CN114806991B

CN114806991B - 一种提高岩藻糖基乳糖产量的工程大肠杆菌及生产方法

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Publication number: CN114806991B
Application number: CN202210530585.2A
Authority: CN
Inventors: 张涛; 李梦丽; 江波; 李晨晨
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2022-05-16
Filing date: 2022-05-16
Publication date: 2023-08-25
Anticipated expiration: 2042-05-16
Also published as: CN114806991A

Abstract

本发明公开了一种提高岩藻糖基乳糖产量的工程大肠杆菌及生产方法，属于基因工程技术领域。本发明利用合成生物学手段，在大肠杆菌BL21(DE3)ΔlacZΔwcaJΔnudDΔpfkAΔlon宿主菌中组合调控HpfutC/HpM32的转录和翻译水平，通过改变转录水平的控制元件(启动子)，翻译水平的控制元件(RBS)，融合标签以及基因拷贝数来提高α‑1，2/3‑岩藻糖基转移酶的催化活力和可溶性表达。构建得到的重组大肠杆菌实现了2’‑岩藻糖基乳糖和3‑岩藻糖基乳糖的高效合成，菌株遗传稳定，转化率高，具有明显的工业化生产潜力。

Description

一种提高岩藻糖基乳糖产量的工程大肠杆菌及生产方法

技术领域

本发明涉及一种提高岩藻糖基乳糖产量的工程大肠杆菌及生产方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

人乳寡糖(Human Milk Oligosaccharides,HMOs)是母乳中必不可少的免疫活性成分，具有显著促进婴儿大脑发育、免疫调节、炎症抑制以及抵抗病原微生物感染等生理功能。HMOs具有多种核心单糖结构单元，根据结构单元的不同，HMOs主要分为三种类型：(1)岩藻糖基化HMOs，如2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)和3-focusyllactose(3-FL)；(2)非岩藻糖基化HMOs，如乳酰-N-四糖(LNT)和乳酰-N-新四糖(LNnT)；(3)唾液酸化HMOs，如3’-唾液酸乳糖(3’-SL)和6’-唾液酸乳糖(6’-SL)。在已鉴定的200多种HMOs分子中，以中性岩藻糖基化HMOs为主，约占HMOs总量的35％，因其在营养保健和药物用途中的潜在应用受到了极大的关注。目前，欧盟，美国和中国已批准2’-FL作为新食品成分使用，且对其安全性、适用性以及使用剂量等进行了规范。

岩藻糖基转移酶(Fucosyltranferases，FucTs，EC 2.4.1.69)广泛分布于植物、脊椎动物、无脊椎动物和细菌中，参与岩藻糖基化寡糖的生物合成，可以催化L-岩藻糖从供体底物GDP-L-岩藻糖转移到各种糖受体底物，包括低聚糖、糖蛋白和糖脂等。α-1,2-岩藻糖基转移酶(α-1,2-FucT)和α-1,3-岩藻糖基转移酶(α-1,3-FucT)是目前研究较深入的两种岩藻糖基转移酶，属于CAZY家族11。α-1,2-FucT和α-1,3-FucT不仅能够催化底物N-乙酰-D-乳糖胺(LacNAc)形成Lewis^X抗原应用于抗炎症药物和抗肿瘤疫苗，还可催化底物乳糖形成2’-FL和3-FL应用于营养品领域，在工业生产中具有广泛的应用前景。然而，目前已报道的大部分FucTs在微生物表达系统中都表现出低催化活力和可溶性表达差等问题，这些问题已成为该酶产业化应用的技术瓶颈，也极大限制了岩藻糖基化寡糖的大规模合成。

随着代谢工程和合成生物学的发展，利用微生物制备岩藻糖基乳糖已显然成为具有绿色高效及可持续发展特征的生产策略。目前，研究人员使用多种策略来提升岩藻糖基乳糖的产量，包括基因编辑改造底盘微生物、模块途径优化、NADPH辅因子供应，筛选高效的产酶菌株、优化发酵条件以及乳糖独立途径构建等。作为FL生产的限速酶，α-1,2-FucT和α-1,3-FucT的高效表达方面鲜有报道。本发明旨在利用合成生物学技术，通过调节转录水平的控制元件(如启动子)，翻译水平的控制元件(如RBS)，融合标签以及基因拷贝数等策略提高α-1,2-FucT和α-1,3-FucT的催化活力，同时减少蛋白错误折叠导致的非活性包涵体的形成，从而促进可溶性重组蛋白的表达。该方法对糖基转移酶技术瓶颈的解决具有借鉴意义，为岩藻糖基乳糖的批量生产提供了有效途径，同时具有较强的理论研究价值和社会经济效益，市场开发前景广阔。

发明内容

[技术问题]

现有技术合成岩藻糖基乳糖效率不高，岩藻糖基转移酶存在催化活力低、可溶性表达差等瓶颈问题，无法提供高效生产岩藻糖基乳糖的菌株，也不能提供成本低廉且绿色高效的岩藻糖基乳糖的制备方法。

[技术方案]

本发明为了解决岩藻糖基乳糖合成过程中岩藻糖基转移酶活力低、表达差等问题，提供了一种高效生产2’-FL和/或3-FL的基因工程菌及其构建方法。

本发明的第一个目的是提供一种生产岩藻基乳糖的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌是在含有载体pRSF-CBGW的大肠杆菌BL21(DE3)ΔlacZΔwcaJΔnudDΔpfkAΔlon宿主中异源表达α-1,2-岩藻糖基转移酶或α-1,3-岩藻糖基转移酶；所述大肠杆菌宿主被敲除了β-半乳糖苷酶基因lacZ、UDP-葡萄糖脂质载体转移酶基因wcaJ、GDP-甘露糖甘露糖基水解酶基因nudD、6-磷酸果糖激酶-1基因pfkA和蛋白酶基因lon，并过表达了磷酸甘露糖变位酶基因manB、甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶基因manC、GDP-甘露糖-6-脱氢酶基因gmd和GDP-岩藻糖合成酶基因wcaG；所述α-1,2-岩藻糖基转移酶或α-1,3-岩藻糖基转移酶的编码基因利用启动子T7、tac、trc、lac、lacUV5或trp调控表达。

在一种实施方式中，启动子T7、tac、trc、lac、lacUV5和trp的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示。

在一种实施方式中，所述的酶是由核糖体结合位点BBa_B0029～BBa_B0035、BBa_B0064、BBa_J61100、BBa_J61101、BBa_J61107、BBa_J61117和BBa_J61127中的任何一个调控翻译；对应的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.21所示。

在一种实施方式中，所述的酶是与SUMO、3×FLAG、HA、pelB和InfB中的任何一个融合肽融合表达；具体为将融合标签连接至所述α-1,2-岩藻糖基转移酶或α-1,3-岩藻糖基转移酶的编码基因的N端；所述融合标签包括SUMO、3×FLAG、HA、pelB、或InfB。

在一种实施方式中，所述的α-1,2-岩藻糖基转移酶或α-1,3-岩藻糖基转移酶的基因拷贝数为一个拷贝、两个拷贝或三个拷贝。

在一种实施方式中，所述β-半乳糖苷酶基因lacZ的Gene ID为945006，UDP-葡萄糖脂质载体转移酶基因wcaJ的Gene ID为946583，GDP-甘露糖甘露糖基水解酶基因nudD的Gene ID为946559，6-磷酸果糖激酶-1基因pfkA的Gene ID为948412，蛋白酶基因lon的GeneID为945085。

在一种实施方式中，所述编码磷酸甘露糖变位酶基因manB、甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶基因manC、GDP-甘露糖-6-脱氢酶基因gmd和GDP-岩藻糖合成酶基因wcaG均来源于大肠杆菌K12 MG655，序列参见公开号为CN114480240A的专利文献。

在一种实施方式中，所述α-1,2-岩藻糖基转移酶基因来源于幽门螺杆菌ATCC26695的HpfutC，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述α-1,2-岩藻糖基转移酶基因来源于幽门螺杆菌NCTC 11639的HpM32，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在一种实施方式中，融合标签SUMO、3×FLAG、HA、pelB和InfB的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26所示。

在一种实施方式中，所述基因工程菌利用pRSFDuet-1表达大肠杆菌K12来源的manB、manC、gmd和wcaG，利用pETDuet-1表达幽门螺杆菌ATCC 26695来源的HpfutC。

在一种实施方式中，所述基因工程菌利用pRSFDuet-1表达大肠杆菌K12来源的manB、manC、gmd和wcaG，利用pETDuet-1表达幽门螺杆菌NCTC 11639来源的HpM32。

本发明的第二个目的是提供生产岩藻基乳糖的方法，利用所述的重组大肠杆菌发酵生产岩藻基乳糖；当所述重组大肠杆菌表达α-1,2-岩藻糖基转移酶时，发酵生产2’-FL；当所述大肠杆菌表达α-1,3-岩藻糖基转移酶时，发酵生产3-FL。

在一种实施方式中，将菌株在摇瓶发酵体系中培养至OD₆₀₀＝0.6±0.1；加入终浓度为0.2～0.5mM的IPTG，同时加入乳糖至终浓度为5～10g/L，20～30℃，150～200rpm的条件下诱导培养不少于60h。

在一种实施方式中，将菌株在发酵罐体系中培养至OD₆₀₀＝20±3；加入终浓度为0.2～0.3mM的IPTG，同时加入乳糖至终浓度为5～10g/L，20～30℃，控制发酵体系中pH为6.5～7.0；溶氧控制在30％±5％，发酵不少于80h。

在一种实施方式中，发酵过程中补加甘油以维持菌体的生长和代谢。

在一种实施方式中，发酵过程中补加乳糖使其在发酵体系中的浓度维持在10±0.5g/L。

在一种实施方式中，所述甘油在初始发酵体系中的浓度为10～30g/L。

在一种实施方式中，在发酵前的发酵体系中还含有甘油20～30g/L，磷酸二氢钾10～15g/L，柠檬酸1～2g/L，磷酸氢二氨3～5g/L，七水硫酸镁1～2g/L，酵母提取物8～10g/L，微量金属溶液8～10mL/L。

在一种实施方式中，所述微量金属溶液中含有柠檬酸三铁8～10g/L，七水硫酸镁2～3g/L，五水硫酸铜0.5～1.0g/L，一水硫酸锰0.2～0.5g/L，硼砂0.2～0.5g/L，钼酸铵0.1～0.2g/L，二水氯化钙1～2g/L。

本发明的第三个目的是提供所述重组大肠杆菌在制备岩藻基乳糖中的应用。

在一种实施方式中，所述岩藻基乳糖包括2’-FL和3-FL。

本发明的有益效果：

本发明在含有载体pRSF-CBGW的大肠杆菌BL21(DE3)ΔlacZΔwcaJΔnudDΔpfkAΔlon宿主菌中组合调控HpfutC/HpM32的转录和翻译水平，增加融合标签以及质粒元件的基因拷贝数来提高HpfutC/HpM32的催化活力和可溶性表达，实现了岩藻糖基乳糖在重组大肠杆菌中的高效合成。本申请构建的基因工程菌在摇瓶发酵培养条件下，生产2’-FL的能力由初始的6.24g/L提升至9.36g/L，生产3’-FL的能力由初始的3.56g/L提升至6.28g/L；在3L发酵罐培养条件下，2’-FL和3-F的产量分别达到64.62和40.48g/L，为岩藻糖基乳糖的工业化生产奠定了基础。

附图说明

图1为岩藻糖基乳糖的代谢通路图。

图2为单酶切后各HpfutC/HpM32基因多拷贝质粒的核酸电泳图。

图3菌株EC54摇瓶发酵生产2’-FL。

图4菌株EM52摇瓶发酵生产3-FL。

图5为菌株EC54的3L发酵罐补料分批发酵。

图6为菌株EM52的3L发酵罐补料分批发酵。

具体实施方式

以下结合实例与附图对本发明的具体实施作进一步的说明。

1、以下实例中所使用的质粒、PCR试剂、限制性内切酶、质粒抽提试剂盒、DNA胶回收试剂盒等采用商业产品，具体操作按照试剂盒说明书进行；本发明的实施方式不限于此，其他未注明的实验操作和工艺参数按照常规技术进行。

2、载体pRSFDuet-1和pETDuet-1购自Addgene。

3、DNA产物、质粒的测序工作交予天霖生物科技(无锡)有限公司完成。

4、大肠杆菌感受态的制备：上海生工生物工程公司试剂盒。

5、LB液体培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠。

6、LB固体培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，18g/L琼脂粉。

7、发酵培养基：甘油30g/L，磷酸二氢钾13.5g/L，柠檬酸1.7g/L，磷酸氢二氨4.0g/L，七水硫酸镁1.4g/L，酵母提取物10g/L，微量金属溶液10mL/L(柠檬酸三铁10g/L，七水硫酸镁2.25g/L，五水硫酸铜1.0g/L，一水硫酸锰0.35g/L，硼砂0.23g/L，钼酸铵0.11g/L，二水氯化钙2.0g/L)，pH 6.8。

8、下述实施例中菌株的摇瓶发酵条件：工程菌单菌落接种于LB液体培养基，37℃，200rpm，摇瓶培养12h，得到种子液；将种子液以3％(v/v)的接种量接入50mL发酵培养基，37℃，200rpm，摇瓶培养至OD₆₀₀为0.6；加入终浓度为0.3mM的IPTG，同时加入乳糖至终浓度为8g/L，25℃，200rpm的条件下诱导培养72h，使用HPLC方法测定2’-FL或3-FL的含量。

9、2’-FL和3-FL的测定方法：

使用HPLC测定：1mL发酵液于100℃煮沸10min，12000r/min离心5min，上清液经0.22μm膜过滤处理，利用HPLC检测岩藻糖基乳糖的生成量以及乳糖和甘油的消耗量。HPLC检测条件：示差折光检测器；色谱柱为Rezex ROA-organic acid(Phenomenex，USA)，柱温为50℃；流动相为0.005mol/L的H₂SO₄水溶液，流速为0.6mL/min；进样量为10μL。

实施例1：不同启动子调控的α-1，2/3-岩藻糖基转移酶的构建

根据岩藻糖基乳糖的代谢通路(图1所示)，以含有载体pRSF-CBGW的大肠杆菌BL21(DE3)ΔlacZΔwcaJΔnudDΔpfkAΔlon(BZWNDPAL)为出发菌株(菌株BZWNAPAL的构建方法已公开于公开号为CN114480240A的专利文献中)。除了表达载体本身的启动子(T7)以外，另选取了几种代表性启动子(tac，trc，lac，lacUV5和trp)进行序列替换，构建并筛选高效生产岩藻糖基乳糖的工程菌株，具体步骤如下(所涉及的引物序列见表1)：

(1)以tac启动子为例，使用tac_F/R上下游引物，以pET-HpfutC/pET-HpM32质粒为模板进行PCR扩增，扩增产物经限制性内切酶Dpn I酶切，去除多余的环状模板。采用OneStep Cloning Kit(Vazyme)试剂盒对线性片段进行同源重组，后将连接产物转化E.coliDH5α感受态细胞，涂板过夜培养。平板上单菌落转接至4mL的LB培养基，培养12h后小提质粒并测序，将构建成功的敲除质粒命名为pET(tac)HpfutC/pET(tac)HpM32。其他启动子trc，lac，lacUV5和trp的构建方法同tac。

表1.启动子的引物序列

(2)对含有重组质粒pRSF-CBGW的大肠杆菌BZWNDPAL进行感受态制备，将构建好的含不同启动子的HpfutC/HpM32的表达质粒转化感受态细胞，最终获得了如表2所示的工程菌株。

(3)将得到的工程菌通过摇瓶发酵生产2’-FL或3-FL，产量结果展示于表2中。

表2.不同启动子调控下的工程菌的详细信息

实施例2：不同RBS调控的α-1，2/3-岩藻糖基转移酶的构建

本发明除了表达质粒本身的RBS外，另选取13种不同翻译强度的RBS序列(RBS序列见表3，翻译强度参考网站MIT Registry of Biological Standard Parts)。本实施例通过不同RBS调控α-1，2/3-岩藻糖基转移酶的翻译强度，构建并筛选了高效生产岩藻糖基乳糖的工程菌株。

表3.RBS序列

在质粒pET-HpfutC/pET-HpM32的原始RBS的-35和-10区域之间替换选定的RBS序列，表达载体的RBS替换步骤如下(涉及的引物序列见表4)：

(1)以BBa_B0029替换为例，使用引物BBa_B0029_CF/R和BBa_B0029_MF/R，以pET-HpfutC/pET-HpM32质粒为模板扩增载体骨架序列，胶回收DNA，产物经限制性内切酶Dpn I酶切，去除多余的环状模板。使用One Step Cloning Kit(Vazyme)试剂盒对线性片段进行重组反应，随后转化至E.coli DH5α并过夜培养，挑取平板上的单克隆至4mL的LB培养基，扩大培养后质粒抽提并测序，将构建成功的敲除质粒命名为pET(BBa_B0029)HpfutC/pET(BBa_B0029)HpM32。其他RBS替换的方法同BBa_B0029。

表4.RBS的引物序列

(2)将上述步骤中成功构建的质粒转入含有pRSF-CBGW的宿主大肠杆菌BZWNDPAL，获得的工程菌株如表5所示。

(3)将得到的工程菌通过摇瓶发酵生产2’-FL或3-FL，产量结果展示于表5中。

表5.不同RBS调控下的工程菌的详细信息

实施例3：含不同融合肽的α-1，2/3-岩藻糖基转移酶的构建

(1)以SUMO融合肽为例进行质粒构建，SUMO的基因序列连接到HpfutC/HpM32基因的N端，(GGGGS)₂柔性Linker的基因序列设计在SUMO的C端和HpfutC/HpM32的N端连接处，构建融合蛋白SUMO-HpfutC/HpM32。使用SUMO_CF/R和SUMO_MF/R上下游引物，以pET(BBa_B0034)HpfutC/pET(BBa_B0034)HpM32为模板，通过反向PCR线性化扩增表达质粒，随后使用Dpn I酶消化模板质粒，纯化回收线性化载体片段。使用One Step Cloning Kit(Vazyme)试剂盒对线性片段进行重组连接，重组反应体系在37℃下反应30min，随后转化至E.coli DH5α并过夜培养，挑取平板上的单克隆至4mL的LB培养基，扩大培养后质粒抽提并测序。将构建成功的敲除质粒命名为pET(BBa_B0034)-SUMO-HpfutC/pET(BBa_B0034)-SUMO-HpM32。其他融合肽的构建方法同SUMO。

表6.融合肽的引物序列

(2)将上述步骤中成功构建的质粒转入含有pRSF-CBGW的宿主大肠杆菌BZWNDPAL，获得的工程菌株如表7所示。

(3)将得到的工程菌通过摇瓶发酵生产2’-FL或3-FL，产量结果展示于表7中。

表7.不同融合肽的工程菌的详细信息

实施例4：α-1，2/3-岩藻糖基转移酶基因多拷贝质粒的构建

(1)二拷贝质粒的构建：以在质粒pET-(BBa_B0034)-pelB-HpfutC/HpM32的基础上构建基因多拷贝质粒为例。使用上下游引物DFC_F/R和DM32_F/R进行目的基因的扩增，得到T7-(BBa_B0034)-pelB-HpfutC/HpM32片段，载体以成功构建的pET-(BBa_B0034)-pelB-HpfutC/HpM32为模板，使用引物DV_F/R扩增骨架序列。根据In-Fusion克隆技术，使用无缝克隆试剂盒(南京诺唯赞生命科技有限公司)将片段T7-(BBa_B0034)-pelB-HpfutC/HpM32插入第一个目的基因之后，筛选阳性克隆并测序，最终得到二拷贝质粒pET-2×-(BBa_B0034)-pelB-HpfutC/HpM32。

(2)三拷贝质粒的构建：以pET-(BBa_B0034)-pelB-HpfutC/HpM32为模板，使用TFC2_F/R、TFC3_F/R、TM322_F/R、TM323_F/R进行目的基因的扩增，分别得到两条T7-(BBa_B0034)-pelB-HpfutC/HpM32片段用于载体和目的基因的无缝连接，载体骨架使用同一条引物TV_F/R进行PCR线性化。根据In-Fusion克隆技术，使用多片段无缝克隆试剂盒(南京诺唯赞生命科技有限公司)构建三拷贝质粒，产物转化至E.coli DH5α并过夜培养，平板筛选阳性克隆并测序，最终得到三拷贝质粒pET-3×-(BBa_B0034)-pelB-HpfutC/HpM32。

(3)多拷贝质粒的单酶切验证信息如图2所示，重组质粒pETDuet-1、pET-(BBa_B0034)-pelB-HpfutC/HpM32、pET-2×-(BBa_B0034)-pelB-HpfutC/HpM32和pET-3×-(BBa_B0034)-pelB-HpfutC/HpM32经限制性内切酶Xho I单酶切后，分别得到长度递增的DNA条带。

表8.基因多拷贝的引物序列

(4)将上述二拷贝和三拷贝的表达载体转化至含有pRSF-CBGW的宿主大肠杆菌BZWNDPAL，获得的工程菌株如表9所示。

(3)将得到的工程菌通过摇瓶发酵生产2’-FL或3-FL，产量结果展示于表9中。

表9.不同拷贝数的工程菌的详细信息

实施例5：菌株分批发酵及遗传稳定性分析

1、EC54和EM52菌株分批发酵

(1)重组菌株EC54和EM52的单菌落接种于5mL种子液，37℃，200r/min回旋式摇床过夜培养。

(2)重组菌株种子液以3.0％(v/v)的接种量接种于50mL发酵培养基，37℃，200r/min培养菌体OD₆₀₀至0.6-0.8，加入IPTG终浓度为0.3mM，同时加入10g/L乳糖，诱导培养72h。

(3)发酵过程定时取样，使用HPLC检测发酵产物。发酵结果如图3和图4所示，重组菌摇瓶发酵过程中，EC54菌株代谢合成2’-FL的积累量浓度可达9.36g/L，EM52菌株代谢合成3-FL的积累量浓度可达6.28g/L。

2、菌株遗传稳定性

将上述菌株EC54和EM52按照上述的摇瓶生产方法，传代培养6代，检测每代的2’-FL和3-FL的产量，结果表10所示，菌株在2’-FL和3-FL生产中均保持稳定的生产性能，具备良好的遗传稳定。

表10.重组菌株传代6次后2’-FL和3-FL的产量(g/L)

实施例6：3L发酵罐补料分批发酵生产岩藻糖基乳糖

为了制备高产量的2’-FL和3-FL，使用重组菌EC54和EM52分别在3L发酵罐进行高密度的补料分批发酵。

发酵条件：发酵培养基，接种量5％(v/v)，诱导前培养温度37℃，待OD₆₀₀达到20，加入IPTG诱导蛋白表达使得其在发酵体系中的浓度为0.2mmol/L，初始乳糖浓度为10g/L，诱导发酵温度为25℃。发酵全程使用NH₄OH控制罐体pH恒定为6.80。为了维持菌体生长以及岩藻糖基乳糖的合成，待初始甘油消耗完后流加800g/L的甘油(含20g/L的MgSO₄·7H₂O)以补充碳源，通过pH反馈调节(设置流速为20mL/h)使甘油在发酵体系中的浓度维持在较低浓度水平(甘油用于菌体生长和代谢，浓度约为0g/L)至发酵结束，待初始乳糖消耗完后手动补加200g/L的乳糖并使其在发酵体系中的终浓度维持在10±0.5g/L左右，发酵过程中若乳糖消耗至较低浓度时继续补加乳糖至发酵结束。发酵过程中系统级联控制，通过调节转速，通气量和氧气使罐内溶氧为30％±5％。

发酵全程定时取样并测定菌体OD₆₀₀，1mL发酵液煮沸15min使细胞破碎完全，12000r/min离心10min，上清液经0.22μm膜过滤处理，发酵过程中利用HPLC检测2’-FL和3-FL的生成量以及乳糖和甘油的消耗量(图5和图6)。结果显示，发酵结束后(共发酵100小时)，产物2’-FL的浓度可达64.62g/L，产物3-FL的浓度可达40.48g/L。

在发酵80、90、100小时2’-FL的浓度分别为46.21、61.42、64.62g/L，转化率分别达到0.65、0.64、0.64mol 2’-FL/mol乳糖。

在发酵80、90、100小时3’-FL的浓度分别为28.41、36.11、40.68g/L，转化率分别达到0.66、0.67、0.67mol 3-FL/mol乳糖。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种提高岩藻糖基乳糖产量的工程大肠杆菌及生产方法

<130> BAA220561A

<160> 26

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 903

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggctttta aggtggtgca aatttgcgga gggcttggga atcaaatgtt tcaatacgct 60

ttcgctaaaa gtttgcaaaa acactctaat acgcctgtgc tgttagatat cacttctttt 120

gattggagcg ataggaaaat gcaattagaa cttttcccta ttgatttgcc ctatgcgagc 180

gcgaaagaaa tcgctatagc taaaatgcaa cacctcccca agctagtaag agacgcgctc 240

aaatgcatgg gatttgatag ggtgagtcaa gaaatcgttt ttgaatacga gcctaaattg 300

ctaaagccaa gccgcttgac ttattttttt ggctatttcc aagatccacg atactttgat 360

gctatatccc ctttaatcaa gcaaaccttc actctaccac caccaccaga aaataataag 420

aataataata aaaaagagga agaatatcag tgcaagcttt ctttgatttt agccgctaaa 480

aacagcgtgt ttgtgcatat aagaagaggg gattatgtgg ggattggctg tcagcttggt 540

attgactatc aaaaaaaggc gcttgagtat atggcaaagc gcgtgccaaa catggagctt 600

tttgtgtttt gcgaagactt agaattcacg caaaatcttg atcttggcta cccttttatg 660

gacatgacca ctagggataa agaagaagag gcgtattggg acatgctgct catgcaatct 720

tgtcagcatg gcattatcgc taatagcact tatagctggt gggcggccta tttgatagaa 780

aatccagaaa aaatcattat tggccccaaa cactggcttt ttgggcatga gaatatcctt 840

tgtaaggagt gggtgaaaat agaatcccat tttgaggtaa aatcccaaaa gtataacgct 900

taa 903

<210> 2

<211> 1239

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgttccagc cgcttctgga tgcttatgtt gaatcggcct caatcgagaa gatggcttca 60

aaatctcccc cgcccctgaa aatcgccgtc gcgaactggt ggggagatga ggagattaag 120

gaatttaaga acttcgtgct gtattttatc ctttcacagc gttatacgat caccctgcac 180

caaaacccaa atgaattctc cgatcttgtt tttgggaatc ctttaggatc ggcacgcaag 240

attctgtcat atcaaaatgc caagcgcgtg ttttacacag gggagaatga gtctccgaat 300

tttaatttat tcgactacgc tatcggtttc gatgaattgg atttcaatga ccgctattta 360

cgcatgccgc tttattacaa cgagttacac atcaaggccg agtctgtgaa tgatacgaca 420

gctccttata aacttaaaga caacagctta tacgcattga agaagccatc ccactgtttt 480

aaggagaaac accccaatct ttgcgctgtc gtaaacgacg aatcagaccc gttgaagcgt 540

ggattcgcat ccttcgttgc ttctaatccg aacgcgccaa ttcgcaatgc ttttaatgat 600

gcgcttaata gtatcgaacc agtgaccgga ggtggttctg tacgtaatac gttgggctac 660

aatgttaaaa ataaaaatga gttcttatca cagtacaagt tcaatctttg ctttgaaaac 720

actcaaggtt atggatacgt tactgagaaa atcattgatg cgtacttcag tcacaccatc 780

cctatttact ggggaagtcc tagcgttgca aaagatttta atccgaagtc tttcgtgaat 840

gttcatgact ttaagaattt cgacgaggct attgactaca ttaagtatct tcacacacat 900

aaaaacgcct atcttgatat gttatacgag aaccccttga atactctgga tgggaaggct 960

tacttttatc agaacttgtc attcaaaaag atcctggcgt tttttaaaac catcctggat 1020

aacgatacaa tttaccacga taacccattc attttttgtc gtgatcttaa cgagcccctg 1080

gtaaccattg acgatttgcg tgctaattac gatgatcttc gtgtaaacta tgatgacctg 1140

cgtattaatt atgacgactt acgtgtaaac tatgatgatt tacgcatcaa ctatgacgat 1200

ctgcgtgtta attatgacga tttacgtgta aactattaa 1239

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

taatacgact cactatagg 19

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cgaaatttga caattaatca tcggctcgta taatggaatt g 41

<210> 5

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cgaaatttga caattaatca tccggctcgt ataatggaat tg 42

<210> 6

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cgaaatttga cactttatgc ttccggctcg tatgttggaa ttg 43

<210> 7

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cgaaatttga cactttatgc ttccggctcg tataatggaa ttg 43

<210> 8

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cgaaatttga caattaatca tcgaactagt taactagtac gc 42

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ctttgttcac acaggaaacc tataccatg 29

<210> 10

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gtataattaa agaggagaaa tataccatg 29

<210> 11

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

atatatcaca caggaaacct ataccatg 28

<210> 12

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

atatatcaca caggaaagta taccatg 27

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

atatatcaca caggactata ccatg 25

<210> 14

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

atataaaaga ggagaaatat accatg 26

<210> 15

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

atataattaa agaggagaat ataccatg 28

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

atataaaaga gggaaatata ccatg 25

<210> 17

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

actttaaaga ggggacaata taccatg 27

<210> 18

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

actttaaaga caggacccta taccatg 27

<210> 19

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

actttaaaga agagactcta taccatg 27

<210> 20

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

actttaaaga catgagttta taccatg 27

<210> 21

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

actttaaaga gtggaactta taccatg 27

<210> 22

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

aacaattaca ataaaacaac gtaaggaggt tgatt 35

<210> 23

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

agcgcgcggc aacctcgcgc gaacaataga gaaagaagat taaggaggtt tttt 54

<210> 24

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

attctaagga aatttgaaga ttaaggaggt ttttt 35

<210> 25

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

atgaaatatg tatgtattac agctgctgct ggtctgctgc tcctcgctgc ccagccggcg 60

atggcc 66

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

atgacagatg taacgattaa a 21

Claims

1. 一种生产岩藻基乳糖的重组大肠杆菌，其特征在于，以含有载体pRSF-CBGW的大肠杆菌BL21（DE3）ΔlacZΔwcaJΔnudDΔpfkAΔlon为出发菌株，过表达了磷酸甘露糖变位酶基因manB、甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶基因manC、GDP-甘露糖-6-脱氢酶基因gmd和GDP-岩藻糖合成酶基因wcaG；利用pETDuet-1表达2个拷贝的α-1,2-岩藻糖基转移酶基因HpfutC或α-1,3-岩藻糖基转移酶基因HpM32，并用SEQ ID NO.14所示的RBS替换质粒pET-HpfutC的原始RBS的-35和-10区域或质粒pET-HpM32的原始RBS的-35和-10区域；所述α-1,2-岩藻糖基转移酶或α-1,3-岩藻糖基转移酶的N端融合SEQ ID NO.25所示的融合标签pelB；基因HpfutC的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；基因HpM32的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述大肠杆菌BL21（DE3）ΔlacZΔwcaJΔnudDΔpfkAΔlon是在大肠杆菌BL21（DE3）中敲除了β-半乳糖苷酶基因lacZ、UDP-葡萄糖脂质载体转移酶基因wcaJ、GDP-甘露糖甘露糖基水解酶基因nudD、6-磷酸果糖激酶-1基因pfkA和蛋白酶基因lon；

所述载体pRSF-CBGW是用pRSFDuet-1表达大肠杆菌K12来源的manB、manC、gmd和wcaG。

2.生产岩藻基乳糖的方法，其特征在于，利用权利要求1所述的重组大肠杆菌发酵生产岩藻基乳糖；当所述重组大肠杆菌表达α-1,2-岩藻糖基转移酶时，发酵生产2’-FL；当所述大肠杆菌表达α-1,3-岩藻糖基转移酶时，发酵生产3-FL。

3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，将菌株在摇瓶发酵体系中培养至OD₆₀₀=0.6±0.1；加入终浓度为0.2~0.5 mM的IPTG，同时加入乳糖至终浓度为5~10 g/L，20~30℃，150~200 rpm的条件下诱导培养不少于60 h；

或者，将菌株在发酵罐体系中培养至OD₆₀₀=20±3；加入终浓度为0.2~0.3 mM的IPTG，同时加入乳糖至终浓度为5~10 g/L，20~30℃，控制发酵体系中pH为6.5~7.0；溶氧控制在30%±5%，发酵不少于80 h。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，发酵过程中补加甘油以维持菌体的生长和代谢。

5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，发酵过程中补加乳糖使其在发酵体系中的浓度维持在10±0.5 g/L。

6.权利要求1所述重组大肠杆菌在制备岩藻基乳糖中的应用。