CN114480240A - 一种产岩藻糖基乳糖的基因工程菌及生产方法 - Google Patents

一种产岩藻糖基乳糖的基因工程菌及生产方法 Download PDF

Info

Publication number
CN114480240A
CN114480240A CN202210184191.6A CN202210184191A CN114480240A CN 114480240 A CN114480240 A CN 114480240A CN 202210184191 A CN202210184191 A CN 202210184191A CN 114480240 A CN114480240 A CN 114480240A
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
fucosyllactose
genetically engineered
gdp
mannose
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202210184191.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114480240B (zh
Inventor
张涛
李梦丽
江波
李晨晨
胡苗苗
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangnan University
Original Assignee
Jiangnan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangnan University filed Critical Jiangnan University
Priority to CN202210184191.6A priority Critical patent/CN114480240B/zh
Publication of CN114480240A publication Critical patent/CN114480240A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114480240B publication Critical patent/CN114480240B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2468—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1) acting on beta-galactose-glycoside bonds, e.g. carrageenases (3.2.1.83; 3.2.1.157); beta-agarase (3.2.1.81)
    • C12N9/2471—Beta-galactosidase (3.2.1.23), i.e. exo-(1-->4)-beta-D-galactanase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1288—Transferases for other substituted phosphate groups (2.7.8)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01017—Mannitol-1-phosphate 5-dehydrogenase (1.1.1.17)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01132—GDP-mannose 6-dehydrogenase (1.1.1.132)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01271—GDP-L-fucose synthase (1.1.1.271)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12Y204/01065—3-Galactosyl-N-acetylglucosaminide 4-alpha-L-fucosyltransferase (2.4.1.65), i.e. alpha-1-3 fucosyltransferase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12Y204/01069—Galactoside 2-alpha-L-fucosyltransferase (2.4.1.69)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/01—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1)
    • C12Y207/01011—6-Phosphofructokinase (2.7.1.11)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/01—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1)
    • C12Y207/01052—Fucokinase (2.7.1.52)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/08—Transferases for other substituted phosphate groups (2.7.8)
    • C12Y207/08031—Undecaprenyl-phosphate glucose phosphotransferase (2.7.8.31)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01023—Beta-galactosidase (3.2.1.23), i.e. exo-(1-->4)-beta-D-galactanase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/02—Aldehyde-lyases (4.1.2)
    • C12Y401/02017—L-Fuculose-phosphate aldolase (4.1.2.17)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y503/00—Intramolecular oxidoreductases (5.3)
    • C12Y503/01—Intramolecular oxidoreductases (5.3) interconverting aldoses and ketoses (5.3.1)
    • C12Y503/01025—L-Fucose isomerase (5.3.1.25)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y504/00—Intramolecular transferases (5.4)
    • C12Y504/02—Phosphotransferases (phosphomutases) (5.4.2)
    • C12Y504/02008—Phosphomannomutase (5.4.2.8)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种产岩藻糖基乳糖的基因工程菌及生产方法，属于代谢工程和食品发酵技术。本发明利用合成生物学手段，基于从头合成途径构建岩藻糖基乳糖的大肠杆菌细胞工厂，采用CRISPR/Cas9基因编辑技术对宿主细胞中的旁路相关基因lacZ、wcaJ、nudD、pfkA、lon进行敲除，通过多质粒表达系统进行基因manB、manC、gmd和wcaG的组装，构建不同拷贝数的表达载体以增加关键基因的表达水平；并筛选不同来源的岩藻糖基转移酶提高限速酶的活力。构建得到的重组大肠杆菌可以利用甘油合成2’‑岩藻糖基乳糖和3‑岩藻糖基乳糖，遗传稳定，表达水平高，具有明显的工业化生产潜力。

Description

一种产岩藻糖基乳糖的基因工程菌及生产方法
技术领域
本发明涉及一种产岩藻糖基乳糖的基因工程菌及生产方法，属于代谢工程和食品发酵技术。
背景技术
人乳寡糖(Human Milk Oligosaccharides,HMOs)是人乳中仅次于乳糖和脂肪的第三大固体组分。HMOs作为母乳中重要的免疫活性成分，对婴幼儿健康及生长发育起到至关重要的作用，并且越来越多的动物和临床试验证实了HMOs的有益特性，例如作为益生元维持肠道生态平衡、抵抗病原菌的黏附、免疫调节以及促进神经系统发育和修复等多种功能活性。岩藻糖基乳糖包括2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)和3-岩藻糖基乳糖(3-FL)是母乳中分泌最丰富的中性人乳寡糖，约占HMOs总量的35％，因其在营养保健和药物用途中的潜在应用而受到了极大的关注。目前，欧盟，美国和中国已批准2’-FL作为新食品成分使用，且对其安全性、适用性以及使用剂量等进行了规范。
岩藻糖基乳糖的生产可采用母乳分离、化学合成、酶法合成和微生物发酵。因母乳来源有限及化学合成过程需精准地对侧链保护和脱保护，过程繁琐，使得岩藻糖基乳糖的高效合成受限。酶法合成岩藻糖基乳糖，可根据受体和糖基供体的构型筛选合适的酶类，但是核苷供体GDP-岩藻糖、UDP-半乳糖等价格昂贵，且糖基转移酶的催化活力低，产量仅有毫克级别，无法实现大规模的工业化制造。随着代谢工程和合成生物学的发展，通过操控微生物的遗传单元、重构细胞生化网络，构建新的底盘微生物，利用微生物合成岩藻糖基乳糖已显然成为具有绿色高效及可持续发展特征的制造策略。
目前，研究较多的是以大肠杆菌为模式生物，通过从头合成途径和补救途径代谢生产GDP-L-岩藻糖，在此基础上异源表达岩藻糖基转移酶，最终发酵得到岩藻糖基乳糖。大肠杆菌具备生长迅速、培养简单、重组子稳定、载体受体系统完备等特点，是作为GDP-岩藻糖合成研究的理想模式微生物。在从头合成途径中，工程菌可直接利用廉价的底物(甘油和葡萄糖)实现关键前体GDP-岩藻糖和受体乳糖的高效合成，进而为岩藻糖基乳糖的工业制备提供了有利条件。本发明旨在利用合成生物学手段，基于从头合成途径构建岩藻糖基乳糖的大肠杆菌细胞工厂，通过解析底盘微生物的代谢网络，采用CRISPR/Cas9基因编辑技术对宿主细胞中的旁路相关基因进行敲除，强化细胞代谢流，实现了代谢通路的全局优化；开展代谢途径的模块化表达，通过多质粒表达系统进行基因组装，构建不同拷贝数的表达载体以增加关键基因的表达水平；筛选不同来源的岩藻糖基转移酶提高限速酶的活力。该方法为岩藻糖基乳糖的批量生产提供了有效途径，同时具有较强的理论研究价值和社会经济效益，市场开发前景广阔。
发明内容
[技术问题]
现有技术生产岩藻糖基乳糖的成本高昂，糖苷供体昂贵且产量较低，不足以实现工业化生产，无法提供高效生产岩藻糖基乳糖的菌株，也不能提供成本低廉且绿色高效的岩藻糖基乳糖的制备方法。
[技术方案]
本发明为了解决现有生物法合成的岩藻糖基乳糖产量较低的问题，提供了一种产2’-FL和/或3-FL的基因工程菌及其构建方法。
本发明的第一个目的是提供一种基因工程菌，所述基因工程菌敲除了β-半乳糖苷酶基因lacZ、UDP-葡萄糖脂质载体转移酶基因wcaJ、GDP-甘露糖甘露糖基水解酶基因nudD、GDP-甘露糖水解酶基因nudK、6-磷酸果糖激酶-1基因pfkA、6-磷酸果糖激酶-2基因pfkB、甘露醇-1-磷酸脱氢酶基因mtlD、蛋白酶基因lon、果糖-6-磷酸醛缩酶A基因fsaA、果糖-6-磷酸醛缩酶B基因fsaB和岩藻糖异构酶/墨角藻糖激酶FucI-FucK基因簇中的一种或多种基因，并表达了磷酸甘露糖变位酶基因manB、甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶基因manC、GDP-甘露糖-6-脱氢酶基因gmd，GDP-岩藻糖合成酶基因wcaG。
在一种实施方式中，所述基因工程菌敲除了β-半乳糖苷酶基因lacZ，并在此基础上分别敲除了UDP-葡萄糖脂质载体转移酶基因wcaJ、GDP-甘露糖甘露糖基水解酶基因nudD、GDP-甘露糖水解酶基因nudK、6-磷酸果糖激酶-1基因pfkA、6-磷酸果糖激酶-2基因pfkB、甘露醇-1-磷酸脱氢酶基因mtlD、蛋白酶基因lon、果糖-6-磷酸醛缩酶A基因fsaA、果糖-6-磷酸醛缩酶B基因fsaB和岩藻糖异构酶/墨角藻糖激酶FucI-FucK基因簇，并同时表达了磷酸甘露糖变位酶基因manB、甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶基因manC、GDP-甘露糖-6-脱氢酶基因gmd，GDP-岩藻糖合成酶基因wcaG。
在一种实施方式中，所述基因工程菌同时敲除了β-半乳糖苷酶基因lacZ和UDP-葡萄糖脂质载体转移酶基因wcaJ，并在此基础上分别敲除了GDP-甘露糖甘露糖基水解酶基因nudD、GDP-甘露糖水解酶基因nudK、6-磷酸果糖激酶-1基因pfkA、6-磷酸果糖激酶-2基因pfkB、甘露醇-1-磷酸脱氢酶基因mtlD、蛋白酶基因lon、果糖-6-磷酸醛缩酶A基因fsaA、果糖-6-磷酸醛缩酶B基因fsaB和岩藻糖异构酶/墨角藻糖激酶FucI-FucK基因簇，并同时表达了磷酸甘露糖变位酶基因manB、甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶基因manC、GDP-甘露糖-6-脱氢酶基因gmd，GDP-岩藻糖合成酶基因wcaG。
在一种实施方式中，所述基因工程菌同时敲除了β-半乳糖苷酶基因lacZ、UDP-葡萄糖脂质载体转移酶基因wcaJ和GDP-甘露糖甘露糖基水解酶基因nudD，并在此基础上敲除了6-磷酸果糖激酶-1基因pfkA或蛋白酶基因lon，并同时表达了磷酸甘露糖变位酶基因manB、甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶基因manC、GDP-甘露糖-6-脱氢酶基因gmd，GDP-岩藻糖合成酶基因wcaG。
在一种实施方式中，所述基因工程菌同时敲除了β-半乳糖苷酶基因lacZ、UDP-葡萄糖脂质载体转移酶基因wcaJ、GDP-甘露糖甘露糖基水解酶基因nudD和6-磷酸果糖激酶-1基因pfkA并在此基础上敲除了蛋白酶基因lon，并同时表达了磷酸甘露糖变位酶基因manB、甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶基因manC、GDP-甘露糖-6-脱氢酶基因gmd，GDP-岩藻糖合成酶基因wcaG。
在一种实施方式中，在上述基因工程菌中表达α-1,2岩藻糖基转移酶基因或α-1,3岩藻糖基转移酶基因。
在一种实施方式中，所述β-半乳糖苷酶基因lacZ的Gene ID为945006，UDP-葡萄糖脂质载体转移酶基因wcaJ的Gene ID为946583，GDP-甘露糖甘露糖基水解酶基因nudD的Gene ID为946559，GDP-甘露糖水解酶基因nudK的Gene ID为947072，6-磷酸果糖激酶-1基因pfkA的Gene ID为948412，6-磷酸果糖激酶-2基因pfkB的Gene ID为946230，甘露醇-1-磷酸脱氢酶基因mtlD的Gene ID为948117，蛋白酶基因lon的Gene ID为945085，果糖-6-磷酸醛缩酶A基因fsaA的Gene ID为945449，果糖-6-磷酸醛缩酶B基因fsaB的Gene ID为948439，岩藻糖异构酶/墨角藻糖激酶FucI-FucK基因簇的Gene ID为946195和946022。
在一种实施方式中，所述α-1,2岩藻糖基转移酶基因分别筛选来源于幽门螺杆菌ATCC 26695的HpfutC、细长嗜热聚球藻BP-1的TvfutC、嗜热蓝藻的TsfutC、人参假单胞菌的PpfutC、大肠杆菌O126的EcwbgL以及脆弱拟杆菌的BfwcfB，α-1,3岩藻糖基转移酶基因分别筛选来源于幽门螺杆菌NCTC 11639的M32和幽门螺杆菌ATCC 26695的HpfutA。
在一种实施方式中，来源于幽门螺杆菌ATCC 26695、细长嗜热聚球藻BP-1、嗜热蓝藻、人参假单胞菌、大肠杆菌O126和脆弱拟杆菌的α-1,2岩藻糖基转移酶基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示；来源于幽门螺杆菌NCTC 11639、幽门螺杆菌ATCC 26695的α-1,3岩藻糖基转移酶基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示。
在一种实施方式中，所述编码磷酸甘露糖变位酶基因manB、甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶基因manC、GDP-甘露糖-6-脱氢酶基因gmd和GDP-岩藻糖合成酶基因wcaG均来源于大肠杆菌K12 MG655。
在一种实施方式中，磷酸甘露糖变位酶基因manB的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶基因manC的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，GDP-甘露糖-6-脱氢酶基因gmd的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，GDP-岩藻糖合成酶基因wcaG的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
在一种实施方式中，所述基因工程菌以大肠杆菌为宿主。
在一种实施方式中，所述基因工程菌利用pRSFDuet-1、pETDuet-1、pCDFDuet-1、pACYCDuet-1或pCOLADuet-1载体过表达基因manB、manC、gmd、wcaG、futC和/或M32。
在一种实施方式中，所述基因工程菌利用pRSFDuet-1表达manB、manC、gmd和wcaG，利用pETDuet-1表达幽门螺杆菌ATCC 26695来源的HpfutC。
在一种实施方式中，所述基因工程菌利用pRSFDuet-1表达manB、manC、gmd和wcaG，利用pETDuet-1表达细长嗜热聚球藻BP-1来源的TvfutC。
在一种实施方式中，所述基因工程菌利用pRSFDuet-1表达manB、manC、gmd和wcaG，利用pETDuet-1表达嗜热蓝藻来源的TsfutC。
在一种实施方式中，所述基因工程菌利用pRSFDuet-1表达manB、manC、gmd和wcaG，利用pETDuet-1表达人参假单胞菌来源的PpfutC。
在一种实施方式中，所述基因工程菌利用pRSFDuet-1表达manB、manC、gmd和wcaG，利用pETDuet-1表达大肠杆菌O126来源的EcwbgL。
在一种实施方式中，所述基因工程菌利用pRSFDuet-1表达manB、manC、gmd和wcaG，利用pETDuet-1表达脆弱拟杆菌来源的BfwcfB。
在一种实施方式中，所述基因工程菌利用pRSFDuet-1表达manB、manC、gmd和wcaG，利用pETDuet-1表达幽门螺杆菌NCTC 11639来源的M32。
在一种实施方式中，所述基因工程菌利用pRSFDuet-1表达manB、manC、gmd和wcaG，利用pETDuet-1表达幽门螺杆菌ATCC 26695来源的HpfutA。
本发明提供了一种构建所述基因工程菌的方法，在大肠杆菌BL21(DE3)基因组中敲除了β-半乳糖苷酶基因lacZ、UDP-葡萄糖脂质载体转移酶基因wcaJ、GDP-甘露糖甘露糖基水解酶基因nudD、6-磷酸果糖激酶-1基因pfkA和蛋白酶基因lon，通过多质粒表达系统过表达磷酸甘露糖变位酶基因manB、甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶基因manC、GDP-甘露糖-6-脱氢酶基因gmd，GDP-岩藻糖合成酶基因wcaG、α-1,2岩藻糖基转移酶基因futC和/或α-1,3岩藻糖基转移酶基因M32。
在一种实施方式中，表达载体为pRSFDuet-1、pETDuet-1、pCDFDuet-1、pACYCDuet-1和/或pCOLADuet-1，所述基因工程菌利用pRSFDuet-1表达manB、manC、gmd和wcaG，利用pETDuet-1表达HpfutC或M32。
本发明提供了一种生产岩藻糖基乳糖的方法，以所述的工程菌为发酵菌株，在以甘油为碳源、以IPTG为诱导剂的含乳糖发酵体系中生产2’-岩藻糖基乳糖和3-岩藻糖基乳糖。
在一种实施方式中，所述甘油在发酵体系中的浓度为10～30g/L。
在一种实施方式中，所述发酵体系中还含有甘油20～30g/L，磷酸二氢钾10～15g/L，柠檬酸1～2g/L，磷酸氢二氨3～5g/L，七水硫酸镁1～2g/L，酵母提取物8～10g/L，微量金属溶液8～10mL/L。
在一种实施方式中，所述微量金属溶液中含有柠檬酸三铁8～10g/L，七水硫酸镁2～3g/L，五水硫酸铜0.5～1.0g/L，一水硫酸锰0.2～0.5g/L，硼砂0.2～0.5g/L，钼酸铵0.1～0.2g/L，二水氯化钙1～2g/L。
在一种实施方式中，将所述基因工程菌在发酵体系中培养至OD600为0.6±0.1，加入终浓度为0.2～0.3mM的IPTG及终浓度为5～10g/L的乳糖，在20～30℃下培养不少于70h。
在一种实施方式中，将所述基因工程菌在发酵体系中培养至OD600为20±3，加入终浓度为0.1～0.3mM的IPTG及终浓度为5～15g/L的乳糖，在20～30℃诱导培养，维持发酵体系中的溶氧为20～50％，pH为6.5～7.0。
在一种实施方式中，待反应体系中初始甘油消耗完后流加甘油，使得甘油的浓度能够保持菌体生长和代谢。
在一种实施方式中，待初始乳糖消耗完后补加乳糖，使其浓度维持在10g/L。
在一种实施方式中，发酵时间不少于50h。
本发明还提供了所述的基因工程菌在生产2’-岩藻糖基乳糖和3-岩藻糖基乳糖及含有2’-岩藻糖基乳糖和3-岩藻糖基乳糖产品中的应用。
本发明的有益效果：
本发明通过敲除大肠杆菌BL21(DE3)中的岩藻糖基乳糖代谢途径中的β-半乳糖苷酶基因lacZ、UDP-葡萄糖脂质载体转移酶基因wcaJ、GDP-甘露糖甘露糖基水解酶基因nudD、6-磷酸果糖激酶基因pfkA和蛋白酶基因lon，组合调控从头合成2’-FL和3-FL所需的磷酸甘露糖变位酶基因manB、甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶基因manC、GDP-甘露糖-6-脱氢酶基因gmd，GDP-岩藻糖合成酶基因wcaG、α-1,2岩藻糖基转移酶基因HpfutC和/或α-1,3岩藻糖基转移酶基因M32的表达，实现了岩藻糖基乳糖在重组大肠杆菌中的高效合成。本发明利用重组大肠杆菌制备2’-FL和3-FL，具有培养基简单，底物廉价，菌株生长快，遗传稳定，表达水平高等优势，具备显著的工业化生产潜力。
在摇瓶发酵培养条件下，本申请构建的基因工程菌生产2’-FL的能力由初始的0.26g/L提升至6.24g/L，生产3’-FL的能力由初始的0.22g/L提升至3.56g/L；在3L发酵罐培养条件下，2’-FL和3-F的产量分别达到54.82和34.20g/L，为岩藻糖基乳糖的工业化生产奠定了基础。
附图说明
图1为岩藻糖基乳糖的代谢通路图。
图2为菌株BZWNDPAL-C1摇瓶发酵生产2’-FL。
图3为菌株BZWNDPAL-M1摇瓶发酵生产3-FL。
图4为菌株BZWNDPAL-C1的3L发酵罐补料分批发酵。
图5为菌株BZWNDPAL-M1的3L发酵罐补料分批发酵。
图6为2’-FL的HPLC检测结果。
图7为3-FL的HPLC检测结果。
具体实施方式
以下结合实例与附图对本发明的具体实施作进一步的说明，以下实例中所使用的质粒、PCR试剂、限制性内切酶、质粒抽提试剂盒、DNA胶回收试剂盒等采用商业产品，具体操作按照试剂盒说明书进行。
本发明的实施方式不限于此，其他未注明的实验操作和工艺参数按照常规技术进行。
载体pRSFDuet-1、pETDuet-1、pCDFDuet-1、pACYCDuet-1和pCOLADuet-1购自Addgene。
DNA产物、质粒的测序工作交予天霖生物科技(无锡)有限公司完成。
大肠杆菌感受态的制备：上海生工生物工程公司试剂盒。
LB液体培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠。
LB固体培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，18g/L琼脂粉。
发酵培养基：甘油30g/L，磷酸二氢钾13.5g/L，柠檬酸1.7g/L，磷酸氢二氨4.0g/L，七水硫酸镁1.4g/L，酵母提取物10g/L，微量金属溶液10mL/L(柠檬酸三铁10g/L，七水硫酸镁2.25g/L，五水硫酸铜1.0g/L，一水硫酸锰0.35g/L，硼砂0.23g/L，钼酸铵0.11g/L，二水氯化钙2.0g/L)，pH 6.8。
2’-FL和3-FL的测定方法：
使用HPLC测定：1mL发酵液于100℃煮沸10min，12000r/min离心5min，上清液经0.22μm膜过滤处理，利用HPLC检测岩藻糖基乳糖的生成量以及乳糖和甘油的消耗量。HPLC检测条件：示差折光检测器；色谱柱为Rezex ROA-organic acid(Phenomenex，USA)，柱温为50℃；流动相为0.005mol/L的H2SO4水溶液，流速为0.6mL/min；进样量为10μL。
下述实施例中菌株的摇瓶发酵条件：工程菌单菌落接种于LB液体培养基，37℃，200rpm，摇瓶培养12h，得到种子液；将种子液以3％(v/v)的接种量接入50mL发酵培养基，37℃，200rpm，摇瓶培养至OD600为0.6；加入终浓度为0.3mM的IPTG，同时加入乳糖至终浓度为8g/L，25℃，200rpm的条件下诱导培养72h。
实施例1：CRISPR-Cas9基因敲除技术改造大肠杆菌底盘微生物
根据岩藻糖基乳糖的代谢通路(图1所示)，以大肠杆菌BL21(DE3)ΔlacZΔwcaJ为出发菌株(大肠杆菌BL21(DE3)ΔlacZΔwcaJ的构建方法已公开于公开号为CN112342176A的专利文献中)，利用CRISPR-Cas9基因敲除系统分别或同时敲除了大肠杆菌BL21(DE3)ΔlacZΔwcaJ基因组中的nudD、nudK、pfkA、pfkB、mtlD、lon、fsaA、fsaB和fucIK基因，具体步骤如下(所涉及到的引物序列见表1)：
(1)以nudD基因为例，通过http://www.regenome.net/cas-offinder查找靶标基因的特异性靶点gRNA(20bp)，使用nudD-gRNA-F/gRNA-R上下游引物，以pTargetF质粒(Addgene：#62226)为模板进行PCR扩增，扩增产物经限制性内切酶Dpn I酶切，以去除多余的环状pTargetF质粒。后将扩增产物转化E.coli DH5α感受态细胞，小提质粒，使用引物gRNA-PF/gRNA-PR测序鉴定，将构建成功的敲除质粒命名为pTargetF-nudD。
(2)以大肠杆菌BL21(DE3)ΔlacZΔwcaJ基因组为模板，利用上游同源臂引物nudD-US-F/nudD-US-R和下游同源臂引物nudD-DS-F/nudD-DS-R分别扩增同源臂序列片段，产物纯化回收后采用SOE-PCR方法用引物nudD-US-F/nudD-DS-R将两片段连接起来获得基因同源修复模板。
(3)取pCas9质粒(Addgene:#62225)及大肠杆菌BL21(DE3)ΔlacZΔwcaJ电转感受态细胞，冰上放置5min后进行感受态融化，取10μL质粒加入100μL感受态细胞中，轻轻混匀。将质粒和电转感受态细胞转入预冷的电转杯中，2.5kV电击5ms，电击后迅速加入预冷的液体LB，轻轻吹打混匀后将混有质粒和感受态细胞的培养基转移到新的离心管中扩大培养1.5h。6000r/min离心2min，弃去上清液，菌体涂布于含有卡那抗性的LB平板上，放置于30℃培养箱过夜培养。
(4)挑取大肠杆菌BL21(DE3)ΔlacZΔwcaJ/pCas9单菌落于LB培养基中，30℃培养1.0h，加入终浓度为30mM的L-阿拉伯糖以诱导λ-red系统表达。当OD600达到0.6-0.8时，制备大肠杆菌BL21(DE3)ΔlacZΔwcaJ/pCas9感受态。
(5)将500ng步骤(1)构建的带有nudD特异性靶点gRNA(20bp)的靶向质粒pTargetF和1000ng步骤(2)构建的同源修复模板电转至步骤(4)制备的大肠杆菌BL21(DE3)ΔlacZΔwcaJ/pCas9感受态细胞，涂布于LB平板(卡那霉素和壮观霉素)，30℃培养16-24h，对平板上长出的单菌落进行菌落PCR验证，筛选阳性转化子和进行基因测序。
(6)对验证正确的单菌落进行pTargetF-nudD和pCas9质粒的消除，单菌落接种于LB液体培养基(卡那抗性)中，30℃、200r/min培养至对数生长期，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG过夜培养，诱导pTargetF-nudD质粒失活。菌液划线含有Kan的LB平板上，于30℃、200r/min培养12h。单菌落点板于卡那和壮观霉素的双抗性平板上，若无菌落生长，表明pTargetF-nudD质粒消除成功。
(7)pCas9质粒为温敏型质粒，将消除成功pTargetF-nudD质粒的单菌落转接至LB无抗性液体培养基中，42℃传代培养消除pCas9质粒。菌液划线无抗性的LB平板后37℃恒温培养，单菌落点板于含卡那抗性的LB培养基中，若单菌落不生长，则表明pCas9质粒消除成功，将构建好的无pTargetF-nudD质粒和pCas9质粒的基因缺失菌株在-80℃条件下保存备用。
(8)基因nudK、pfkA、pfkB、mtlD、lon、fsaA、fsaB和fucIK基因的敲除操作参照上述基因nudD的敲除。
表1.基因敲除引物
Figure BDA0003514269690000051
Figure BDA0003514269690000061
实施例2：从头合成路径的构建及敲除菌株分批发酵生产岩藻糖基乳糖
从头合成路径表达载体的构建具体步骤如下(涉及到的引物序列见表2)：
(1)manB，manC，gmd和wcaG片段的获得：以大肠杆菌K12的基因组为模板，使用引物manCB_F/R和GW_F/R进行PCR扩增，胶回收DNA，获得manC-manB、gmd-wcaG基因片段。
(2)以pRSFDuet-1、pETDuet-1、pCDFDuet-1、pACYCDuet-1和pCOLADuet-1为模板，使用引物V1_F/R和V2_F/R扩增载体骨架序列。根据In-Fusion克隆技术，将片段manC-manB分别插入上述载体的Nco I/BamH I酶切位点之间，片段gmd-wcaG分别插入上述载体的NdeI/Xho I酶切位点之间，筛选阳性克隆并测序，最终得到重组质粒pRSF-CBGW、pET-CBGW、pCDF-CBGW、pACYC-CBGW和pCOLA-CBGW。
(3)HpfutC和M32基因片段的获得：委托天霖生物科技(上海)有限公司合成来源于幽门螺杆菌ATCC26695的HpfutC基因序列(SEQ ID NO.1)和来源于幽门螺杆菌NCTC 11639的M32基因序列(SEQ ID NO.7)。将合成后的目的基因片段通过无缝克隆试剂盒(南京诺唯赞生命科技有限公司)连接到载体pRSFDuet-1、pETDuet-1、pCDFDuet-1、pACYCDuet-1和pCOLADuet-1的Nco I/BamH I酶切位点之间，分别获得质粒pRSF-HpfutC、pET-HpfutC、pCDF-HpfutC、pACYC-HpfutC、pCOLA-HpfutC以及pRSF-M32、pET-M32、pCDF-M32、pACYC-M32和pCOLA-M32。
表2.质粒构建引物
Figure BDA0003514269690000062
Figure BDA0003514269690000071
(4)将上述步骤中获得的质粒pRSF-CBGW以及pET-HpfutC或pET-M32组合转入实施例1中获得的大肠杆菌菌株(见表3)。在单轮、二轮、三轮和四轮的基因敲除后，最终获得了产量均提升的BZW、BZWND、BZWNDPA、BZWNDL和BZWNDPAL等缺陷菌株。摇瓶条件下，最佳菌株BZWNDPAL经72h发酵后产物2’-FL和3-FL的产量最高达到6.24和3.56g/L(图2和图3)，分别是原始菌株BL21(DE3)的24倍和16倍。
表3.菌株详细信息
Figure BDA0003514269690000072
Figure BDA0003514269690000081
实施例3：模块途径工程优化岩藻糖基乳糖从头合成的代谢网络
通过质粒表达系统进行基因组装，构建不同拷贝数的表达载体以增加上游关键基因和下游糖基转移酶的表达水平(实施例2)。采用5种不同强度的表达载体(pCOLDuet-1、pACYCDuet-1、pCDFDuet-1、pETDuet-1和pRSFDuet-1)进行优化，将关键基因包括从头合成途径的gmd，wcaG，manC，manB划分为上游模块，将含有糖基转移酶的HpfutC或M32划分为下游模块。最终得到包含岩藻糖基乳糖完整代谢路径的多拷贝质粒系统。筛选出不同模块组合的表达载体，比较不同组合下岩藻糖基乳糖的生产性能。
发酵实验结果显示，以E.coli BL21(DE3)ΔlacZΔwcaJΔnudDΔpfkAΔlon为宿主菌产2’-FL或3-FL的最佳质粒组合为pRSF-CBGW和pET-HpfutC/M32。在下游模块固定表达下，产物积累随上游模块表达强度的增加而呈上升趋势，固定上游模块的表达后，下游模块在略低于上游模块的表达强度时，产物积累较多。最佳菌株BZWNDPAL-C1和BZWNDPAL-M1经60h发酵后产物2’-FL和3-FL的产量最高达到6.24和3.56g/L。
表4.不同质粒组合的工程菌的详细信息
Figure BDA0003514269690000082
Figure BDA0003514269690000091
实施例4：不同来源岩藻糖基转移酶的筛选
(1)HpfutC、TvfutC、TsfutC、PpfutC、EcwbgL、BfwcfB、M32和futA基因片段的获得：委托天霖生物科技(上海)有限公司合成来源于幽门螺杆菌ATCC 26695的HpfutC基因序列、来源于细长嗜热聚球藻BP-1的TvfutC基因序列、来源于嗜热蓝藻的TsfutC基因序列、来源于人参假单胞菌的PpfutC基因序列、来源于大肠杆菌O126的EcwbgL基因序列、来源于脆弱拟杆菌的BfwcfB基因序列、来源于幽门螺杆菌NCTC 11639的M32基因序列和来源于幽门螺杆菌ATCC 26695的futA基因序列。将合成后的目的基因片段通过无缝克隆试剂盒(南京诺唯赞生命科技有限公司)连接到载体pETDuet-1的Nco I/BamH I酶切位点之间，分别获得质粒pET-HpfutC、pET-TvfutC、pET-TsfutC、pET-PpfutC、pET-EcwbgL、pET-BfwcfB、pET-M32和pET-futA。
(2)将实施例2中的表达载体pRSF-CBGW和上述(1)中岩藻糖基转移酶的表达载体共转化至E.coli BL21(DE3)ΔlacZΔwcaJΔnudDΔpfkAΔlon，所得菌株如表5所示。发酵结果显示，来源于幽门螺杆菌ATCC26695的HpfutC基因和来源于幽门螺杆菌NCTC 11639的M32基因具备较强的岩藻糖基转化能力。
表5.含不同来源岩藻糖基转移酶的工程菌
Figure BDA0003514269690000092
实施例5：BZWNDPAL菌株分批发酵及遗传稳定性分析
1、BZWNDPAL菌株分批发酵
(1)重组菌株BZWNDPAL-C1和BZWNDPAL-M1的单菌落接种于5mL种子液，37℃，200r/min回旋式摇床过夜培养。
(2)重组菌株种子液以3.0％(v/v)的接种量接种于50mL发酵培养基，37℃，200r/min培养菌体OD600至0.6-0.8，加入IPTG终浓度为0.3mM，同时加入8g/L乳糖，诱导培养72h。
(3)发酵过程定时取样，使用HPLC检测发酵产物。发酵结果如图2和图3所示，重组菌摇瓶发酵过程中，BZWNDPAL-C1菌株代谢合成2’-FL的积累量浓度可达6.24g/L，BZWNDPAL-M1菌株代谢合成3-FL的积累量浓度可达3.56g/L。
2、菌株遗传稳定性
将上述菌株BZWNDPAL-C1和BZWNDPAL-M1按照上述的摇瓶生产方法，传代培养6代，检测每代的2’-FL和3-FL的产量，结果表6所示，筛选出的菌株在2’-FL和3-FL生产中均保持稳定的生产性能，具备良好的遗传稳定。
表6.重组菌株传代6次后2’-FL和3-FL的产量(g/L)
Figure BDA0003514269690000101
实施例6：3L发酵罐补料分批发酵生产岩藻糖基乳糖
为了制备高产量的2’-FL和3-FL，使用重组菌BZWNDPAL-C1和BZWNDPAL-M1分别在3L发酵罐进行高密度的补料分批发酵。
发酵条件：发酵培养基，接种量5％(v/v)，诱导前培养温度37℃，待OD600达到20，加入IPTG诱导蛋白表达使得其在发酵体系中的浓度为0.2mmol/L，初始乳糖浓度为10g/L，诱导发酵温度为25℃。发酵全程使用NH4OH控制罐体pH恒定为6.80。为了维持菌体生长以及岩藻糖基乳糖的合成，待初始甘油消耗完后流加800g/L的甘油(含20g/L的MgSO4·7H2O)以补充碳源，通过pH反馈调节(设置流速为20mL/h)使甘油在发酵体系中的浓度维持在较低浓度水平(甘油用于菌体生长和代谢，浓度约为0g/L)至发酵结束，待初始乳糖消耗完后手动补加200g/L的乳糖并使其在发酵体系中的终浓度维持在10±2g/L，发酵过程中若乳糖消耗至较低浓度时继续补加乳糖至发酵结束。发酵过程中系统级联控制，通过调节转速，通气量和氧气使罐内溶氧为30±5％。
发酵全程定时取样并测定菌体OD600，1mL发酵液煮沸15min使细胞破碎完全，12000r/min离心10min，上清液经0.22μm膜过滤处理，发酵过程中利用HPLC检测2’-FL和3-FL的生成量以及乳糖和甘油的消耗量(图4和图5)。结果显示，发酵结束后(共发酵100小时)，产物2’-FL的浓度可达54.82g/L，产物3-FL的浓度可达34.2g/L。
在发酵80、90、100小时2’-FL的浓度分别为35.75、48.42、54.82g/L，转化率分别达到0.63、0.62、0.64mol 2’-FL/mol乳糖。
在发酵80、90、100小时3’-FL的浓度分别为30.42、32.45、34.2g/L，转化率分别达到0.68、0.68、0.69mol 3-FL/mol乳糖。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> BAA211891A
<130> 一种产岩藻糖基乳糖的基因工程菌及生产方法
<160> 12
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 903
<212> DNA
<213> Helicobacter pylori
<400> 1
atggctttta aggtggtgca aatttgcgga gggcttggga atcaaatgtt tcaatacgct 60
ttcgctaaaa gtttgcaaaa acactctaat acgcctgtgc tgttagatat cacttctttt 120
gattggagcg ataggaaaat gcaattagaa cttttcccta ttgatttgcc ctatgcgagc 180
gcgaaagaaa tcgctatagc taaaatgcaa cacctcccca agctagtaag agacgcgctc 240
aaatgcatgg gatttgatag ggtgagtcaa gaaatcgttt ttgaatacga gcctaaattg 300
ctaaagccaa gccgcttgac ttattttttt ggctatttcc aagatccacg atactttgat 360
gctatatccc ctttaatcaa gcaaaccttc actctaccac caccaccaga aaataataag 420
aataataata aaaaagagga agaatatcag tgcaagcttt ctttgatttt agccgctaaa 480
aacagcgtgt ttgtgcatat aagaagaggg gattatgtgg ggattggctg tcagcttggt 540
attgactatc aaaaaaaggc gcttgagtat atggcaaagc gcgtgccaaa catggagctt 600
tttgtgtttt gcgaagactt agaattcacg caaaatcttg atcttggcta cccttttatg 660
gacatgacca ctagggataa agaagaagag gcgtattggg acatgctgct catgcaatct 720
tgtcagcatg gcattatcgc taatagcact tatagctggt gggcggccta tttgatagaa 780
aatccagaaa aaatcattat tggccccaaa cactggcttt ttgggcatga gaatatcctt 840
tgtaaggagt gggtgaaaat agaatcccat tttgaggtaa aatcccaaaa gtataacgct 900
taa 903
<210> 2
<211> 882
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgattatcg ttcacttatg tggagggctt ggaaaccaga tgtttcagta cgcggctgga 60
ctggccgccg cgcaccgtat cggatcggag gttaaatttg acacgcattg gtttgacgca 120
acgtgtcttc atcaaggctt agagcttcgc cgtgtcttcg ggttggaact tccagagcca 180
tcatcgaaag atttacgcaa ggttttaggg gcgtgtgtgc atcctgcggt tcgccgcttg 240
ttggcggggc actttcttca tggactgcgc cctaagtcat tagtgattca accccacttt 300
cattattgga ccggttttga gcatttgcca gacaatgtgt atctggaagg ttactggcaa 360
agcgaacgct atttcagtaa catcgccgat atcatccgtc agcagttccg cttcgttgaa 420
cctcttgatc cacataatgc cgccttaatg gacgagatgc agagcggcgt atcggtttct 480
cttcacattc gccgtggcga ttactttaac aatccccaga tgcgccgcgt gcatggggta 540
gatctttcag agtactaccc cgccgcggta gcaaccatga tcgaaaaaac aaatgcagaa 600
cgtttttatg tattctctga cgatccccaa tgggtcttag agcaccttaa attaccagtt 660
tcgtacacag tggtagacca caaccgtgga gccgcctctt accgcgacat gcaactgatg 720
agtgcttgtc gccaccatat catcgcgaac agcacttttt cgtggtgggg tgcgtggctt 780
aaccctcgtc cggacaaggt agtaattgct ccgcgtcatt ggttcaatgt ggacgtgttc 840
gatacacgcg atttgtactg ccctggatgg attgtcttgt aa 882
<210> 3
<211> 882
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atgatcattg tccgcttgta cggtggactg ggcaatcaga tgtttcagta tgcggctgga 60
ctggcgttat cgttgcgtca tgccgtgccg ttgcgctttg atttagactg gttcgacggc 120
gtacgcttac accaagggct ggaattacac cgcgtcttcg acttagacct gccgcgtgcc 180
gcaccgtcag agatgcgcca ggtgcttggt tctttttcac acccccttgt ccgccgcctt 240
cttgtccgcc gtcgtctgcg ctggttgctt ccacagggct atgccttgga gccccatttc 300
cattactggc ccggatttga agcgcttgga ccgaaggcat acttggacgg ctactggcaa 360
agcgagcgtt atttcagtga gtatcaggat gcggtacgcg cagccttccg ctttgctcag 420
ccccttgacg aacgtaatcg tcagatcgtt gaagaaatgg cagcatgtga aagcgtgagc 480
ttacacgtac gtcgcggtga cttcgtccaa gaccccgtag tccgtcgcgt acatggagtg 540
gatcttagtg cttactatcc gcgtgcggtc gccctgctga tggaacgcat gcgcgagcct 600
cgcttctacg tattcagtga tgatcccgat tgggtacgtg cgaacttaaa actgcccgcc 660
ccgatgatcg taattgacca caaccgtgga gaacactcct ttcgcgatat gcaacttatg 720
agcgcttgtc gtcatcacat cctggcaaat tcttccttct catggtgggg ggcatggtta 780
aattctcaac ctcataaact ggtcatcgct ccgaagcgct ggtttaacgt cgatgacttc 840
gacactcgtg acctgtattg ctcagggtgg acggtccttt aa 882
<210> 4
<211> 867
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atgattatcg ctcacatcat cggaggactg ggtaatcaga tttttcagta tgcggcagcg 60
aaggccttat cagttgagaa aaacactgaa ttattgctgg atgtcacttc tttcgacagt 120
tatgcccttc atcaaggctt tgagttaaac aaaatcttca gtgcggattt caagactgcg 180
tcatcgagcg acatcaagaa gatcttggga tggcaggcgc ccacaatcgt ccgttcagtg 240
ttacatcgcc cacgtttgac atggcttcgc aagacgaccc tttcgattga acctagtttt 300
cagtattggc gtgggttcca agacctttct gacaatacct atcttagcgg ctattggcag 360
tccgaacgct atttcaagaa cattgagtct attattcgca aagacttctc ctttaagctg 420
ccgatggaca acgagaactc gcgtattgcg aatcttatct caaacaccga agcggtgtct 480
ttacatattc gccgcggtga ttacgtcaat aactctgcat acagcgcttg ttccctggac 540
tactaccagg cagctatttc acatttcact cacatgaaca aaccaccaac attcttcatc 600
ttctcagacg atatcaactg ggtgaaagag cacttaaaaa tcgaacatcc gcactgctat 660
gtagatcata acaacggagc agcctcctat aatgacatgc gtttgatgag cctgtgtaag 720
cacaacatca ttgctaacag ttctttctcg tggtggggag catggttgaa cgcaaataac 780
gacaagattg taatcacacc taaatcttgg tttaacacaa acaaccatat tgatgatctg 840
attcccccaa cttggatttc attgtaa 867
<210> 5
<211> 894
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 5
atgtctatta taagattaca aggcggactt ggaaatcaac tttttcagtt ctcatttggg 60
tatgcgcttt ccaaaattaa tgggacacca ttatattttg atataagtca ttatgctgaa 120
aatgatgatc atggtggtta caggctaaac aatctacaaa ttccagagga atatttacag 180
tattacacac caaaaattaa taatatttat aaatttttgg ttcgtgggtc aagattatat 240
cctgaaatct ttcttttttt aggtttttgc aatgaatttc atgcctatgg ttatgatttt 300
gaatatatag cgcaaaaatg gaaatccaaa aaatatatag ggtattggca atctgagcac 360
tttttccata aacatatatt agatctaaaa gaatttttta ttccaaagaa tgtgtctgaa 420
caagcaaatt tacttgcagc aaaaattctt gaatctcaat catcactttc tattcatata 480
agaagaggag attatataaa aaacaaaaca gctactttaa ctcatggcgt ttgttcgtta 540
gagtattaca aaaaagcttt aaataaaata cgcgatttgg caatgatacg tgacgtgttt 600
attttcagtg atgatatttt ttggtgtaaa gaaaatatcg aaacattact cagtaaaaaa 660
tataatatat attattcaga agatttatca caagaagaag atttatggtt aatgagctta 720
gctaaccatc atattatagc gaatagtagt tttagttggt ggggggctta tttaggtaca 780
tcagcgtcac agattgttat ttatcctact ccttggtacg atataactcc aaaaaatact 840
tatatcccca tagtcaatca ctggataaac gtggataaac atagctcgtg ttag 894
<210> 6
<211> 864
<212> DNA
<213> Bacteroides fragilis
<400> 6
atgttatatg taattttacg tggacgatta ggtaataatc tttttcagat agcaactgcc 60
gcttcgttga ctcagaattt tatattttgt acagtaaata aggaccaaga gagacaggtc 120
cttttgtata aggattcttt ttttaaaaat ataaaagtta tgaagggggt tcctgatggc 180
ataccatatt acaaagaacc attccatgaa tttagcagaa ttccttatga agaaggaaag 240
gatctcatta ttgatggata tttccaatca gaaaagtact ttaaaagaag tgtcgtatta 300
gatctttata gaataactga tgagctaagg aagaaaatat ggaatatttg tggaaatatt 360
ttagaaaagg gagaaactgt gagtattcat gttagaagag gtgattactt gaagctgcca 420
catgcattac cattttgtgg aaagtcatac tataagaatg ctattcaata tattggtgag 480
gataaaatat tcattatttg tagtgatgat atcgattggt gtaaaaaaaa ctttatagga 540
aaaagatatt acttcataga gaacactact cctttactag atttatatat ccaatccttg 600
tgcactcaca atattataag taatagctct tttagttggt ggggagcatg gcttaatgaa 660
aatagtaata aaattgttat tgcacctcaa atgtggtttg gcatttctgt gaagttgggt 720
gttagtgatt tattgcctgt cagttgggtt cgacttccta ataattatac tttaggaaga 780
tattgttttg ctctatataa agtagttgag gactatttat taaatattct gcgattaata 840
tggaaaagaa agaagaatat gtga 864
<210> 7
<211> 1239
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
atgttccagc cgcttctgga tgcttatgtt gaatcggcct caatcgagaa gatggcttca 60
aaatctcccc cgcccctgaa aatcgccgtc gcgaactggt ggggagatga ggagattaag 120
gaatttaaga acttcgtgct gtattttatc ctttcacagc gttatacgat caccctgcac 180
caaaacccaa atgaattctc cgatcttgtt tttgggaatc ctttaggatc ggcacgcaag 240
attctgtcat atcaaaatgc caagcgcgtg ttttacacag gggagaatga gtctccgaat 300
tttaatttat tcgactacgc tatcggtttc gatgaattgg atttcaatga ccgctattta 360
cgcatgccgc tttattacaa cgagttacac atcaaggccg agtctgtgaa tgatacgaca 420
gctccttata aacttaaaga caacagctta tacgcattga agaagccatc ccactgtttt 480
aaggagaaac accccaatct ttgcgctgtc gtaaacgacg aatcagaccc gttgaagcgt 540
ggattcgcat ccttcgttgc ttctaatccg aacgcgccaa ttcgcaatgc ttttaatgat 600
gcgcttaata gtatcgaacc agtgaccgga ggtggttctg tacgtaatac gttgggctac 660
aatgttaaaa ataaaaatga gttcttatca cagtacaagt tcaatctttg ctttgaaaac 720
actcaaggtt atggatacgt tactgagaaa atcattgatg cgtacttcag tcacaccatc 780
cctatttact ggggaagtcc tagcgttgca aaagatttta atccgaagtc tttcgtgaat 840
gttcatgact ttaagaattt cgacgaggct attgactaca ttaagtatct tcacacacat 900
aaaaacgcct atcttgatat gttatacgag aaccccttga atactctgga tgggaaggct 960
tacttttatc agaacttgtc attcaaaaag atcctggcgt tttttaaaac catcctggat 1020
aacgatacaa tttaccacga taacccattc attttttgtc gtgatcttaa cgagcccctg 1080
gtaaccattg acgatttgcg tgctaattac gatgatcttc gtgtaaacta tgatgacctg 1140
cgtattaatt atgacgactt acgtgtaaac tatgatgatt tacgcatcaa ctatgacgat 1200
ctgcgtgtta attatgacga tttacgtgta aactattaa 1239
<210> 8
<211> 1281
<212> DNA
<213> Helicobacter pylori
<400> 8
atgggcttcc aacccctatt agacgccttt atagaaagcg cttccattga aaaaatggcc 60
tctaaatctc caccaccacc actaaaaatc gctgtggcga attggtgggg agatgaagaa 120
attaaagaat ttaaaaagag cgttctttat tttatcctaa gccaacgcta cgcaatcacc 180
ctccaccaaa accccaatga attttcagat ctagttttta gcaatcctct tggagcggct 240
agaaagattt tatcttatca aaacactaaa cgagtgtttt acaccggtga aaacgaatca 300
cctaatttca acctctttga ttacgccata ggctttgatg aattggattt taatgatcgt 360
tatttgagaa tgcctttgta ttatgcccat ttgcactata aagccgagct tgttaatgac 420
accactgcgc cctacaaact caaagacaac agcctttatg ctttaaaaaa accctctcat 480
cattttaaag aaaaccaccc taatttgtgc gcagtagtga atgatgagag cgatctttta 540
aaaagagggt ttgccagttt tgtagcgagc aacgctaacg ctcctatgag gaacgctttt 600
tatgacgctc taaattccat agagccagtt actgggggag gaagtgtgag aaacacttta 660
ggctataagg ttggaaacaa aagcgagttt ttaagccaat acaagttcaa tctctgtttt 720
gaaaactcgc aaggttatgg ctatgtaacc gaaaaaatcc ttgatgcgta ttttagccat 780
accattccta tttattgggg gagtcccagc gtggcgaaag attttaaccc taaaagtttt 840
gtgaatgtgc atgatttcaa caactttgat gaagcgattg attatatcaa atacctgcac 900
acgcacccaa acgcttattt agacatgctc tatgaaaacc ctttaaacac ccttgatggg 960
aaagcttact tttaccaaga tttgagtttt aaaaaaatcc tagatttttt taaaacgatt 1020
ttagaaaacg atacgattta tcacaaattc tcaacatctt tcatgtggga gtacgatctg 1080
cataagccgt tagtatccat tgatgatttg agggttaatt atgatgattt gagggttaat 1140
tatgaccggc ttttacaaaa cgcttcgcct ttattagaac tctctcaaaa caccactttt 1200
aaaatctatc gcaaagctta tcaaaaatcc ttgcctttgt tgcgcgcggt gagaaagttg 1260
gttaaaaaat tgggtttgta a 1281
<210> 9
<211> 1371
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 9
atgaaaaaat taacctgctt taaagcctat gatattcgtg gaaaattagg cgaagaactg 60
aatgaagata ttgcctggcg cattggtcgc gcttatggcg aatttctcaa accgaaaacc 120
attgtgttag gcggtgatgt ccgcctcacc agcgaaacct taaaactggc gctggcgaaa 180
ggtttacagg atgcgggcgt cgatgtgctg gatattggca tgtccggcac cgaagagatc 240
tatttcgcca cgttccatct cggtgtggat ggcggcattg aagttaccgc cagccataat 300
ccgatggatt ataacggcat gaagctggtg cgcgaagggg ctcgcccgat cagcggtgat 360
accggactgc gcgatgtcca gcgtctggca gaagccaacg actttcctcc cgttgatgaa 420
accaaacgcg gtcgctatca gcaaatcaat ctgcgtgacg cttacgttga tcacctgttc 480
ggttatatca acgtcaaaaa cctcacgccg ctcaagctgg tgatcaactc cgggaacggc 540
gcagcgggtc cggtggtgga cgctatcgaa gcccgcttta acgccctcgg cgctccggtg 600
gaattaatca aagtgcacaa cacgccggac ggcaatttcc ccaacggtat tcctaacccg 660
ctgctgccgg aatgccgcga cgacacccgc aatgcggtca tcaaacacgg cgcggatatg 720
ggcattgcct ttgacggtga ttttgatcgc tgtttcctgt ttgacgaaaa agggcagttt 780
atcgagggct actacattgt cggcctgttg gcagaagcat tcctcgaaaa aaatcccggc 840
gcgaagatca tccacgatcc acgtctctcc tggaacaccg ttgatgtggt gactaccgca 900
ggtggcaccc cggtaatgtc gaaaaccgga cacgccttta ttaaagaacg tatgcgcaag 960
gaagacgcca tctacggtgg cgaaatgagc gcccaccatt acttccgtga tttcgcttac 1020
tgcgacagcg gcatgatccc gtggctgctg gtcgccgaac tggtgtgcct gaaagagaaa 1080
acgctgggcg aactggtacg cgaccggatg gcggcgtttc cggcaagcgg tgagatcaac 1140
agcaaactgg cgcaacccgt tgaggcgatt aaccgcgtcg aacagcattt tagccgcgag 1200
gcgctggcgg tggatcgcac tgatggcatc agcatgacct ttgccgactg gcgctttaac 1260
ctgcgcacct ccaataccga accggtggtg cgcctgaatg tggaatcgcg cggtgatgtg 1320
ccgctgatgg aagcgcgaac gcgaactctg ctgacgttgc tgaacgagta a 1371
<210> 10
<211> 1437
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 10
atggcgcagt cgaaactcta tccagttgtg atggcaggtg gctccggtag ccgcttatgg 60
ccgctttccc gcgtacttta ccccaagcag tttttatgcc tgaaaggcga tctcaccatg 120
ctgcaaacca ccatctgccg cctgaacggt gtggagtgcg aaagcccggt ggtgatttgc 180
aatgagcagc accgctttat tgtcgcggaa cagctgcgtc aactgaacaa actcaccaag 240
aacattattc tcgaaccggc agggcgtaac actgcacctg ccattgcgct ggcggcgctg 300
gcggcaaaac gtcatagccc ggagagcgac ccgttaatgc tggtcttggc ggcggatcat 360
gtgattgccg atgaagacgc gttccgtgcc gccgtgcgta atgccatgcc gtatgccaaa 420
gcgggcaagc tggtgacctt cggcattgtg ccggatctac ctgaaaccgg ttatggctat 480
attcgtcgcg gtgaagtgtc ggcgggtgag caggatacgg tggcctttga agtggcgcag 540
tttgtcgaaa aaccgaatct ggaaaccgct caggcctatg tggcaagcgg cgaatattac 600
tggaacagcg gtatgttcct gttccgcgcc ggacgctatc tcgaagaact gaaaaaatat 660
cgcccggata ttctcgatgc ctgtgaaaaa gcgatgagcg ccgtcgatcc ggatctcgat 720
tttattcgtg tggatgaaga agcgtttctc gcctgcccgg aagagtcggt ggattacgcg 780
gtcatggaac gtacggcaga tgccgttgtg gtgccgatgg atgcgggctg gagtgatgtc 840
ggttcttggt cttcattatg ggagatcagc gcccacaccg ccgagggcaa cgtttgccac 900
ggcgatgtga ttaatcacaa aactgaaaac agctatgtgt acgccgaatc tggcctggtc 960
accaccgtcg gggtgaaaga tttggtggta gtgcagacca aagatgcagt gctgattgcc 1020
gaccgtaacg cggtgcagga tgtgaaaaaa gtggtcgagc agatcaaagc cgatggtcgc 1080
catgagcatc gggtacatcg cgaagtgtat cgtccgtggg gcaaatatga ctctatcgac 1140
gcgggcgacc gctaccaggt gaaacgcatc accgtgaaac cgggcgaggg cttgtcggta 1200
cagatgcacc atcaccgcgc ggaacactgg gtagtggtcg cgggaacggc aaaagtcact 1260
attgacggtg atatcaaact gcttggtgaa aacgagtcca tttatattcc gctgggggcg 1320
acgcactgcc tggaaaaccc ggggaaaatt ccgctcgatt taattgaagt gcggtccggc 1380
tcttatctcg aagaggatga tgtggtgcgc ttcgcggatc gctacggacg ggtgtaa 1437
<210> 11
<211> 1122
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 11
atgtcaaaag tcgctctcat caccggtgta accggacaag acggttctta cctggcagag 60
tttctgctgg aaaaaggtta cgaggtgcat ggtattaagc gtcgtgcatc gtcattcaac 120
accgagcgcg tggatcacat ttatcaggat ccgcacacct gcaacccgaa attccatctg 180
cattatggcg acctgagtga tacctccaac ctgacacgca ttttgcgtga agtgcagccg 240
gatgaagtgt ataacctggg cgcaatgagc cacgttgcgg tctcttttga gtcaccggaa 300
tataccgcag acgttgatgc gatgggtacg ctgcgcctgc tcgaggcgat ccgcttcctc 360
ggtctggaaa agaaaacccg tttttatcag gcttccacct ctgaactgta cggtctggtg 420
caggaaattc cgcagaaaga aactacgccg ttctacccgc gatctccgta tgcggtcgcc 480
aaactgtacg cctactggat caccgttaac taccgcgaat cctacggcat gtacgcctgt 540
aacggtattc tcttcaacca tgaatccccg cgccgcggtg aaaccttcgt tacccgcaaa 600
atcacccgcg caatcgccaa tatcgcccag gggctggagt cgtgcctgta cctcggcaat 660
atggattccc tgcgtgactg gggccatgcc aaagactacg taaaaatgca gtggatgatg 720
ctgcaacagg aacagccgga agatttcgtt attgctaccg gcgttcagta ctccgtacgt 780
cagttcgtgg aaatggcggc agcacagttg ggcatcaaac tgcgctttga aggcacgggt 840
gttgaagaga agggcattgt ggtttccgtc accgggcatg acgcgccggg cgttaaaccg 900
ggtgatgtga ttatcgccgt tgacccgcgt tacttccgtc cggcagaagt tgaaacgctg 960
ctcggcgacc cgaccaaagc gcacgaaaaa ctgggctgga aaccggaaat caccctcaga 1020
gagatggtgt ctgaaatggt ggctaatgac ctcgaagcgg cgaaaaaaca ctctctgctg 1080
aaatctcacg gctacgacgt ggcgatcgcg ctggagtcat aa 1122
<210> 12
<211> 966
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 12
atgagtaaac aacgagtttt tattgctggt catcgcggga tggtcggttc tgccatcagg 60
cggcagctcg aacagcgcgg tgatgtggaa ctggtattac gcacccgcga cgagctgaac 120
ctgttggaca gccgcgcggt gcatgatttc tttgccagcg aacgcattga ccaggtctat 180
ctggcggcgg cgaaagtggg cggcattgtt gctaacaaca cctatccggc ggatttcatc 240
taccagaaca tgatgattga gagcaacatc attcacgccg cgcatcagaa cgacgtgaac 300
aaactgctgt ttctcggatc gtcctgtatc tacccgaaac tggcaaaaca gccgatggca 360
gaaagcgagt tgttgcaggg cacgctggag ccgactaacg agccttatgc tattgccaaa 420
atcgccggga tcaaactgtg cgaatcttac aatcgccagt acggacgaga ttaccgttca 480
gtcatgccga ccaacctgta cgggccgcac gacaacttcc acccgagtaa ttcgcatgtg 540
atcccagcat tgctgcgccg cttccacgag gcgacggcac agaatgcacc ggacgtggtg 600
gtatggggca gcggtacacc gatgcgtgaa ttcctgcacg tcgatgatat ggcggcggcg 660
agcattcatg tcatggagct ggcgcatgaa gtctggctgg agaacaccca gccgatgctg 720
tcgcacatta acgtcggcac gggcgttgac tgcaccatcc gtgaactggc gcaaaccatc 780
gccaaagtgg tgggttacaa aggtcgggtg gtttttgatg ccagcaaacc ggatggtacg 840
ccgcgcaaac tgctggatgt gacgcgcctg catcagcttg gctggtatca cgaaatctca 900
ctggaagcgg ggcttgccag cacttaccag tggttccttg agaatcaaga ccgctttcgg 960
gggtaa 966

Claims (10)

1.一种基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌敲除了β-半乳糖苷酶基因lacZ、UDP-葡萄糖脂质载体转移酶基因wcaJ、GDP-甘露糖甘露糖基水解酶基因nudD、GDP-甘露糖水解酶基因nudK、6-磷酸果糖激酶-1基因pfkA、6-磷酸果糖激酶-2基因pfkB、甘露醇-1-磷酸脱氢酶基因mtlD、蛋白酶基因lon、果糖-6-磷酸醛缩酶A基因fsaA、果糖-6-磷酸醛缩酶B基因fsaB和岩藻糖异构酶/墨角藻糖激酶FucI-FucK基因簇中的一种或多种基因，并表达了磷酸甘露糖变位酶基因manB、甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶基因manC、GDP-甘露糖-6-脱氢酶基因gmd，GDP-岩藻糖合成酶基因wcaG。
2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌中还表达来源于大肠杆菌O126的α-1,2岩藻糖基转移酶基因、来源于幽门螺杆菌ATCC 26695的α-1,2岩藻糖基转移酶基因或来源于幽门螺杆菌NCTC 11639的α-1,3岩藻糖基转移酶基因。
3.根据权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述编码磷酸甘露糖变位酶基因manB、甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶基因manC、GDP-甘露糖-6-脱氢酶基因gmd和GDP-岩藻糖合成酶基因wcaG均来源于大肠杆菌K12 MG655。
4.根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌利用pRSFDuet-1、pETDuet-1、pCDFDuet-1、pACYCDuet-1或pCOLADuet-1载体过表达基因manB、manC、gmd、wcaG、HpfutC和/或M32。
5.根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，利用载体pRSFDuet-1表达manB、manC、gmd和wcaG，利用pETDuet-1表达HpfutC或M32。
6.根据权利要求1～5所述的基因工程菌，其特征在于，以大肠杆菌为宿主。
7.一种生产岩藻糖基乳糖的方法，其特征在于，以甘油为碳源，以0.1～1.0mM IPTG为诱导剂，利用权利要求1～6任一所述的基因工程菌在乳糖存在的条件下发酵生产岩藻糖基乳糖，所述甘油在发酵体系中的浓度为10～30g/L。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，将权利要求1～6任一所述基因工程菌在发酵体系中培养至OD600为0.6±0.1，加入终浓度为0.2～0.3mM的IPTG及终浓度为5～10g/L的乳糖，在20～30℃下培养不少于70h。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，将权利要求1～6任一所述基因工程菌在发酵体系中培养至OD600为20±3，加入终浓度为0.1～0.3mM的IPTG及终浓度为5～15g/L的乳糖，在20～30℃诱导培养，维持发酵体系中的溶氧为20～50％，pH为6.5～7.0。
10.权利要求1～6任一所述基因工程菌在生产岩藻糖基乳糖及含有岩藻糖基乳糖的产品中的应用。
CN202210184191.6A 2022-02-22 2022-02-22 一种产岩藻糖基乳糖的基因工程菌及生产方法 Active CN114480240B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210184191.6A CN114480240B (zh) 2022-02-22 2022-02-22 一种产岩藻糖基乳糖的基因工程菌及生产方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210184191.6A CN114480240B (zh) 2022-02-22 2022-02-22 一种产岩藻糖基乳糖的基因工程菌及生产方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114480240A true CN114480240A (zh) 2022-05-13
CN114480240B CN114480240B (zh) 2024-03-26

Family

ID=81484430

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210184191.6A Active CN114480240B (zh) 2022-02-22 2022-02-22 一种产岩藻糖基乳糖的基因工程菌及生产方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114480240B (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114774343A (zh) * 2022-05-24 2022-07-22 江南大学 一种生产2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌株及应用
CN114806991A (zh) * 2022-05-16 2022-07-29 江南大学 一种提高岩藻糖基乳糖产量的工程大肠杆菌及生产方法
CN116042682A (zh) * 2022-12-22 2023-05-02 芝诺(苏州)生物科技有限公司 一株产2’-岩藻糖基乳糖的工程菌及其构建方法和应用
CN116200360A (zh) * 2023-01-30 2023-06-02 芝诺(苏州)生物科技有限公司 一种futCB突变体及生物合成2’-岩藻糖基乳糖的方法
CN116732075A (zh) * 2023-06-09 2023-09-12 江南大学 一种生产2′-岩藻糖基乳糖的多层动态调控系统及其应用
CN116948928A (zh) * 2023-06-02 2023-10-27 虹摹生物科技(上海)有限公司 种子培养基及无抗生素、无iptg诱导剂的2’-岩藻糖基乳糖的发酵生产方法

Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105683387A (zh) * 2013-09-06 2016-06-15 格礼卡姆股份公司 寡糖的发酵生产
CN109790559A (zh) * 2016-10-29 2019-05-21 詹尼温生物技术有限责任公司 改良的用于产生岩藻糖基化寡糖的方法
CN110734889A (zh) * 2019-11-11 2020-01-31 江南大学 一种高效生产gdp-岩藻糖的大肠杆菌工程菌株
CN110804577A (zh) * 2019-11-28 2020-02-18 江南大学 一种生产2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌株
CN111808790A (zh) * 2020-06-05 2020-10-23 武汉中科光谷绿色生物技术有限公司 一株大肠杆菌及其在合成岩藻糖基化寡糖中的应用
CN112342176A (zh) * 2020-10-15 2021-02-09 江南大学 产2’-岩藻糖基乳糖的基因工程菌及其应用
CN112501095A (zh) * 2020-12-08 2021-03-16 南开大学 一种合成3-岩藻乳糖的重组大肠杆菌构建方法及其应用
CN112574936A (zh) * 2020-12-21 2021-03-30 中国科学院合肥物质科学研究院 一种重组大肠杆菌及其构建方法与应用
CN112625990A (zh) * 2020-12-29 2021-04-09 量子高科(广东)生物有限公司 一种合成2`-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌及其构建方法
CN113832092A (zh) * 2021-10-20 2021-12-24 江南大学 一种提高乳酰-n-岩藻五糖产量的基因工程菌及其生产方法
CN113957027A (zh) * 2021-10-20 2022-01-21 江南大学 一种提高乳酰-n-岩藻六糖产量的基因工程菌及其生产方法

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105683387A (zh) * 2013-09-06 2016-06-15 格礼卡姆股份公司 寡糖的发酵生产
CN109790559A (zh) * 2016-10-29 2019-05-21 詹尼温生物技术有限责任公司 改良的用于产生岩藻糖基化寡糖的方法
CN110734889A (zh) * 2019-11-11 2020-01-31 江南大学 一种高效生产gdp-岩藻糖的大肠杆菌工程菌株
CN110804577A (zh) * 2019-11-28 2020-02-18 江南大学 一种生产2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌株
CN111808790A (zh) * 2020-06-05 2020-10-23 武汉中科光谷绿色生物技术有限公司 一株大肠杆菌及其在合成岩藻糖基化寡糖中的应用
CN112342176A (zh) * 2020-10-15 2021-02-09 江南大学 产2’-岩藻糖基乳糖的基因工程菌及其应用
CN112501095A (zh) * 2020-12-08 2021-03-16 南开大学 一种合成3-岩藻乳糖的重组大肠杆菌构建方法及其应用
CN112574936A (zh) * 2020-12-21 2021-03-30 中国科学院合肥物质科学研究院 一种重组大肠杆菌及其构建方法与应用
CN112625990A (zh) * 2020-12-29 2021-04-09 量子高科(广东)生物有限公司 一种合成2`-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌及其构建方法
CN113832092A (zh) * 2021-10-20 2021-12-24 江南大学 一种提高乳酰-n-岩藻五糖产量的基因工程菌及其生产方法
CN113957027A (zh) * 2021-10-20 2022-01-21 江南大学 一种提高乳酰-n-岩藻六糖产量的基因工程菌及其生产方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
李云飞等: "2’-岩藻糖基乳糖生物合成专利技术研究进展", 《乳业科学与技术》, vol. 44, no. 5, pages 2 *
贾红红;李玉;刘逸寒;王尧;梁晓梅;路福平;: "α1, 2-岩藻糖基转移酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达", 生物技术通报, no. 03, pages 185 - 190 *

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114806991A (zh) * 2022-05-16 2022-07-29 江南大学 一种提高岩藻糖基乳糖产量的工程大肠杆菌及生产方法
CN114806991B (zh) * 2022-05-16 2023-08-25 江南大学 一种提高岩藻糖基乳糖产量的工程大肠杆菌及生产方法
CN114774343A (zh) * 2022-05-24 2022-07-22 江南大学 一种生产2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌株及应用
CN114774343B (zh) * 2022-05-24 2023-09-12 江南大学 一种生产2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌株及应用
CN116042682A (zh) * 2022-12-22 2023-05-02 芝诺(苏州)生物科技有限公司 一株产2’-岩藻糖基乳糖的工程菌及其构建方法和应用
CN116042682B (zh) * 2022-12-22 2024-01-23 芝诺(苏州)生物科技有限公司 一株产2’-岩藻糖基乳糖的工程菌及其构建方法和应用
CN116200360A (zh) * 2023-01-30 2023-06-02 芝诺(苏州)生物科技有限公司 一种futCB突变体及生物合成2’-岩藻糖基乳糖的方法
CN116200360B (zh) * 2023-01-30 2023-09-15 芝诺(苏州)生物科技有限公司 一种futCB突变体及生物合成2’-岩藻糖基乳糖的方法
CN116948928A (zh) * 2023-06-02 2023-10-27 虹摹生物科技(上海)有限公司 种子培养基及无抗生素、无iptg诱导剂的2’-岩藻糖基乳糖的发酵生产方法
CN116732075A (zh) * 2023-06-09 2023-09-12 江南大学 一种生产2′-岩藻糖基乳糖的多层动态调控系统及其应用
CN116732075B (zh) * 2023-06-09 2024-03-08 江南大学 一种生产2′-岩藻糖基乳糖的多层动态调控系统及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN114480240B (zh) 2024-03-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN114480240B (zh) 一种产岩藻糖基乳糖的基因工程菌及生产方法
CN111712570B (zh) 一种生产阿洛酮糖及其衍生物的工程菌株及其构建方法和应用
CN112342176A (zh) 产2’-岩藻糖基乳糖的基因工程菌及其应用
CN108753669B (zh) 一种腺嘌呤生产菌株及其构建方法和应用
CN114774343B (zh) 一种生产2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌株及应用
CN114874964B (zh) 一种高产2′-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌的构建方法及应用
CN113564193B (zh) 一种微生物基因表达命运共同体及其构建方法和应用
CN111548979A (zh) 合成乳酰n-新四糖的重组大肠杆菌及其构建方法与应用
CN116555145A (zh) 重组大肠杆菌及其构建方法和生产2′-岩藻糖基乳糖的方法
CN113025548B (zh) 基于kosakonia sp.菌株生产2’-岩藻糖基乳糖的重组菌及其方法和应用
CN114480465A (zh) 一种产生2’-岩藻糖基乳糖的枯草芽孢杆菌及其应用
CN113073074B (zh) 一种高效合成核黄素的基因工程菌及其应用
CN115948314B (zh) 一种高效生产2’-岩藻糖基乳糖的地衣芽孢杆菌工程菌株
CN114806991B (zh) 一种提高岩藻糖基乳糖产量的工程大肠杆菌及生产方法
CN113832092B (zh) 一种提高乳酰-n-岩藻五糖产量的基因工程菌及其生产方法
CN111484942A (zh) 一种利用酿酒酵母生产己二酸的方法
CN115838682A (zh) 一种利用甘露聚糖高效生产2′-岩藻糖基乳糖的地衣芽孢杆菌工程菌株
CN116676243A (zh) 产2&#39;-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌的构建方法及其应用
CN113957027B (zh) 一种提高乳酰-n-岩藻六糖产量的基因工程菌及其生产方法
CN115725484A (zh) 合成d-阿洛酮糖的酶突变表达工程菌及应用
CN114672448A (zh) 一种合成2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌及其构建方法与应用
CN113684163A (zh) 一种提高乳酰-n-四糖产量的基因工程菌及其生产方法
CN117363553B (zh) 一种生产2’-脱氧腺苷的基因工程菌及其构建方法与应用
CN116042562B (zh) 重组酵母菌及其应用
CN116478894A (zh) 一种提高唾液酸乳糖产量的基因工程菌及其生产方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant