KR102253701B1 - 하이브리드형 해당 경로 - Google Patents

Abstract

본 발명은 비산화적 해당 과정 및 해당 과정의 에너지 회수기 단계를 함께 이용하는 하이브리드형 해당 과정을 이용하는 재조합 균주에 관한 것으로, 본 발명에 따라 fxpk 유전자, glk 유전자 및 tal 유전자를 포함하는 비산화적 해당 과정 도입용 재조합 벡터로 형질전환하고, pfkA 유전자가 제거된 재조합 균주는 돌연변이 유도를 통한 세포 진화 과정(ALE) 없이 핵심 유전자 발현만으로 비산화적 해당과정을 이용할 수 있으며, 비산화적 해당과정을 통해 C2 탄소 화합물 합성과 더불어 C3 탄소 화합물 합성이 가능하여 발효과정에서 발생하는 이산화탄소가 감소하고, 중심 대사산물인 아세틸 조효소의 생성량이 증가하였으므로, 발효 화합물의 생산량 또는 합성 수율 증가 효과가 있으며, 발효화합물 생산 뿐 아니라 C3 탄소 화합물 기반 발효화합물의 수율 증대에 이용될 수 있어, 미생물을 이용한 식품, 화장품, 의학, 소재, 등 다양한 산업에 유용하게 활용될 수 있다.

Description

하이브리드형 해당 경로{HYBRID TYPE GLYCOLYSIS PATHWAY}

본 발명은 비산화적 해당 과정 및 해당 과정의 에너지 회수기 단계를 함께 이용하는 하이브리드형 해당 과정을 이용하는 재조합 균주에 관한 것이다.

미생물이 단백질, 약물, 정밀 화학물질, 입체-특이적 화학물질 등과 같은 유용한 생체 물질을 생산하는 세포 공장(cell factory)으로 이용되고 있으며, 기존의 발효공학 기술에 유전공학 기술 및 생물공학 기술을 접목하여, 유용한 목적 물질을 효율적으로 생산할 수 있도록 박테리아, 효모, 진균 또는 동식물 세포의 대사 경로를 변형시키거나 특정 유전자의 과발현 또는 억제 또는 제거를 통해 미생물을 개량하는 방법이 널리 연구되고 이용되고 있다. 미생물을 이용한 유용한 목적 물질의 생산을 위해 주로 특정 목적 물질의 생성에 관여된 효소를 코딩하는 유전자의 발현을 증가시키거나 또는 불필요한 유전자를 제거하는 것과 같은 목적 물질 특이적 접근방법이 주로 이용되었다. 이와 같이 다량의 대상 분자를 생성할 수 있는 다수의 미생물학적 공정이 개발되었으나, 일반적으로, 주로 보조 인자에 대한 필요성과 산화환원 대사 반응의 평형의 어려움 때문에 이러한 미생물학적 공정의 생성 수율은 낮으며, 미생물에 의해 동화될 수 있는 탄소원이 여전히 필요하기 때문에 비용적인 측면에서 어려움이 있어왔다. 즉, 현재 미생물학적 공정을 통해 대상 분자를 생성하기 위해서는 확실히 산업적 가치가 더 낮으나, 경제적으로는 유리하지 않은 특정 분자를 생성하기에 충분한 분자를 제공할 필요가 있다. 동시에, 대기로의 방출이 지속적으로 증가하는 이산화탄소(CO₂)는 현재의 미생물학적 공정에서 거의 또는 전혀 사용되지 않는다. 따라서, 현재 공정보다 더 낮은 비용으로 대량의 대상 분자를 생성할 수 있는 미생물학적 공정이 여전히 필요한 실정이다.

미생물의 해당과정(embden-meyerhof-parnas, EMP pathway)을 통해 생산된 피루브산(Pyruvate)이 아세틸 조효소로(Acetyl-CoA)로 전환되면서 필수적으로 1몰의 이산화탄소가 발생한다. 이산화탄소 발생으로 인한 탄소 손실은 발효 화합물 합성에서 생산 수율에 영향을 미치므로, 이러한 문제점을 해결하기 위해 합성 비산화적 해당 과정(NOG pathway)이 고안되었다 (Bogorad, I. W., Lin, T. S., & Liao, J. C. (2013). Synthetic non-oxidative glycolysis enables complete carbon conservation. Nature, 502(7473), 693.). 또한, 이와 같은 전략을 대장균(Escherichia coli)에서 이용하기 위해 해당 과정의 주요 유전자들을 제거하고 비산화적 해당 과정을 도입한 균주가 제작되었다 (Lin, P. P., Jaeger, A. J., Wu, T. Y., Xu, S. C., Lee, A. S., Gao, F., ... & Liao, J. C. (2018). Construction and evolution of an Escherichia coli strain relying on nonoxidative glycolysis for sugar catabolism. Proceedings of the National Academy of Sciences, 115(14), 3538-3546.). 이와 같은 대장균은 이론상 이산화탄소가 전혀 발생하지 않아 1몰의 포도당으로부터 3몰의 아세틸조효소가 생산 가능하나, 포도당에서 성장하지 않으므로, 돌연변이 유도를 통해 진화된 균주를 획득하여 세포 성장률을 높이는 과정이 필요하다. 또한, 해당 과정을 전체 제거해버렸기 때문에 대사 과정에 중요한 인산(Phosphate) 및 에너지 공급원인 ATP의 생산 균형이 맞지 않는 문제로 인해, 피루브산과 같은 C3 탄소 화합물의 생산이 어려워 라이신과 같은 아미노산 합성에 이용되기 어렵다는 문제점이 있다.

한편, 코리네박테리움은 그람 양성 균주로서, 글루타메이트, 라이신, 트레오닌과 같은 아미노산 및 이노신산과 같은 퓨린 계열의 핵산을 생산하는 용도로 널리 이용되고 있다. 코리네박테리움 글루타미쿰은 생장 조건이 용이하며, 대장균에 비해 4배 가량 고농도 배양이 가능하고, 유전체 구조가 안정적이어서 돌연변이 발생 확률이 낮다. 또한, 비병원성 균주이고 포자를 만들지 않아 환경에 유해한 영향을 미치지 않는 등 산업용 균주로서의 장점을 갖추고 있다.

본 발명의 목적은 해당 과정의 재설계를 통해, 해당 과정 중 필연적으로 발생되는 이산화탄소 손실을 줄여 아세틸조효소의 생산량을 증가시키고, 산업적으로 이용하기 위해 기존 당 대비 발효 화합물의 생산 수율을 원천적으로 높이는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 비산화적 해당 과정 도입용 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 벡터가 숙주세포에 형질전환된 재조합 세포주를 제공한다.

또한, 본 발명은 하이브리드형 해당 과정을 이용하는 재조합 미생물을 제공한다.

아울러, 본 발명은 대사산물 생산용 미생물의 제조 방법을 제공한다.

본 발명에 따라 fxpk 유전자, glk 유전자 및 tal 유전자를 포함하는 비산화적 해당 과정 도입용 재조합 벡터로 형질전환하고, pfkA 유전자가 제거된 재조합 균주는 돌연변이 유도를 통한 세포 진화 과정(ALE) 없이 핵심 유전자 발현만으로 비산화적 해당과정을 이용할 수 있으며, 비산화적 해당과정을 통해 C2 탄소 화합물 합성과 더불어 C3 탄소 화합물 합성이 가능하여 발효과정에서 발생하는 이산화탄소가 감소하고, 중심 대사산물인 아세틸 조효소의 생성량이 증가하였으므로, 발효 화합물의 생산량 또는 합성 수율 증가 효과가 있으며, 발효화합물 생산 뿐 아니라 C3 탄소 화합물 기반 발효화합물의 수율 증대에 이용될 수 있어, 미생물을 이용한 식품, 화장품, 의학, 소재, 등 다양한 산업에 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 일반적인 해당 과정(embden-meyerhof-parnas, EMP pathway) 및 본 발명의 균주에서 이용된 하이브리드 해당 과정을 비교한 모식도이다.
도 2는 본 발명의 균주에서 이용된 하이브리드 해당 과정을 구체적으로 나타낸 모식도이다.
도 3은 크리스퍼 유전자 염기편집 기술을 이용하여 제거한 pfkA 유전자의 1~100bp 뉴클레오타이드 서열을 나타낸 도이다.
도 4는 fxpk, glk 및 tal 유전자를 항시 발현하는 비산화적 해당 과정 발현 벡터 pZ8-1-glk,fxpk,tal를 나타낸 도이다.
도 5는 야생형 균주와 본 발명의 하이브리드 해당 과정 균주의 포도당 포함 배지에서의 세포 성장률을 비교한 도이다:
WT pZ8-1: 야생형 균주; 및
ΔpfkA pZ8-1-glk-fxpk-tal: 본 발명의 하이브리드 해당과정 균주.
도 6은 야생형 균주와 본 발명의 하이브리드 해당 과정 재조합 균주의 이산화탄소 생산량을 비교한 도이다:
WT pZ8-1: 야생형 균주;
ΔpfkA pZ8-1-glk-fxpk-tal: 본 발명의 하이브리드 해당과정 균주;
좌: 야생형 균주와 하이브리드 해당과정 균주의 세포 성장률 및 포도당 소비율; 및
우: 이산화탄소 생산량.
도 7은 야생형 균주와 본 발명의 하이브리드 해당 과정 재조합 균주의 세포 내 아세틸 조효소 생산량을 비교한 도이다:
WT pZ8-1: 야생형 균주; 및
ΔpfkA pZ8-1-glk-fxpk-tal: 본 발명의 하이브리드 해당과정 균주.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.

또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

일 측면에서, 본 발명은 포스포프락토케톨레이즈(Phosphofructoketolase) 효소를 코딩하는 fxpk 유전자, 글쿠코카이네이즈(Glucokinase)를 코딩하는 glk 유전자 및 코리네박테리움 글루타미쿰 유래 트렌스알돌레이즈(Transaldolase)를 코딩하는 tal 유전자를 포함하는 비산화적 해당 과정 도입용 재조합 벡터에 관한 것이다.

일 구현예에서, 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis) 유래 코돈 최적화된 fxpk 유전자일 수 있다.

일 구현예에서, glk 유전자 또는 tal 유전자는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebaecterium glutamicum) 유래일 수 있다.

일 구현예에서, fxpk 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 포함할 수 있으며, glk 유전자는 서열번호 2의 염기서열을 포함할 수 있고, tal 유전자는 서열번호 3의 염기서열을 포함할 수 있다.

일 구현예에서, 비산화적 해당 과정 도입용 재조합 벡터는 서열번호 4의 염기서열을 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 벡터의 제작 시, 상기 항체를 생산하고자 하는 숙주세포의 종류에 따라 프로모터(promoter), 종결자(terminator), 인핸서(inhancer) 등과 같은 발현 조절 서열, 막 표적화 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 선택하고 목적에 따라 다양하게 조합할 수 있다.

본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오 파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 상기 시그널 서열에는 숙주가 에쉐리키아속(Escherichia sp.)균인 경우에는 PhoA 시그널 서열, OmpA 시그널 서열 등이, 숙주가 바실러스속(Bacillus sp.)균인 경우에는 α-아밀라아제 시그널 서열, 서브틸리신 시그널 서열 등이, 숙주가 효모(yeast)인 경우에는 MFα 시그널 서열, SUC2 시그널 서열 등이, 숙주가 동물세포인 경우에는 인슐린 시그널 서열, α-인터페론 시그널 서열, 항체 분자 시그널 서열 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함할 수 있고, 복제 가능한 벡터인 경우 복제 기원을 포함한다.

일 측면에서, 본 발명은 벡터가 숙주세포에 형질전환된 재조합 세포주에 관한 것이다.

일 구현예에서, 상기 숙주세포는 박테리아 또는 동물세포일 수 있으며, 동물 세포주는 CHO 세포, HEK 세포 또는 NSO 세포일 수 있고, 박테리아는 대장균 또는 코리네박테리움일 수 있다.

본 발명에 따른 상기 벡터를 적절한 숙주세포, 예를 들어, 대장균 또는 코리네박테리움 등에 형질전환시킨 후, 형질전환된 숙주세포를 배양함으로써 본 발명에 따른 비산화적 해당 과정 도입용 재조합 벡터를 대량 생산할 수 있다. 숙주세포의 종류에 따른 적절한 배양 방법 및 배지 조건 등은 당해 분야의 통상의 기술자에게 알려진 공지 기술로부터 당업자가 용이하게 선택할 수 있다. 상기 숙주세포는 대장균(E. coli) 또는 코리네박테리움과 같은 원핵 생물일 수 있다. 또한, 사카로마이세스 세르비지애(Saccharomyces cerevisiae)와 같은 효모, 곤충 세포, 식물 세포, 동물 세포로부터 유래한 진핵 세포일 수 있다. 또한, 상기 동물 세포는 자가 또는 동종 이계 동물 세포일 수 있다. 상기 숙주세포로의 벡터 도입 방법은 당업자에게 공지된 어느 방법을 사용해도 무방하다.

일 측면에서, 본 발명은 6-포스포프락토카이네이즈(Phosphofructokinase)를 코딩하는 pfkA 유전자 또는 이의 일부가 제거되고, 및 본 발명의 벡터로 형질전환된 재조합 미생물에 관한 것이다.

일 구현예에서, 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있으며, 수탁번호 KCTC14103BP의 코리네박테리움 글루타미쿰 YL1 pNOG2 균주일 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명의 재조합 미생물은 비산화적 해당 과정(NOG pathway) 및 해당 과정의 에너지 회수기(Payoff phase) 단계를 함께 이용하는 하이브리드형 해당 과정을 이용할 수 있다.

일 구현예에서, 도 3의 서열이 삭제된 pfkA 유전자는 서열번호 5의 염기서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 해당과정의 에너지 투자기(Preparatory phase)를 제거하기 위해 과당-6인산(F6P)로부터 과당 1,6-이중인산(FBP)를 생산하는 효소를 코딩하는 유전자 pfkA를 제거하였으며, 비산화적 해당경로를 도입하기 위해, 비피도박테리움 균주의 대사 경로 중 비피도 션트(Bfido shunt)의 주요 효소이고, 과당 6-인산(F6P)로부터 에리트로스 4-인산(E4P) 및 아세틸 인산(AcP) 생산, 및 자일룰로오스 5-인산(X5P)로부터 글리세르알데하이드 3-인산(G3P) 및 아세틸 인산(AcP)을 생산하는 효소인 포스포프락토케톨레이즈(Phosphofructoketolase)를 코딩하는 유전자 fxpk; 포도당(glucose)로부터 포도당 6-인산(G6P)를 생산하는 효소인 글쿠코카이네이즈(Glucokinase)를 코딩하는 유전자 glk; 및 과당 6-인산(F6P) 및 에리트로스 4-인산(E4P)을 세도헵툴로스 7-인산(S7P) 및 글리세르알데하이드 3-인산(G3P)으로 전환하는 효소인 트렌스알돌레이즈(Transaldolase)를 코딩하는 유전자 tal을 포함하는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 제작하였다.

일 측면에서, 본 발명은 미생물에서 6-포스포프락토카이네이즈(Phosphofructokinase)를 코딩하는 pfkA 유전자를 제거하는 단계; 및 본 발명의 벡터를 상기 미생물에 형질전환하는 단계를 포함하는, 대사산물 생산용 미생물의 제조 방법에 관한 것이다.

일 구현예에서, 대사산물 생산용 미생물은 비산화적 해당 과정 및 해당 과정의 에너지 회수기 단계를 함께 이용할 수 있다.

하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 비산화적 해당 과정 경로 설계

비산화적 해당 과정(NOG pathway) 및 해당 과정의 에너지 회수기(Payoff phase) 단계를 함께 이용하는 하이브리드형 해당 과정 (도 1B)을 구축하였다. 구체적으로, 코리네박테리움 글루타미쿰의 해당 과정(embden-meyerhof-parnas, EMP pathway) (도 1A)에서 에너지 투자기 단계를 제거하기 위해 pfkA 유전자를 제거하고, 비산화적 해당 과정(NOG pathway) 도입을 위해 fxpk 유전자, tal 유전자 및 glk 유전자를 이용하여 새로운 비산화적 해당 과정 경로를 설계하였다 (도 2). 이와 같은 하이브리드형 해당 과정은 1 몰의 이산화탄소만 발생하므로, 기존 해당 과정 대비 1.25 배 증가한 2.5 몰의 아세틸 조효소를 생산 가능하다. 따라서, 해당 과정 중 발생하는 이산화탄소의 절감에 따른 아세틸 조효소의 생산량 증가효과를 얻을 수 있다

실시예 2. 하이브리드형 해당 과정 이용 재조합 균주 제작

2-1. pfkA 유전자 제거

코리네박테리움 글루타미쿰의 6-포스포프락토카이네이즈(Phosphofructokinase)를 코딩하는 pfkA 유전자의 첫 시작 코돈을 포함한 1~100bp의 뉴클레오타이드 (서열번호 5) (도 3)를 Coryne-CR12-Del 기술 (Bioconversion of xylose to ethylene glycol and glycolate in engineered Corynebacterium glutamicum, ACS Omega. 4(25), 21279-21287을 이용하여 제거한 뒤, 해당 균주의 pfkA 유전자 제거 여부를 하기 표 1의 프라이머를 사용한 PCR 분석을 통해 확인하였다.

	5' -> 3'
forward	CTC GGA CAA TGT CGA TTT GT
reverse	CAT TGT CAA TGG TCT TTG GG

2-2. 비산화적 해당 과정 발현 벡터 제작 및 재조합 균주 제작

비산화적 해당 과정 경로 구축을 위해, glk, fxpk 및 tal 유전자를 항시 발현하는 벡터를 제작하였다. 구체적으로, pZ8-1-gfp (Dusch, N., Puhler, A., & Kalinowski, J. (1999). Expression of the Corynebacterium glutamicum panD gene encoding l-aspartate-α-decarboxylase leads to pantothenate overproduction in Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol., 65(4), 1530-1539.)의 gfp 유전자 부분을 EcoRI-BamHI 제한효소를 이용하여 제거한 후 그 자리에 코돈 최적화 과정을 거친 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis)의 포스포프락토케톨레이즈(Phosphofructoketolase) 효소 [과당 6-인산(F6P)로부터 에리트로스 4-인산(E4P) 및 아세틸 인산(AcP) 생산, 및 자일룰로오스 5-인산(X5P)로부터 글리세르알데하이드 3-인산(G3P) 및 아세틸 인산(AcP)을 생산하는 효소]를 코딩하는 fxpk; 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebaecterium glutamicum) 유래 글쿠코카이네이즈(Glucokinase) [포도당(glucose)로부터 포도당 6-인산(G6P)를 생산하는 효소]를 코딩하는 glk; 및 코리네박테리움 글루타미쿰 유래 트렌스알돌레이즈(Transaldolase) [과당 6-인산(F6P) 및 에리트로스 4-인산(E4P)을 세도헵툴로스 7-인산(S7P) 및 글리세르알데하이드 3-인산(G3P)으로 전환하는 효소]를 코딩하는 tal 유전자의 DNA 시퀀스를 삽입하여 pZ8-1-glk-fxpk-tal 벡터를 제작하였다 (도 4). 그 후, 제작한 벡터를 상기 실시예 2-1에서 pfkA 유전자를 제거한 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에 형질전환하고 형질 전환 여부를 하기 표 2의 프라이머를 사용한 PCR 분석을 통해 확인하였다.

	5' -> 3'
forward	TGT GTG GAA TTG TGA GCG GA
reverse	GTT GAT GTG GCC GAT CAG GA

이와 같이, 과당-6인산(F6P)로부터 과당 1,6-이중인산(FBP)를 생산하는 효소인 6-포스포프락토카이네이즈(Phosphofructokinase)를 코딩하는 pfkA 유전자가 제거된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에 비산화적 해당 과정 발현 벡터, pZ8-1-glk-fxpk-tal 벡터를 도입함으로써, 하이브리드형 해당 과정을 이용하는 코리네박테리움 글루타미쿰 YL1 pNOG2 균주를 제작하였으며, 이를 한국생명공학연구원에 수탁번호 KCTC14103BP로 기탁하였다.

실시예 3. 하이브리드 해당 과정 이용 균주의 세포 성장률 확인

종래의 재조합 균주들의 포도당에서의 세포 성장 불가 문제점이 glk 유전자의 도입으로 해결되었는지 확인하기 위해, 상기 실시예 2에서 제작한 재조합 균주의 성장률을 확인하였다. 구체적으로, 250ml 진탕 삼각 플라스크(baffled flask)에서 2% 포도당을 포함하는 CgXII 최소배지 50ml로 30℃ 및 120rpm의 조건으로 진탕 배양하여 본 발명의 재조합 균주와 야생형 균주의 세포 성장률을 비교하였다.

그 결과, 야생형 균주와 달리, 글루코카이네이즈 효소를 코딩하는 glk 유전자가 추가 발현되는 본 발명의 재조합 균주는 정상적인 성장률을 나타내, 야생형 균주들과 달리, 돌연변이 유도없이 정상적인 세포 성장이 가능함을 알 수 있었다 (도 5).

실시예 4. 이산화탄소 발생량 및 세포 내 아세틸 조효소 생산량 확인

상기 실시예 2에서 제작한 재조합 균주를 5L 발효기에서 카나마이신 항생제 25μg/mL 및 2% 포도당을 포함하는 CgXII 최소배지 2L에 접종한 뒤, 30℃, 400RPM 및 pH7의 조건으로 회분배양하였다. 그 후, CO₂ 분석기를 이용하여 발효기로부터 발생되는 배기가스를 분석함으로써, 재조합 균주의 이산화탄소 생산량을 측정하였으며, 세포 성장 곡선의 대수기 중간 지점의 세포를 수확하여 Acetyl CoA Fluorometric Assay Kit를 이용하여 아세틸 조효소의 생산량을 측정하였다.

그 결과, 하이브리드형 해당 과정을 가지는 본 발명의 재조합 균주의 포도당이 모두 소모된 시점까지의 이산화탄소 발생량이 야생형 균주 대비 17.4% 감소한 것으로 나타났다 (도 6). 또한, 본 발명의 재조합 균주의 세포 내 아세틸 조효소 생산량을 확인한 결과, 생형 균주에 비해 19% 증가한 것으로 나타났다 (도 7).

이를 통해, 본 발명의 균주가 해당 과정이 아닌 비산화적 해당 과정을 이용함으로써, 이산화탄소 생산량이 감소하였으며 이에 따라 아세틸 조효소 생산량이 증가했음을 알 수 있다.

한국생명공학연구원 KCTC14103BP 20200114

<110> Research and Business Foundation SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY <120> HYBRID TYPE GLYCOLYSIS PATHWAY <130> R-2019-0901-KR-1 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 2478 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fxpk <400> 1 atgacctccc cagtgatcgg caccccatgg aagaagctga acgcaccagt gtccgaagaa 60 gcaatcgaag gcgtggataa gtactggcgc gcagcaaact acctgtccat cggccagatt 120 tacctgcgct ccaacccact gatgaaggaa ccattcaccc gcgaagatgt gaagcaccgc 180 ctggtgggcc actggggcac caccccaggc ctgaacttcc tgatcggcca catcaaccgc 240 ctgatcgcag atcaccagca gaacaccgtg atcatcatgg gcccaggcca cggcggccca 300 gcaggcaccg cacagtccta cctggatggc acctacaccg aatacttccc aaacatcacc 360 aaggatgaag caggcctgca gaagttcttc cgccagttct cctacccagg cggcatccca 420 tcccactacg caccagaaac cccaggctcc atccacgaag gcggcgaact gggctacgca 480 ctgtcccacg catacggcgc agtgatgaac aacccatccc tgttcgtgcc agcaatcgtg 540 ggcgatggcg aagcagaaac cggcccactg gcaaccggct ggcagtccaa caagctgatc 600 aacccacgca ccgatggcat cgtgctgcca atcctgcacc tgaacggcta caagatcgca 660 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660 aaaacgatca ctgcggcagc gcgccaagaa gacccacttg ctctcgccgt tctggaagat 720 ttcagcgagt ggctgggcga aactttggcg atcattgctg atgtccttga cccaggcatg 780 atcatcattg gtggcggact gtccaatgct gccgaccttt atttggatcg ctcggtcaac 840 cactattcca cccgcatcgt cggcgcagga tatcgccctt tggcacgcgt tgccacagct 900 cagttgggtg cggatgctgg catgatcggt gtcgctgatc tagctcgacg ctctgtagtg 960 gaagccaact ag 972 <210> 3 <211> 1083 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tal <400> 3 atgtctcaca ttgatgatct tgcacagctc ggcacttcca cttggctcga cgacctctcc 60 cgcgagcgca ttacttccgg caatctcagc caggttattg aggaaaagtc tgtagtcggt 120 gtcaccacca acccagctat tttcgcagca gcaatgtcca agggcgattc ctacgacgct 180 cagatcgcag agctcaaggc cgctggcgca tctgttgacc aggctgttta cgccatgagc 240 atcgacgacg ttcgcaatgc ttgtgatctg ttcaccggca tcttcgagtc ctccaacggc 300 tacgacggcc gcgtgtccat cgaggttgac ccacgtatct ctgctgaccg cgacgcaacc 360 ctggctcagg ccaaggagct gtgggcaaag gttgatcgtc caaacgtcat gatcaagatc 420 cctgcaaccc caggttcttt gccagcaatc accgacgctt tggctgaggg catcagcgtt 480 aacgtcacct tgatcttctc cgttgctcgc taccgcgagg tcatcgctgc gttcatcgag 540 ggcatcaagc aggctgctgc aaacggccac gacgtctcca agatccactc tgtggcttcc 600 ttcttcgtct cccgcgtcga cgttgagatc gacaagcgcc tcgaggcaat cggctccgat 660 gaggctttgg ctctgcgcgg caaggcaggc gttgccaacg ctcagcgcgc ttacgctgtg 720 tacaaggagc ttttcgacgc cgccgagctg cctgaaggtg ccaacactca gcgcccactg 780 tgggcatcca ccggcgtgaa gaaccctgcg tacgctgcaa ctctttacgt ttccgagctg 840 gctggtccaa acaccgtcaa caccatgcca gaaggcacca tcgacgcggt tctggagcag 900 ggcaacctgc acggtgacac cctgtccaac tccgcggcag aagctgacgc tgtgttctcc 960 cagcttgagg ctctgggcgt tgacttggca gatgtcttcc aggtcctgga gaccgagggt 1020 gtggacaagt tcgttgcttc ttggagcgaa ctgcttgagt ccatggaagc tcgcctgaag 1080 tag 1083 <210> 4 <211> 4623 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RBS-glk-fxpk-tal <400> 4 aggatctaaa aggaggtatt ttatgccaca aaaaccggcc agtttcgcgg tgggctttga 60 catcggcggc accaacatgc gagccgggct tgtcgacgaa tccgggcgca tcgtgaccag 120 tttgtcggcg ccgtcgccgc gcacgacgca ggcaatggaa 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ttccgagctg 4380 gctggtccaa acaccgtcaa caccatgcca gaaggcacca tcgacgcggt tctggagcag 4440 ggcaacctgc acggtgacac cctgtccaac tccgcggcag aagctgacgc tgtgttctcc 4500 cagcttgagg ctctgggcgt tgacttggca gatgtcttcc aggtcctgga gaccgagggt 4560 gtggacaagt tcgttgcttc ttggagcgaa ctgcttgagt ccatggaagc tcgcctgaag 4620 tag 4623 <210> 5 <211> 932 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> del-pfkA <400> 5 tcgttggtta tcaagacggt tgggaaggac tgttaggcga tcgtcgcgta cagctgtatg 60 acgatgaaga tattgaccga atcctccttc gaggcggcac cattttgggc actggtcgcc 120 tccatccgga caagtttaag gccggaattg atcagattaa ggccaactta gaagacgccg 180 gcatcgatgc ccttatccca atcggtggcg aaggaaccct gaagggtgcc aagtggctgt 240 ctgataacgg tatccctgtt gtcggtgtcc caaagaccat tgacaatgac gtgaatggca 300 ctgacttcac cttcggtttc gatactgctg tggcagtggc taccgacgct gttgaccgcc 360 tgcacaccac cgctgaatct cacaaccgtg tgatgatcgt ggaggtcatg ggccgccacg 420 tgggttggat tgctctgcac gcaggtatgg ccggcggtgc tcactacacc gttattccag 480 aagtaccttt cgatattgca gagatctgca aggcgatgga 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Claims (15)

1. 6-포스포프락토카이네이즈(Phosphofructokinase)를 코딩하는 pfkA 유전자 또는 이의 일부가 제거되고, 및
   포스포프락토케톨레이즈(Phosphofructoketolase) 효소를 코딩하는 fxpk 유전자, 글쿠코카이네이즈(Glucokinase)를 코딩하는 glk 유전자 및 코리네박테리움 글루타미쿰 유래 트렌스알돌레이즈(Transaldolase)를 코딩하는 tal 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰.
   
2. 제 1항에 있어서, 상기 fxpk 유전자는 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis) 유래 코돈 최적화된 fxpk 유전자인, 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰.
   
3. 제 1항에 있어서, 상기 glk 유전자 또는 tal 유전자는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebaecterium glutamicum) 유래인, 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰.
   
4. 제 1항에 있어서, 상기 fxpk 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는, 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰.
   
5. 제 1항에 있어서, 상기 glk 유전자는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는, 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰.
   
6. 제 1항에 있어서, 상기 tal 유전자는 서열번호 3의 염기서열을 포함하는, 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰.
   
7. 제 1항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 서열번호 4의 염기서열을 포함하는, 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰.
   
8. 제 1항에 있어서, 상기 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰은 수탁번호 KCTC14103BP의 코리네박테리움 글루타미쿰 YL1 pNOG2인, 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰.
   
9. 제 1항에 있어서, 비산화적 해당 과정(NOG pathway) 및 해당 과정의 에너지 회수기(Payoff phase) 단계를 함께 이용하는, 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰.
   
10. 제 1항에 있어서, 상기 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰은 서열번호 5의 염기서열을 포함하는 변이 pfkA 유전자를 포함하는 것인, 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰.
    
11. a) 코리네박테리움 글루타미쿰에서 6-포스포프락토카이네이즈(Phosphofructokinase)를 코딩하는 pfkA 유전자의 전부 또는 일부를 제거하는 단계; 및
    b) 포스포프락토케톨레이즈(Phosphofructoketolase) 효소를 코딩하는 fxpk 유전자, 글쿠코카이네이즈(Glucokinase)를 코딩하는 glk 유전자 및 코리네박테리움 글루타미쿰 유래 트렌스알돌레이즈(Transaldolase)를 코딩하는 tal 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 상기 코리네박테리움 글루타미쿰에 형질전환하는 단계를 포함하는, 대사산물 생산용 미생물의 제조 방법.
    
12. 제 11항에 있어서, 상기 fxpk 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는, 대사산물 생산용 미생물의 제조 방법.
    
13. 제 11항에 있어서, 상기 glk 유전자는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는, 대사산물 생산용 미생물의 제조 방법.
    
14. 제 11항에 있어서, 상기 tal 유전자는 서열번호 3의 염기서열을 포함하는, 대사산물 생산용 미생물의 제조 방법.
    
15. 제 11항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 서열번호 4의 염기서열을 포함하는, 대사산물 생산용 미생물의 제조 방법.
    

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