CN108641992B - 高温产核黄素的工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及高温产核黄素的工程菌及其构建方法与应用。所述工程菌为大肠杆菌或地芽孢杆菌，并携带有表达地芽孢杆菌核黄素合成基因簇的表达载体。利用高温产核黄素的大肠杆菌工程菌生产核黄素，发酵液中核黄素产量最高可达276mg/L左右，利用高温产核黄素的地芽孢杆菌工程菌生产核黄素，产量最高可达50mg/L左右。本发明提供的工程菌比现有的核黄素工程菌生产周期短，节约能源，可以低成本地用于核黄素的生产，为高温条件下生产核黄素提供宝贵的菌种资源。

Description

高温产核黄素的工程菌及其构建方法与应用
技术领域
本发明涉及基因工程和发酵工程技术领域，具体地说，涉及高温产核黄素的工程菌及其构建方法与应用。
背景技术
核黄素，即维生素B2(Riboflavin)，是细菌和动物必需的维生素之一，在生物体内通常以FMN和FAD的形式存在，参与细胞内氧化还原反应。它主要应用在制药，饲料添加剂，食品添加剂和化妆品，目前，核黄素生产工艺是微生物发酵法。在早期其生产菌株为真菌，像解朊假丝酵母(Candida famata)、棉囊阿舒氏酵母(Ashbya gossypii)、阿舒氏假囊酵母(Eremothecium ashbyii)、酿酒酵母(Saccharomy cescerevisiae)等(Stahmann et al,2016,Appl Microbiol Biotechnol 100:2107-2119)。但由于真菌生产核黄素存在着一些问题，例如发酵周期长(6-7天)、产量较低(小于5g/L)、原料成分配比复杂、菌体粘度大、后期分离困难、需加入不饱和脂肪酸来促进核黄素合成等。随后，又开发了以细菌为宿主菌的基因工程菌。这些基因工程菌具有发酵周期短(2-3天)、原料要求简单、产量高、成熟的原核细胞基因工程技术等优点，迅速替代了利用真菌的生产技术。目前，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)通过遗传改造成为主要的核黄素工业生产菌，但其生产过程属于常温发酵，能耗高。主要体现在生产过程中需维持常温，以缓解发酵过程的生物热。与之相比，高温发酵(45～60℃)更具有优势。对于细菌个体，在较高温度下，细胞内酶的反应速率提高，细胞生长快。对于工业生产，高温发酵缩短了发酵周期，一是细菌生长快，可在较短时间内达到产目的代谢物的生产状态；二是设备原料等高温灭菌冷却时间较少，节能节水。同时，高温发酵节约生产成本，在生产过程的冷却水维持恒定温度是必不可少的，且常温发酵过程中冷却水的耗费约占生产成本的20％，而高温发酵可以减少甚至不使用冷却水。此外，高温发酵可以避免常温杂菌的污染，减少原料的浪费。因此，开发核黄素高温生产工艺是未来核黄素工业发展的方向。
发明内容
本发明的目的是提供高温产核黄素的工程菌及其构建方法与应用，特别是高温产核黄素的地芽孢杆菌和大肠杆菌工程菌的构建及应用。
为了实现本发明目的，本发明提供的高温产核黄素的工程菌，其为大肠杆菌或地芽孢杆菌，并携带有表达地芽孢杆菌核黄素合成基因簇的表达载体。
优选地，所述大肠杆菌的出发菌株为JM109、EK-12MG1655或BL21(优选JM109)，所述地芽孢杆菌的出发菌株为热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌(Geobacillusthermoglucosidasius)NCIMB 11955。
优选地，所述地芽孢杆菌核黄素合成基因簇来自于热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌(Geobacillus thermoglucosidasius)NCIMB 11955或热脱氮地芽孢杆菌(Geobacillusthermodenitrificans)CGMCC 1.5331，用于扩增热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌核黄素合成基因簇tgrib的引物序列如SEQ ID NO:1-2所示，用于扩增热脱氮地芽孢杆菌核黄素合成基因簇dnrib的引物序列如SEQ ID NO:3-4所示。
优选地，所述地芽孢杆菌核黄素合成基因簇是通过表达载体pUCG3.8导入宿主菌的。质粒pUCG3.8可参见Jeremy Bartosiak-Jentys et al,Modular system forassessment of glycosyl hydrolase secretion in Geobacillusthermoglucosidasius，Microbiology(2013),159,1267–1275。其他大肠杆菌地芽孢杆菌穿梭载体也可用于本发明。
所述高温产核黄素的工程菌可按如下方法构建得到：
1、重组质粒的构建(图1)：
(1)以质粒pTAC-RiboJ-gfp为模板，用引物sgfps和sgfpa进行PCR扩增，获得sgfp和终止子T3序列；以热脱氮地芽孢杆菌基因组为模板，用引物Pldhs和Pldha进行PCR扩增，获得启动子pLdh序列；然后经过融合PCR，得到pLdh-sgfp-T3序列；将pUCG3.8和pLdh-sgfp-T3进行EcoRI和BamHI双酶切，然后T4连接酶连接，经转化，卡那霉素抗性筛选，获得重组质粒pUCG3.8S；
(2)以pUCG3.8S为模板，用引物pucG3.8ls和pucG3.8la进行PCR扩增，获得含有pLdh和T3终止子的载体骨架序列；
(3)以热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌(Geobacillus thermoglucosidasius)NCIMB11955基因组为模板，用引物Tgribs和Tgriba扩增得到核黄素合成基因簇tgrib；再以热脱氮地芽孢杆菌(Geobacillus thermodenitrificans)CGMCC 1.5331基因组为模板，用引物Dnribs和Dnriba扩增得到核黄素合成基因簇dnrib；
(4)将上述步骤(2)含有pLdh和T3终止子的载体骨架序列分别与步骤(3)的核黄素合成基因簇tgrib和dnrib进行Gibson组装，转化JM109，筛选得到重组质粒pUCG3.8-R1和pUCG3.8-R2。
质粒Ptac-RiboJ-gfp可参见Chunbo Lou et al,Ribozyme-based insulatorparts buffer synthetic circuits from genetic context,Nature biotechnology(2012),30,P1137–1142。
2、工程菌的构建：将上述重组质粒pUCG3.8-R1或pUCG3.8-R2转入大肠杆菌(Escherichia coli JM109)或地芽孢杆菌(Geobacillus thermoglucosidasiusNCIMB11955)，从而获得高温产核黄素的工程菌。
其中，步骤2)中使用的引物序列见表1：
表1
Figure BDA0001643921210000031
本发明还提供所述工程菌在发酵生产核黄素中的应用。
前述的应用，所述工程菌为大肠杆菌，将菌种接入含有抗生素的LBG培养基中，在≤45℃(37℃～45℃)条件下发酵生产核黄素。
本发明中，所述LBG培养基为含有10g/L葡萄糖和20.9g/L3-(N-玛琳代)丙磺酸(MOPS)的LB液体培养基。
优选地，将菌种接入含有7.5-12.5μg/mL卡那霉素的LBG培养基中，250mL摇瓶的装液量为50mL，在≤45℃(37℃～45℃)，摇床转速220-250r/min条件下发酵生产核黄素。
更优选地，所述LBG培养基中还添加有1％CaCO3，以维持培养液的pH值在菌株生长范围。
以含有热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌核黄素合成基因簇的大肠杆菌作为生产菌株，摇瓶发酵生产核黄素，在如下发酵条件下，核黄素产量达到最大，为276mg/L左右。具体发酵条件为：以接种后OD600值为0.1的接种量将种子液接入不含有CaCO3的LBG培养基中，摇瓶装液量50mL/250mL，发酵培养基中卡那霉素浓度7.5μg/mL；发酵温度45℃，摇床转速250r/min，发酵48小时至OD600值4.8左右(发酵结束后发酵液pH值约为5.3)。
以含有热脱氮地芽孢杆菌核黄素合成基因簇的大肠杆菌作为生产菌株，摇瓶发酵生产核黄素，在如下发酵条件下，核黄素产量达到最大，为214mg/L左右。具体发酵条件为：以接种后OD600值为0.1的接种量将种子液接入不含有CaCO3的LBG培养基中，摇瓶装液量50mL/250mL，发酵培养基中卡那霉素浓度12.5μg/mL；发酵温度45℃，摇床转速250r/min，发酵48小时至OD600值3.8左右(发酵结束后发酵液pH值约为5.3)。
前述的应用，所述工程菌为热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌(Geobacillusthermoglucosidasius NCIMB 11955)，将菌种接入含有抗生素的LB液体培养基中，在≤60℃(37℃～60℃)条件下发酵生产核黄素。
其中，所述LB液体培养基中添加有1‰的金属离子溶液。所述金属离子溶液为0.04M FeSO4+0.91M MgSO4+0.59M CaCl2，以水配制。
优选地，将菌种接入含有12.5μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，250mL摇瓶的装液量为50mL，在≤60℃(37℃～60℃)，摇床转速220-250r/min条件下发酵生产核黄素。
以过表达热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌核黄素合成基因簇的热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌作为生产菌株，摇瓶发酵生产核黄素，在如下发酵条件下，核黄素产量达到最大，为50mg/L左右。具体发酵条件为：以接种后OD600值为0.1的接种量将种子液接入含有1‰金属离子的LB培养基中，摇瓶装液量50mL/250mL，发酵培养基中卡那霉素浓度12.5μg/mL；发酵温度60℃，摇床转速250r/min，发酵24小时至OD600值6.1左右(发酵结束后发酵液pH值约为8.6)。
以含有热脱氮地芽孢杆菌核黄素合成基因簇的热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌作为生产菌株，摇瓶发酵生产核黄素，在如下发酵条件下，核黄素产量达到最大，为49mg/L左右。具体发酵条件为：以接种后OD600值为0.1的接种量将种子液接入含有1‰金属离子的LB培养基中，摇瓶装液量50mL/250mL，发酵培养基中卡那霉素浓度12.5μg/mL；发酵温度60℃，摇床转速250r/min，发酵24小时至OD600值4.2左右(发酵结束后发酵液pH值约为8.4)。
本发明还提供地芽孢杆菌核黄素合成基因簇在构建产核黄素的工程菌中的应用，其中，所述地芽孢杆菌核黄素合成基因簇来自于热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌(Geobacillusthermoglucosidasius)NCIMB 11955或热脱氮地芽孢杆菌(Geobacillusthermodenitrificans)CGMCC 1.5331，用于扩增热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌核黄素合成基因簇tgrib的引物序列如SEQ ID NO:1-2所示，用于扩增热脱氮地芽孢杆菌核黄素合成基因簇dnrib的引物序列如SEQ ID NO:3-4所示。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
(一)工程菌的选择。本发明利用大肠杆菌和地芽孢杆菌作为发酵生产核黄素的底盘。地芽孢杆菌是一种天然高温生产底盘，其中热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌的最适生长温度为60℃。而大肠杆菌是可改造的耐高温菌株，也是一种良好的产核黄素宿主菌。此外，热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌可以利用更廉价的碳源纤维素，比枯草芽孢杆菌更节约成本；而大肠杆菌遗传背景清楚，比枯草芽孢杆菌遗传操作简单，更容易改造。
(二)高温发酵节约生产成本。本发明提供的高温产核黄素的地芽孢杆菌工程菌可在60℃高温下发酵生产核黄素，高温产核黄素的大肠杆菌工程菌可在45℃条件下发酵生产核黄素。
(三)高温发酵缩短了发酵周期。枯草芽胞杆菌生长代时长达40-120min，生产周期长。大肠杆菌代时约为20min，热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌代时约为16min，均比枯草芽孢杆菌代时短，而且高温发酵时的设备原料灭菌等预处理中等待冷却的时间会相应缩短。本发明高温产核黄素的地芽孢杆菌和大肠杆菌工程菌的发酵产核黄素周期比枯草芽胞杆菌平均缩短了48h和24h左右。
附图说明
图1为本发明实施例1中重组质粒pUCG3.8-R1和pUCG3.8-R2的构建过程示意图。
图2为本发明实施例2中重组质粒pUCG3.8-R1转入大肠杆菌和地芽孢杆菌的菌落PCR结果电泳图谱。其中，M：分子量标记(2000bp Ladder)；1：pUCG3.8-R1质粒扩增产物，大小为444bp；2和4分别为E.coli-R0和GT扩增产物，几乎没有条带；3和5分别为E.coli-R1和GT-R1扩增产物，大小为444bp。
图3为本发明实施例2中重组质粒pUCG3.8-R2转入大肠杆菌和地芽孢杆菌的菌落PCR结果电泳图谱。其中，M：分子量标记(2000bp Ladder)；1：pUCG3.8-R2质粒扩增产物，大小为1105bp；2和4分别为E.coli-R0和GT扩增产物，几乎没有条带；3和5分别为E.coli-R2和GT-R2扩增产物，大小为1105bp。
图4为本发明实施例4中大肠杆菌在37℃，42℃，45℃和46℃条件下发酵48小时，E.coli-R0，E.coli-R1和E.coli-R2的OD值。当LBG培养基中不添加CaCO3时，45℃菌株E.coli-R0发酵液的OD值为2.8，菌株E.coli-R1发酵液的OD值为3.9，菌株E.coli-R2发酵液的OD值为3.76。
图5为本发明实施例4中大肠杆菌在37℃，42℃，45℃和46℃条件下发酵48小时，E.coli-R0，E.coli-R1和E.coli-R2的核黄素浓度。45℃时，E.coli-R0几乎不产核黄素，E.coli-R1产量为245mg/L，E.coli-R2产量为214mg/L。
图6为本发明实施例4中E.coli-R1在卡那霉素浓度为12.5μg/mL，10μg/mL和7.5μg/mL时，45℃发酵48小时的OD值变化图。
图7为本发明实施例4中E.coli-R1在卡那霉素浓度为12.5μg/mL，10μg/mL和7.5μg/mL时，45℃发酵48小时的核黄素浓度变化图。
图8为本发明实施例4中E.coli-R1在45℃发酵48小时，培养基内不加CaCO3与加入1％CaCO3的OD值对比图。加入CaCO3后，菌液OD值增加至4.8。
图9为本发明实施例4中E.coli-R1在45℃发酵48小时，培养基内不加CaCO3与加入1％CaCO3的核黄素产量对比图。加入CaCO3后，核黄素产量提高至276mg/L。
图10为本发明实施例3中GT-R1和GT-R2在60℃发酵24小时的核黄素产量。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J & Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1 重组质粒的构建
从NCBI获取热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌(NZ_CP016916.1)和热脱氮地芽孢杆菌(NC_009328.1)的基因组信息，通过注释找到参与核黄素合成的酶，确定其基因簇的大小，并与枯草芽孢杆菌的核黄素簇基因序列通过BLAST进行比较，确定序列有较高的相似性。热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌(Geobacillus thermoglucosidasius)NCIMB 11955和热脱氮地芽孢杆菌(Geobacillus thermodenitrificans)CGMCC 1.5331为实验室储藏菌株，用北京天根公司的细菌基因组提取试剂盒提取两种地芽孢杆菌的基因组，热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌的核黄素合成基因簇命名为tgrib，热脱氮地芽孢杆菌的核黄素合成基因簇命名为dnrib，用Primer 6.0软件设计的引物如表1所示。
(1)以质粒pTAC-RiboJ-gfp为模板，用引物sgfps和sgfpa进行PCR扩增，获得sgfp和终止子T3序列；以热脱氮地芽孢杆菌基因组为模板，用引物Pldhs和Pldha进行PCR扩增，获得启动子pLdh序列。然后经过融合PCR，得到pLdh-sgfp-T3序列。将pUCG3.8和pLdh-sgfp-T3先经过EcoRI和BamHI双酶切，然后T4连接酶连接，经转化，卡那霉素抗性筛选，获得重组质粒pUCG3.8S。
(2)以pUCG3.8S为模板，用引物pucG3.8ls和pucG3.8la进行PCR扩增，获得含有pLdh和T3终止子的载体骨架序列。
(3)以热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌的基因组为模板，用引物Tgribs和Tgriba扩增得到核黄素合成基因簇tgrib；再以热脱氮地芽孢杆菌的基因组为模板，用引物Dnribs和Dnriba扩增得到核黄素合成基因簇dnrib。
(4)将上述步骤(2)含有pLdh和T3终止子的载体骨架序列分别与tgrib和dnrib进行Gibson组装，转化JM109，筛选得到重组质粒pUCG3.8-R1和pUCG3.8-R2。具体构建过程示意见图1。
以上PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳后，均采用AXYGEN的AxyPrep DNA GelExtraction Kit回收得到DNA片段。
实施例2 高温产核黄素的地芽孢杆菌和大肠杆菌工程菌的构建
将重组质粒转化至Escherichia coli JM109，含有pUCG3.8-R1的菌株命名为E.coli-R1，含有pUCG3.8-R2的菌株命名为E.coli-R2，含有pUCG3.8的菌株命名为E.coli-R0。转化后的菌株进行菌落PCR验证(图2)。
将重组质粒电转至热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌(Geobacillusthermoglucosidasius)NCIMB 11955，含有pUCG3.8-R1的菌株为GT-R1，含有pUCG3.8-R2的菌株命名为GT-R2，不含质粒的菌株命名为GT为野生型，含有pUCG3.8的菌株命名为GT-R0。转化后的菌株进行菌落PCR验证(图3)。
实施例3 利用工程菌发酵生产核黄素
1、以含有地芽孢杆菌核黄素合成基因簇的大肠杆菌作为生产菌株
(1)种子液的制备
在LB培养基平板上划线，得到单菌落，接种含有12.5μg/mL卡那霉素的LB培养基，37℃，220r/min试管培养约12h。
(2)摇瓶发酵
将上述种子液按照接种后OD600值为0.1的接种量接入含有12.5μg/mL卡那霉素的LBG培养基(LB液体培养基+10g/L葡萄糖+20.9g/L MOPS)，摇瓶装液量50mL/250mL，在45℃，摇床转速250r/min的发酵条件下，进行核黄素生产。
当LBG培养基中不添加CaCO3时，卡那霉素为12.5μg/mL，45℃发酵48小时后，菌株E.coli-R2发酵液OD600值约为3.76，核黄素产量最大，为214mg/L；菌株E.coli-R1发酵液OD600值约为3.9，核黄素产量为245mg/L。
当LBG培养基中不添加CaCO3时，卡那霉素为12.5μg/mL，42℃发酵48小时后，菌株E.coli-R1发酵液OD600值约为4.3，核黄素产量达249mg/L。
当LBG培养基中不添加CaCO3时，卡那霉素为7.5μg/mL，45℃发酵48小时后，菌株E.coli-R1发酵液OD600值约为4.8，核黄素产量最大，核黄素产量达276mg/L。
当LBG培养基中加入1％CaCO3时，卡那霉素为12.5μg/mL，45℃发酵48小时后，菌株E.coli-R1发酵液OD600值约为5.1，核黄素产量为269mg/L左右。
而菌株E.coli-R0发酵液中几乎检测不到核黄素。
2、以含有地芽孢杆菌核黄素合成基因簇的热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌作为生产菌株(1)种子液的制备在TSA培养基平板上划线，得到单菌落，接种于含有12.5μg/mL卡那霉素的LB培养基，60℃，250r/min试管培养约12h。
(2)摇瓶发酵
将上述种子液按照接种后OD600值为0.1的接种量接入含有12.5μg/mL卡那霉素的LB培养基，所述LB培养基中加入1‰金属离子(0.04M FeSO4+0.91M MgSO4+0.59M CaCl2)，摇瓶装液量50mL/250mL，在60℃，摇床转速250r/min的发酵条件下，进行核黄素生产。
菌株GT-R1发酵24小时后，发酵液OD600值约为6.1，测定发酵液中核黄素含量为50mg/L左右。
菌株GT-R2发酵24小时后，发酵液OD600值约为4.2，测定发酵液中核黄素含量为49mg/L左右。
而菌株GT及GT-R0发酵液中检测不到核黄素。
3、OD值及核黄素的测定
OD值即菌体浓度，测定先对发酵液进行稀释，再用紫外分光光度计在600n波长测定吸收值。
核黄素的测定采用HPLC分析的方法。先用HPLC分析0.12mg/L，0.06mg/L，0.03mg/L，0.01mg/L核黄素标准品，绘制标准曲线，然后将发酵液进行10000r/min离心2min，再进行HPLC分析，根据吸收峰值估算发酵液内核黄素的产量。流动相组成：10％甲醇(v/v)，10％乙腈(v/v)，终浓度为2mM的磷酸，用水补足1L，流速为1mL/min，高效液相色谱仪为日本Shimadzu,LC-20AT的HPLC系统及SPD-20AT检测器，液相色谱柱采用美国Agilent，AgilentZORBAX SB-C18(4.6mm×250mm，5μm)。
实施例4 发酵条件的优化
1、以E.coli-R1和E.coli-R2作为生产菌株
(1)不同发酵温度对OD值的影响
参照实施例3的条件，LBG培养基中不添加CaCO3，卡那霉素浓度12.5μg/mL，分别在37℃，42℃，45℃和46℃进行摇瓶发酵。
发酵结果显示，在37℃～46℃范围内，E.coli-R1，E.coli-R2和E.coli-R0三株菌的OD值均随着温度的增加而逐渐减小(图4)。46℃时OD值几乎为0，37℃时OD值大。同一温度下，三株菌OD值相差不多，说明质粒的存在没有给细胞带来负担。
(2)不同发酵温度对核黄素产量的影响
参照实施例3的条件，LBG培养基中不添加CaCO3，卡那霉素浓度12.5μg/mL，在37℃～45℃范围内，核黄素的浓度随着温度的增加而增加(图5)。同一温度下，E.coli-R1产量最高，E.coli-R2产量次之，E.coli-R0导入的质粒不含地芽孢杆菌的核黄素合成簇，基本不积累核黄素。45℃是大肠杆菌产核黄素最高的温度，该温度下，E.coli-R1产量为245mg/L，E.coli-R2量为214mg/L。该结果说明pUCG3.8-R1和pUCG3.8-R2在大肠杆菌内发挥了作用，实现核黄素的高温生产。
(3)发酵液中抗生素浓度对OD值及核黄素产量的影响
参照实施例3的条件，LBG培养基中不添加CaCO3，在45℃条件下改变卡那霉素的浓度(12.5μg/mL，10μg/mL和7.5μg/mL)进行发酵。
E.coli-R1菌株OD值随着卡那霉素浓度逐渐减少而逐渐增加(图6)，核黄素产量也逐渐增加(图7)。但经过计算，单位OD值内核黄素的产量没有变化，因此，减少卡那霉素浓度是通过增加菌体OD值，从而使总体的核黄素产量增加。OD值和核黄素浓度在卡那霉素浓度为7.5μg/mL时，达到最大值，OD值为4.8，核黄素产量为276mg/L。
(4)pH值对发酵液OD值及核黄素产量的影响
在45℃条件下发酵，向培养基内添加1％CaCO3，卡那霉素浓度12.5μg/mL，发酵结果显示OD值和核黄素产量均有所增加(图8和图9)。OD值达到5.1，核黄素产量为269mg/L。添加CaCO3可以中和发酵过程中产生的酸，维持pH值在菌株生长范围。未加入CaCO3时发酵液的pH值约为5.3，而加入CaCO3后，pH值维持在5.7左右，更适宜大肠杆菌的生长，从而提高核黄素的产量。
2、以GT-R1和GT-R2作为生产菌株
GT菌株为野生型，本身不产核黄素，GT-R0含有空质粒pUCG3.8，也不产核黄素。地芽孢杆菌60℃发酵结果显示，GT-R1和GT-R2可以在60℃产核黄素，且GT-R1产核黄素浓度约为50mg/L，GT-R2产核黄素浓度约为49mg/L(图10)。
以上结果证明，利用大肠杆菌和热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌工程菌发酵生产核黄素，不仅发酵温度比枯草芽孢杆菌高，而且发酵周期比枯草芽孢杆菌大大缩短。节约了时间和成本。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国科学院微生物研究所 中国科学院大学
<120> 高温产核黄素的工程菌及其构建方法与应用
<130> KHP181112073.4
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgtattcaca ataataagaa gggagaatag tgatgcgaaa cgatgaacaa tatatgc 57
<210> 2
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cctttcgttt tatttgatgc ctggctcatt acaactcaca tttatccaaa a 51
<210> 3
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgtattcaca ataataagaa gggagaatag tgatgtacaa tgatgaacat tacatgc 57
<210> 4
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cctttcgttt tatttgatgc ctggctcagc tgcatgtttg acatttatc 49
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gccaggcatc aaataaaacg a 21
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cactattctc ccttcttatt attgtga 27
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
agtgaattcg gagttaactg cctcgtcca 29
<210> 8
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cgcctttacg catcactatt ctcccttctt attattgtg 39
<210> 9
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cacaataata agaagggaga atagtgatgc gtaaaggcga agagctgttc a 51
<210> 10
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tagaggatcc gagtcactaa gggctaacta ac 32

Claims (6)

1.高温产核黄素的工程菌，其特征在于，其为大肠杆菌或地芽孢杆菌，并携带有表达地芽孢杆菌核黄素合成基因簇的表达载体；
所述大肠杆菌的出发菌株为JM109，所述地芽孢杆菌的出发菌株为热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌(Geobacillus thermoglucosidasius)NCIMB 11955；
所述地芽孢杆菌核黄素合成基因簇来自于热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌(Geobacillusthermoglucosidasius)NCIMB 11955或热脱氮地芽孢杆菌(Geobacillusthermodenitrificans)CGMCC 1.5331，用于扩增热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌核黄素合成基因簇tgrib的引物序列如SEQ ID NO:1-2所示，用于扩增热脱氮地芽孢杆菌核黄素合成基因簇dnrib的引物序列如SEQ ID NO:3-4所示；
所述表达载体为pUCG3.8或其他大肠杆菌地芽孢杆菌穿梭载体。
2.权利要求1所述工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以质粒pTAC-RiboJ-gfp为模板，用引物sgfps和sgfpa进行PCR扩增，获得sgfp和终止子T3序列；以热脱氮地芽孢杆菌基因组为模板，用引物Pldhs和Pldha进行PCR扩增，获得启动子pLdh序列；然后经过融合PCR，得到pLdh-sgfp-T3序列；将pUCG3.8和pLdh-sgfp-T3进行EcoRI和BamHI双酶切，然后T4连接酶连接，经转化，卡那霉素抗性筛选，获得重组质粒pUCG3.8S；
(2)以pUCG3.8S为模板，用引物pucG3.8ls和pucG3.8la进行PCR扩增，获得含有pLdh和T3终止子的载体骨架序列；
(3)以热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌(Geobacillus thermoglucosidasius)NCIMB 11955基因组为模板，用引物Tgribs和Tgriba扩增得到核黄素合成基因簇tgrib；再以热脱氮地芽孢杆菌(Geobacillus thermodenitrificans)CGMCC 1.5331基因组为模板，用引物Dnribs和Dnriba扩增得到核黄素合成基因簇dnrib；
(4)将上述步骤(2)含有pLdh和T3终止子的载体骨架序列分别与步骤(3)的核黄素合成基因簇tgrib和dnrib进行Gibson组装，转化JM109，筛选得到重组质粒pUCG3.8-R1和pUCG3.8-R2；
(5)将上述重组质粒pUCG3.8-R1或pUCG3.8-R2转入大肠杆菌或地芽孢杆菌，从而获得高温产核黄素的工程菌；
所用引物序列见表1：
表1
Figure FDA0003214870710000011
Figure FDA0003214870710000021
3.权利要求1所述工程菌在发酵生产核黄素中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述工程菌为大肠杆菌，将菌种接入含有抗生素的LBG培养基中，在≤45℃条件下发酵生产核黄素；
其中，所述LBG培养基为含有10g/L葡萄糖和20.9g/L3-(N-玛琳代)丙磺酸的LB液体培养基。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述LBG培养基中还添加有1％CaCO3。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述工程菌为热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌，将菌种接入含有抗生素的LB液体培养基中，在≤60℃条件下发酵生产核黄素；
其中，所述LB液体培养基中添加有1‰的金属离子溶液，所述金属离子溶液为0.04MFeSO4+0.91M MgSO4+0.59M CaCl2，以水配制。
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