유전자를 도입이 바로 글리세롤 대사능력이 향상을 가져온다는 의미가 아님을 확인하였다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는 멘하이미아 속 균주가 아닌 클로스트리디움 속 유래의 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈 유전자인 glpA를 숙신산을 생산하는 균주인 M. succiniciproducens PALK (KCTC 10973BP)에 도입한 Mannheimia succiniciproducens PALK/pEglpA(JYJM02)균주의 글리세롤 업테이크 효율, 숙신산 생산량, 글리세롤 소비량을 측정한 결과, 역시 글리세롤 대사능 및 숙신산 생산능이 증가함을 확인하여 숙신산을 생산하는 맨하이미아 균주의 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네즈 유전자를 과발현시키는 경우뿐만 아니라, 타 속의 균주에서 분리한 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈 유전자를 도입하여 발현시키는 경우에도 글리세롤 대사능 및 숙신산 생산능이 증가함을 보였다.

아울러, 상기 Mannheimia succiniciproducens PALK/ACRP(JYJM03) (KCTC11458BP), Mannheimia succiniciproducens PALK/AFK(JYJM04) (KCTC11459BP), 및 Mannheimia succiniciproducens PALK/SDGOX(JYJM05) (KCTC11460BP)의 글리세롤 업테이크 효율, 숙신산 생산량, 글리세롤 소비량을 측정한 결과, 역시 글리세롤 대사능 및 숙신산 생산능이 현저히 증가됨을 확인하였다. 이에 본 발명은 바람직하게는 추가적으로 글리세롤 업테이크 촉진자(glycerol uptake facilitator)를 코딩하는 유전자, 글리세롤 카이네이즈(glycerol kinase)를 코딩하는 유전자, cAMP 수용체 (cAMP receptor)를 코딩하는 유전자 및 디하이드록시 아세톤 카이네이즈(dehydroxyaceton kinase)를 코딩하는 유전자 중 어느 하나 이상을 추가적으로 함유하는 것을 특징으로 할 수 있다. 이때, 상기 균주 중 Mannheimia succiniciproducens PALK/ACRP(JYJM03) (KCTC11458BP)균주의 글리세롤 대사능력 및 숙신산 생산능력이 가장 우수한 것으로 확인되었다.

숙신산 생산능을 가지는 숙주세포에 도입하여 발현된 효소 단백질의 숙신산 대사경로 참여는 상기와 같은 실험결과 및 유전정보와 대사특성에 관한 연구로 예측될 수 있으며, 이는 도 1과 같다.

이때, 본 발명에 있어서, 상기 숙신산 생산능을 가지는 숙주세포는 바람직하게는 맨하이미아 속(genus Mannheimia), 액티노바실러스 속(genus Actinobacillus) 및 언애로우바이오스필리움 속(genus Anaerobiospillium)으로 구성되는 군에서 선택된 미생물임을 특징으로 할 수 있다. 특히 액티노바실러스 속 및 언애로우바이오스필리움 속의 균주의 경우 맨하이미아 속의 균주와 동일한 숙신산 생산 대사경로와 유전정보를 가짐이 알려져 있는 바(Zeikus et al ., Appl Microbiol . Biotechnol., 51:545, 1999; McKinlay et al ., Appl Microbiol . Biotechnol ., 76:727, 2007), 본 발명의 실시예에서는 맨하이미아 속의 균주를 이용하여 실험하였으나, 동일한 숙신산 대사경로를 가지는 액티노바실러스 속 및 언애로우바이오스필리움 속의 균주를 숙주세포로 사용하여도 동일한 결과를 얻을 수 있다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 사항이라 할 것이다.

또한, 보다 바람직한 글리세롤 대사능 향상 및 숙신산 생산효과를 얻기 위하여 숙주세포로서 Mannheimia succiniciproducens MBEL55E (KCTC 0769BP), Mannheimia succiniciproducens MBEL55E로부터 젖산 탈수소화효소 유전자인 ldhA와 피르브산-개미산 분해효소 유전자인 pfl을 결실시켜 숙신산 생성능을 향상시킨 Mannheimia succiniciproducens LPK (KCTC 10558BP), Mannheimia succiniciproducens LPK 균주에서 추가적으로 포스포트랜스아세틸화효소 유전자인 pta와 아세트산 키나제 유전자인 ackA를 결실시켜 숙신산 생성능을 향상시킨 Mannheimia succiniciproducens LPK7 (KCTC 10626BP) (LEE et al ., Appl . Environ . Microbiol., 72:1939, 2006), Mannheimia succiniciproducens PALK(KCTC 10973BP), Mannheimia succiniciproducens PALK 균주에서 포스포트랜스아세틸화효소 유전자 pta를 과발현시킨 Mannheimia succiniciproducens ALK 및 Mannheimia succiniciproducens MBEL55E로부터 젖산 탈수소화효소 유전자 ldhA와 아세트산키나제 유전자 ackA를 결실시킨 변이균주 Mannheimia succiniciproducens ALKt로 구성된 군에서 선택되는 것이 바람직하나, 맨하이미아 속의 균주는 모두 동일한 숙신산 생산의 대사경로, 즉 PEP 카복시카이네이즈 대사경로(PEP carboxkinase pathway)에 의하여 숙신산을 생산하는 바 이에 한정되지 않고 맨하이미아 속에서 선택된 숙주세포를 사용하는 경우 본 발명에 따른 재조합 미생물을 수득할 수 있음은 자명하다고 할 것이다.

한편, 본 발명에 따른 재조합 미생물은 우수한 숙신산 생산효과를 가지는바, 본 발명은 다른 관점에서, 상기 숙신산 생성능이 향상된 재조합 미생물을 글리세롤을 탄소원으로 함유하는 배양배지에서 배양하는 단계; 및 상기 배양액으로부터 숙신산을 회수하는 단계를 포함하는 숙신산의 생산방법에 관한 것이다. 이때, 본 발명에서 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈로 glpABC를 도입하여 사용하는 경우 혐기조건에서 작용하는바, 상기 배양은 혐기조건에서 수행하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 배양배지에서 글리세롤은 글리세롤 이외의 다른 탄소원과 함께 함유되어 있는 것을 특징으로 할 수 있으며, 이때, 상기 글리세롤 이외의 다른 탄소원은 수크로오스(sucrose)인 것을 특징으로 할 수 있다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

특히, 하기 실시예에서는 Mannheimia succiniciproducens를 숙주세포로 하여 실험하여 숙신산 생성능 향상 효과를 확인하였으나, 다른 맨하이미아 속 균주 및 동일한 숙신산 생산 대사경로를 가지는 액티노바실러스 속(genus Actinobacillus) 및 언애로우바이오스필리움 속(genus Anaerobiospirillum)의 균주를 숙주세포로 사용하여서도 동일한 결과를 얻을 수 있다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 사항이라 할 것이다.

또한, 숙신산 생산을 위한 배양에 있어 회분식 배양만을 예시하였으나, 역시 유가식과 연속식 배양방법에 의하여 재조합 미생물을 배양하여서도 숙신산을 수득할 수 있다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 사항이라 할 것 이다.

실시예 1: 글리세롤 디하이드로지네이즈를 코딩하는 유전자의 분리

1-1: 맨하이미아 유래 glpABC 및 crp 유전자의 분리

맨하이미아 속 균주인 M. succiniciproducens MBEL55E(KCTC0769BP)로부터 다음과 같이, 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈를 코딩하는 유전자인 glpABC 및 cAMP 수용체(receptor) 단백질을 코딩하는 유전자인 crp를 분리하였다.

M. succiniciproducens MBEL55E(KCTC0769BP)의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 다음의 서열번호 8 및 9와, 10 및 11의 프라이머들을 사용하여 PCR을 수행함으로써 맨하이미아 속에서 강한 프로모터로 사용되는 fumC 유전자의 프로모터 DNA와 glpABC(MS1993,1994,1995)오페론 유전자의 DNA를 증폭하였고, 이들을 혼합한 것을 주형으로 서열번호 8과 11의 프라이머들을 사용하여 오버래핑 PCR(overlapping PCR)을 수행하였다. 마찬가지로, 서열번호 12 및 13와, 14 및 15의 프라이머를 사용한 PCR을 수행하여 맨하이미아 속에서 강한 프로모터인 Enolase 유전자의 프로모터 DNA와 crp(MS1934)의 DNA를 증폭하였고, 이들을 혼합한 것을 주형으로 서열번호 12과 15의 프라이머들을 사용하여 오버래핑 PCR을 수행하여 glpABC 및 crp를 분리하였다.

서열번호 8: 5'-TATACTGCAGACATCGGCATCAGTTATATCG-3’

서열번호 9: 5'-CGCAACCCAACATTGTATCACCTCATTGTAATA-3’

서열번호 10: 5'-TGAGGTGATACAATGTTGGGTTGCGTATTTTA-3’

서열번호 11: 5'-TATGGGATCCTTATTGGTTTATTGACATAG-3’

서열번호 12: 5'-TAGTGAGCTCTACTCTGTTACCGCAAATTG-3’

서열번호 13: 5'-TTGTTCTAGCATTTTTATTTTCCTCTTAGTTA-3’

서열번호 14: 5'-AGGAAAATAAAAATGCTAGAACAAGTGAATGCG-3’

서열번호 15: 5'-TGTCCATATGCTTATCTCGTACCGAATACC-3’

1-2: 클로스트리디움 아세토부틸리컴 유래 glpA 유전자의 분리

클로스트리디움 속 균주인 Clostridium acetobutylicum ATCC824로부터 다음과 같이, 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈를 코딩하는 유전자인 glpA 를 분리하였다.

먼저 Clostridium acetobutylicum ATCC824의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 18 및 19의 프라이머들을 이용해 glpA(CAC1322) 유전자의 DNA를 증폭하였고, 서열번호 16 및 17의 프라이머를 이용해 상기 실시예 1-1에 기재된 것과 같이, 맨하이미아 Enolase 프로모터 DNA를 증폭하였다. 이들을 혼합한 것을 주형으로 서열번호 16와 19의 프라이머들을 사용하여 오버래핑 PCR을 수행하여 glpA를 분리하였다.

서열번호 16: 5'-AGGAAAATAAAAATGCTAGAACAAGTGAATGCG-3’

서열번호 17: 5'-TGTCCATATGCTTATCTCGTACCGAATACC-3’

서열번호 18: 5'-AGGAAAATAAAAATGCTAGAACAAGTGAATGCG-3’

서열번호 19: 5'-TGTCCATATGCTTATCTCGTACCGAATACC-3’

1-3: 대장균 유래 glpF 및 glpK 유전자의 분리

에스케리키아 속 균주인 E. coli K-12 MG1655로부터 다음과 같이, 글리세롤 업테이크 촉진자(Glycerol uptake facilitator)를 코딩하는 유전자인 glpF 및 글리세롤 카이네이즈(Glycerol kinase)를 코딩하는 유전자인 glpK 유전자를 분리하였다. 즉, E. coli K-12 MG1655의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 20 및 21의 프라이머들을 사용하여 PCR을 수행하여 glpF(B3927)와 glpK(B3926) 유전자들을 포함하는 DNA를 증폭하였다.

서열번호 20: 5'-TGTGTCTAGAATGAGTCAAACATCAACCTT-3’

서열번호 21: 5'-TATACTGCAGACATTATTCGTCGTGTTCTT-3’

1-4: 글루코노박터 옥시단스 유래 sldAB, dhaK 유전자의 분리

글루코노박터 속 균주인 Gluconobacter oxydans로부터 다음과 같이, 글리세롤 디하이드로지네이즈를 코딩하는 유전자인 sldAB 및 디하이드록시아세톤 카이네이즈를 코딩하는 유전자인 dhaK를 분리하였다. sldAB(GOX0854,0855)는 관용명으로는 디-소비톨 디하이드로지네이즈 혹은 퀴노프로테인 글루코즈 디하이드로지네이즈(D-sorbitol dehydrogenase subunit SldA, subunit SldB)이지만, 글리세롤 디하이드로지네이즈로써도 기능하는 유전자이다. 즉, Gluconobacter oxydans의 게놈 DNA를 주형으로하고, 서열번호 22 및 23와 서열번호 24 및 25의 프라이머들을 사용하여 PCR을 수행하여 각각 sldAB(GOX0854,0855)와 dhaK(GOX2222) 유전자의 DNA를 증폭하였다.

서열번호 22: 5'-TCCGAATTCATGCCGAATACTTATGGCAGC-3’

서열번호 23: 5'-TATTGGTACCTTTCTCAGCCCTTGTGATCA-3’

서열번호 24: 5'- TATAGGTACCCTGGGGAGAATATCATGACCAAGATCTGCGGTGA-3’

서열번호 25: 5'-TATTGCATGCGGACGGGCTATAGATTACCG-3’

실시예 2: 재조합 벡터의 제조

2-1: 재조합 벡터 pFglpABC 의 제조

맨하이미아 유래의 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈를 코딩하는 유전자인 glpABC(MS1993,1994,1995)를 포함한 발현벡터를 다음과 같이 제작하였다.

실시예 1-1에서 증폭된 glpABC(MS1993,1994,1995)유전자를 포함하는 PCR 절편을 PstI 과 BamHI으로 절단하고, 이를 같은 절단효소로 자른 맨하이미아-대장균 셔틀벡터인 pME19-2 (Kim et . al ., FEMS Microbiol Lett.,278: 78-85, 2008)와 결합시켜 pME19-2FglpABC(MSU)를 제작하고, 이를 pFglpABC라고 명명하였다. 제작된 벡터는 도 2의 개열지도에 나타난 바와 같다.

이때, 상기 pME19-2 벡터는, 맨하이미아로부터 분리 보고된 pMVSCS1 (Kehrenberg et al., J. Antimicrob. Chemother., 49:383, 2002)과 대장균 벡터 puc19 (New England Biolabs)으로부터 맨하이미아/대장균 셔틀벡터 pME19-2를 이용하여 제조하였는데, 먼저 대장균 ori와 암피실린 내성유전자를 포함하는 puc19를 AatII으로 제한한 후, 회수한 단편과 pMVSCS1로부터 얻은 origin 단편(1.96kb; 서 열번호 26)을 AatII으로 제한한 후 회수한 단편을 T4 DNA ligase를 이용하여 접합하여 맨하이미아/대장균 셔틀벡터 pME19-2(4.7kb)를 제작하였다.

2-2: 재조합 벡터 pEglpA의 제작

클로스트리디움 속 유래의 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈를 코딩하는 유전자인 glpA 를 포함한 발현벡터를 다음과 같이 제작하였다.

상기 실시예 1-2에서 얻은 DNA단편을 HindIII 와 PstI 으로 절단하고, 이를 같은 절단효소로 자른 맨하이미아-대장균 셔틀벡터인 pME19-2와 결합시켜 pME19-2glpA(CAC)를 제작하고, 이를 pEglpA라고 명명하였다. 제작된 벡터는 도 3의 개열지도에 나타난 바와 같다.

2-3: 재조합 벡터 pACRP의 제작

클로스트리디움 속 유래의 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈를 코딩하는 유전자인 glpA 및 맨하이미아 속 유래의 cAMP 수용체(receptor) 단백질을 코딩하는 유전자인 crp를 포함한 발현벡터를 다음과 같이 제작하였다.

상기 실시예 1-1에서 증폭된 crp(MS1932) 유전자를 포함하는 PCR 절편을 SacI 과 NdeI으로 절단하고, 이를 같은 절단효소로 자른 실시예 2-2에서 제작된 pEglpA 에 결합시켜 pME19-2glpA(CAC)crp(MSU)를 제작하고, 이를 pACRP라고 명명하였다. 제작된 벡터는 도 4의 개열지도에 나타난 바와 같다.

2-4: 재조합 벡터 pAFK의 제작

클로스트리디움 속 유래의 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈를 코딩하는 유전자인 glpA와, 대장균 유래의 글리세롤 업테이크 촉진자(Glycerol uptake facilitator)를 코딩하는 유전자인 glpF 및 글리세롤 카이네이즈(Glycerol kinase)를 코딩하는 유전자인 glpK 유전자를 포함한 발현벡터를 다음과 같이 제작하였다.

먼저, 상기 실시예 1-2에서 얻은 DNA 단편을 각각 HindIII 와 PstI 으로 절단하고, 이를 같은 절단효소로 자른 맨하이미아-대장균 셔틀벡터인 pMS3와 결합시켜 pMS3EglpA(CAC)를 제작하였다. 다음으로, 실시예 1-3에서 증폭된 glpF(B3927)와 glpK(B3926)를 동시에 포함하는 DNA 조각을 XbaI과 PstI으로 절단하고, 이를 같은 절단효소로 자른 발현벡터 pMS3EglpA(CAC)와 결합시켜 pMS3EglpA(CAC)glpF(B3927)glpK(B3926)를 제작하고, 이를 pAFK라고 명명하였다. 제작된 벡터는 도 5의 개열지도에 나타난 바와 같다.

2-5: 재조합 벡터 pSDGOX의 제작

글루코노박터 속 유래의 글리세롤 디하이드로지네이즈를 코딩하는 유전자인 sldAB(GOX0854,0855) 및 디하이드록시아세톤 카이네이즈를 코딩하는 유전자인 dhaK(GOX2222)를 포함한 발현벡터를 다음과 같이 제작하였다.

실시예 1-4에서 증폭된 sldAB(GOX0854,0855) 유전자의 DNA를 포함하는 PCR 절편을 각각 EcoRI 과 KpnI으로 절단하고, 이를 같은 절단효소로 자른 맨하이미아- 대장균 셔틀벡터인 pMS3 (Jang et . al ., APPL. Environ. Microbiol.,,73(17) 5411-5420, 2007)와 결합시켜 pMS3sldAB를 제작하였다.

다음으로, 실시예 1-4에서 증폭된 dhaK(GOX2222) DNA 조각을 KpnI과 SphI으로 절단하고, 이를 같은 절단효소로 자른 발현벡터 pMS3sldAB와 결합시켜 pMS3sldABdhaK를 제작하고, 이를 pSDGOX라고 명명하였다. 제작된 벡터는 도 6의 개열지도에 나타난 바와 같다.

실시예 3: 재조합 균주의 제조

3-1: Mannheimia succiniciproducens MBEL55E / pFglpABC ( JYJM01 ) 균주의 제작

글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈를 코딩하는 유전자인 glpABC(MS1993,1994,1995)를 포함한 발현벡터인 pFglpABC를 다음과 같이 도입하여 재조합 균주를 제조하였다. 균주의 제작을 위하여 숙주세포로는 글리세롤 대사능이 미약한 M. succiniciproducens MBEL55E(KCTC0769BP) 균주를 모델 미생물로 하기의 실험을 진행하였다.

M. succiniciproducens MBEL55E (KCTC0769BP)를 10g/L의 포도당을 함유한 LB-포도당 고체배지에 도말하여 36시간 동안 37℃에서 배양한 후, 콜로니를 LB-포도당 액체배지 10 mL에 접종하여 12 시간 배양하였다. 충분히 자란 배양액을 LB-포도당 액체배지 100 mL에 1% 접종하여 200 rpm, 37℃ 진탕 배양기에서 배양하였다.약 4~5 시간 후, OD600가 0.3 ~ 0.4 정도가 되면 4℃, 4,500 rpm, 20분 조건으로 원심분리하여 세포를 수득한 다음, 4℃ 상태의 10% 글리세롤 용액 200 mL로 세포를 재현탁 하였다. 그리고 4℃, 5,500 rpm, 20 분 조건으로 원심분리하여 세포를 수득하였다. 재현탁시 사용되는 글리세롤 용액을 반으로 줄여가며 이를 두 번 연속 실행한 후, 세포와 글리세롤 용액 부피비가 1:1이 되도록 재현탁하여 세포 농축액을 수득하였다. 상기 수득된 세포 농축액과 상기 실시예 2-1에서 제작된 pFglpABC를 혼합한 다음, 2.5 kV, 25 μF, 400 ohms의 조건으로 전기천공법(electroporation)을 수행함으로써, 상기 발현 벡터를 배양된 M. succiniciproducens MBEL55E에 도입시켰다.

전기충격 후, LB-포도당 액체배지 1 mL을 가하여 200 rpm, 37℃ 진탕 배양기에서 1시간 동안 배양하였다. 배양액을 항생제 암피실린(최종농도 50 ㎍/L)를 함유한 LB 고체 배지에 도말하여, 37℃에서 12 시간 이상 배양하였다. 형성된 콜로니를 암피실린 항생제가 함유된 LB-포도당 액체배지에서 12시간 이상 배양하여, M. succiniciproducens MBEL55E pFglpABC를 준비하였고, 이를 Mannheimia succiniciproducens MBEL55E/pFglpABC(JYJM01) 균주라고 명명하였다.

3-2: Mannheimia succiniciproducens PALK / pEglpA ( JYJM02 ), Mannheimia succiniciproducens PALK/ACRP(JYJM03), Mannheimia succiniciproducens PALK / AFK ( JYJM04 ), Mannheimia succiniciproducens PALK/SDGOX(JYJM05) 및 M. succiniciproducens PALK pMS3 균주의 제작

상기 실시예 3-1에 기재된 방법과 동일한 방법으로 Mannheimia succiniciproducens PALK(KCTC 10973BP)를 실시예 2-2, 2-3, 2-4 및 2-5 에서 제작된 pEglpA, pACRP, pAFK 및 pSDGOX를 이용하여 형질전환시켰고, 이들을 Mannheimia succiniciproducens PALK/pEglpA(JYJM02), Mannheimia succiniciproducens PALK/ACRP(JYJM03), Mannheimia succiniciproducens PALK/AFK(JYJM04) 및 Mannheimia succiniciproducens PALK/SDGOX(JYJM05) 균주라고 명명하고, 이 중 Mannheimia succiniciproducens PALK/ACRP(JYJM03), Mannheimia succiniciproducens PALK/AFK(JYJM04), 및 Mannheimia succiniciproducens PALK/SDGOX(JYJM05)를 각각 한국생명공학연구원 생물자원센서 유전자은행에 2009년 1월 23일자에 각각 기탁번호 KCTC11458BP, KCTC11459BP 및 KCTC11460BP로 기탁하였다. 또한, 같은 방법으로 대조군으로 pMS3를 M.succiniciproducens PALK로 형질전환을 수행하여 M. succiniciproducens PALK pMS3 균주를 준비하였다.

실시예 4 : Mannheimia succiniciproducens MBEL55E / pFglpABC ( JYJM01 ) 균주 및 모균주(MBEL55E)간의 글리세롤 발효 및 숙신산 생산 양상 비교

글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈를 코딩하는 유전자인 glpABC(MS1993,1994,1995)를 도입한 본 발명에 따른 Mannheimia succiniciproducens MBEL55E/pFglpABC(JYJM01) 균주의 글리세롤 대사능 및 숙신산 생산능의 향상 여부를 살피기 위하여 다음의 실험을 수행하였다.

상기 실시예 2-1에서 만들어진 재조합 JYJM01 균주를 BHI (BactoTM Brain Heart Infusion; Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD) 배양배지에서 8시간 정도 배양한 다음, 1ml을 수득하여 20ml의 MH5 글리세롤 배양 배지 (liter 당: 2.5g of yeast extract, 2.5g of polypeptone, 1g of NaCl, 8.7g of K₂HPO₄, 10g of NaHCO₃, 0.02g of CaCl₂2H₂O, 0.2g of MgCl₂6H₂O 및 5g of glycerol)에서 혐기조건으로 39℃에서 16 시간 동안 배양한 후, 4번 정도 계대 배양하였다. 이를 다시 같은 조성의 250ml의 배양배지가 들어있는 플라스크에 5ml 옮겨 39℃에서 약 16시간 배양하였다. 이때 모든 배양 과정에서 항생제로 100μg/L 암피실린을 첨가하였다.

그 다음 상기 플라스크의 Mannheimia succiniciproducens MBEL55E/pFglpABC(JYJM01) 균주 배양액을 표 1의 복합배지 2.25L에 접종한 다음 회분식 발효를 수행하였다. 발효조건은 44시간 동안 5g/L 초기 글리세롤 농도, pH 6.8, 배양 온도 39℃로 하였다. 발효 중 pH의 조정을 위하여 암모니아수를 사용하였으며, 항생제 암피실린의 농도는 상기와 같이 100μg/L로 하였다.

발효 중 샘플은 주기적으로 채취하였으며, 배양액 내의 세포농도는 분광광도계를 이용하여 OD₆₀₀의 값으로 측정하였다(1 OD₆₀₀=0.451gDCWL^-1; Lee et al.,Appl. Environ. Microbiol. 72(3): 1939-1948,2006). 채취된 시료는 13,000 rpm에서 5분 동안 원심분리한 후, 상등액의 글리세롤 및 대사산물의 농도를 액체크로마토그래피(HPLC)로 분석하였다. 한편, 대조군으로서 모균주(Mannheimia succiniciproducens MBEL55E)를 동일한 조건으로 회분식 발효를 수행하여 분석하였다.

[표 1]MH5 복합배지 조성(회분식발효용)

Glycerol 55, 110mM	12.5g, 25g
Yeast extract	12.5g
Polypeptone	12.5g
NaCl	2.5g
K₂HPO₄	21.77g
NaHCO₃	24.99g
CaCl₂2H₂0	0.05g
MgCl₂6H₂0	0.5g
DW	2.25L

[표 2]

Strain	Plasmid	Final Succinic acid production for 44h(g/L)	Glycerol consumed for 44h(g/L)	Overall glycerol consumption rate(g/l/h/gDCW)
MBEL55E	-	3.31	1.81	0.0170
MBEL55E	pFglpABC	4.68	4.02	0.0447

그 결과, 표 2 및 도 7에 나타난 바와 같이, 상기와 같은 혐기조건에서 44시간 동안 본 발명에 따른 균주인 Mannheimia succiniciproducens MBEL55E/pFglpABC(JYJM01) 균주의 경우 4.02 g/L의 글리세롤을 소모하였고, 그 결과 4.68 g/L의 숙신산, 1.41 g/L의 아세트산을 생산하였다. 또한, 전체 균체 무게당 글리세롤 업테이크 속도(overall glycerol uptake rate)는 대조군인 모균주 MBEL55E에 비해 약 2배 정도 향상되었다.

이러한 실험 결과는 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈의 도입이 글리세롤의 업테이크 속도를 향상시키면서 숙신산의 생산능은 증가시켰음을 보여준다. 또한, 모균주와 대비하여 Mannheimia succiniciproducens MBEL55E/pFglpABC(JYJM01) 균주의 생장능 역시 향상된 것으로 나타난 바, glpABC 유전자의 과발현이 글리세롤 배지상에서 생장에도 효과적임을 알 수 있다.

한편, M. succiniciproducens MBEL55E(KCTC0769BP)로부터 글리세롤 업테이크 촉진자(glycerol uptake facilitator)를 코딩하는 glpF (MS1990) 및 글리세롤 카이네이즈(glycerol kinase)를 코딩하는 glpK(MS1988)의 재조합벡터를 각각 도입한 균주에 상기와 같은 동일한 실험을 수행하였다. 상기 glpF (MS1990)를 포함하는 재조합 벡터와 glpK(MS1988)를 포함하는 재조합벡터는 실시예 1-1과 동일하게 다음과 같이 제조하였다.

먼저, M. succiniciproducens MBEL55E(KCTC0769BP)의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 다음의 서열번호 27 및 28와, 29 및 30의 프라이머들을 사용하여 PCR을 수행함으로써 맨하이미아 속에서 강한 프로모터로 사용되는 fumC 유전자의 프로모터 DNA와 glpF(MS1990)오페론 유전자의 DNA를 증폭하였고, 이들을 혼합한 것을 주형으로 서열번호 27과 30의 프라이머들을 사용하여 오버래핑 PCR(overlapping PCR)을 수행하였다. 상기와 같은 방법으로, 다음의 서열번호 31 및 32와, 33 및 34의 프라이머들을 사용하여 PCR을 수행함으로써 맨하이미아 속에서 강한 프로모터로 사용되는 fumC 유전자의 프로모터 DNA와 glpK(MS1988)오페론 유전자의 DNA를 증폭하였고, 이들을 혼합한 것을 주형으로 서열번호 31과 34의 프라이머들을 사용하여 오버래핑 PCR(overlapping PCR)을 수행하였다.

서열번호 27: 5'-TATAGAGCTCACATCGGCATCAGTTATATC-3

서열번호 28: 5'-GAAAAGAGGCAATGTATCACCTCATTGTAATA-3

서열번호 29: 5'-TGAGGTGATACATTGCCTCTTTTCTTTTATTT-3

서열번호 30: 5'-GTAGAAGCTTGTTATATATTTGTGATTTTA-3

서열번호 31: 5'-TAACGGATCCACATCGGCATCAGTTATATC-3

서열번호 32: 5'-AATATGTGTTCAATGTATCACCTCATTGTAATA-3

서열번호 33: 5'-TGAGGTGATACATTGAACACATATTTTATAAA-3

서열번호 34: 5'-TACGCTGCAGTTATTCCACGTCTTCTTTCG-3

그 다음, 맨하이미아 유래의 글리세롤 업테이크 촉진자를 코딩하는 유전자인 glpF(MS1990)를 포함한 발현벡터는, 증폭된 glpF(MS1990)유전자를 포함하는 PCR 절편을 SacI 과HindIII으로 절단하고, 이를 같은 절단효소로 자른 맨하이미아-대장균 셔틀벡터인 pME19-2 (Kim et . al ., FEMS Microbiol Lett., 278: 78-85, 2008)와 결합시켜 pME19-2FglpF(MSU)를 제작하고, 이를 pFglpF라고 명명하였다.

또한, 증폭된 glpK(MS1988)유전자를 포함하는 PCR 절편을 SalI 과 PstI으로 절단하고, 이를 같은 절단효소로 자른 맨하이미아-대장균 셔틀벡터인 pME19-2 (Kim et . al., FEMS Microbiol Lett.,278: 78-85, 2008)와 결합시켜 pME19-2FglpK(MSU)를 제작하고, 이를 pFglpK라고 명명하였다.

상기 제작된 두 벡터는 각각 M. succiniciproducens PALK 균주에 도입하여 그 결과를 살펴보았다.

그 결과, glpF를 단독으로 도입한 경우 도 8과 같이 글리세롤 업테이크 효율과 숙신산 생산 효율이 본 발명에 따른 균주처럼 현저히 증가하지 않음을 확인할 수 있었다. 더욱이, 이를 pMS3 벡터만을 도입한 M. succiniciproducens PALK pMS3 균주와 대비 시 오히려 숙신산 생산효율이 좋지 않은 것으로 나타났다.

또한, glpK를 단독으로 도입한 경우 세포 용해(cell lysis)가 발생하여 회분식 발효자체가 불가능하였으며, 이는 글리세롤에서 glpK의 과발현이 세포 성장에 부정적인 영향을 준다는 보고 (Marie M. Zhu et al ., Biotechnol . Prog ., 18:694, 2002)와 일치하는 것으로 보인다.

이러한 실험 결과는 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈 유전자의 도입이 글리세롤 대사능 및 숙신산 생산능 향상에 필수적임을 보여준다.

실시예 5: Mannheimia succiniciproducens PALK / pEglpA ( JYJM02 ), Mannheimia succiniciproducens PALK / ACRP ( JYJM03 ), Mannheimia succiniciproducens PALK/AFK(JYJM04), 및 Mannheimia succiniciproducens PALK / SDGOX ( JYJM05 ) 균주 균주의 글리세롤 발효 및 숙신산 생산 양상 분석

추가적으로 멘하이미아 속 균주 유래 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈를 코딩하는 유전자인 glpABC 이외의 다른 속의 균주 유래 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈를 코딩하는 유전자를 도입한 경우에도 동일하게 글리세롤 대사능 및 숙신산 향상 효과를 가져오는지 확인하기 위하여, 실시예 4의 클로스트리디움 속 유래의 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈를 코딩하는 유전자인 glpA 를 도입한 Mannheimia succiniciproducens PALK/pEglpA(JYJM02) 균주에 대하여 실험하였다.

또한, 추가적으로 글리세롤 업테이크 촉진자(glycerol uptake facilitator)를 코딩하는 유전자, 글리세롤 카이네이즈(glycerol kinase)를 코딩하는 유전자 및 cAMP 수용체 단백질을 코딩하는 유전자를 함께 도입한 경우의 글리세롤 대사능 및 숙신산 향상 효과를 살펴보기 위하여, 실시예 4의 Mannheimia succiniciproducens PALK/ACRP(JYJM03), Mannheimia succiniciproducens PALK/AFK(JYJM04) 및 Mannheimia succiniciproducens PALK/SDGOX(JYJM05) 균주에 대하여 실험을 수행하였다.

실험은 Mannheimia succiniciproducens MBEL55E(KCTC0769BP)를 기반으로 대사공학적으로 개량된 genome-engineered 균주인 PALK(KCTC 10973BP)를 모델로 하여 진행하였다. 실시예 4에서 설명한 방법과 같은 방법으로, 상기의 Mannheimia succiniciproducens PALK/pEglpA(JYJM02), Mannheimia succiniciproducens PALK/ACRP (JYJM03), Mannheimia succiniciproducens PALK/AFK (JYJM04), Mannheimia succiniciproducens PALK/SDGOX (JYJM05) 균주 및 대조군인 PALKpMS3 균주들을 회분식 발효를 수행하였다. 발효 배지는 상기 표1에 나타난 바와 같으며, 이중 글리세롤 110mM를 탄소원으로 사용하여 진행하였다.

그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, 글리세롤을 단일 탄소원으로 포함한 MH5 복합배지에서 대조군인 PALK pMS3균주에 비하여, Mannheimia succiniciproducens PALK/pEglpA(JYJM02), Mannheimia succiniciproducens PALK/ACRP (JYJM03), Mannheimia succiniciproducens PALK/AFK (JYJM04), Mannheimia succiniciproducens PALK/SDGOX (JYJM05) 균주의 글리세롤 업테이크 효율과 소비율, 숙신산 생산능 모두 더 우수함을 확인할 수 있었다.

특히 도 10에 나타난 바와 같이, 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈 를 코딩하는 유전자 및 cAMP 수용체 단백질을 코딩하는 유전자를 도입한 Mannheimia succiniciproducens PALK/ACRP (JYJM03) 균주는, 다른 균주들보다 훨씬 빠른 15시간 동안 8.06 g/l의 글리세롤을 대사하여, Maximum OD₆₀₀이 2.31로 바이오매스의 증가를 보였다.

또한, Mannheimia succiniciproducens PALK/ACRP (JYJM03) 균주는 30시간 동안 8.78g/L의 글리세롤을 소모하며, 최종적으로 숙신산을 11.42g/L 생산하였다. 이는, 1.30 g Succinic acid/g Glycerol의 수율로 생산한다는 것을 의미하며, 이론치에 근접한 상당히 높은 수율이다. 이때, 부산물인 아세트산, 젖산, 포름산, 피루브산이 전혀 생산되지 않아, 100% 순수한 숙신산이 생산해 낼 수 있었다.

이러한 실험결과는 숙신산을 생산하는 맨하이미아 균주에서 자체 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네즈 유전자를 과발현시키는 경우뿐만 아니라, 타 속의 균주에서 분리한 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈 또는 글리세롤 디하이드로지네이즈 유전자를 도입하여 발현시키는 경우에도 글리세롤 대사능 및 숙신산 생산능이 증가하는 것을 의미한다.

또한, 상기 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈 또는 글리세롤 디하이드로지네이즈 유전자 이외에 글리세롤 업테이크 촉진자(glycerol uptake facilitator)를 코딩하는 유전자, 글리세롤 카이네이즈(glycerol kinase)를 코딩하는 유전자 및 cAMP 수용체 단백질을 코딩하는 유전자를 함께 도입하여 글리세롤 대사능 및 숙신산 생산능이 증가시킬 수 있음을 나타낸다.

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 숙신산 생산 루멘 박테리아 균주인 Mannheimia succiniciproducens 에서 글리세롤을 섭취하고 분해되어 해당과정을 통해 대사되는 경로를 나타내는 모식도이다 (가는 선: 재조합 맨하이미아가 원래 가지고 있는 해당과정의 대사경로를 나타냄. 굵은 선: 도입한 Gluconobacter oxydans 유래의 글리세롤 대사관련 효소들에 의해 관장될 것으로 예상되는 대사경로를 나타냄).

도 2는 재조합 벡터 pFglpABC의 개열 지도이다.

도 3은 재조합 벡터 pEglpA의 개열 지도이다.

도 4는 재조합 벡터 pACRP의 개열 지도이다.

도 5는 재조합 벡터 pAFK의 개열 지도이다.

도 6는 재조합 벡터 pSDGOX의 개열 지도이다.

도 7은 모균주 MBEL55E와 JYJM01균주의 글리세롤 배지상에서의 회분식 발효 결과의 비교하는 그래프이다.

도 8은 pFglpF를 도입한 M. succiniciproducens PALK pFglpF 균주의 글리세롤 배지상에서의 회분식 발효결과를 나타내는 그래프이다.

도 9는 본 발명에 따른 재조합 균주인 Mannheimia succiniciproducens PALK/pEglpA(JYJM02), Mannheimia succiniciproducens PALK/ACRP(JYJM03), Mannheimia succiniciproducens PALK/AFK(JYJM04), Mannheimia succiniciproducens PALK/SDGOX(JYJM05) 및 대조군인 PALKpMS3 균주의 글리세롤 배지상에서의 회분식 발효 결과를 비교한 그래프로, (A)는 전체 균체 무게당 글리세롤 업테이크 속 도(Overall glycerol uptake rate)을 나타내며, 그 단위는 g/L/h/gDCW이고, (B)는 최종 숙신산 생산 (Final succinic acid production)을 나타내는 그래프로, 그 단위는 g/L이며, (C)는 소비된 글리세롤의 량을 나타내는 그래프이며, 그 단위는 g/L이다.

도 10은 Mannheimia succiniciproducens PALK/ACRP (JYJM03)균주의 글리세롤 배지상에서의 회분식 발효 결과를 나타내는 그래프이다.

<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Recombinant Microorganism Having Enhanced Glycerol Metabolism and Succinic Acid-Productivity and Method for Preparing Succinic Acid Using the Same <130> P08-B166 <160> 34 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 4317 <212> DNA <213> glpABC gene isolated from Mannheimia succiniciproducens MBEL55E <400> 1 atgttgggtt gcgtatttta tttaacaacc aatcaattta ctttcactcg tgggggcatt 60 atgggaatgt catctcaact ttataaaaat gttggtgatt tttcacctat taatactgat 120 gtgattatta tcgggggcgg tgccaccggt gccggtgtgg ctcgagattg ttcattacgc 180 ggtttgaaat gcgtattgtt agagcgtcat gatattgcga ccggtgcgac gggccgtaat 240 cacggcttgc tccacagcgg cggtcgttat gcagtcaatg atcgtgaatc cgccgaagaa 300 tgtatcaaag aaaatcttat tttaaaacgt attgcccgtc attgtgtgga tgacacgaaa 360 ggcttattta tcactctgcc ggaagatgat cttgactatc agaaaaaatt tatcgaggct 420 tgtcaggcat ccggcattga agcggaagcc attgatccgg ctttagcaaa atttatggaa 480 ccttccgtga atccggattt agtcggcgcg gtagtagttc ccgacggttc tatcgacccg 540 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cactgagcgt 1440 aattaccgtt acgcaggctg gaaaaaagcg gttaaacgcg cgatggcgtg ggaagaacac 1500 gacgaataa 1509 <210> 6 <211> 2232 <212> DNA <213> sldAB gene isolated from Gluconobacter oxydans <400> 6 atgcgcagat cccatcttct cgccaccgtt gcctgtgcca cgctggcctg cgcaccgctg 60 gctgccaatg cccagttcgc ccccgcaggc agcggtggct cgccgacctc ctccgtgccg 120 ggccccggca atggcagcgg caattccttc gagccgaccg agaacacgcc ggccgcgaag 180 agccgctttt ccggcccgtc cccctatgcg ccccaggctc cgggtgtgaa cgcggccaac 240 ctgccggata tcgggtccat ggatccgaac gacgttccgc agatggcccc gcagcagagt 300 gccagccccg cctccggaga ctgggccgcc tacggccatg acgacagtca gatgcgctat 360 tcgccgctgt ccgagatcac gccgcagaac gccgatcagc tcaaggtcgc tttcgtctat 420 cacaccggta gctatccgcg tccgggccag acgaacaaat gggctgccga aaccaccccg 480 atcaaggtgg gtgacggcct ctacatgtgc tcggcacaga acgacatcat gaagatcgac 540 ccggcgacgg gtaaggagat ctggcgtcac aacatcaacg agaaatacga agccatcccc 600 tacaccgcag cgtgcaaggg cgtgacgtat ttcacgtcgt ctcaggtgcc cgaaggccag 660 ccctgccata accgtatcct tgaaggcacg ctcgacatgc gcctgatcgc ggttgatgcc 720 gcgaccggca atctgtgcga aggcttcggc aatggcggcc aggtcaacct gatgcagggt 780 cttggcgaat ccgtccccgg cttcgtctcc atgacgacgc cgccgccggt cgtgaacggt 840 gtggttgtgg tcaaccacga agttctcgac ggtcagcgcc gctgggctcc gtcgggtgtg 900 atccgtggct atgatgccga gagcggcaag ttcctgtggg cctgggacgt gaaccgcccc 960 aacgatcaca gccagccgac cggcaacaac cattacagcc gtggtacgcc gaactcctgg 1020 gctgcgatga ccggcgacaa tgcgctgggc ctcgtctacg tcccgaccgg caactcggct 1080 tccgattact acagtgccct gcgtagccct gaagaaaaca aggtctcgtc cgcagttgtc 1140 gcgcttgacg taaagacggg ttcgccgcgc tgggtcttcc agaccgttca caaggacgtc 1200 tgggactatg acatcggctc gcaggccacc ctcatggaca tgcccggcca ggatggtcag 1260 cctgttcccg cactcatcat gccgaccaag cgtggccaga ccttcgtgct cgaccgtcgt 1320 gacggcaagc cgatcctgcc ggtcgaagag cgtcccgctc cgtcgccggg cgtgatcccg 1380 ggcgatccgc gttcgccgac gcagccctgg tccacgggaa tgccggctct gcgcgtgccg 1440 gatctgaaag agacggatat gtggggcatg tcccccatcg accagctctt ctgccgtatc 1500 aagttccgcc gtgcgaacta tacgggtgag ttcacgccac 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ccgatctcgt gcgatatgtg cgcggcggtg tgcttcgggc aaccccgggc 120 cgtcgcggca aggtggctgt tgtgctgggc ggtggctcgg gacattatcc ggcctttgcg 180 ggctatgtcg gtccgggctt cggcgatgcg gcagtggcgg gggatatctt cgcctcgccc 240 tccacgcagg ccatcaagag cattgctcgc caggccgatc tggacggcgg gatcattctc 300 ggttacggca actatgccgg ggacgtgctc aatttcggga tcgcagcgga ccgcctgcgc 360 gaagagggct atgacgtccg tgttctggcg acggcagatg atgtggccag ctcggatgcc 420 tctacacggg agaagcggcg cggaattgcc ggggatctgg tgattttccg gatcgtgggc 480 gctgcagccg aggcggggct gacgctcgac gaagtcgagg aagtcgcgca gcgggtgaac 540 cgtcagacct gcacgttcgg cgtggcgttc gatggctgca cgctgccggg cgagaaggaa 600 aagttgttcg aagttccgaa gaaccgcatg gcgctcgggt taggggtgca tggcgagccc 660 ggcattgacg agcaggatgt tccggacccg gagcatctgg cgcagatcct gttcgaccgt 720 ctgctggcag agcttccgga aggggcgtcg cgccgggtag ccgtcctgct gaacggtctg 780 ggcagcacca agcaggaaga gctgttcgtc ctgtgggacc ggctggtgcc aatgttcgaa 840 aaggcaggtc tgacgctcgt ggcgccgctg gtgggtgagt acgttacgag ccttgatatg 900 gcgggctgct cgctaacgct gacctggctc gatgaggatc tggagcggta ctggcgatcc 960 cctgtggaat ctgcagcgct gagccatggg cagctgagcg gggacggaat cacgcggctt 1020 gaagtccctg aggaaaccga gatcctgtac atgcgctccg gaacggcgca ggggcgtcgt 1080 ggcggaacct gtgtggccgc tgtcatggat catctggccc ggacactggc ggaagcggag 1140 tctgacctgg ggcatatcga tgctgtggtt ggggacgggg accatggaca gggcatggct 1200 cgcggctcgg cggcagcagc gaaggtagcg cgggctgcgg cggatgccgg cgctgggcca 1260 gcgacggttc tggcctcggc ggcggacgcc tgggcggaca gggccggggg aacatccggg 1320 gcgctctggg gcgaggggct gcgggccttc agtctggcgt tcgatgacaa cagcctgccc 1380 gatgcacagc agctttcagg cggtgcacgg aacagcatgg aacgcatcat ggagcttggc 1440 cgggcaaaac ccggcgacaa gacactggta gatgcgctgg tgccgtttgt tgaaacgctg 1500 gagaaggctc tggccgcggg gcatgggctt gtggaagcct ggcagatggg ggcgcaggcg 1560 tctcatgaag cagcgcaggc cacgcgtgat cttctacccc ggatgggacg tgcgaaaatg 1620 catggtgagc gtagcaaggg ccacccggat gcaggtgcgc tctcgctggc actgtgtgcg 1680 cggatcgtgg gggaagatct gggcaggggc ctggcctctc cgggcggaga aggcgatcag 1740 acagaggcgg ttcgtctggt gaaagccggc cggtaa 1776 <210> 8 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 tatactgcag acatcggcat cagttatatc g 31 <210> 9 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 cgcaacccaa cattgtatca cctcattgta ata 33 <210> 10 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 tgaggtgata caatgttggg ttgcgtattt ta 32 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 tatgggatcc ttattggttt attgacatag 30 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 tagtgagctc tactctgtta ccgcaaattg 30 <210> 13 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 ttgttctagc atttttattt tcctcttagt ta 32 <210> 14 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 aggaaaataa aaatgctaga acaagtgaat gcg 33 <210> 15 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 tgtccatatg cttatctcgt accgaatacc 30 <210> 16 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 aggaaaataa aaatgctaga acaagtgaat gcg 33 <210> 17 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 tgtccatatg cttatctcgt accgaatacc 30 <210> 18 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 aggaaaataa aaatgctaga acaagtgaat gcg 33 <210> 19 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 tgtccatatg cttatctcgt accgaatacc 30 <210> 20 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 tgtgtctaga atgagtcaaa catcaacctt 30 <210> 21 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 tatactgcag acattattcg tcgtgttctt 30 <210> 22 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 tccgaattca tgccgaatac ttatggcagc 30 <210> 23 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 tattggtacc tttctcagcc cttgtgatca 30 <210> 24 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 tataggtacc ctggggagaa tatcatgacc aagatctgcg gtga 44 <210> 25 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 tattgcatgc ggacgggcta tagattaccg 30 <210> 26 <211> 1960 <212> DNA <213> origin fragment isolated from pMVSCS1 <400> 26 ttgccaaatg ttcttcttcg gtcacagtac attcaatgcg attacttgcg tgagccgttt 60 taattgcctg aatacgtttt tctatgattt tgtccatatt cattgaattt tttccaactc 120 acaatctttg attttataac cacgcttttt cagttcatct gaaaagattt tctttgaacc 180 aaattttgat gtgttacttg cgttacccgc aagaaaaatc caataaaaca gcaaatcttc 240 attgggtata tcttcaattt tttgataaaa actttccaag atttttaaac aatcacgggc 300 atataatccg tactcgtgag agctgttttt aggattttgg cgatcaagtt ttacaaattg 360 accatacttg tttttatgtg ggaacggtgg gcgtttttga attggttttt catagctgat 420 attaaactca acaccaacaa ttttacgacc acgcttgata ggctcatatt tcacataaag 480 atcagatttt tcgttgattt ctgcgagtgc aggcgttaat actctttgat taagattgtt 540 gtatcggtca tatttttctt caagctgtaa ccattttttt aactcttcaa cagtaatata 600 tctttcgcca agacgtttat attgcgtaaa 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gcgttttaga gtggctatgc 1500 ttgattgaat acaaaccttg aaaaatcagg ggatagggca tacaagggaa aaaggtcggg 1560 gatagctacc aactaccccc ttcccgattg tcttaggaca atctattcaa gatgtaagta 1620 attaggtcga gaatggtaag aactcgaaaa cctaataccg caactactac ggtgagcagt 1680 agtatcatta cgaagtattg taatgcgttc acatagatca cccccttagt gctataagcc 1740 taaggcaatc gggcaacgtg ctaaggacac gttacaccgt ttgccgatag cacaaggaag 1800 attttatcac ataaccgcct aacagggcgg ttttgttttt ttataatttc cgcttatagc 1860 tatgtgttaa agccttatcc acttcatctg ataacgcctg aatgtgtttt tgaatatcca 1920 ataacaacgt atcattgata ggtgtttttt gatcgaccgc 1960 <210> 27 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 tatagagctc acatcggcat cagttatatc 30 <210> 28 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 gaaaagaggc aatgtatcac ctcattgtaa ta 32 <210> 29 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 tgaggtgata cattgcctct tttcttttat tt 32 <210> 30 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 gtagaagctt gttatatatt tgtgatttta 30 <210> 31 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 taacggatcc acatcggcat cagttatatc 30 <210> 32 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 aatatgtgtt caatgtatca cctcattgta ata 33 <210> 33 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 tgaggtgata cattgaacac atattttata aa 32 <210> 34 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 tacgctgcag ttattccacg tcttctttcg 30

Claims

맨하이미아 속(genus Mannheimia), 액티노바실러스 속(genus Actinobacillus) 및 언애로우바이오스필리움 속(genus Anaerobiospillium)으로 구성되는 군에서 선택된 미생물에, 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 또는 글리세롤 디하이드로지네이즈(glycerol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터가 도입되어 있는, 글리세롤 대사능력 및 숙신산 생산능력이 향상된 재조합 미생물.
맨하이미아 속(genus Mannheimia), 액티노바실러스 속(genus Actinobacillus) 및 언애로우바이오스필리움 속(genus Anaerobiospillium)으로 구성되는 군에서 선택된 미생물의 염색체에, 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 또는 글리세롤 디하이드로지네이즈(glycerol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자가 삽입되어 있는, 글리세롤 대사능력 및 숙신산 생산능력이 향상된 재조합 미생물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 재조합 미생물은 글리세롤 업테이크 촉진자(glycerol uptake facilitator)를 코딩하는 유전자, 글리세롤 카이네이즈(glycerol kinase)를 코딩하는 유전자, cAMP 수용체 (cAMP receptor)를 코딩하는 유전자 및 디하이드록시 아세톤 카이네이즈(dehydroxyaceton kinase)를 코딩하는 유전자 중 어느 하나 이상의 유전자가 추가로 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 글리세롤 대사능력 및 숙신산 생산능력이 향상된 재조합 미생물.
삭제
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 맨하이미아 속은 Mannheimia succiniciproducens MBEL55E (KCTC 0769BP), Mannheimia succiniciproducens LPK (KCTC 10558BP), Mannheimia succiniciproducens LPK7 (KCTC 10626BP), Mannheimia succiniciproducens PALK(KCTC 10973BP), Mannheimia succiniciproducens ALK 및 Mannheimia succiniciproducens ALKt로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 글리세롤 대사능력이 향상된 재조합 미생물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자는 클로스트리디움 속(genus Clostridium) 또는 맨하이미아 속(genus Mannheimia)에서 유래된 것임을 특징으로 하는 글리세롤 대사능력 및 숙신산 생산능력이 향상된 재조합 미생물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 글리세롤 디하이드로지네이즈 (glycerol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자는 글루코노박터 속(genus Gluconobacter)에서 유래된 것임을 특징으로 하는 글리세롤 대사능력 및 숙신산 생산능력이 향상된 재조합 미생물.
제3항에 있어서, 상기 글리세롤 업테이크 촉진자(glycerol uptake facilitator)를 코딩하는 유전자, 글리세롤 카이네이즈(glycerol kinase)를 코딩하는 유전자 및 cAMP 수용체 단백질을 코딩하는 유전자는 클로스트리디움 속(genus Clostridium), 에스케리키아 속(genus Escherichia), 맨하이미아 속(genus Mannheimia) 및 글루코노박터 속(genus Gluconobacter)으로 구성되는 군에서 선택된 미생물에서 유래된 것임을 특징으로 하는 글리세롤 대사능력 및 숙신산 생산능력이 향상된 재조합 미생물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이 즈 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자는 glpABC 또는 glpA임을 특징으로 하는 글리세롤 대사능력 및 숙신산 생산능력이 향상된 재조합 미생물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 글리세롤 디하이드로지네이즈 (glycerol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자는 sldAB임을 특징으로 하는 글리세롤 대사능력 및 숙신산 생산능력이 향상된 재조합 미생물.
제1항에 있어서, 상기 재조합 미생물은 Mannheimia succiniciproducens MBEL55E/pFglpABC(JYJM01), Mannheimia succiniciproducens PALK/pEglpA(JYJM02), Mannheimia succiniciproducens PALK/ACRP(JYJM03) (KCTC11458BP), Mannheimia succiniciproducens PALK/AFK(JYJM04) (KCTC11459BP), 및 Mannheimia succiniciproducens PALK/SDGOX(JYJM05) (KCTC11460BP) 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 글리세롤 대사능력 및 숙신산 생산능력이 향상된 재조합 미생물.
맨하이미아 속(genus Mannheimia), 액티노바실러스 속(genus Actinobacillus) 및 언애로우바이오스필리움 속(genus Anaerobiospillium)으로 구성되는 군에서 선택된 미생물에, 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 또는 글리세롤 디하이드로지네이즈(glycerol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터를 도입하는 것을 특징으로 하는 글리세롤 대사능력 및 숙신산 생산능력이 향상된 재조합 미생물의 제조방법.
맨하이미아 속(genus Mannheimia), 액티노바실러스 속(genus Actinobacillus) 및 언애로우바이오스필리움 속(genus Anaerobiospillium)으로 구성되는 군에서 선택된 미생물의 염색체에, 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 또는 글리세롤 디하이드로지네이즈(glycerol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자가 삽입합는 것을 특징으로 하는 글리세롤 대사능력 및 숙신산 생산능력이 향상된 재조합 미생물의 제조방법.
제1항 또는 제2항의 재조합 미생물을 글리세롤을 탄소원으로 함유하는 배양배지에서 배양하는 단계; 및 상기 배양액으로부터 숙신산을 회수하는 단계를 포함하는 숙신산의 제조방법.
제14항에 있어서, 상기 배양은 혐기조건에서 수행되는 것임을 특징으로 하는 방법.
제14항에 있어서, 상기 글리세롤은 배양배지에서 단일 탄소원으로 함유되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제14항에 있어서, 상기 글리세롤은 배양배지에서 글리세롤 이외의 다른 탄소원과 함께 함유되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제17항에 있어서, 상기 글리세롤 이외의 다른 탄소원은 수크로오스(sucrose)인 것을 특징으로 하는 방법.
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